A Euterpe oleracea (açaí) modifica o metabolismo de esteróis e atenua a aterosclerose induzida experimentalmente

Claudine Maria Alves Feio

A

Euterpe oleracea

(açaí) modifica o

metabolismo de esteróis e atenua a

aterosclerose induzida experimentalmente

Tese apresentada à Universidade Federal de São Paulo

_–

Escola Paulista de Medicina para obtenção

do título de Doutor em Ciências

Claudine Maria Alves Feio

A

Euterpe oleracea

(açaí) modifica o

metabolismo de esteróis e atenua a

aterosclerose induzida experimentalmente

Tese apresentada à Universidade Federal de São Paulo

_–

Escola Paulista de Medicina para obtenção

do título de Doutor em Ciências

Orientador:

Prof. Dr. Francisco Antonio Helfenstein Fonseca

Co-orientador:

Profa. Dra. Maria Cristina de Oliveira Izar

Co-orientador:

Profa. Dra. Silvia Saiuli Miki Ihara

Feio, Claudine Maria Alves

A Euterpe oleracea (açaí) modifica o metabolismo de esteróis e atenua a aterosclerose induzida experimentalmente / Claudine Maria Alves Feio ; orientador, Francisco Antonio Helfenstein ; co-orientadoras, Maria Cristina Oliveira Izar, Silvia SaiuliMiki Ihara. - 2011

xiii, 53 p.

Tese (doutorado)-Universidade Federal de São Paulo. Escola Paulista de Medicina. Programa de Pós-Graduação em Cardiologia. São Paulo, 2011. Título em inglês: Euterpe oleracea (açai) modifies sterol metabolism and attenuates experimentally-induced atherosclerosis

DEPARTAMENTO DE MEDICINA

_–

DISCIPLINA DE CARDIOLOGIA

Chefe do Departamento: Reinaldo Salomão

Claudine Maria Alves Feio

A

Euterpe oleracea

(açaí) modifica o

metabolismo de esteróis e atenua a

aterosclerose induzida experimentalmente

Presidente da Banca:

Prof. Dr. Francisco Antonio Helfenstein Fonseca

Banca Examinadora:

Prof. Dr.

Prof. Dr.

Prof. Dr.

Prof. Dr.

ii

DEDICATÓRIA

Aos meus queridos pais Antonio e Fernanda,

(in memoriam), pelo amor incondicional e dedicação durante tantos anos.

Ao Max, meu marido, meu amigo e companheiro obrigada por todo o amor, respeito e

felicidade durante todos esses anos .

Ao meu filho e amigo Thiago

iii

Um agradecimento especial ao meu orientador Prof. Dr. Francisco Fonseca, por toda a confiança depositada em mim, pelo apoio constante e amizade, pela paciência, orientações pertinentes e incentivo. Que Deus o conserve sempre assim e lhe dê toda a felicidade que o senhor merece;

À minha querida co-orientadora e amiga Prof. Dra. Maria Cristina Izar, por toda a paciência, ajuda e incentivo, sempre disposta a ajudar os mais necessitados;

À minha amiga e co-orientadora Prof. Dra. Sílvia Saiuli Miki Ihara, sempre disponível e interessada na pesquisa;

Ao prof. Dr. Antonio Carvalho pela confiança e oportunidade deste doutorado;

A minha querida amiga e colaboradora Soraia Kasmas, pela inestimável ajuda;

Aos meus irmãos (ãs), cunhadas (os) e sobrinhos pela ajuda e compreensão em todos os momentos;

À Universidade Federal do Pará (UFPA) pela oportunidade deste Doutorado;

À Universidade do Estado do Pará (UEPA) pela oportunidade deste Doutorado;

À professora Eliete da Cunha Araújo, Coordenadora do Instituto Ciências da Saúde da Universidade Federal do Pará pela ajuda e incentivo na realização deste Doutorado;

À professora Tânia de Fátima D’Almeida Costa, Diretora da Faculdade de Medicina da Universidade Federal do Pará;

À professora Laélia Feio Brasil pela ajuda e apoio na realização deste projeto

Ao professor Paulo Amorim pela inestimável ajuda na concretização deste estudo;

Aos queridos amigos e funcionários do setor de Lípides, Aterosclerose e Biologia Vascular (UNIFESP);

À secretária da pós-graduação a Sra. Christina Almeida, pela paciência e disponibilidade;

iv

Guimarães pelo constante incentivo e ajuda;

Aos meus colegas, professores da Disciplina de Cardiologia da UFPA, pela compreensão e ajuda;

Aos meus colegas, professores da Disciplina de Propedêutica Médica da UEPA, pela compreensão e ajuda;

Ao doutorando Luís Antonio Maués pela importante contribuição na realização dos exames;

Às alunas Luana Relvas, Thais Tapajós e Daniel Charone, pela importante contribuição em todas as fases da realização deste projeto;

À bibliotecária do Instituto de Ciências da Saúde, Sra. Vilma Bastos, pela inestimável ajuda, durante todo este tempo;

v

vi

DEDICATÓRIA

_______________________________________________ ii

AGRADECIMENTOS

_________________________________________ iii

LISTA DE FIGURAS

_________________________________________ viii

LISTA DE TABELAS

_________________________________________ ix

LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS

_________________________ x

RESUMO

__________________________________________________ xii

ABSTRACT

________________________________________________ xiii

1 I

NTRODUÇÃO _____________________________________________ 1

1.1 EPIDEMIOLOGIA ___________________________________________________ 1

1.2 FATORES DE RISCO CARDIOVASCULAR ______________________________ 2

1.3 FISIOPATOLOGIA DA ATEROSCLEROSE ______________________________ 7

1.3.1 Indução de Aterosclerose em coelhos ______________________________ 10

1.3.2 Evolução da Aterosclerose em Humanos ____________________________ 12

1.4 CONSIDERAÇÕES SOBRE A EUTERPE OLERACEA ____________________ 13

2

OBJETIVOS ______________________________________________ 18

2.1 OBJETIVOS GERAIS ______________________________________________ 18

2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS _________________________________________ 18

3

MÉTODOS________________________________________________ 19

3.1. DESENHO EXPERIMENTAL ________________________________________ 19

3.2 ANIMAIS ________________________________________________________ 21

3.3 DIETA __________________________________________________________ 21

3.4 INDUÇÃO DE HIPERCOLESTEROLEMIA ______________________________ 22 3.5. EUTERPE OLERACEA (AÇAÍ)_______________________________________ 22

3.5.1 Composição Química da Euterpe Oleracea_________________________ 22 3.6 PARAMETROS AVALIADOS NO PROTOCOLO EXPERIMENTAL ___________ 24

3.6.1 Aspectos laboratoriais ___________________________________________ 24

3.6.1.1 Dosagens bioquímicas __________________________________________ 24

3.6.1.2 Metodologia empregada ________________________________________ 24

3.6.1.3 Lípides _______________________________________________________ 24

3.6.1.4 Quantificação dos Esteróis ______________________________________ 25

3.7 SACRFÍCIO DOS ANIMAIS __________________________________________ 25

vii

3.7.2.1 Avaliação Macroscópica ________________________________________ 26

3.7.2.2 Avaliação da Extensão das Lesões Ateromatosas ___________________ 26

3.7.2.2.1 Avaliação Microscópica _______________________________________ 27

3.7.2.2.2 Avaliação Histológica por Microscopia óptica _____________________ 27

3.7.3 Estudo Imuno-histoquímico _______________________________________ 27

3.7.4 Estudo Histopatológico __________________________________________ 28

3.8 ANÁLISE ESTATÍSTICA ___________________________________________ 29

4 RESULTADOS ____________________________________________ 30

5 DISCUSSÃO ______________________________________________ 36

6 CONCLUSÕES ____________________________________________ 39

REFERÊNCIAS _____________________________________________ 40

ANEXOS _____________________________________________________

Anexo 1: Parecer do Comitê de Ética Institucional ____________________

viii

Figura 1: Mecanismo de ação do fitosterol________________________________33

Figura 2: Palmeira do Euterpe oleracea (açaí)_____________________________33

Figura 3: Cachos e frutos do Euterpe oleracea (açaí)_______________________33

Figura 4: Euterpe oleracea (açaí) sendo despolpado_______________________33

Figura 5: Extrato (vinho) do Euterpe oleracea (açaí)________________________33

Figura 6: Organograma do desenho experimental_________________________33

Figura 7: Box plots da área de placas no arco aórtico e relação íntima/média___33

Figura 8: Box plots da área das placas mensuradas por planimetria__________34

ix

LISTA DE TABELAS

Tabela 1. Composição química da Euterpe oleracea_____________________22

Tabela 2. Pêso dos animais nas semanas 12 e 24________________________29

Tabela 3. Perfil lipídico e glicemia nas semanas 12 e 24__________________30

Tabela 4. Desmosterol, campesterol e beta-sitosterol ao final do estudo____31

x AVC: Acidente vascular cerebral

CT : Colesterol total

DAC: Doença arterial coronariana

DCNT: Doenças crônicas não transmissíveis

DCV: Doenças cardiovasculares

DHA: Ácido graxo docosahexaenóico

DM2: Diabetes mellitus tipo 2

DNA: Ácido desoxirribonucleico

ECA: Enzima conversora de angiotensina

EDTA: Ácido etilenodiamino tetra-acético

EMI: Espessura médio-intimal

eNOS: Óxido nítrico sintetase endotelial

EPA: Ácido graxo eicosapentaenóico

FR: Fatores de risco

H2O2: Peróxido de hidrogênio

HÁ: Hipertensão arterial

HDL: Lipoproteína de alta densidade

HE: Hematoxilina e eosina

I/M: Relação íntima média

IAM: Infarto agudo do miocárdio

ICAM-1: Molécula de adesão inter-celular 1

IgG: imunoglobulinas G

IMC: Índice de massa corpórea

xi LDLox: Lipoproteína de baixa densidade oxidada

NCEP: Programa de Educação Nacional do Colesterol

NF-KB: Fator nuclear kappa B

NPC1L1: Proteína Niemann-Pick C1 Like 1 PBS: Tampão fosfato salino

PCR: Proteína C-reativa

PECAM-1: Molécula de adesão de plaquetas/célula endotelial

RI: Resistência a insulina

SEM: Erro padrão da média

SM: Síndrome metabólica

VCAM-1: Molécula de adesão ao endotélio vascular

VLDL: Lipoproteína de muito baixa densidade

xii

Introdução: Euterpe oleracea (açaí) é uma fruta da região amazônica, cuja

composição química pode ser benéfica para indivíduos com aterosclerose. Nós hipotetizamos que o consumo de Euterpe oleracea poderia reduzir o desenvolvimento

da aterosclerose por uma redução na absorção e síntese de colesterol. Métodos:

Coelhos machos Nova Zelândia foram alimentados com uma dieta enriquecida em colesterol (0.5%) por 12 semanas, quando foram aleatoriamente distribuídos para tratamento com Euterpe oleracea ou água além de dieta enriquecida em colesterol

(0,05%) por 12 semanas adicionais. Fitosteróis plasmáticos e desmosterol foram determinados por cromatografia líquida de alto desempenho e espectrometria de massa. As lesões ateroscleróticas foram estimadas por planimetria computadorizada.

Resultados: Ao sacrifício, os animais tratados com Euterpe oleracea tiveram menores

níveis de colesterol total (p=0.03) e de colesterol não-HDL (p=0.03) em comparação

aos controles. Estes animais tiveram menores areas de aterosclerose em suas aortas ((p=0.001) e menor relação íntima/média (p=0.002) em comparação aos controles. Ao final do estudo, os valores plasmáticos de campesterol, β-sitosterol, e desmosterol não diferiram entre os grupos. Entretanto, os animais tratados com Euterpe oleracea

mostraram menores valores para as relações desmosterol/campesterol (p=0.026) e desmosterol/β-sitosterol (p=0.006) em comparação aos controles. Conclusões:

Consumo do extrato de Euterpe oleracea marcadamente melhora o perfil lipídico e

atenua a aterosclerose. Estes efeitos foram em parte relacionados a um melhor balanço entre síntese e absorção de esteróis.

xiii ABSTRACT

Background: Euterpe oleracea (açaí) is a fruit from the Amazon region, whose

chemical composition may be beneficial for individuals with atherosclerosis. We hypothesized that consumption of Euterpe oleracea would reduce therosclerosis

development by a decrease in cholesterol absorption and synthesis. Methods: Male New Zealand rabbits were fed a cholesterol-enriched diet (0.5%) for 12 weeks, when they were randomized to receive Euterpe oleracea extract or water plus a 0.05%

cholesterol-enriched diet for additional 12 weeks. Plasma phytosterols and desmosterol were determined by ultra performance liquid chromatography and mass spectrometry. Atherosclerotic lesions were estimated by computerized planimetry.

Results: At sacrifice, animals treated with Euterpe oleracea had lower levels of total

cholesterol (p=0.03) and non-HDL-cholesterol (p=0.03) as compared to controls.

These animals had smaller atherosclerotic plaque area in their aortas (p=0.001) and

a smaller intima/media ratio (p=0.002) in comparison with controls. At the end of the

study, campesterol, β-sitosterol, and desmosterol plasma levels did not differ between groups. However, animals treated with Euterpe oleracea showed lower

values for the desmosterol/campesterol (p=0.026) and desmosterol/β-sitosterol

(p=0.006) ratios as compared to controls. Conclusion: Consumption of Euterpe oleracea extract markedly improved the lipid profile and attenuated atherosclerosis.

These effects were related in part to a better balance in the synthesis and absorption of sterols.

INTRODUÇÃO

1.1 EPIDEMIOLOGIA

As doenças cardiovasculares (DCV) assumem importante destaque na mortalidade mundial, tanto em países desenvolvidos como em países em desenvolvimento, sendo responsáveis por aproximadamente 50% das mortes em países ocidentais. Desde a década de 1970 a taxa de mortalidade por idade foi reduzida pela metade em países industrializados, inclusive nos Estados Unidos, talvez devido ao maior controle de fatores de risco como hipercolesterolemia, hipertensão arterial e tabagismo (FORD et al., 2007; CAPEWELL et al., 2010).

Estima-se que 2/3 das mortes por DCV ocorram em países em desenvolvimento, como o Brasil, taxa que corresponde ao dobro da observada em países desenvolvidos (LAURENTI; BUCHALLA, 2001). No Brasil, a principal causa de morte ainda é o acidente vascular cerebral (AVC), entretanto em alguns locais, como o Estado de São Paulo o perfil de mortalidade se assemelha ao de países mais desenvolvidos, ou seja, a maior mortalidade decorre da doença coronária aterosclerótica (DAC) e o AVC ocupa o segundo lugar (LOTUFO; LOLIO, 1993; LOTUFO, 2005; WHO, 2008).

A doença cardiovascular tem custo mais elevado em países em desenvolvimento que em países desenvolvidos (MARTINEZ et al., 2003; RIBEIRO et al., 2005), e a previsão para esses países é de piora desse quadro nos próximos

anos se não conseguirmos realizar o controle adequado dos fatores de risco.(LUZ et al., 2003; SCHERR; RIBEIRO, 2009; SPOSITO et al., 2007; BLASI, 2008), elas são

responsáveis por grande parte da mortalidade dos brasileiros, correspondendo a 31% do total, sendo proporcionalmente maior nas mulheres em relação aos homens (BERTOLAMI, M; BERTOLAMI, A, 2006). Essas doenças representam um crescente encargo para a sociedade, para a família e para o indivíduo (MURRAY; LOPEZ, 1996; WHO, 2005). Entre os 58 milhões de óbitos mundiais em 2005, 35 milhões foram causados pelas doenças crônicas não transmissíveis (DCNT), o que representa o dobro do número total de óbitos por todas as doenças de notificação obrigatória. Em 2006 a World Health Statistics apontou que entre as doenças

principal causa de óbito, responsável por 31% de todos os casos, cerca de 17,5 milhões de óbitos (WHO, 2006).

A experiência de países desenvolvidos indica que intervenções sustentadas na prevenção primária e secundária da doença aterosclerótica podem reduzir em até 4% a mortalidade média anual em pessoas na faixa etária entre 60 - 69 anos, e em até 3% na faixa etária entre 70 - 79 anos. Essas faixas etárias, após intervenções contínuas, foram as que mais evidenciaram queda na mortalidade em vários países na década de 1990 (YACH, 2004; Australian Institute of Health And Welfare (AIHW),

2006; STRONG; MHATERS; BONITA, 2007). Além das medidas de intervenção na prevenção primária e secundária, a efetiva implementação dos resultados de vários ensaios clínicos aleatorizados, como, por exemplo, o uso de drogas trombolíticas, de novas drogas antitrombóticas, a anticoagulação na fibrilação atrial crônica, a disseminação de unidades de AVC, e a endarterectomia carotídea conseguiram reduzir em até 80% a incidência de AVC (SILVA; LIMA, 2002; FONSECA et al.,

2003; WALD; LAW, 2003).

Apesar dos grandes avanços nas áreas de diagnóstico e tratamento das doenças cardiovasculares, a prevenção continua sendo o principal caminho para combater esse problema. A prevenção tem como base o conhecimento dos fatores de risco que levam à doença aterosclerótica, e entre esses fatores, a dislipidemia destaca-se como um dos mais importantes, pois, representa um dos seus principais desencadeantes, sendo o aumento dos níveis de colesterol o principal fator envolvido no seu desenvolvimento (JALDIN et al., 2006).

1.2 FATORES DE RISCO

Na primeira metade do século passado, experimentos com animais e observações clínicas ligaram certas condições, como por exemplo, a hipercolesterolemia, ao risco aumentado de eventos aterotrombóticos (BRAUNWALD, 2002).Após a avaliação de desfechos de estudos clássicos, como o de Framingham e o Seven Countries Study, houve melhor compreensão das

doenças cardiovasculares e também, da relação entre alguns fatores e o risco de desenvolver doenças cardiovasculares (DCV) (KEYS, 1970; PETER et al., 1998;

dentre estes já implicados na patogênese da aterosclerose, podemos listar: idade, sexo, hipertensão arterial, tabagismo, diabetes mellitus tipo 2 (DM2), dislipidemia,

história familiar de infarto precoce do miocárdio, resistência periférica à insulina (RI), obesidade e sedentarismo. Atualmente outros fatores, como níveis séricos aumentados de homocisteína, lipoproteína (a), fibrinogênio e proteína C reativa, bem como algumas infecções crônicas por organismos do gênero Chlamydia vêm sendo investigados quanto a suas possíveis implicações neste processo (BRAUNWALD et al., 2002; RIDKER et al., 2009), assim como também, a idéia de que tais fatores

possam ter uma etiopatogenia comum, pois, um hábito de vida sedentário, um ambiente ansiogênico e uma alimentação hipercalórica rica em carboidratos e gorduras saturadas, ao longo do tempo, podem levar à obesidade, aumento gradual da resistência a insulina (RI), dislipidemia, hipertensão arterial (HA), diabetes

mellitus tipo 2 e síndrome metabólica (SM) (KANNEL, 2000; NCEP, 2002; SILVA;

LIMA, 2002; LINDSAY; HOWARD, 2004; TEIXEIRA et al., 2005; BRANDÃO et al.,

2005; MICHA et al., 2010; CHEN et al., 2010).

Alguns estudos mostram os benefícios do controle dos FR, como o estudo de Ciorlia e Godoy, com seguimento de até 20 anos (CIORLIA; GODOY, 2005), o de Caterina, demonstrando a relação entre a redução do colesterol e a incidência de AVC (DE CATERINA et al., 2010). No Brasil, por meio dos dados do estudo

AFIRMAR, foi verificado que a maioria dos fatores de risco (FR) para infarto agudo do miocárdio (IAM) é passível de prevenção (PIEGAS et al., 2003). Outros estudos

no Brasil, também enfatizam a grande importância do controle dos fatores de risco na prevenção do infarto agudo do miocárdio (AVEZUM; PIEGAS; PEREIRA, 2005; BERTOLAMI, M; BERTOLAMI, A, 2006).

O INTERHEART (YUSUF, 2004), um estudo destinado ao exame de fatores

comuns, entre os quais tabagismo, pressão arterial e gordura abdominal, apresentado no World Congresso of Cardiology (O’DONNELL et al., 2010). Dentre

os fatores de risco encontrados no estudo INTERSTROKE, cinco foram mais

prevalentes a hipertensão arterial, o tabagismo, o consumo de álcool, a gordura abdominal e a má alimentação que são fatores de risco passíveis de intervenção. De acordo com uma revisão feita pela American Heart Association (AHA), três classes

de compostos encontrados nas frutas e vegetais como os esteróis, flavonóides e compostos contendo enxofre, ácidos graxos monoinsaturados (AGMI) e poliinsaturados (AGPI), de vitaminas e minerais com ação antioxidante (A, C, E, Se), de ligninas, podem ser importantes na redução do risco de arteriosclerose (MOREIRA et al., 2006; NAGAO; YANAGITA, 2008; O’DONNELL et al., 2010).

Os esteróis vegetais ou fitosteróis são substâncias de origem vegetal, cuja estrutura química é muito similar à do colesterol. A sua ação hipocolesterolêmica parece resultar da inibição da absorção do colesterol no intestino delgado, resultante do fato de haver competição entre os fitosteróis e o colesterol na solubilização da micela, alterando a atividade de enzimas envolvidas no metabolismo e excreção do colesterol. Os fitoesteróis são mais hidrofóbicos e têm maior afinidade pelas micelas do que o colesterol, logo estes são menos absorvidos e mais excretados (Fig.1). Os

principais tipos de fitoesteróis são o β-sitosterol, sitostanol e campesterol. O β -sitosterol, principal fitosterol extraído dos óleos vegetais, e o sitostanol-éster, produto de sua esterificação, reduzem a absorção do colesterol alimentar, em torno de 30 a

40% (ROBERFROID; CALDERON, 1994;

LOTTENBERG, 2002; LU, 2007).

Alguns estudos clínicos e também experimentais têm mostrado que a adição de 3 g/dia de fitoesteróis na dieta pode reduzir os níveis plasmáticos tanto do colesterol total como da fração LDL-colesterol, mas as concentrações de HDL-colesterol e de triglicérides não apresentam modificações significativas (SANTOS, 2001; SALGADO et al., 2008). O consumo diário de 1,6g de esteróis vegetais reduziu eficazmente o LDL-colesterol em indivíduos com hipercolesterolemia moderada sem efeitos deletérios nos biomarcadores de stress oxidativo (LOTTENBERG et al., 2002; HANSEL et al.,

que quanto maior o consumo de fitosteróis, menor é o valor plasmático do LDL, tanto em homens quanto em mulheres (ANDERSSON et al., 2004). Uma metanálise que

envolveu mais de 6.000 pacientes observou que o consumo de aproximadamente 2,0 g/dia de fitosterol levou a uma redução de 10% do nível do LDL-C plasmático e que existe uma relação linear, de forma que quanto maior o consumo de fitoesterol maior é a redução do LDL, até 3,0 g/dia, consumidos num único período ou ao longo do dia (DEMONTY et al., 2009). Os transportadores responsáveis pela eliminação

do colesterol e fitosteróis são ABCG5 e ABCG8, devolvendo estes esteróis à luz intestinal. Foram também descritos no fígado, onde secretam na bile, pela mesma via, os fitosterois e o colesterol, mecanismo este diferente da ação da ezetimiba que também reduz a absorção do colesterol, mas por meio da inibição do transportador NPC1L1 que é o responsável pela absorção de esteróis livres na parede intestinal (KATRAGADDA; RAI; ARORA, 2010). Os fitosteróis, quando associados à estatina podem reduzir em até 17% o colesterol plasmático (BLAIR et al., 2000).

Os flavonóides têm estruturas químicas variadas e são encontrados nas frutas, vegetais, nozes e sementes. Alguns têm mostrado efeito antioxidante, outros possuem efeitos antiplaquetários. As principais fontes de flavonóides incluem o vinho tinto e os produtos da soja (isoflavonas). O Euterpe oleracea Mart. contém

78mg de fitosteróis por litro do suco da fruta, os habitantes locais costumam consumir até um litro do suco dessa fruta /dia (ROGEZ, 2000), que contém 1,28 g de flavonóides por litro de suco, sendo o principal a cianidina-3 glucosídeo, comprovadamente três a cinco vezes mais forte do que o trolox (análogo da vitamina E) e um volume 10 a 30 vezes maior de antocianinas que o vinho tinto (ROGEZ,

2000; O’DONNELL et al., 2010). Os compostos fenólicos, ou polifenóis, presentes no Euterpe oleracea Mart., são os grandes responsáveis por sua atividade antioxidante,

que atuam na prevenção da aterosclerose reduzindo a oxidação do LDL-colesterol. Também possuem alto teor de lipídios, o que lhes conferem alto valor energético. O

Euterpe oleracea Mart. é uma fruta tropical rica em compostos bioativos como

de compostos fenólicos e encontra-se entre as frutas que apresentam maior capacidade antioxidante, sendo também rica em proteínas, vitaminas, minerais e fibras, mantendo suas propriedades mesmo sob a forma de polpa congelada (KUSKOSKI et al., 2006; SCHAUSS et al., 2006; ALMEIDA et al., 2006; SANTOS et al., 2008).

Estudos experimentais e clínicos mostram ação protetora de vitaminas antioxidantes (beta-caroteno e vitamina E) na aterosclerose (KANG; LEAF, 2000). Os flavonóides também são antioxidantes, encontrados nos alimentos, principalmente verduras, frutas, grãos, sementes, castanhas, condimentos e ervas e também em bebidas como vinho e chá (RIBEIRO; SHINTAKU, 2004).

O estudo realizado por Lin mostrou que a suplementação com fitosteróis na dieta pode modificar o metabolismo do LDL-colesterol (LIN et al., 2010),

principalmente com o uso de doses mais elevadas (RACETTE et al., 2010).

Tão importante quanto os fitosteróis, são as fibras vegetais. Na década de 1970 começaram a surgir estudos relacionando as fibras com a saúde, em pesquisas demonstrando que em comunidades que consumiam poucos alimentos processados industrialmente, eram raras as doenças como hipertensão, infarto do miocárdio, obesidade e distúrbios gastrointestinais, (NEVES, 1997; GONÇALVES, 2007). Em nosso País, não existe uma avaliação precisa do consumo de fibras dietéticas, muito embora, alguns trabalhos já alertem para o baixo consumo de fibras em todas as classes sociais, como conseqüência da ingestão reduzida de frutas e hortaliças (MATTOS; MARTINS, 2000).

Estudos realizados tanto com animais (RIBEIRO et al., 1998; ROSA et al.,

1998: PIEDADE; CANNIATTI-BRAZACA, 2003; ODETOLA; IRANLOYE, Y; IRANLOYE, O, 2004), quanto com humanos (OLIVEIRA; SICHIERI, 2004; JENKINS

et al., 2005; DIKEMAN; MURPHY; FAHEY, 2006; ROGOVIC et al., 2006), permitem

evidenciar os efeitos benéficos das fibras solúveis na atenuação da dislipidemia, a partir de diferentes mecanismos de ação, ligados principalmente a redução da absorção intestinal do colesterol dietético, ao aumento da excreção fecal dos ácidos biliares, forçando o fígado a degradar mais colesterol, para produzir novos ácidos biliares, e pela própria inibição da síntese endógena do colesterol pela succinil-CoA, formada a partir do propionato originado do metabolismo das fibras solúveis no intestino (LÓPEZ et al., 1997; RAUP et al., 2000; MARLETT; MCBURNEY; SLAVIN,

Mais recentemente, num estudo transversal de menor porte com cerca de 2.000 mulheres que fizeram parte da população do estudo National Health and Nutrition Examination Survey (1999-2000), onde se avaliou a relação entre a

ingestão de grãos integrais e o IMC, demonstrou que mulheres que costumavam consumir mais frequentemente grãos integrais tinham valores de IMC e circunferência da cintura menores, e menor predisposição para terem sobrepeso (SAVAGE; MARINI; BIRCH, 2008; GOOD et al., 2008). Todavia, faz-se necessário

um maior número de estudos (GONÇALVES et al., 2007; MELLO; LAAKSONEN,

2009).

Várias pesquisas têm demonstrado uma redução da taxa de mortalidade para doenças cardiovasculares após o uso de ácidos graxos poliinsaturados ômega 3 de

cadeia longa (EPA, DHA) e de cadeia mais curta (Ácido α-linolênico - ALA) (CONNOR, 2000; MORISE, 2004; RIBEIRO; SHINTAKU, 2004).

1.3 FISIOPATOLOGIA DA ATEROSCLEROSE

Estudos experimentais e clínico–epidemiológicos comprovam que a aterosclerose é uma doença multifatorial, e como tal é necessária uma abordagem mais abrangente no controle dos múltiplos fatores de risco cardiometabólicos, dentre estes fatores a hipercolesterolemia exerce um papel muito importante. (KANNEL, 2000; NCEP, 2002; LINDSAY; HOWARD, 2004; TEIXEIRA et al., 2005; BRANDÃO et al., 2005). Atualmente não se discute mais a influência da hipercolesterolemia na

doença arterial coronária. Os níveis sanguíneos de colesterol são determinados em grande parte por fatores genéticos e fatores ambientais (NCEP, 2001; POZZAN; POZZAN, R; BRANDÃO, 2005; BAIGENT et al., 2006; GIROLDO; ALVES; BATISTA,

2007; KOLANKIEWICZ; GIOVELLI; BELLINASO, 2008).

principais desencadeantes (NCEP, 2002).

Em 1999, Russel Ross, um dos principais estudiosos da fisiopatologia da

aterosclerose, mostrava a aterosclerose como doença inflamatória (ROSS, 1999), demonstrou que a elevação dos níveis de lipídios e de lipoproteínas, além da elevação de outras moléculas do sangue como a homocisteína, infecções e hipertensão, podem, induzir ou promover inflamações associadas à aterosclerose (ROSS, 1999). Essa pesquisa mudou a visão sobre a aterosclerose, surgindo então o conceito da aterosclerose como uma doença inflamatória crônica de origem multifatorial em resposta à agressão endotelial, uma doença generalizada da parede arterial, que pode evolutivamente progredir, regredir ou estabilizar-se, na dependência de uma série de fatores (AIKAWA; LIBBY, 2004). Esse processo dinâmico é caracterizado por remodelamento na parede arterial que pode permanecer silencioso por muito tempo ou pode manifestar-se como um evento vascular agudo, tornando-se clinicamente aparente, ou seja, a doença vascular aterosclerótica deve ser entendida como um complexo processo fisiopatológico, em que a inflamação crônica vascular se associa com ciclos de agudização da inflamação e de acentuação do estado pró-trombótico (NISSEN et al., 2004;

SOLIMAN; KEE, 2008), acomete principalmente a camada íntima de artérias de médio e grande calibre, é um processo que se inicia na infância, apresenta progressão lenta, acometendo basicamente as artérias elásticas, como a aorta, carótidas e ilíacas e as artérias musculares de grande e médio calibre, como coronárias e poplíteas (ROSS; GLOMSET, 1976; LIBBY, 2002; ENGELHORN et al.,

2005; SPOSITO et al., 2007).

A American Heart Association classifica as lesões ateroscleróticas em dois

grupos: lesões precursoras e avançadas. As lesões do tipo precursoras são silenciosas, discretas e não provocam desorganização da íntima, da média e nem da adventícia, elas podem ainda ser subdivididas segundo um critério predominantemente morfológico em lesões do tipo I, II e III (ZHAN-LONG et al.,

2008).

podem trazer conseqüências deletérias à saúde do indivíduo, entretanto, é importante lembrar que as lesões precursoras provêm o caminho para que as lesões avançadas se desenvolvam (FRANÇA, T; FRANÇA, N, 2001).

A formação da placa aterosclerótica tem início com a agressão ao endotélio vascular que pode ocorrer por diversos fatores como, a hipertensão arterial, o tabagismo, a elevação de lipoproteínas aterogênicas que levam a disfunção endotelial, manifesta principalmente por deficiência de óxido nítrico (NO) e prostaciclina e por aumento dos níveis circulantes de endotelina-1 (ET-1), angiotensina II (ang. II) e inibidores do ativador do plasmonogênio-1(PAI-1) (PACKARD; LIBBY, 2008), aumentando assim a permeabilidade da íntima às lipoproteínas plasmáticas favorecendo a retenção das mesmas no espaço subendotelial. O mecanísmo inicial da aterogênese é o depósito de lipoproteínas na parede arterial que ocorre de modo proporcional à concentração dessas lipoproteínas no plasma. Outra manifestação da disfunção endotelial é o surgimento de moléculas de adesão leucocitária na superfície endotelial processo esse estimulado pela presença de LDL minimamente oxidada. Em uma edição de 1989, do New England Journal of Medicine, o pesquisador Daniel Steinberg postulou que

os radicais livres alteram ou oxidam o colesterol LDL e que se a esses pacientes fosse fornecido antioxidantes adequados seria possível evitar essa oxidação (STEINBERG, 1989). As moléculas de adesão leucocitária são indutoras da produção de substâncias quimiotáxicas pelos macrófagos, levando a um processo de adesão monocitária e interiorização no espaço subendotelial, ou seja, são responsáveis pela atração de monócitos e linfócitos T para a parede arterial. Os monócitos migram para o espaço subendotelial onde se diferenciam em macrófagos que captam as LDL oxidadas, ficam repletos de lípides e passam a ser chamados de células espumosas, sendo os principais componentes das estrias gordurosas que são as lesões macroscópicas iniciais da aterosclerose. Alguns mediadores da inflamação estimulam a migração e proliferação das células musculares lisas da camada média arterial que ao migrarem para a íntima passam a produzir citocinas, fatores de crescimento e matriz extracelular que formará parte da capa fibrosa da placa aterosclerótica. A placa aterosclerótica é constituída por elementos celulares, componentes da matriz extracelular, núcleo lipídico que é rico em colesterol e uma capa fibrosa rica em colágeno.(LIBBY, 2003; SPOSITO et al., 2007; ARAÚJO, 2007;

1.3.1 Indução de aterosclerose em coelhos

A primeira investigação sobre indução experimental de aterosclerose ocorreu em 1908 com Ignatowski, que utilizou coelhos alimentados com leite, carne e ovo e observou espessamento da íntima em suas aortas. Logo depois, Lubarsch (1910, 1912) e Steimbiss (1913) desenvolveram aterosclerose em aorta de coelhos com dietas envolvendo fígado, adrenal e músculo (IGNATOWSKI, 1908; MOGHADASIAN, 2002).

Na Rússia, em 1912, o pesquisador Nicolai Anitschkov induziu aterosclerose em coelhos alimentados com gemas de ovos misturadas a óleo de girassol. No ano seguinte o próprio Nicolai publicou o que veio a ser o primeiro experimento de reprodução de aterosclerose em animais na história da medicina. Esses trabalhos foram praticamente esquecidos, mas retornaram com toda força por volta de 1954, quando também da Rússia o pesquisador David Kritchevsky confirmou que coelhos alimentados com gorduras e colesterol apresentavam lesões ateromatosas, afirmou também que a administração de gorduras poliinsaturadas tinha provocado diminuição nos níveis de colesterol dos animais pesquisados (KRITCHEVSKY et al.,

1989; KRITCHEVSKY, 2001; PUPPIN, 2004).

Em 1926, Clarkson e Newburgh, alimentaram coelhos com dieta rica em colesterol e encontraram moderada aterosclerose em 71% dos coelhos alimentados com 507 mg/dia de colesterol por 47-87 dias. Meeker e Kesten (1940-1941) dissolveram 60 ou 250 mg de colesterol em óleo vegetal e acrescentaram à dieta de coelhos por três meses e verificaram que os animais desenvolveram lesões ateroscleróticas típicas, similares àquelas vistas em humanos, permanecendo, deste modo, a teoria de que o colesterol é o precursor para o desenvolvimento de doença vascular aterosclerótica (KRITCHEVSKY, 1995).

Para induzir hipercolesterolemia em animais, têm-se utilizado dietas contendo 1% de colesterol em rações, em várias pesquisas, alcançando hipercolesterolemia moderada com níveis de colesterol plasmáticos na faixa de 200 a 800 mg/dl (HOLVOET; COLLEN, 1997; IHARA et al.,2001), mas essas lesões produzidas são

além do que processam e toleram o consumo de colesterol melhor do que os coelhos (KOLODGIE et al., 1996). Essa indução é para investigarmos substâncias

que podem ser viabilizadas, no futuro, como medicamentos no controle do metabolismo lipídico e no desenvolvimento de testes de potenciais terapias e diagnósticos entre diferentes procedimentos experimentais (PERCEGONI et al., 2004; LIMA et al., 2008).

As lesões ateroscleróticas observadas são compostas por três componentes maiores, o primeiro é o componente celular, que predominantemente compreende células musculares lisas e macrófagos, o segundo componente é o tecido conectivo matriz e lipídio extracelular e o terceiro componente é o lipídio intracelular, que se acumula dentro de macrófagos, convertendo-se, então, em células espumosas (CROWTHER, 2005). Tem sido observada a presença de leucócitos aderidos ao arco aórtico torácico e abdominal de coelhos após três semanas de dieta enriquecida com 0,2% de colesterol; ao se aumentar o tempo de indução para 3-5 semanas com essa mesma dieta, numerosas células espumosas são encontradas no espaço subendotelial e constituem o desenvolvimento de camadas de gordura na mesma localização em que monócitos aderentes foram observados anteriormente (ROSENFELD et al., 1987).

O coelho é a espécie mais estudada, em especial a linhagem Nova Zelândia, citada pela primeira vez por IGNATOWSKI (1908) e isso se deve ao fato desta espécie desenvolver hipercolesterolemia, em poucos dias, quando se administra uma dieta acrescida de colesterol entre 0,1 a 2% por aproximadamente 12 semanas (BOCAN et al., 1993; YANNI, 2004; JALDIN et al., 2006; RIEDMÜLLER et al., 2010).

Esse modelo permite a formação de lesões ateroscleróticas nas aortas torácica e abdominal (PATEL et al., 2008; DUCKWORTH et al., 2009) assim como, em

carotídas (YANNI, 2004; HERTZEL et al., 2008). Bocan et al (1993) forneceram a

semelhantes às lesões que ocorrem em humanos (KOLODGIE et al., 1996;

FINKING; HANKE, 1997; AIKAWA et al., 1998; SILVA; LIMA, 2002; FONSECA et al.,

2003, HELFENSTEIN et al., 2011).

A extensão da aterosclerose em aorta de coelhos pode ser quantificada pela superfície de lesões sudanofílicas (STAPRANS et al., 1998) e por análise

imuno-histoquímica (NAKAZATO et al., 1996). O grau de aterosclerose em coelhos tende a

ser maior na aorta abdominal do que na torácica, o que pode ser devido ao efeito hemodinâmico ou pelo fato de que a aorta abdominal de coelhos diminui gradualmente abaixo na bifurcação aórtica e dessa forma, a aorta mais distal pode ter mais lesão em relação à aorta proximal (JOHNSTONE et al., 2001). Mudanças

ateromatosas com 08 semanas em coelhos alimentados com colesterol são formadas na aorta torácica e, então, estendem para a aorta abdominal, artéria coronária e outros vasos, predominando lesões concêntricas na aorta torácica e na porção proximal da artéria coronária (KAMIMURA et al., 1999).

1.3.2 Evolução da aterosclerose em humanos

A doença aterosclerótica quando clinicamente manifesta progride rapidamente, com conseqüências fatais, logo é fundamental a abordagem preventiva na história natural das doenças cardiovasculares, sendo a prevenção um caminho viável, pois estudos epidemiológicos como os de Framingham, o MRFIT, nos Estados Unidos e o PROCAM na Europa (ASSMANN et al., 1998), já demonstraram

claramente a importância dos fatores de risco para o desenvolvimento da aterosclerose e suas complicações e têm identificado fatores de risco que podem ser modificáveis e que levam a redução do risco cardiovascular (GORDON et al., 1981;

PETER et al., 1998; NEATON et al., 1981; ASSMANN et al., 1998; NCEP, 2002;

BERTOLAMI, M; BERTOLAMI, A, 2006). A importância da redução dos níveis de colesterol e LDL-C elevados na etiologia da doença arterial coronária (DAC) na prevenção tanto primária quanto secundária desta doença já está bem documentada, assim como também níveis elevados de HDL-C relacionados à proteção cardiovascular, tanto na prevenção primária quanto secundária(CASTELLI, 1986; CONSENSUS, 2002; GRUNDY et al., 2004), pois, estudos indicam que o HDL

(CASTELLI et al., 1986) e apesar da escassez de estudos que avaliem o benefício

da manutenção dos triglicerídeos abaixo de 150mg/dl, todas as diretrizes aconselham a redução e manutenção como uma medida de prevenção cardiovascular, particularmente nos diabéticos, onde a hipertrigliceridemia em geral se associa a LDL-C pequena e densa e a redução do HDL-C, constituindo uma dislipidemia aterogênica (DUCKWORTH et al., 2009).

O consumo de dietas ricas em ácidos graxos monoinsaturadas (ácido oléico) e poliinsaturados, em substituição a gorduras saturadas, assim como também a dieta rica em fitosteróis e fibras exercem efeitos fisiológicos sobre humanos,

reduzindo os níveis plasmáticos de colesterol (REBOLLO et al., 1998; TURATTI et al., 1985; DE ANDELIS, 2001; MAGALHÃES;CHAGAS; LUZ, 2002; FEIO et al.,

2003; HU, 2003; OPAS, 2003).

1.4 CONSIDERAÇÕES SOBRE A EUTERPE OLERACEA (AÇAÌ)

O Brasil é o maior produtor, consumidor e exportador do açaí, bebida símbolo do país, rica em gorduras mono e poliinsaturadas, em fitosteróis e fibras, produzida a partir dos frutos do açaí. A bebida extraída da fruta é normalmente comercializada à temperatura ambiente ou então na forma congelada (MENEZES; TORRES; SABAA-SRUR, 2008). A Euterpe oleracea (açaí) é uma fruta típica da região

Amazônica largamente consumida no Brasil e exportada para muitos países da Europa, Ásia e Américas. Estudos químicos revelam que a Euterpe oleracea é rica

em antocianinas e em vários polifenóis (DEL POZO- INSFRAN; BRENES; TALCOTT, 2004; RODRIGUES et al.,, 2006; METENS-TALCOTT et al., 2008; CHIN,

2008; SANTOS, 2008). Alguns estudos demonstram que promove melhora da função endotelial além de aumentar a biodisponibilidade do óxido nítrico e a liberação do fator hiperpolarizante derivado do endotélio (ROCHA et al., 2007).

Apresenta na sua composição ácidos graxos de boa qualidade (60% monoinsaturado e 13% poliinsaturado), e é também rico em fibras e vitamina E (EMBRAPA, 2006). Recentemente, alguns benefícios da Euterpe oleracea no perfil lipídico foram demonstrados num estudo envolvendo ratos hipercolesterolêmicos (DE SOUZA et al., 2010). Apesar de todos esses aspectos interessantes, seus

O açaí ocorre predominantemente na região Norte, e entre os estados mais valorizados produtores de açaí podemos citar o Pará, o Maranhão, o Amapá, o Acre e Rondônia, sendo o primeiro, responsável por 95% da produção, calculada em 100 a 180 mil litros/dia em Belém (HOMMA; FRAZÃO, 2002; OLIVEIRA et al., 2002;

MENDES, 2003). Atualmente sua expansão econômica, já atinge novos mercados, no próprio país (sudeste) e até mesmo em alguns países da Europa, Estados Unidos, Japão e China (SOUTO, 2001; SILVA, 2002).

O açaizeiro (Euterpe oleracea)

destaca-se na rica floresta amazônica, como sendo a palmeira mais produtiva desse estuário, tanto em frutos como em gêneros derivados, sendo o fruto o principal produto oriundo da palmeira. Faz parte da família das palmáceas (MENEZES; TORRES; SABAA-SRUR, 2008). Esta palmeira brasileira é uma

planta que se desenvolve próxima aos ribeirões, rios, igapó, várzea e nas matas de terra firme, e com menos freqüência, em terrenos mais afastados e locais pantanosos (figura 2). É uma palmeira delgada e alta que pode atingir uma altura de 20 a 25 metros. O açaizeiro apresenta farta perfilhação e alcança, no estado nativo, cerca de 20 palmeiras por "touceira" (das quais pelo menos três em produção). Cada touceira produz entre 6 e 8 cachos com 2,5 kg cada um, representando de 15 a 20 quilos de frutos por palmeira (em duas safras) e de 12 a 25 toneladas de frutos/ano. Os troncos são lisos, roliços, longos, de cor clara, sem espinhos. A palmeira do açaí apresenta folhas grandes, compridas e recortadas em tiras, de cor verde-escura, atingindo até 2 metros de comprimento. As folhas são usadas na cobertura das casas (MATTOS, 1993). A frutificação mais intensa do Euterpe oleracea é de outubro a janeiro (MENEZES; TORRES; SABAA-SRUR, 2008).Os frutos são pequenos, redondos, roxos, quase pretos e agrupados em

Figura 2: Palmeira do açaí

cachos pendentes. Tem um caroço grande e polpa muito fina (figura 3). O fruto é colhido subindo-se na palmeira com o auxílio de um trançado de folha amarrado aos pés (a peçonha).

O principal produto oriundo do fruto é uma bebida de consistência pastosa, denominada açaí. A consistência pastosa da bebida é devido aos elevados teores de

amido (9,30%) e pectina (0,67%) encontrados na parte comestível do fruto. São necessários cerca de 2,5 quilos de frutos maduros para a produção de um litro de suco de açaí. De cor arroxeada, a bebida é

assim extraída: colocam-se os caroços do açaí de molho na água para amolecer a casca fina que os reveste, em seguida os caroços são amassados com certa quantidade de água e com o auxilio de pequenas despolpadeiras (Figura 4), originando assim o extrato de açaí (Figura 5), seu armazenamento se faz em pequenos sacos plásticos lacrados. (EMBRAPA, 2006).

No Estado do Pará existe um consumo extremamente elevado desta bebida que é rica em fibras, fitosteróis, ácidos graxos mono e poliinsaturados e antioxidantes (DEL POZO-INSFRAM; BRENES; TALCOTT, 2004). Segundo Rogez, o açaí possuí, em grande quantidade, o mesmo corante presente nas uvas, a antocianina e, segundo o pesquisador, um litro de açaí médio (entre a consistência fina e grossa) contém 33 vezes mais antocianina que um litro de vinho tinto

“francês”. Na região, esta fruta é muito consumida sob a forma de “suco” ou “vinho”,

sorvetes, cremes, geléias e etc. (ROGEZ, 2000).

Alguns estudos sugerem vários benefícios à Euterpe oleracea (açaí), dentre

eles podemos citar a sua ação vasodilatadora, anti-hipertensiva, antiinflamatória, sua ação na redução dos fatores de risco e nas desordens metabólicas como sugeriu

Figura 4: Açaí sendo despolpado

Oliveira, que realizou um estudo em que induziu a síndrome metabólica em ratos e observou que no grupo alimentado com a Euterpe oleracea houve uma redução da

Síndrome metabólica (de OLIVEIRA et al., 2010). Um estudo realizado por Udani,

também observou redução nos fatores de risco para síndrome metabólica ao alimentar 10 adultos que apresentavam sobrepeso, com 100g de Euterpe oleracea

ao dia por um período de 30 dias e observou que ocorreu redução dos níveis dos marcadores de risco selecionados para síndrome metabólica (UDANI, et al., 2011).

Noratto também sugeriu uma possível ação anti-inflamatória da Euterpe oleracea

num estudo realizado em que observou uma inibição da expressão das moléculas de adesão e da atividade do NF-kB, por diminuírem a proteína ICAM-1 e a PECAM - 1 (NORATTO et al.,2011).

Apesar de possuir um alto teor de gordura, 66% destas gorduras são monoinsaturadas, que são gorduras benéficas ao organismo porque diminuem os níveis de colesterol LDL e ajudam a aumentar os níveis de colesterol HDL, auxiliando, assim, na proteção do sistema cardiovascular (HORTON;

KUTHBERT;SPADY, 1993; SESSIONS; SALTER, 1995). Segundo as

recomendações nutricionais atuais o perfil ideal é 50% de ácidos graxos monoinsaturados, máximo de 33% de ácidos graxos saturados e 17% de poliinsaturados. No açaí temos a seguinte proporção de gorduras: 60% de gorduras monoinsaturadas, 13% poliinsaturados e < 3% de saturadas. (EMBRAPA, 2006; NEPA-UNICAMP, 2006).

O açaí contém 60% de ácido oleico, 22% de ácido palmítico, 12% de ácido linoléico e quanto aos fitosteróis um número recente do Journal of Agricultural and Food Chemistry, publicou uma pesquisa realizada com 12 voluntários saudáveis que consumiam o suco de açaí diariamente. De acordo com a pesquisadora responsável, Dra. Susanne Talcott, o açaí é pobre em açúcares e em sua visão, os benefícios são tantos que a fruta pode ser considerada uma "mistura de vinho tinto e chocolate". O estudo conduzido na Univesidade do Texas conseguiu mostrar que os antioxidantes (antocianinas e vitamina C) do açaí são muito bem absorvidos, o que pode contribuir para a prevenção de muitas doenças e condições como o câncer, os problemas cardiovasculares e o envelhecimento precoce (DEL POZO-INSFRAN; PERCIVAL; TALCOTT, 2006). Outros estudos, também referem importantes propriedades antioxidantes da Euterpe oleracea (METENS-TALCOTT et al., 2008;

O açaí em si é uma fruta de grande valor energético e rico em valores nutricionais e até mesmo funcionais, então a sua ingestão deve ser o mais natural possível e em substituição a pequenas refeições. pois, como vimos na constituição do açaí a concentração de fibras alimentares totais é notavelmente elevada (em torno de 30g/100 g de matéria seca), lipídios totais em torno de 48g / 100g e as antocianinas em torno de 1.28 g em 1 litro de açaí do tipo médio, ou seja 1% da matéria seca. As fibras têm um papel muito importante na regulação do transito intestinal, sendo sua ingestão diária recomendada de cerca de 35g / adulto. A população do Pará consome esta fruta diariamente e em grande quantidade, portanto, atingindo facilmente essa cota, pois 1 litro de açaí do tipo médio contém 31,5 g de fibras alimentares totais, o que corresponde a 90% da recomendação diária, podendo o açaí realmente ser considerado uma excelente fonte de fibras e de lípides, pois, representam cerca de 90% das calorias contidas nessa bebida. Logo, o consumo de açaí permite assegurar um bom aproveitamento em ácidos graxos mono e poliinsaturados, de antioxidantes (flavonóides) e também de proteínas (12,6 g em 1 litro de açaí médio), sendo o valor nutricional muito semelhante ao do ovo (EMBRAPA, 2006). O Açaí é também uma importante fonte de fitoesteróis e apresenta a seguinte proporção: Sitosteróis (78%), stigmasterol (6.5%), campesterol (6.0%), avenasterol (6.5%) e colesterol (2.0%). (LUBRANO; ROBIN; KHAIAT, 1994; LEEDES; HUSSAIN, 1998; SILLBERBERG, 2000; COOK-FULLER, 2000; ROGEZ, 2000; RODRIGUES et al., 2006; SCHAUSS et al., 2006; PACHECO-PALENCIA;

MERTENS-TALCOTT; TALCOTT, 2008; CHIN et al., 2008; METENS-TALCOTT et al., 2008).

Segundo Rocha, o Euterpe oleracea Mart. melhora a função endotelial,

provavelmente por aumentar a vasodilatação endotélio dependente, assim como a biodisponibilidade do óxido nítrico e do fator de hiperpolarização derivado do endotélio (ROCHA et al., 2007).

Recentemente, foram relatados alguns benefícios do Euterpe oleracea nos

biomarcadores do estresse oxidativo e no perfil lipídico de ratos hipercolesterolêmicos induzidos experimentalmente (de SOUZA et al., 2010). Em

2. OBJETIVOS

Gerais:

Avaliar os efeitos da Euterpe oleracea (açai) na aterosclerose induzida

experimentalmente.

Específicos:

Analisar as modificações induzidas pela Euterpe oleracea (açai) no perfil

lipídico e desenvolvimento de aterosclerose, no modelo de coelhos induzido por

dieta rica em colesterol.

Examinar as modificações na síntese e absorção de colesterol, pelas

quantificações plasmáticas de desmosterol e dos fitosteróis (campesterol e

3. MÉTODOS

3.1 Desenho Experimental

O estudo foi constituído por 30 coelhos, da raça Nova Zelândia, brancos, machos, com cerca de três meses de idade e peso entre 2,5 – 3,0 Kg, que permaneceram os primeiros 15 dias em adaptação. Após este período inicial foram coletados 10 ml de sangue total para as dosagens laboratoriais basais, sendo então a ração normal consumida anteriormente substituída por uma ração enriquecida com colesterol a 0,5%, para indução de hipercolesterolemia e desenvolvimento de aterosclerose, por um período de 12 semanas. Após novas determinações laboratoriais e verificação dos níveis de colesterolemia, os animais foram aleatoriamente alocados em dois grupos, o grupo I (açaí) e o grupo II (controle). Os animais de ambos os grupos passaram a receber dietas enriquecidas com colesterol a 0,05%, para indução de hipercolesterolemia moderada, mas diferenciadas como descritas a seguir:

 Grupo I – Dieta hipercolesterolêmica (0,05% de colesterol)+ 80 ml de açaí/dia + água

 Grupo II – Dieta hipercolesterolêmica (0,05% de colesterol) + água

1º coleta de sangue - laboratório basal

Dieta hipercolesterolêmica

( 0,5% de colesterol) 12 semanas

2º coleta de sangue: Glicemia Lipidograma

Randomização dos Animais

15 coelhos Grupo Controle

15 coelhos Euterpe oleracea

Ração + 0,05%

colesterol +água Ração + 0,05% CT Euterpe oleracea _{12 semanas} 12 semanas

3 coelhos

morreram coelhos 12 controle

15 coelhos Eut.. oleracea excluído

3ª col. de sangue : Glicemia, Lipidograma e Fitosteróis

Sacrifício dos animais, retirada das aortas e coloração pelo Sudam III

Análise Histopatológica das Aortas - Avaliação macroscópica

- Aval. extensão lesões ateromatosas - Avaliação microscópica

- Aval. histológica por microsc. óptica - Estudo Imuno-histoquímico

- Estudo Histopatológico

3.2 Animais

Os animais foram adquiridos da empresa Criex Cunicultura Ltda / Mogi das Cruzes - São Paulo e durante todo o período do estudo foram alojados no biotério do laboratório de cirurgia experimental da Universidade Federal do Pará, localizado no "Hospital Universitário João de Barros Barreto", mantidos em gaiolas individuais (50 x 50 cm), de ferro galvanizado e pintadas, dispostas lado a lado, com fundo removível, para que não tivessem contato com seus dejetos, sendo higienizadas diariamente. A temperatura local foi mantida constante em torno de 22ºC, com ciclo de luz claro-escuro de 12 h, receberam água à vontade e ração peletizada Nuvilab cobaias (Nuvital, Brasil) nos primeiros 15 dias de adaptação. Posteriormente, como indicado em nosso protocolo, a ração foi enriquecida com colesterol 0,5% nas primeiras 12 semanas e 0,05% nas 12 semanas finais de forma similar em ambos os grupos. Este trabalho foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa animal da Universidade Federal do Pará sob o número 002/2006.

Todos os dias pela manhã foram recolhidas as sobras de ração do dia anterior, que era pesada para controle da ingestão de colesterol; foi realizado também o controle da ingestão de açaí por animal, diariamente. Os animais foram pesados mensalmente e o consumo de ração também foi controlado mensalmente.

3.3 Dieta

A ração oferecida aos coelhos (Nuvilab Cobaias Nuvital, Brasil) apresentava a seguinte composição: milho integral moído, farelo de alfaia, farelo de soja, farelo de trigo, calcário calcítico, fosfato bicálcico, cloreto de sódio e vitaminas A, B, C, D, E, K, microelementos minerais e aminoácidos (DL- metionina).

Durante os primeiros 15 dias de adaptação a ração foi oferecida livremente e se calculou a média da quantidade diária consumida por cada coelho que era cerca de 100 g ao dia.

máquina industrial de moer carne formando, como produto final, pequenos pellets

que foram colocados em uma estufa industrial a 60ºC, por 24 h, para secagem. Após o preparo, a ração foi separada em porções individuais de 100 g, para uso diário, sendo então colocada em sacos plásticos lacrados. Os animais foram pesados mensalmente e o consumo de ração controlado diariamente.

3.4 Indução de Hipercolesterolemia

A hipercolesterolemia foi induzida por meio de uma dieta hipercolesterolêmica preparada na proporção de 0,5 g de colesterol em pó para 100 g de ração (0,5%); o colesterol foi obtido junto a empresa Sigma-Aldrich Brasil Ltda, representante exclusivo da Sigma Corporation (Sigma C8503, EUA). Após o preparo, a ração foi separada em porções individuais de 100 g, para uso diário, sendo então colocada em sacos plásticos lacrados. Após 12 semanas de dieta hipercolesterolêmica para o desenvolvimento de aterosclerose, os coelhos foram aleatoriamente designados para compor dois grupos, o grupo I (açaí) e o grupo II (controle). O açaí foi fornecido aos coelhos com base nos estudos realizados anteriormente por CONSTANTINIDES,1960; FANI,1987; JORGE, 1997; IHARA, 2001.

3.5 Euterpe oleracea (Açaí)

A Euterpe oleracea foi obtida da região amazônica (Estado do Pará, Brasil). O

ml/dia, puro sem acréscimos de água ou qualquer outra substância, durante 12 semanas.

3.5.1 COMPOSIÇÃO QUÍMCA DA EUTERPE OLERACEA

A composição do extrato de Euterpe oleracea é descrita na Tabela 1,

conforme dados de ROGEZ (2000).

Tabela 1: Composição Química da Euterpe oleracea

COMPOSIÇÃO UNIDADE QT. DE MATÉRIA

SECA

Matéria Seca % 15.00

Proteínas g/100 g(1) 13.00

Lipídios Totais g/100 g(1) 48.00

Gord. monoinsaturada g/100 g(1) 28.8

Gord. Poliinsaturada g/100 g(1) 6.24

Carboidratos g/100 g(1) 1.50

Frutose g/100 g(1) 0.00

Glicose g/100 g(1) 1.50

Sacarose g/100 g(1) 0.00

Fibras g/100 g(1) 34.0

Energia Kcal/100 g(1) 66.3

Cinza g/100 g(1) 3.50

Sódio mg/100 g(2) 56.9

Potássio mg/100 g(2) 932

Cálcio mg/100 g(2) 286

Magnésio mg/100 g(2) 174

Ferro mg/100 g(2) 1.50

Cobre mg/100 g(2) 1.7

Zinco mg/100 g(2) 7.0

Fósforo mg/100 g(2) 124

Vitamina B1 mg/100 g(2) 0.25

Alfa-tocoferol mg/100 g(2) 45.0

(1)Matéria seca; (2)Cálculo por diferença.

Em adição aos dados fornecidos pela EMBRAPA sobre a composição química da Euterpe oleracea (Tabela 1), quantificamos os níveis de fitosteróis da

mesma. Observamos uma concentração de 15 mg de fitosteróis por 100 g da fruta,

principalmente às custas de β-sitosterol, em nossa análise por espectrometria de massa.

3.6. PARÂMETROS AVALIADOS DO PROTOCOLO EXPERIMENTAL 3.6.1 Aspectos Laboratoriais

Para a coleta da amostra de sangue, após jejum de 12-14 horas, foram utilizados escalpes 21G (Becton Dickinson Indústrias Cirúrgicas Ltda), por meio dos quais foram colhidas amostras de sangue da artéria central da orelha dos coelhos que encontravam-se previamente imobilizados em uma caixa de contensão. Utilizou-se o EDTA (BD VacutainerTM , _{Brasil) e o fluoreto de sódio (BD Vacutainer}TM , _Brasil) como anticoagulantes. Foram colhidos 10 ml de sangue que foram centrifugados por 10 min a 3000 rpm para obtenção do soro para dosagens bioquímicas de colesterol total e do HDL-C, assim como dos triglicerídeos e glicemia. As dosagens bioquímicas foram processadas no Laboratório Paulo Azevedo

.

3.6.1.1 DOSAGENS BIOQUÍMICAS

Foi realizado um total de três coletas sanguíneas para a dosagem do perfil lipídico e glicemia dos animais, a 1ª, logo no início do estudo, para verificar o perfil lipídico basal dos coelhos, a 2ª, após as 12 semanas de indução de hipercolesterolemia, para poder se realizar a randomização dos animais e a 3ª, após as 12 semanas seguintes, no final do estudo.

3.6.1.2 MÉTÓDOS EMPREGADOS 3.6.1.3 LÍPIDES

(HDL-C) e triglicerídeos (TG). Os níveis de glicose no sangue foram dosados pelo método enzimático colorimétrico (Advia, 1650, Bayer, Japan).

3.6.1.4 QUANTIFICAÇÃO DO FITOSTERÓIS

Para a quantificação do β-sitosterol e do campesterol (marcadores da absorção do colesterol), assim como do desmosterol (precursor endógeno da síntese do colesterol) foi usada a cromatografia líquida de ultra performance (UPLC)

e espectrometria de massas (MS). Estes esteróis foram quantificados em amostras de plasma por um método desenvolvido pela Synchrophar (Campinas, SP, BRASIL). O método consiste na extração líquido a líquido, seguido pela separação no sistema UPLC e detecção com o ion APCI nascente da massa espectrofométrica operando

sobre “íon simples monitorados” para cada esterol (β-sitosterol, campesterol e

desmosterol). A extração foi realizada com uma mistura de dietil éter e hexanes (80 ∕ 20; v ∕ v) por centrifugação seguida de evaporação da camada orgânica a 50ºC sob um leve vapor de nitrogênio. O resíduo da evaporação foi reconstituído com isoproterenol e injetado no sistema UPLC (Acquity Waters Co.,Milford). O sistema MS (Quattro Premier-XE, Waters Co., Manchester) foi ajustado pela monitoração do íon simples formado pela ionização química da pressão atmosférica (APCI) do íon nascente. Os esteróis foram detectados em suas formas livres e não esterificadas;

monitoramos os íons com m ∕ z, 367.30 para desmosterol, 397.25 para β-sitosterol e 383.60 para campesterol. Os níveis dos compostos foram determinados pela

comparação da resposta pico sobre uma curva de calibração de 0.5 μg ∕ mL para 10.0 μg ∕ mL. As amostras que apresentaram altos níveis (mais do que 10.0 μg ∕ mL)

foram diluídas para comparar com os níveis de calibração.

3.7 SACRIFÍCIO DOS ANIMAIS E RETIRADA DAS AORTAS 3.7.1 Aspectos cirúrgicos do protocolo experimental

mg/kg de peso (Ketalar, Parke-Davis, EUA ) e cloridrato de xilazina 15 mg/kg de (Rompum, Bayer, EUA), por via intramuscular. A anestesia foi potencializada com éter etílico quando necessário. Sob anestesia profunda, os animais foram colocados em uma canaleta para dissecação e realizada incisão mediana toraco-abdominal, sendo obtidas amostras de sangue por punção intra-cardíaca. Em seguida, os órgãos abdominais foram rebatidos para isolamento da aorta que foi seccionada desde o arco aórtico até a bifurcação ilíaca. Foram então perfundidas por uma solução de papaverina a 12% em PBS – 37ºC, abertas longitudinalmente, presas em placas de isopor e fixadas em formol tamponado por 24horas, quando então foram retiradas do isopor e coradas pelo Sudam III, para que o conteúdo lipídico da placa fosse evidenciado.

3.7.2 ANÁLISE HISTOPATOLÓGICA DAS AORTAS

3.7.2.1 Avaliação macroscópica

Após a fixação, as aortas foram coradas com Sudam III, para que o conteúdo lipídico da placa fosse evidenciado. As aortas coradas foram analisadas comparativamente em ambos os grupos I e II, para avaliação macroscópica em relação à intensidade de presença de placas gordurosas.

3.7.2.2 Avaliação da extensão das lesões ateromatosas

3.7.2.2.1 Avaliação microscópica

Foram seccionados nove fragmentos de aproximadamente 5 mm cada, sendo três do arco aórtico, três da aorta torácica e três da aorta abdominal.

3.7.2.2.2 Avaliação histológica por microscopia óptica

Estes fragmentos foram embebidos em parafina e obtidos cortes de 4 µm. A histomorfometria foi realizada em cortes histológicos corados por Verhoeff para melhor identificar os limites entre a camada média e a íntima da artéria (SILVA, 2002). As imagens obtidas em um aumento de 6,5 x foram capturadas com auxílio de uma vídeo-câmera Sony CCD-IR15 (Sony, Japão) conectadas a um microscópio Olympus BX-40. As imagens foram então digitalizadas e transmitidas a um microcomputador, e com a utilização de um programa para morfometria, IMAGE TOOL FOR WINDOWS VS 3.0 ( The University of Texas Health Science Center in

San Antonio UTHSCSA, EUA), foi mensurada então a maior altura das placas (µm), as áreas das camadas íntima e média (mm2_{) e calculada a relação} íntima-média(I/M).

3.7.3 Estudo imuno-histoquímico

temperatura ambiente. Posteriormente, os cortes foram então incubados com a solução do complexo estreptoavidina-peroxidase na concentração de 1:100 (Strept ABComplex, Dako, Dinamarca) por uma hora, seguida de lavagens em PBS. A revelação foi realizada com substrato cromógeno 3,3 diamino-benzidina (DAB) (Sigma, A3648) 0,06% em PBS acrescido de 100 µL de H2O2 30% (Merck, Alemanha). Após, os cortes foram lavados em água corrente, contracorados com Hematoxilina de Harris e montados em Entellan (Merck-Alemanha). As imagens capturadas foram inicialmente tratadas no programa Corel Photo-paint 9 (Corel,

EUA), afim de se isolar as áreas positivamente coradas pela reação de imuno-histoquímica. As áreas positivas foram determinadas utilizando-se novamente o programa de morfometria citado anteriormente (ENGELMAN, 2001).

De acordo com este programa determinou-se a área marcada positivamente pela reação imuno-histoquimica e a área da íntima na mesma imagem, calculando-se a percentagem de área da íntima ocupada por macrófagos ou células musculares lisas.

3.7.4 Estudo Histopatológico

Foram analisados os aspectos histopatológicos da placa para a caracterização do seu estágio evolutivo nos fragmentos obtidos da aorta, em cortes de 4 µm corados por HE, sendo avaliados os seguintes parâmetros: maior ou menor celularidade, matriz extracelular, presença de cristais de colesterol, formação de capa fibromuscular com colágeno e células musculares lisas, desestruturação da camada média junto à limitante elástica interna (LEI), desestruturação da camada média junto à limitante elástica externa (LEE) e processo inflamatório na adventícia.