SACRIFÍCIO DOS ANIMAIS E RETIRADA DAS AORTAS 1 Aspectos cirúrgicos do protocolo experimental

Ao final do experimento, os animais foram sacrificados retirando-se a artéria aórtica em toda a sua extensão para avaliação da área ocupada por lesões ateroscleróticas e estudo histopatológico das placas de ateroma. Na ocasião do sacrifício os animais foram pesados e anestesiados com cloridrato de cetamina 35

mg/kg de peso (Ketalar, Parke-Davis, EUA ) e cloridrato de xilazina 15 mg/kg de (Rompum, Bayer, EUA), por via intramuscular. A anestesia foi potencializada com éter etílico quando necessário. Sob anestesia profunda, os animais foram colocados em uma canaleta para dissecação e realizada incisão mediana toraco-abdominal, sendo obtidas amostras de sangue por punção intra-cardíaca. Em seguida, os órgãos abdominais foram rebatidos para isolamento da aorta que foi seccionada desde o arco aórtico até a bifurcação ilíaca. Foram então perfundidas por uma solução de papaverina a 12% em PBS – 37ºC, abertas longitudinalmente, presas em placas de isopor e fixadas em formol tamponado por 24horas, quando então foram retiradas do isopor e coradas pelo Sudam III, para que o conteúdo lipídico da placa fosse evidenciado.

3.7.2 ANÁLISE HISTOPATOLÓGICA DAS AORTAS

3.7.2.1 Avaliação macroscópica

Após a fixação, as aortas foram coradas com Sudam III, para que o conteúdo lipídico da placa fosse evidenciado. As aortas coradas foram analisadas comparativamente em ambos os grupos I e II, para avaliação macroscópica em relação à intensidade de presença de placas gordurosas.

3.7.2.2 Avaliação da extensão das lesões ateromatosas

As aortas abertas, fixadas e coradas, foram reproduzidas em folhas de acetato, para quantificarmos a extensão da área de aorta comprometida por meio da planimetria computadorizada, realizada em mesa digitadora acoplada a um microcomputador. Os resultados foram expressos em percentagem de área lesada em relação à área total da aorta.

3.7.2.2.1 Avaliação microscópica

Foram seccionados nove fragmentos de aproximadamente 5 mm cada, sendo três do arco aórtico, três da aorta torácica e três da aorta abdominal.

3.7.2.2.2 Avaliação histológica por microscopia óptica

Estes fragmentos foram embebidos em parafina e obtidos cortes de 4 µm. A histomorfometria foi realizada em cortes histológicos corados por Verhoeff para melhor identificar os limites entre a camada média e a íntima da artéria (SILVA, 2002). As imagens obtidas em um aumento de 6,5 x foram capturadas com auxílio de uma vídeo-câmera Sony CCD-IR15 (Sony, Japão) conectadas a um microscópio Olympus BX-40. As imagens foram então digitalizadas e transmitidas a um microcomputador, e com a utilização de um programa para morfometria, IMAGE

TOOL FOR WINDOWS VS 3.0 ( The University of Texas Health Science Center in

San Antonio UTHSCSA, EUA), foi mensurada então a maior altura das placas (µm), as áreas das camadas íntima e média (mm2_{) e calculada a relação íntima-} média(I/M).

3.7.3 Estudo imuno-histoquímico

Por meio de reação imuno-histoquímica identificou-se macrófagos e células musculares lisas, utilizando-se os seguintes anticorpos monoclonais: anti- macrófagos de coelhos na diluição de 1:200 em BSA 1% (RAM-11, Dako Laboratories, EUA) e anti-α actina para músculo liso humano na diluição de 1:200 em BSA 1% (HHF-35, Dako Laboratories, EUA). Este ensaio baseou-se no método imunoenzimático indireto em três etapas, utilizando-se o complexo estreptoavidina- biotina-peroxidase. Foram colhidos cortes histológicos com 2 µm de espessura em lâminas silanizadas (Sigma, St Louis, MD) e após serem desparafinizados, foi realizado o bloqueio da peroxidase endógena com uma solução de H2O2 na concentração de 8% sendo após lavados em PBS (pH: 7,4). Os anticorpos primários foram incubados à 4ºC overnight. Após a lavagem em solução de PBS, as seções foram incubadas com o anticorpo secundário IgG de cabra anti IgG de camundongo biotinilado na diluição de 1:100 (Dako Laboratories, Dinamarca) durante uma hora à

temperatura ambiente. Posteriormente, os cortes foram então incubados com a solução do complexo estreptoavidina-peroxidase na concentração de 1:100 (Strept ABComplex, Dako, Dinamarca) por uma hora, seguida de lavagens em PBS. A revelação foi realizada com substrato cromógeno 3,3 diamino-benzidina (DAB) (Sigma, A3648) 0,06% em PBS acrescido de 100 µL de H2O2 30% (Merck, Alemanha). Após, os cortes foram lavados em água corrente, contracorados com Hematoxilina de Harris e montados em Entellan (Merck-Alemanha). As imagens capturadas foram inicialmente tratadas no programa Corel Photo-paint 9 (Corel, EUA), afim de se isolar as áreas positivamente coradas pela reação de imuno- histoquímica. As áreas positivas foram determinadas utilizando-se novamente o programa de morfometria citado anteriormente (ENGELMAN, 2001).

De acordo com este programa determinou-se a área marcada positivamente pela reação imuno-histoquimica e a área da íntima na mesma imagem, calculando- se a percentagem de área da íntima ocupada por macrófagos ou células musculares lisas.

3.7.4 Estudo Histopatológico

Foram analisados os aspectos histopatológicos da placa para a caracterização do seu estágio evolutivo nos fragmentos obtidos da aorta, em cortes de 4 µm corados por HE, sendo avaliados os seguintes parâmetros: maior ou menor celularidade, matriz extracelular, presença de cristais de colesterol, formação de capa fibromuscular com colágeno e células musculares lisas, desestruturação da camada média junto à limitante elástica interna (LEI), desestruturação da camada média junto à limitante elástica externa (LEE) e processo inflamatório na adventícia.

A caracterização do estágio evolutivo das placas teve como base a classificação de Stary (STARY, 1994), considerando-se como placas tipo II as lesões nas quais havia predominância de células espumosas dispostas em camadas estratificadas, com predomínio em relação à matriz. As lesões foram consideradas tipo III quando apresentavam lipídeos extracelulares formando cristais confluentes e grande quantidade de matriz extracelular, além da formação de capa fibromuscular.