Metodologia para a avaliação da qualidade da carne

Différents kit d’extractions ont été utilisés au cours de ce travail, en fonction de la nature des échantillons utilisés. Toutefois, tous les kits utilisés reposent sur le même principe : une première étape permet la lyse des membranes des cellules ou des vésicules, puis une séparation organique permet de séparer puis récupérer la fraction contenant les ARN. Ensuite, l’ARN est précipité sur une membrane incluse dans une colonne (variable en fonction du kit) grâce à l’ajout d’éthanol à 100%. Des successions de lavages avec des solutions contenant des concentrations d’éthanol décroissantes visent à éluer tous les composants du lysat retenus par la membrane sauf l’ARN. Finalement, après les différents lavages, l’ARN total est élué dans de l’eau sans RNase ni DNase (ou une solution tampon en fonction du kit) et est dénaturé à 65°C pendant 5 minutes, puis placé sur glace.

4.1.1. A partir de sérum ou de plasma

L’extraction d’ARN total à partir de sérum ou de plasma (humain ou murin) a été réalisée avec le kit

miRNeasy Serum/Plasma (Qiagen). Les consignes du fournisseur ont été suivies.

L’échantillon de plasma ou sérum a été décongelé doucement sur glace, puis l’extraction a été effectuée à partir de 200µL de sérum ou de plasma maximum. Un volume équivalent au volume de sérum/plasma de QIAzol a été ajouté, le lysat a été mélangé puis laissé à température ambiante pendant 5 minutes. Ensuite, 1.6 x 10⁸ copies du miARN synthétique cel-miR-39 ont été ajoutées à chaque échantillon, pour pouvoir servir de normalisateur et de contrôle de la qualité de l’extraction. Un volume équivalent au volume de départ de chloroforme a été ajouté au lysat qui a été laissé à température ambiante pendant 2 à 3 minutes, puis une phase de centrifugation a eu lieu de 20 minutes à 12 000g à 4°C. Cela a permis la séparation du lysat en plusieurs phases : la phase aqueuse contenait l’ARN et a été récupérée puis placée dans un nouveau tube.

A partir de cette étape, toutes les centrifugations ont été effectuées à température ambiante et l’extraction a pu être continuée manuellement ou achevée de manière automatisée par le QIAcube (Qiagen). Ces deux techniques incluent la précipitation de l’ARN total par de l’éthanol à 100% sur une colonne contenant une membrane en silice. Ensuite, une suite de lavages avec des solutions contenant des concentrations décroissantes d’éthanol a été effectuée sur la colonne. Finalement, la

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colonne a été séchée par centrifugation (5 minutes, 10 000g) puis l’ARN total a été élué par 18µL d’eau sans RNAse ni DNAse sur la colonne et une étape de centrifugation d’une minute à 10 000g. L’extraction automatisée par QIAcube a été utilisée pour l’extraction ARN des cohortes AAT Liège (dans l’étude 3) et sous-cohortes TTM sérum et plasma (dans les études 4 et 5).

Au cours des différentes études, plusieurs paramètres ont légèrement varié dans ce protocole : au cours de l’étude 1, l’extraction ARN a été effectuée à partir de 200µL de sérum ou de plasma. Au cours de l’étude 3, l’extraction ARN de la cohorte sérum AAT Liège a été faite à partir de 90µL de sérum et 100µL de PBS ; alors que l’extraction ARN des plasmas murins a été effectuée à partir de 50µL de plasma. Enfin, au cours des études 4 et 5, l’extraction ARN a été effectuée à partir de 200µL de sérum (étude 4) ou de plasma (étude 5).

4.1.2. A partir de sang total : tubes PAXgene™

L’extraction ARN à partir de sang total récupéré en tubes PAXgene® a été effectuée avec le kit

PAXgene Blood RNA (Qiagen).

Pour cela, les tubes PAXgene™ ont été décongelés à température ambiante pendant 2h avant le début de l’extraction, afin de finaliser la lyse des cellules. Les échantillons ont ensuite été mélangés doucement, puis centrifugés pendant 13 minutes à température ambiante à 5 000g.

Pour chaque échantillon, le surnageant a été éliminé. Le culot, contenant l’ARN et toujours présent dans le tube, a été lavé avec 4mL d’eau sans RNase, puis chaque tube a été vortexé vigoureusement pour détacher le culot. Chaque tube a ensuite été centrifugé pendant 10 minutes, à température ambiante à 5 000g. Le surnageant obtenu a été éliminé puis 350µL de tampon BR1 ont été ajoutés, afin de re-suspendre et de récupérer le culot, qui a ensuite été placé dans un nouveau tube. 300µL de

tampon BR2 puis 40µl de Protéinase K ont été ajoutés par échantillon. Chaque échantillon a ensuite

été mélangé et incubé pendant 10 minutes, à 1 400 rpm, à 55°C.

Le lysat a été transféré sur une colonne PAXgene Shreeder puis centrifugé pendant 3 minutes à 12 000g à 25°C. L’éluant obtenu après le passage dans la colonne a été récupéré et transféré dans un nouveau tube, puis 350µL d’éthanol à 96-100% ont ensuite été ajouté par échantillon. Chaque échantillon a ensuite été placé sur une colonne PAXgene RNA spin puis centrifugé à 12 000g pendant 1 minute à 25°C. Cette étape permet la précipitation de l’ARN sur la colonne. L’éluat de la colonne a été éliminé puis des lavages successifs avec des solutions (tampons BR3 et BR4) ont été effectués.

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Au milieu de ces étapes de lavage, une étape a été ajoutée. Il s’agit d’un traitement à la DNase I ( Qiagen) qui vise à éliminer l’ADN génomique présent dans les échantillons. Il consiste en l’ajout de DNase I et de tampon RDD (Qiagen) sur la colonne pendant 15 minutes à température ambiante.

Après les différentes étapes de lavage et de traitement DNAse, l’ARN total a été élué dans 80µL (2 fois 40µL) de tampon BR5. Une étape de désalage de l’ARN a été menée à l’aide du kit MinElute

(Qiagen), comme ceci : de l’eau sans RNase et 350µL de tampon RLT ont été ajoutés par échantillon. Ensuite, 250µL d’éthanol ont été ajoutés par échantillon pour diluer l’ARN. Chaque échantillon a ensuite été passé sur une colonne MinElute, puis centrifugé pendant 15 secondes à 12 000g, 25°C. Deux étapes de lavage de la colonne ont ensuite été effectuées : une avec 500µL de tampon RPE et l’autre avec 500µL d’éthanol à 80%. Finalement, la membrane de la colonne a été séchée par une centrifugation de 5 minutes à 12 000g, 25°C et tubes ouverts, puis l’ARN a été élué dans 14µL de

tampon BR5 grâce à une centrifugation d’1 minute à 12 000g.

4.1.3. A partir de de tissu murin ou de VE

L’ARN total a été extrait à l’aide du kit miRNeasy mini (Qiagen) selon les recommandations du fournisseur.

Brièvement, pour chaque échantillon, le tissu murin ou l’extrait de VE a été lysé avec 700µL de

QIAzol puis mélangé et laissé 5 minutes à température ambiante.

140µL de chloroforme ont été ajoutés par échantillon, qui ont ensuite été vortexés et laissés 2 à 3 minutes à température ambiante. Ensuite, une étape de centrifugation de 15 minutes à 12 000g à 4°C a permis la séparation des phases. La phase aqueuse contenant les ARN a été récupérée, puis mélangée doucement avec de l’éthanol à 100%. Le mélange a été passé sur une colonne, suivi par plusieurs lavages successifs (avec le tampon RWT, puis le tampon RPE et de l’éthanol à 80%). Enfin, l’ARN total a été élué avec de l’eau sans RNAse ni DNAse.

4.1.4. A partir de tissu humain

L’ARN total a été extrait depuis les tissus aortiques de la cohorte AAT tissue Paris avec le kit mirVana

isolation (Life Technologies, Merelbeke, Belgique) selon les recommandations du fournisseur.

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Pour chaque échantillon, environ 45mg de tissu aortique congelé a été prélevé sur glace pour limiter la décongélation et rapidement broyé dans 600µL de Lysis binding buffer grâce au Polytron, (Kinematica, Lucerne, Suisse). Le broyat obtenu a alors été congelé très rapidement par snap-freezing à -80°C.

Les broyats ont été décongelés doucement sur glace, puis 60µL de miRNA homogenate additive ont été ajoutés par échantillon pour stabiliser l’ARN, qui ont ensuite été laissés 10 minutes sur glace. Ensuite, 1mL d’acide phénol-chloroforme ont été ajoutés par échantillon. Après une étape de centrifugation pendant 5 minutes à 10 000g, la phase aqueuse (contenant l’ARN) a été récupérée et placée dans un nouveau tube. 1.25 volumes d’éthanol à 100% ont été ajoutés par échantillon. Chaque échantillon a été mélangé avant d’être passé sur une colonne qui contient une membrane. L’ARN a été ainsi précipité sur cette colonne, qui a ensuite subi des lavages successifs. La colonne a ensuite été centrifugée pendant 1 minute à 10 000g, pour éliminer tout liquide éventuellement restant sur la membrane, puis l’ARN total présent sur la membrane a été élué avec 50µL d’eau sans RNAse ni DNAse chauffée à 95°C.