Avaliar os efeitos da Euterpe oleracea (açai) na aterosclerose induzida experimentalmente.
Específicos:
Analisar as modificações induzidas pela Euterpe oleracea (açai) no perfil lipídico e desenvolvimento de aterosclerose, no modelo de coelhos induzido por dieta rica em colesterol.
Examinar as modificações na síntese e absorção de colesterol, pelas quantificações plasmáticas de desmosterol e dos fitosteróis (campesterol e sitosterol).
3. MÉTODOS
3.1 Desenho Experimental
O estudo foi constituído por 30 coelhos, da raça Nova Zelândia, brancos, machos, com cerca de três meses de idade e peso entre 2,5 – 3,0 Kg, que permaneceram os primeiros 15 dias em adaptação. Após este período inicial foram coletados 10 ml de sangue total para as dosagens laboratoriais basais, sendo então a ração normal consumida anteriormente substituída por uma ração enriquecida com colesterol a 0,5%, para indução de hipercolesterolemia e desenvolvimento de aterosclerose, por um período de 12 semanas. Após novas determinações laboratoriais e verificação dos níveis de colesterolemia, os animais foram aleatoriamente alocados em dois grupos, o grupo I (açaí) e o grupo II (controle). Os animais de ambos os grupos passaram a receber dietas enriquecidas com colesterol a 0,05%, para indução de hipercolesterolemia moderada, mas diferenciadas como descritas a seguir:
Grupo I – Dieta hipercolesterolêmica (0,05% de colesterol)+ 80 ml de açaí/dia + água
Grupo II – Dieta hipercolesterolêmica (0,05% de colesterol) + água
Após 12 semanas deste tratamento, novamente foram coletados 10 ml de sangue total para avaliação dos parâmetros. Neste momento, os animais foram sacrificados, retirando-se a artéria aorta em toda a sua extensão para quantificação da área ocupada pelas lesões ateroscleróticas e estudo histopatológico das placas de ateroma.
1º coleta de sangue - laboratório basal
Dieta hipercolesterolêmica
( 0,5% de colesterol) 12 semanas
2º coleta de sangue: Glicemia Lipidograma
Randomização dos Animais
15 coelhos Grupo Controle
15 coelhos Euterpe oleracea
Ração + 0,05%
colesterol +água Ração + 0,05% CT Euterpe oleracea 12 semanas 12 semanas 3 coelhos morreram coelhos 12 controle 15 coelhos Eut.. oleracea excluído
3ª col. de sangue : Glicemia, Lipidograma e Fitosteróis
Sacrifício dos animais, retirada das aortas e coloração pelo Sudam III
Análise Histopatológica das Aortas - Avaliação macroscópica
- Aval. extensão lesões ateromatosas - Avaliação microscópica
- Aval. histológica por microsc. óptica - Estudo Imuno-histoquímico
- Estudo Histopatológico
3.2 Animais
Os animais foram adquiridos da empresa Criex Cunicultura Ltda / Mogi das Cruzes - São Paulo e durante todo o período do estudo foram alojados no biotério do laboratório de cirurgia experimental da Universidade Federal do Pará, localizado no "Hospital Universitário João de Barros Barreto", mantidos em gaiolas individuais (50 x 50 cm), de ferro galvanizado e pintadas, dispostas lado a lado, com fundo removível, para que não tivessem contato com seus dejetos, sendo higienizadas diariamente. A temperatura local foi mantida constante em torno de 22ºC, com ciclo de luz claro-escuro de 12 h, receberam água à vontade e ração peletizada Nuvilab cobaias (Nuvital, Brasil) nos primeiros 15 dias de adaptação. Posteriormente, como indicado em nosso protocolo, a ração foi enriquecida com colesterol 0,5% nas primeiras 12 semanas e 0,05% nas 12 semanas finais de forma similar em ambos os grupos. Este trabalho foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa animal da Universidade Federal do Pará sob o número 002/2006.
Todos os dias pela manhã foram recolhidas as sobras de ração do dia anterior, que era pesada para controle da ingestão de colesterol; foi realizado também o controle da ingestão de açaí por animal, diariamente. Os animais foram pesados mensalmente e o consumo de ração também foi controlado mensalmente. 3.3 Dieta
A ração oferecida aos coelhos (Nuvilab Cobaias Nuvital, Brasil) apresentava a seguinte composição: milho integral moído, farelo de alfaia, farelo de soja, farelo de trigo, calcário calcítico, fosfato bicálcico, cloreto de sódio e vitaminas A, B, C, D, E, K, microelementos minerais e aminoácidos (DL- metionina).
Durante os primeiros 15 dias de adaptação a ração foi oferecida livremente e se calculou a média da quantidade diária consumida por cada coelho que era cerca de 100 g ao dia.
Os coelhos passaram então a receber a mesma ração acrescida de colesterol conforme já descrito. O colesterol em pó (Sigma C8503, EUA) foi misturado à ração, após a mesma ser moída, com uma pequena quantidade de água, para hidratá-la, formando então uma massa semi-pastosa que em seguida era colocada em uma
máquina industrial de moer carne formando, como produto final, pequenos pellets que foram colocados em uma estufa industrial a 60ºC, por 24 h, para secagem. Após o preparo, a ração foi separada em porções individuais de 100 g, para uso diário, sendo então colocada em sacos plásticos lacrados. Os animais foram pesados mensalmente e o consumo de ração controlado diariamente.
3.4 Indução de Hipercolesterolemia
A hipercolesterolemia foi induzida por meio de uma dieta hipercolesterolêmica preparada na proporção de 0,5 g de colesterol em pó para 100 g de ração (0,5%); o colesterol foi obtido junto a empresa Sigma-Aldrich Brasil Ltda, representante exclusivo da Sigma Corporation (Sigma C8503, EUA). Após o preparo, a ração foi separada em porções individuais de 100 g, para uso diário, sendo então colocada em sacos plásticos lacrados. Após 12 semanas de dieta hipercolesterolêmica para o desenvolvimento de aterosclerose, os coelhos foram aleatoriamente designados para compor dois grupos, o grupo I (açaí) e o grupo II (controle). O açaí foi fornecido aos coelhos com base nos estudos realizados anteriormente por CONSTANTINIDES,1960; FANI,1987; JORGE, 1997; IHARA, 2001.
3.5 Euterpe oleracea (Açaí)
A Euterpe oleracea foi obtida da região amazônica (Estado do Pará, Brasil). O vinho do açaí do tipo médio foi obtido por meio dos frutos maduros colocados de molho em água morna para que amoleçam e soltem do caroço. Em seguida, foram amassados em pequenas despolpadeiras (máquinas de inox artesanais), diluídos com uma pequena quantidade de água, na proporção de 2,5 Kg desses frutos para 40 ml de água, para se obter um litro do extrato, produzindo-se assim vinho de consistência pastosa e de cor vermelha-arroxeada. Após produzido, o vinho do açaí foi embalado em sacos plásticos que foram lacrados imediatamente para se evitar possíveis contaminações, fornecido pela empresa Francisco Ltda, grande produtora na cidade de Belém, que obedece às normas preconizadas de higienização. O mesmo foi produzido diariamente e enviado ao biotério, sendo oferecido imediatamente aos animais do grupo açaí em vasilhas de vidro, na quantidade de 80
ml/dia, puro sem acréscimos de água ou qualquer outra substância, durante 12 semanas.
3.5.1 COMPOSIÇÃO QUÍMCA DA EUTERPE OLERACEA
A composição do extrato de Euterpe oleracea é descrita na Tabela 1, conforme dados de ROGEZ (2000).
Tabela 1: Composição Química da Euterpe oleracea
COMPOSIÇÃO UNIDADE QT. DE MATÉRIA
SECA