Os objectos prototípicos da relação espacial

TABLE DES MATIERES

MATERIEL ET METHODES EXPERIMENTALES

I. Dosage des activités enzymatiques. 37 1.1. Dosage de l’activité InsP3 3-kinase 37 1.2. Dosage de l’activité InsP3 5-phosphatase 38 II. Séparation de protéines par électrophorèse sur gel. 38

II. 1. Gel SDS/polyacrylamide 38 11.2. Coloration à l’argent inverse 38 11.3. Régénération de l’activité InsP3 3-kinase 39 III. Western blotting et immunodétection de PInsP3 3-kinase. 39 IV. Mutagénèse dirigée avec oligonucléotide muté. 40 V. Purification des enzymes native et recombinante. 42 VI. Chromatographie liquide à haute performance. 43 VI. 1. Digestion à l’a-chymotrypsine 43 VI.2. HPLC en phase inversée 43 VI. 3. Microséquençage 44 VII. Méthodes classiques de biologie moléculaire. 45 VII. 1. Réaction en chaîne à la polymérase (PCR) 45 VII.2. Sous-clonage d’un fragment d’ADN dans un vecteur 46 VII.3. Transformation de bactéries par l’ADN 46 VII.4. Préparation d’ADN simple brin 47 VII.5. Préparation d’ADN double brin plasmidique 47 VII.6. Détermination d’une séquence d’ADN 48

37

MATERIEL ET METHODES EXPERIMENTALES

I. Dosage des activités enzymatiques.

I.l. Dosage de l’activité InsP^ 3-kinase

Ce dosage permet de mesurer le nombre de moles d’InsP4 formées à partir d’une concentration connue d’InsP3 par unité de temps (min) et par unité de volume de préparation enzymatique (ml) ou par mg de protéines (pour mesurer l’activité spécifique). Le principe consiste à séparer les différents inositols phosphate générés durant la réaction enzymatique en fonction de leur charge sur une colonne échangeuse d’anions (Takazawa et coll., 1988).

Pour ce faire, un aliquot (5 pl) de la préparation enzymatique diluée dans le tampon de dilution enzymatique (84 mM Hépès/NaOH pH 7.4, 1 mg/ml de BSA et 12 mM 2- mercaptoéthanol) est incubé durant 8 min à 37°C dans un volume final de 50 pi dans un tampon d’incubation de composition suivante: 84 mM Hépès/NaOH pH 7.4, 1 mg/ml de BSA, 1 mM ATP, 20 mM MgCl2, 12 mM 2-mercaptoéthanol, ImM EGTA, 1500 cpm/tube de [^H]InsP3 (NEN) et 10 pM InsP3 non marqué (Boehringer). La concentration en InsP3 (0 à 20 pM) ou en ATP (0-20 mM) est variable pour les mesures de la vitesse enzymatique en fonction de la concentration en substrat. Pour doser l’activité dans les conditions de stimulation par le complexe calcium/calmoduline, l’incubation est effectuée en présence de 0.1 pM calmoduline et de 0.98 mM CaCl2 de manière à ajuster la concentration en calcium libre à 10 pM. Le 2,3-biyphosphoglycérate (2.5 à 7.5 mM) est ajouté à ce milieu d’incubation lors du dosage enzymatique sur des préparations présentant encore une activité InsP3 5- phosphatase, cette dernière étant inhibée par le 2,3-bwphosphoglycérate.

La réaction est arrêtée par 3 ml d’une solution 0.1 M HCOOH/0.4 M NH4COOH. Le volume total est déposé sur 0.5 ml d’une résine échangeuse d’anions Dowex AG-1X8 (BioRad) sous forme formate. Ainsi, après élution des InsP, du phosphate inorganique et des InsP2, nous éluons les InsP3 par 20 ml d’une solution 0.1 M HCOOH/0.7 M NH4COOH. Enfin, rinsP4 formé est élué par 5 ml d’une solution 0.1 M HCOOH/1.2 M NH4COOH. Les différentes fractions sont ensuite comptées en présence de 10 ml du liquide scintillant Instagel.

1.2. Dosage de Tactivité InsP^ 5-phosphatase

38

Ce dosage permet de mesurer le nombre de moles d’InsP2 formées à partir d’une concentration connue d’InsP3 par unité de temps (min) et par unité de volume de préparation enzymatique (ml) ou par mg de protéines (pour mesurer l’activité spécifique).

Le principe est le même que celui décrit pour le dosage de l’activité InsP3 3-kinase si ce n’est que l’incubation se fait en présence de 50 mM Hépès/NaOH pH 7.4, 20 mM MgCl2, 1 mg/ml de BSA, 12 mM 2-mercaptoéthanol, 1500 cpm/tube de [^H]InsP3 et 30 pM InsP3 non marqué. Une élution sur 0.25 ml de résine Dowex en présence de 5 ml d’une solution 0.1 M HCOOH/0.4 M NH4COOH suivie de 5 ml d’une solution 0.1 M HCOOH/0.8 M NH4COOH permet de séparer l’InsP2 et l’InsP3 respectivement (Erneux et coll., 1989).

II. Séparation de protéines par électrophorèse sur gel.

II.l. Gel SDS/polyacrylamide

L’électrophorèse sur gel de polyacrylamide en présence de dodécylsulfate de sodium (SDS) permet de séparer les protéines en jouant sur le rapport de leur charge à leur masse moléculaire pendant l’application d’un champ électrique à un mélange de protéines.

Nous préparons 63 ml d’une solution dégazée constituant le gel de migration (8% ou 10% polyacrylamide BioRad, 375 mM Tris/HCl pH 8.8, 0.1% SDS). La polymérisation du gel est catalysée en présence de 35 ;iil de TEMED et 210 jjI de 10% persulfate d’ammonium (BioRad). Les échantillons sont déposés en présence de 62.5 mM Tris/HCl pH 6.8, 5% 2- mercaptoéthanol, 2.3% SDS et 10% glycérol sur un gel de concentration (36 ml d’une solution 4% polyacrylamide, 125 mM Tris/HCl pH 6.8, 0.1% SDS, 36 jul de TEMED, 120 jjI de 10% persulfate d’ammonium). La migration est effectuée à 250 V durant 3 à 4 h. dans un tampon d’électrophorèse (25 mM Tris, 0.192 M glycine, 0.1% SDS).

II.2. Coloration à l’argent inverse

Les protéines séparées dans le gel d’électrophorèse peuvent être colorées en présence de nitrate d’argent (Merril et coll., 1982).

Le gel est agité dans une solution 50% méthanol, 12% acide acétique durant au moins 2 h. afin de fixer les protéines dans le gel. Il est ensuite lavé en présence de 40% glutaraldéhyde

39 pour 30 min puis dans 10% éthanol, 5% acide acétique durant 2 fois 15 min. Après 12 min dans une solution 0.1% bichromate de potassium et 0.015 % acide nitrique, le gel est mis en présence de 0.0205% nitrate d’argent durant 18 min. Il est abondamment rincé dans de l’eau pendant 1 min et l’image du gel est révélée en présence de 3% carbonate de sodium, 0.0185% formaldéhyde en 5 à 10 min sous forte agitation. La coloration est arrêtée dans une solution 3% acide acétique, 5% glycérol.

II.3. Régénération de l’activité InsP^ 3-kinase

Nous avons constaté d’un point de vue empirique qu’il était possible de régénérer l’activité InsP3 3-kinase après séparation des protéines par électrophorèse sur gel SDS/polyacrylamide (Takazawa et coll., 1989). Ce comportement n’est pas unique et s’observe par exemple pour une enzyme du métabolisme du Ptdins, la Ptdins 4-kinase (Saltiel et coll., 1987). Cette méthode facilite la localisation et l’identification de l’enzyme sur un gel de protéines.

La méthode a été optimalisée lors de la purification de l’InsP3 3-kinase native de plaquettes sanguines humaines. Elle est décrite dans la section concernant les résultats au niveau de l’article III.A.

III. Western blotting et immunodétection de l’InsP3 3-kinase.

Après séparation des protéines par électrophorèse sur gel SDS/polyacrylamide (8% ou 10%), celles-ci sont transférées sur une membrane de nitrocellulose (Schleicher & Schuell) durant 16 h. à 60 V et à 4°C (Towbin et coll, 1979). Les différents sérums immuns ou préimmuns de lapin sont dilués 500 à 2000 fois. Après avoir incubé la membrane en présence du sérum, les complexes immuns sont détectés par l’utilisation d’immunoglobulines G (dressées contre les antigènes de lapin) couplées à la phosphatase alcaline (Promega) et par la méthode colorimétrique correspondante (Kincaid, 1988).

L’immunoprécipitation de l’activité InsP3 3-kinase par les sérums de lapin est décrite dans la section concernant les résultats au niveau de l’article III.A.

Mulant oligonucleotide ---

N---O

\

I

Figure M.l. Méthode de mutagénèse dirigée par Sayers & Eckstein.

L’oligonucléotide muté est hybridé à l’ADN simple brin correspondant au vecteur M13 contenant l’insertion à muter. L’oligonucléotide sert d’amorce pour une réaction de polymérisation (en présence de dCTPaS) et de ligation. L’ADN double brin est purifié sur nitrocellulose et clivé par l’endonucléase Ncil au niveau du brin non muté. Cette enzyme ne présente pas la capacité de cliver de l’ADN phosphorothioate. Ces sites de clivage sont la cible de l’exonucléase III afin de digérer le brin non muté. Une dernière réaction de polymérisation et de ligation permet d’obtenir un ADN muté sur les deux brins. Des bactéries adéquates sont alors transformées par ce dernier afin de sélectionner les clones mutés.

40

rv. Mutagénèse dirigée avec oligonucléotide muté.

Nous avions le choix entre plusieurs stratégies en vue de l’obtention de mutants ponctuels de l’enzyme. Une méthode souvent rencontrée dans la littérature consiste en l’amplification par une réaction en chaîne à la polymérase (PCR) d’une région de l’ADN complémentaire codant pour la protéine. La PCR est effectuée à l’aide de deux amorces synthétiques dont l’une contient la mutation désirée. Ayant ajouté des sites de restriction adéquats au sein des deux amorces, le fragment issu de la PCR est ensuite sous-cloné au sein du reste de la séquence non mutée de l’ADN complémentaire considéré. Malheureusement, l’activité polymérase utilisée dans la PCR risque d’engendrer l’apparition d’autres mutations non désirées au sein du fragment amplifié. De plus, cette méthode nécessite la présence de sites de restriction adéquats pour le sous-clonage à proximité du site que nous voudrions muter, ce qui n’était pas toujours notre cas.

Nous avons choisi une autre méthode qui n’était pas utilisée dans le laboratoire et qui était susceptible de permettre la production de mutants avec une haute efficience. Il s’agit d’une méthode dont le principe a été développé par Sayers et Eckstein. Elle est décrite à la figure M.l (Sayers et coll., 1988a,b). Les réactifs nécessaires sont vendus par Amersham.

Les différentes étapes de cette méthode sont décrites ci-dessous, en mentionnant les modifications apportées à la procédure préconisée par Amersham:

1 ) Hybridation de l’oligonucléotide muté

L’ADN simple brin correspondant au vecteur M13mpl8 contenant l’insertion codant pour rinsP3 3-kinase A (de cerveau de rat) est préparé en grande quantité après infection de la souche bactérienne DH5aF’ ou TGI. Un aliquot de 10 ug de cet ADN est hybridé avec 5 pmol de l’oligonucléotide synthétique muté durant 30 min à 37°c après une dénaturation de 5 min à 70°C. Plusieurs tentatives de mutagénèse au départ de 1 à 5 jig d’ADN simple brin ont échoué, probablement en raison des pertes de matériel occasionnées au cours des étapes qui sont décrites ci-après.

L’oligonucléotide synthétique est phosphorylé au préalable en position 5’ par la T4

polynucléotide kinase (5 U) durant 30 min à 37°C. Il est constitué de 30 bases et est choisi de manière à contenir une première mutation provoquant le changement d’acide aminé désiré, ainsi qu’une seconde mutation n’affectant pas la séquence en acides aminés mais générant ou détruisant un site de restriction à proximité de la première mutation. Cette seconde mutation permettra un criblage rapide d’un grand nombre de clones susceptibles de présenter les mutations. Les différents oligonucléotides sont synthétisés sur phase solide selon la méthode

41 de Merrifield par un synthétiseur d’ADN/ARN Applied Biosystems modèle 392 (Merrifield et coU., 1982).

2) Polymérisation et ligation du second brin

Après son hybridation, l’oligonucléotide sert comme amorce pour la polymérisation et la ligation du brin complémentaire en présence du fragment de Klenow (10 U) et de la T4 DNA ligase (15 U) à 15°C durant 24 h. Il y a ainsi synthèse d’un hétéroduplex où seul le brin nouvellement synthétisé contient les mutations.

Il est important de préciser à ce stade que le mélange de nucléotides nécessaire à la réaction de polymérisation contient les quatre nucléotides (dNTP), sauf le dCTP qui est remplacé par le thionucléotide dCTPaS (avec un groupement phosphorothioate en position a) pour un motif expliqué en 4.

3) Purification de l’ADN double brin

L’échantillon est mis en présence de 0.6 M NaCl et déposé sur une petite colonne contenant un double filtre de nitrocellulose. Après centrifugation à 500 g durant 10 min, l’ADN double brin nouvellement formé est élué alors que l’ADN simple brin reste accroché au filtre. Les filtres sont lavés en présence de 500 mM NaCl. L’ADN double brin est ensuite précipité en présence de 0.1 volume de 3 M acétate de sodium (pH 5.2) et de 2 volumes d’éthanol froid (- 20°C). Après 30 min à -80°C, une centrifugation de 30 min à 16000 g permet d’obtenir un culot d’ADN qui est ensuite séché sous vide.

4) Clivage sélectif du brin non muté par l’endonucléase Ncil

L’enzyme de restriction Ncil reconnaît un site de restriction nucléotidique (CCCGG) qui fait intervenir des liens internucléotidiques C-C sur un même brin. Mais, comme c’est le cas pour certaines autres enzymes de restriction, elle est incapable de cliver un brin où le dCTP est remplacé par un dCTPaS. Ainsi, dans notre cas, une incubation de l’ADN double brin en présence de Ncil durant 90 min à 37°C va permettre de cliver sélectivement le brin ne contenant pas les mutations. Nous avons vérifié au préalable que la région de séquence correspondant à l’oligonucléotide muté ne présente aucun site de restriction pour Ncil.

5) Digestion du brin non muté à l’exonucléase III

Les sites de clivage par Nci I représentent des sites d’attaque pour l’exonucléase III qui dégrade l’ADN double brin dans la direction 3’ vers 5’ à partir d’extrémités 3’ libres. Dans notre cas, seul le brin non muté, clivé par Ncil au préalable, sera digéré. Les conditions de digestion à l’exonucléase III (50 U durant 30 min à 37°C, soit 100 bases par minute) ont été

42 choisies de telle manière à digérer au moins la séquence non mutée sur base de laquelle l’oligonucléotide a été synthétisé. En effet, le site Ncil le plus proche du polylinker du vecteur M13mpl8 où est inséré l’ADN complémentaire ne se situe qu’à quelques centaines de bases du site d’insertion EcoRI.

6) Repolymérisation et ligation

Le second brin muté est ensuite polymérisé et ligué en présence de DNA polymérase I (3 U) et de T4 DNA ligase (2 U) durant au moins 25 h. à 16°C pour obtenir un homoduplex. Au cours de cette réaction, aucun des nucléotides ne présente de groupement phosphorothioate.

Cet ADN double brin muté est alors transformé dans la souche bactérienne DH5aF’ ou XLl-Blue, après s’être rendu compte que la souche TGI n’offrait pas une efficience de transformation suffisante.

7) Sélection des clones mutés

Après transformation, l’ADN double brin de plusieurs dizaines de clones (pour chacune des mutations) est isolé et digéré avec les enzymes de restriction adéquates afin de sélectiormer les clones mutés. En effet, ces clones présentent une carte de restriction particulière comparée à celle du clone sauvage, étant donné que les oligonucléotides utilisés présentent au moins une mutation générant ou détruisant un site de restriction unique.

Après avoir déterminer les conditions optimales à chacune des étapes de la méthode, 30% à 60% des clones suivis présentaient les mutations désirées. L’insertion des clones mutés, codant pour des InsP3 3-kinases mutées, est alors sous-cloné au sein du vecteur d’expression procaryote pBluescript qui permettra l’expression des protéines mutées dans Escherichia coli.

V. Purification des enzymes native et recombinante.

A la fin de notre travail de thèse, nous avons déterminé les conditions optimales pour la purification de l’activité I11SP3 3-kinase native à partir de plaquettes sanguines humaines. La purification est réalisée en une seule étape et avec un rendement élevé sur une coloime d’affinité de calmoduline-sépharose (Gibco). Nous avons ainsi tiré profit de l’interaction de l’enzyme avec le complexe calcium/calmoduline. Nous avons également utilisé cette étape chromatographique afin de purifier en une seule étape 2.2 mg d’enzyme recombinante pure au départ d’un litre de culture de bactéries Escherichia coli. La procédure expérimentale et les

Expression de l’enzyme recombinante dans un système procaryote

V

purification de l’enzyme sur calmoduline-sépharose (mg de protéine pure)

V

marquage de l’enzyme par le phénylglyoxal marqué

V

digestion à la chymotrypsine

séparation des peptides par HPLC

V

purification du peptide marqué par HPLC

V

microséquençage du peptide

Figure MJ. Procédure suivie pour identifler une arginine modifiée de manière covalente par le phénylglyoxal au niveau de l’lnsP3 3-kinase.

43 précautions prises durant la purification sont détaillées dans les sections reprenant les articles correspondants (voir Résultats II.A et III.A).

VI. Chromatographie liquide à haute performance.

Nous avons utilisé la chromatographie liquide à haute performance (HPLC) en phase inversée afin de purifier avec une haute résolution des peptides issus de la digestion complète par l’a-chymotrypsine de l’enzyme purifiée marquée par modification chimique au [^^C]phénylglyoxal. La purification de ces peptides a permis leur séquençage. La procédure est décrite à la figure M.2.

VI. 1. Digestion à l’a-chymotrypsine

Après marquage radioactif de l’enzyme recombinante purifiée, nous avons vérifié par électrophorèse sur gel SDS/polyacrylamide suivie d’une coloration des protéines à l’argent que les conditions de précipitation de l’enzyme à l’acide trichloroacétique étaient optimales: arrêt de la réaction de marquage en présence de 1 ml d’une solution 10% (masse/volume) acide trichloroacétique glacée durant 15 min, ceci suivi d’une centrifugation durant 5 min à 16000 g à 4°C et du rinçage du culot à l’acétone glacé. Cette étape de précipitation précède la digestion à l’a-chymotrypsine (Sigma).

L’a-chymotrypsine est une sérine endoprotéinase qui clive du côté COOH des résidus aromatiques que sont le tryptophane, la phénylalanine et la tyrosine avec une haute spécificité. Néanmoins, elle présente également une activité protéolytique de moindre spécificité au niveau de la leucine, de la méthionine, de l’aspartate, de l’alanine et du glutamate. Cette activité à faible spécificité au niveau de la leucine et de la méthionine a d’ailleurs été rencontrée au cours de nos expériences. Sachant que le pH optimal pour l’activité chymotryptique se situe entre 7 et 9, il était crucial de vérifier le pH de la solution 8

M urée/0.4 M NH4HCO3 (pH 8.0) dans laquelle était resuspendu le culot avant digestion, vu la présence persistante d’acide trichloroacétique à un taux variable dans le culot précipité.

VI.2. HPLC en phase inversée

La séparation des différents peptides issus de la digestion chymotryptique est effectuée par HPLC dont l’élution est suivie par la mesure de l’absorbance à 214 nm (atténuation 128 sur un intégrateur Spectraphysics) en fonction du temps de rétention (min).

44 La colonne HPLC utilisée est une colonne Alltech Macrosphère dont les caractéristiques ont été choisies pour une séparation optimale de petits peptides issus d’une digestion protéolytique en vue de leur microséquençage. La phase stationnaire se présente sous forme de particules de silice de 5 ^m présentant des chaînes hydrophobes Cjg; son diamètre est de 2.1 mm (narrow bore) et sa longueur est de 25 cm.

Quant à la phase mobile, nous avons choisi d’éluer les différents peptides issus de la digestion par un gradient de 5% à 68% (volume/volume) d’acétonitrile en présence de 0.1%

de Vion-pairing agent (agent formant des paires d’ions) qu’est l’acide trifluoroacétique (TFA).

L’acétonitrile (Romil) est le solvant hydrophobe le plus couramment utilisé en HPLC en phase inversée en raison de sa faible absorption pour des longueurs d’onde entre 200 et 220

nm, sa faible viscosité et sa haute volatilité. Le TFA (Sigma) est un ion-pairing agent qui réagit avec les fonctions amines NH3'*’ des peptides et est courant d’utilisation car il offre une séparation des peptides à très haute résolution et est également très volatile. Comme le TFA absorbe de manière plus importante à 214 nm en présence d’une concentration élevée d’acétonitrile (ce qui a pour effet de générer une ligne de base montante), la concentration en TFA est diminuée de 10% dans la solution d’acétonitrile concentrée du gradient afin de compenser cette absorption. Une élution sur HPLC en absence d’échantillon est effectuée dans les mêmes conditions avant l’injection de chaque échantillon, afin de vérifier l’absence de pics parasites sur le profil correspondant à la ligne de base.

Plusieurs tentatives en partant de 10, 30 et 60 ug d’enzyme pure marquée n’ont pas permis d’obtenir un profil HPLC où le pic correspondant au peptide marqué était en quantité suffisante pour être séquencé. En partant de 120 ug de protéine, le séquençage du pic marqué a donné une séquence multiple qui n’était pas interprétable (c’est-à-dire une séquence où plusieurs résidus étaient détectés à chaque cycle de la dégradation d’Edman). C’est pourquoi, nous avons été amenés à réinjecter le pic marqué sur la même colonne HPLC en remplaçant l’acide trifluoroacétique par un autre ion-pairing agent qu’est l’acide 1-hexane sulfonique (0.1%; Sigma) dans la phase mobile. Ce dernier étant plus hydrophobe, l’interaction avec la phase stationnaire du peptide marqué et de ceux qui le contaminent est différente par rapport à l’interaction en présence d’acide trifluoroacétique. Nous avons ainsi purifié le peptide marqué, qui a dès lors pu être microséquencé de manière univoque.

VI.3. Microséquençage

La séquence du peptide modifié de manière covalente a été déterminée par dégradation d’Edman sous argon sur un séquenceur AppUed Biosystems modèle 477A (Hunkapiller et coll., 1984). Le peptide considéré est déposé sur un filtre de fibre de verre baigné au préalable en présence de polybrène. Trois cycles de lavage sont suivis par l’injection d’un échantillon standard contenant les différents dérivés phénylthiohydantoïnes (PTH), ce qui

45 permet de déterminer leur temps de rétention avant chaque réaction de séquençage. Après couplage, clivage et conversion de chacun des acides aminés N-terminaux, chaque dérivé PTH est injecté sur une colonne HPLC. Le temps de rétention sur la colonne des dérivés PTH inconnus permet ainsi de déterminer la nature de l’acide aminé N-terminal clivé. Chaque dérivé est également quantifié (pmol) par un système informatique (Apple Macintosh) et est récolté dans le collecteur de fractions interne du microséquenceur afin d’en compter la