4. O ESPAÇO DINÂMICO E A PREDICAÇÃO VERBAL
4.4. Moldes proposicionais
4.4.1. Proposta de um molde proposicional de movimento
caractérisation.
Ce travail ayant fait l'objet d'un article soumis à la publication, je n'insisterai que sur les
éléments essentiels de cette étude, le reste étant détaillé dans l'article en annexe.
i) État des données.
Une activité ATCase a été détectée en extrait brut chez l'archéon
acidothermophile Sulfolobus acidocaldarius (Van de Casteele et ai, 1997 ^).
L'activité ATCase mesurée est cependant trop faible (activité spécifique à
55°C = 0,32 unité4/ mg de protéine) pour permettre une étude détaillée de
l'enzyme. Nous avons donc entrepris de cloner le gène codant pour l'ATCase
de S. acidocaldarius afin de surexprimer l'enzyme, de la purifier et d'en
étudier les caractéristiques cinétiques et régulatrices.
ii) Clonage des gènes codant pour l'ATCase de S. acidocaldarius.
Le clonage des gènes codant pour l'ATCase de S. acidocaldarius par
complémentation d'une souche d'E. coli CôOOAATCase *6 a permis d'isoler un
fragment PstI de 6,9 kb de la banque génomique de S. acidocaldarius. Un
“Southern blot” en conditions restrictives (voir Matériels et Méthodes) a
confirmé que cet insert provenait du génome de S. acidocaldarius. La figure
28 montre la présence d'une bande de taille identique à notre insert de 6.9
kb présente dans le génome de 5. acidocaldarius coupé par Pstl.
Le fragment de 6,9 kb a été séquencé par Thia-Lin Thia-Toong et Daniel Charlier (Onderzoekingsinstituut.
COOVI et Erfelijkheidsleer en Microbiologie, VUE).
Tableau 6. Identité et similarité de différentes ATCases.
PyrB Pyrl n° accession
ref.
identity % similarity % identity % similarity %
Pyrococcus
horikoshii*
50 68 48 66 PH0720
PH0721
Kawarabayasi
et al.,1998
Archaeoglobus
fulgidus*
47 69.8 43.3 57.8 AF0106
AF0107
Klenk et
al., 1997
Methanohacterium
thermoautotrophicum
*
47 66 49 71 MTH1413
MTH850
Smith et
al., 1997
Methanococcus
iannaschii *
44.5 63.6 40 50.6 MJ1581
MJ1406
Bult et al.,
1996
Pyrococcus abyssi 43.5 60.7 43.5 60.6 U61765 Purcarea et
al., 1997
Vibrio sp. 38 54 27.6 48 Y09786 (Xu et al.,
1998)
Serratia warcescens 36 55 30 50 J05033 Beck et al.,
1989
Escherichia coli 35 53.6 30 48 K01472 Hoover et
al., 1983;
Schachman et
al., 1984
Salmonella
tvphimurium
34.3 54 29 48 X05641 Michaëls et
al., 1987
PyrB: sous-unité catalytique; Pyrl: sous-unité régulatrice.
Ce fragment Psîl contient plusieurs ORF dont deux codent effectivement
pour les éléments d’une ATCase de classe B. Les protéines codées par la
deuxième et la troisième ORF de ce fragment montrent en effet entre 27,6 et
50% d'identité pour la sous-unité catalytique (codée par le gène pyrB) et
pour la sous-unité régulatrice (codée par le gène pyrl) des ATCases de
classes-B caractéristiques des Enterobacteriaceae, des Vibrionaceae et des
archaea (Voir Introduction) (Tableau 6).
Cependant, contrairement aux ATCases des archaea actuellement connues
appartenant au domaine des Euryarchaeota, les gènes codant pour l'ATCase
de Sulfolobus acidocaldarius, représentant du domaine des Crenarchaeota,
sont regroupés en opéron avec d'autres gènes de la biosynthèse des
pyrimidines ’ ^(figure 29):
i) La protéine codée par la première ORF montre 36% d'identité avec
l'orotate phosphorybosyl transférase (codée par le gène pyrE) de la bactérie
primitive Aquifex aeoliticus, 34 à 35% d'identité avec la partie N-terminale
de l'UMP synthétase eucaryotique (qui correspond à l'activité orotate
phosphorybosyltransférase)!^ et 31 à 36 % d'identité avec leurs homologues
archéens. L’extrémité 5’ du gène pyrE ainsi que l’extrémité 3’ chevauchante
du gène pyrF (codant pour l’orotidine 5’- phosphate décarboxylase) ont été
clonées par PCR inverse par D. Charlier et T-L. Thia-Toong (communication
personnelle). Les gènes pyrE et pyrE, contrairement aux gènes pyrB, pyrl,
pyrC et pyrD, sont transcrit en sens inverse. Cette organisation n'a encore
jamais été décrite pour les gènes de la biosynthèse des pyrimidines chez
quelque organisme que ce soit. En outre, à notre connaissance, cette
organisation en opéron divergent n'a encore jamais été rapportée dans les
génomes d'archaea.
ii) La protéine codée par la quatrième ORF présente 30% d'identité
avec la dihydroorotase (DHOase; codée par le gène pyrC) d'Aquifex, entre 27
et 29% d'identité avec la partie dihydroorotase du complexe CAD
eucaryotique et entre 31 et 33% d'identité avec leur homologue archéen.
Deux familles de DHOase ont été mises en évidence sur base d'analyses
phylogénétiques (Simmer et al., 1990 b);
-d'une part, les DHOases monofonctionnelles actives (E. coli, S.
typhimurium, la DHOase encodée par le gène URA4 de 5. cerevisae)
^ ^ Les séquences des gènes pyrB, pyrl, pyrC, pyrD et pyrE sont accessibles dans les banques de données sous les
numéros d'accession suivants: X 99782, Y08309, Y12822, Y12823.
Chez les mammifères, l'activité orotate phosphorybosyl transférase (EC. 2.4.2.10) et l'activité orotidine 5'
monophosphate décarboxylase (EC. 4.1.1.23) sont regroupées en une protéine bifonctionnelle, l'UMP synthétase
(Griffith et ai, 1986).
Fig 29.Clone d'un fragment d'ADN
génomique Pstl de 6.9 kB de
Sulfolobus acidocaldarius.
1000 2000 3000 4000 5000 6000PstI
?y^ pyrD
pyrB pyrC Psfcl
pyrE
pyrB : gène codant pour la sous-unité catalytique de l’ATCase (299 aa)
pyrl : gène codant pour la sous-unité régulatrice de l’ATCase (164 aa)
pyrC igène codant pour la dihydroorotase (DHOase; EC 3.5.2.3) (355 aa)
pyrD : gène codant pour la dihydroorotate déshydrogénase (DHOdehase; EC 1.3.3.1 ) (265 aa)
pyrE : gène codant pour l’orotate phosphoribosyl transférase (OPRTase; EC 2.4.2.10) (197 aa)
-d'autre part, les DHOases soit actives {T. aquaticus) soit inactives
(ATCase de classe A de Pseudomonas, la DHOase encodée par le gène URA2
chez S. cerevisiae) formant un complexe avec l'ATCase, les DHOases
d'eucaryotes supérieurs (complexe CAD) ainsi que les DHOases d'archaea.
Ces analyses ont conduit Shepherdson et al. (1997) à proposer que les
DHOases eucaryotiques dérivent des DHOases archéennes. La DHOase de
S. acidocaldarius présente entre 27 et 29% d'identité avec les DHOases
eucaryotiques et semble donc, tout comme les DHOases des autres archaea,
appartenir à la deuxième famille. Ce résultat a été confirmé ultérieurement
par des analyses phylogénétiques (Shepherdson étal., 1997).
iii) La protéine codée par la cinquième ORF présente entre 36 et 39%
d'identité avec les dihydroorotate oxydases bactériennes (codée par le gène
pyrD), 28% d'identité avec la dihydroorotate oxydase de levure et entre 32
et 40% d'identité avec leurs homologues archéens.
La dernière ORF du fragment de 6,9 kb code pour une protéine homologue
au régulateur transcriptionnel global eubactérien Irp. Cette ORF montre, en
effet, entre 24,5 et 29% d'identité avec les protéines régulatrices
eubactériennes de la famille Irp et entre 25,8% et 30,6% d'identité avec leurs
homologues archéens issus de Methanococcus jannaschii (Bult et al., 1996)
et de Pyrococcus furiosus (Kyrpides et Ouzounis, 1995). L'abondance de
messagers codant pour cette protéine chez S. acidocaldarius (voir article en
annexe: Charlier et al., 1997) suggère en outre que celle-ci fonctionne en tant
que régulateur global de la transcription et organisateur de génome, comme
proposé pour la protéine Irp é'E. coli (Newman et ai, 1997). Les gènes de S.
acidocaldarius, de M. jannaschii et de P. furiosus codent donc pour des
activateurs transcriptionnels de type bactérien, ce qui est surprenant vu les
importantes similarités structurales et fonctionnelles entre les machineries
transcriptionnelles des archaea et des eucaryotes (voir Introduction).
iii) Analyses des séquences promotrices et de terminaison de la
transcription.
Trois sites d'initiation de la transcription ont été mis en évidence en amont
des gènes pyrE, pyrB et pyrC par élongation d'une sonde spécifique par la
transcriptase inverse (Charlier et Thia-Toong, résultats non publiés). Ces
sites sont situés à une distance de 23 à 28 bp d'une boîte-A putative
(équivalent de la boîte TATA eucaryotique, voir Introduction) (figure 30).
Les gènes pyrB et pyrl ont en commun la même boîte A de séquence "tttaaa"
proche de la séquence consensus. Par contre, la séquence de la boîte A
putative "tcaata" située en amont du gène pyrC est moins conservée. Il est
Fig.30: Clone d’un fragment d’ADN génomique Bam HIPstI de 7.6 Kb de
Sulfolobus acidocaldarius.
PS tl
BamUI
1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000
pyrD
pyrB
rF
ÆrE
TAGAATAATTTTAGCTTTAG
stop
taaattttgacaggtcaat^aaggaaattagggcaaactgcaagcctgat atg
PS tl
TAAGTTTTTATTAAGCAAAACCCTTA
stop
cat 11taacccta11taaactgaaggcaaaag
gta aaattgggataaatttgacttccgttttct
actttae atataattttagactaaccttatttaagggcgtta ttg
gaaatt tatattaaaatctgattggaataaattcccgcaat aac
Promoteurs et sites de terminaison putatif de l’opéron pyr de Sulfolobus acidocaldarius.
boîtes = boîte -A, lettres en gras = site de terminaison.
Le fragment cloné au cours de ce travail est un fragment Pst \-Pst I qui ne comprend pas l’intégralité
du gène pyrE, la fin de ce gène et l’extrémité 3’ du gène pyrF ont été clonés par PCR reverse par
donc probable, si on considère le fait que les gènes pyr forment un opéron,
que ce promoteur constitue un promoteur secondaire.
Concernant la terminaison de la transcription, une succession de
pyrimidines pouvant potentiellement servir de site de terminaison apparaît
en aval du gène pyrE mais aucune succession n'a été détectée en aval des
gènes pyrBI,pyrC etpyrD. Par contre, une succession de pyrimidines
apparaît en aval du gène Lrp ce qui suggère que le gène Lrp pourrait
éventuellement faire partie de l'opéron pyr. Aucune répétition inversée riche
en GC et aucune structure secondaire de type "stem-loop" pouvant
potentiellement servir de terminateur de la transcription chez les archaea
Wich et ai, 1986 b; Millier et ai, 1985) n'ont été mises en évidence (DNasis,
DNA-strider).
iv) Composition en acides aminés.
Afin de révéler les éléments de la structure primaire contribuant à la
thermostabilité des ATCases d'organismes thermophiles, leur composition en
acides aminés a été comparée avec celles d'enzymes issues d'organismes
mésophiles ( dont les séquences sont disponibles dans les banques de
données).
i) Chaîne catalytique:
On observe une diminution du nombre de résidus thermolabiles au niveau
de la chaîne catalytique des ATCases d'organismes thermophiles comparée à
celles d'organismes mésophiles (64% de cystéines et 38% d'asparagines en
moins); seule l'ATCase de S. acidocaldarius exhibe un contenu en asparagine
de 31% plus élevé comparé aux ATCases des organismes mésophiles. De
même, les résidus neutres sont moins abondants au niveau des ATCases
d'organismes thermophiles (46% de glutamine et 19.1% de sérine en moins).
Par contre, le contenu en résidus chargés est nettement plus élevé au niveau
des ATCases d'organismes thermophiles (33% de glutamate et 33% de lysine
en plus), seule la chaîne catalytique de l'ATCase de S. acidocaldarius se
distingue par un contenu en glutamate seulement supérieur de 7% à celui
des enzymes issues d'organismes mésophiles. En ce qui concerne les résidus
hydrophobes, nous observons une diminution du nombre d'alanines (26.5%
en moins) compensée par une augmentation du nombre d'isoleucines (27%
en plus) au niveau des chaînes catalytiques des ATCases d'organismes
thermophiles par rapport à ceUes issues d'organismes mésophiles. Enfin, les
résidus aromatiques telle la tyrosine sont plus fréquents dans l'ATCase de 5.
acidocaldarius que dans les ATCases d'organismes mésophiles (43%).
Fig. 31a : Alignement multiple de séquences de la chaîne catalytique des ATCases
issues d'organismes bactériens et archéens.
Site actif, résidus impliqués dans l'interface cl-c4 et l'interface cl-c2 dans
l'ATCase d'F. coli.
Sulac
Pyrho
Pyrab
Arcfu
Metau
Met ja
Salti
Serma
E.coli
Vibrio
Sulac
Pyrho
Pyrab
Arcfu
Metau
Met ja
Salti
Serma
E.coli
Vibrio
Sulac
Pyrho
Pyrab
Arcfu
Metau
Met ja
Salti
Serma
E.coli
Vibrio
Sulac
Pyrho
Pyrab
Arcfu
Metau
Met ja
Salti
Serma
E.coli
Vibrio
Sulac
Pyrho
Pyrab
Arcfu
Metau
Met ja
Salti
Serma
E.coli
Vibrio
1 10 20 30 40 50
--- MKHIISAYNFSRDELEDIFALTDKYSKNLNDTR—KILSGKTISIAFFEPSTRT
—MEWKGRDVISIRDFSKEDIEWLSTAERLEKEMKEKGQLEYAKGKILATLFFEPSTRT
—MDWKGRDVISIRDFSKEDIETVLATAERLERELKEKGQLEYAKGKILATLFFEPSTRT
--- VMRHLISIGDLDREDINYILKKAEEFEDVARGEKKLRILEGKILGNLFFEPSTRT
--- MFENVISIKDFKREDIEFILREAEKMEPFASGEKSSSALRGKILGMMFYEPSTRT
--- MKHLISMKDIGREEILEILDEARKMEELLNTKRPLKLLEGKILATVFYEPSTRT
MANPLYQKHIISINDLSRDDLNLVLATAAKLKANPQP--- ELLKHKVIASCFFEASTRT
MANPLYHKHIISINDLSRDDLELVLATAAGLKANPQP--- ELLKHKVIASCFFEASTRT
MANPLYQKH11SINDLSRDDLNLVLATAAKLKANPQP--- ELLKHKVIASCFFEAS TRT
MANPLFRKHIVSINDISRNELELIVKTAAKLKKQPQP--- ELLKNKVIASCFFEASTRT
..* .... . *. *.*****
60 70 80 90 100 110
YLSFQKAIINLGGDVIGFSGEESTSVAK-GENLADTIRMLNNYSDGIVMRHKYDGASRFA
RLSFESAMHRLGGSVIGFAEASTSSV-KKGESLRDTIKTVEQYSDVIVIRHPKEGAARLA
RLSFESAMHRLGGAVIGFAEASTSSV-KKGESLRDTIKTVEQYCDVIVIRHPKEGAARLA
RMSFETAMKRLGGDVINMTAQEASSIAK-GETLADTIRWSGYCDAIVIRHPLEGAARFA
RLSFETAMKRLGGDWGFADTGATSAVK-GESLADTAMMLSAYSDAIVIRHNLEGAARYI
RLSFETAMKRLGGEVITMTDLKSSSVAK-GESLIDTIRVISGYADIIVLRHPSEGAARLA
RLSFETSMHRLGASWGFSDSANTSLGKKGETLADTISVISTYVDAIVMRHPQEGAARLA
RLSFETSMHRLGASWGFADGSNTSLGKKGETLADTISVISTYVDAIVMRHPQE-GARMA
RLS FETSMHRLGAS WGFSDS ANTSLGKKGETLADTIS VISTYVDAIVMRHPQEGAARLA
RLSFETAIQRLGGTVIGFDNASNTSLAKKGETLADSISVISSYVDAFVMRHPQEGAARLA
•**••• ** *• .* *****^ ^ ** ^
120 130 140 150 160 170
SEIS-DIPVINAGDGKHEHPTQAVIDIYTINKHFNTIDGLVFALLGDLKYARTVNSLL-R
AEVA-DIPVINAGDGSNQHPTQTLLDLYTIKKEFGTIDGLKIGLLGDLKYGRTVHSLA-E
AEVA-EVPVINAGDGSNQHPTQTLLDLYTIKKEFGRIDGLKIGLLGDLKYGRTVHSLA-E
AENS-SVPVINAGDGAGQHPTQTLLDLYTIKKECGRLDGITIALMGDLKYSRTIHSLI-K
SDW-DVPVINAGDGAGQHPTQTLLDLYTMKRFFGRIGSLRVALVGDLKYGRTVHSLA-Y
SEYS-QVPIINAGDGSNQHPTQTLLDLYTIMREIGRIDGIKIAFVGDLKYGRTVHSLV-Y
TEFSGQVPVLNAGDGSNQHPTQTLLDLFTIQETQGRLDNLHIAMVGDLKYGRTVHFAKPR
SEFSGNVPVLNAGDG-NQHPTQTLLDLFTIQETQGRLSNLSIAMVGDLKYGRTVHSLT-Q
TEFSGNVPVLNAGDGSNQHPTQTLLDLFTIQETEGRLDNLHVAMVGDLKYGRTVHSLT-Q
SEFS-NVPVINGGDGSNQHPTQTLLDLFSIYETQGCLDNLNIALVGDLKYGRTVHSLA-Q
.. .*..* *** .****...*.... . . . ,***** **..
180 190 200 210 220 230
ILTRFRPKLVYLISPQLLRARKEILDELNYPVKEVEN--- PFEVINEVDVLYVTRIQKER
ALAFYD-VELYLISPELLRMPKHIVEELRERGMKIVETTKLEEVIGELDVLYVTRIQKE R
ALTFYD-VELYLISPELLRMPRHIVEELREKGMKWETTTLEDVIGKLDVLYVTRIQKER
ALALFD-MRIYLISPEALALPEDIIEDVSAEIRRAR--- LEEVISEIDVLYVTRIQKER
ALAVFG-ASMSFVSPPVLRMPDNIIHDLRRAGVEVKETERLDDVIDEVDVLYVTRIQKER
ALSLFENVEMYFVSPKELRLPKDIlEDLKAKNIKFYEKESLDDLDDDIDVLYVTRIQKER
TLAKFSGNRFYFIAPDALAMPQYILDMLDEKGMAWSLHGSIEEVMADVDILYMTRVQKER
ALAKFEGNRFYFIAPDALAMPAYILKMLEEKGIEYSSHGSIEEWPELDILYMTRVQKER
ALAKFDGNRFYFIAPDALAMPQYILDMLDEKGIAWSLHSSIEEVMAEVDILYMTRVQKER
ALAKFSGCKFYFIAPDALAMPEYICDELDEHNVSYACYNSIEEWPEIDVLYMTRVQKER
^ ★ * ** **
*• •• • ••••••240 250 260 270 280 290
FVDEMEYEKIKGSYIVSLDLANKMKKDSIILHPLPRVNEIDRKVDKTTKAKYFEQASYGV
FPDEQEYLKVKGSYQVNLKILENVKDSLRIMHPLPRVDEIHPEVDKTKHAIYFKQVFNGV
FPDEQEYLKVKGSYQVNLKVLEKAKDELRIMHPLPRVDEIHPEVDNTKHAIYFRQVFNGV
FPDEEEYRKVSGSYRITAETLKSAKDSMIVMHPLPRVDEIHPSVDSTKHARYFQQSFYGV
FPDPEEYSRIRGAYHIDGSTVA—DRDLIVMHPLPRIDEISPEVDSLPQAMYFRQAFYGV
FPDPNEYEKVKGSYKIKREYVE—GKKFIIMHPLPRVDEIDYDVDDLPQAKYFKQSFYGI
LD-PSEYANVKAQFVLRP-DLNGARENMKVLHPLPRIDEITTDVDKTPHAWYFQQAGNGI
LD-PSEYANVKAQFVLAA—DLAGAANLKVLHPLPRIDEIATDVDKTPHAYYFQQAGNGI
LD-PSEYANVKAQFVLRASDLHNAKANMKVLHPLPRVDEIATDVDKTPHAWYFQQAGNGI
FD-ETEYQHMKAGFILSASSLKHAKDNLKVLHPLPRVDEIAVDVDKTPYAYYFQQAENGV
ii) Chaîne régulatrice:
La sous-unité régulatrice des ATCases issues d'organismes thermophiles
présente un faible contenu en résidus thermolabiles avec 92% de glutamines
en moins comparé à celles des organismes mésophiles. Concernant le
contenu en résidus chargés, on observe une augmentation du taux de
glutamate et de lysine au niveau des ATCases des organismes thermophiles
(38 et 37% respectivement) qui est compensé par une diminution en
aspartate et en histidine (33 et 49.3% respectivement). Certains résidus
hydrophobes comme l'isoleucine et la méthionine sont abondants (27 et 44
% en plus) au niveau des chaînes régulatrices des organismes thermophiles.
alors que l'on observe un contenu en résidus hydrophiles plus faible
comparé aux enzymes d'organismes mésophiles (38% sérine et 27% de
thréonine en moins); seule l'ATCase de S. acidocaldarius exhibe un contenu
en thréonine de 32% supérieur aux contenus des ATCases des autres
organismes thermophiles.
v) Alignement des séquences de l'ATCase de S. acidocaldarius
avec des ATCase d'enterobactéries et d'archaea.
Des alignements de séquences des sous-unités catalytiques et des sous-unités
régulatrices de S. acidocaldarius avec celles issues d'autres archaea.
d'entérobactéries et d’une bactérie psychrophile Vibrio sp. ont été réalisés.
a) Sous unités catalytiques:
L'alignement des sous-unités catalytiques révèle que tous les résidus du site
actif de l'ATCase d'E. coli sont parfaitement conservés ainsi que la majorité
des résidus impliqués dans des interactions aux interfaces cl-c4 (élaboration
de la structure quaternaire) (figure 31a).
On note néanmoins quelques modifications au niveau de l'interface cl-c4:
-l'acide aspartique 271 est remplacé par une asparagine au niveau des
interfaces de l'ATCase de 5. acidocaldarius.
-la proline 237 conservée dans les enzymes issues des entérobactéries
et des archaea méthanogènes {Methanococcus jannaschii et
Methanobacterium thermoautotrophicum) est remplacée par un glutamate
dans les enzymes des autres archaea et du Vibrio sp.
-l'alanine 241, conservée dans les enzymes issues des entérobactéries,
n'est conservée ni chez les archaea, ni chez Vibrio sp.
Contrairement aux résidus impliqués dans les interactions cl-c4, les résidus
impliqués dans les interactions cl-c2 sont peu conservés chez les enzymes
issues des archaea. Néanmoins, les trois interactions arginine-carbony 1
essentielles au niveau de l'interface cl-c2 de l'ATCase é'E. coli sont
conservées (Arg 269 - Asp 90; Arg 54 - Glut 86; Arg 65 - Asp 100) seule
310
Sulac
Pyrho
Pyrab
Arcfu
Metau
Met ja
Salti
Serma
E.coli
Vibrio
PVRMSILTKIYGE---
PVRMALLALVLGVI---
PVRMAILSEVML---PVRMALLRLLISERRGSENQKIV
PVRMAILKKLIEDNEGE---
FAAQALLAIiVLNSELSL---FAR- S ALAL WNADL
AL---
FARQALLALVLNRDLVL---
YAREALLALVLNATIEG---300
Fig. 31b; Alignement multiple de séquences de chaînes régulatrices d'ATCases issues
de bactéries et d'archaea.
Résidus impliqués dans la liaison de l'ATP ou du CTP. Cystéines impliquées dans
la liaison de l'atome de Zinc dans l'ATCase d'E. coli.
Sulac
Pyrho
Pyrab
Arcfu
Metau
Met ja
Serma
Salti
E.coli
Vibrio
Sulac
Pyrho
Pyrab
Arcfu
Metau
Met ja
Serma
Salti
E.coli
Vibrio
Sulac
Pyrho
Pyrab
Arcfu
Metau
Met ja
Serma
Salti
E.coli
Vibrio
1 10 20 30 40
---
meIQGNRKELMVSKIKNGTVIDHIPAGRAFAVLNVLGIKGHEG
--- MPELKVSAIKEGTVIDHIPAGKGLKVIEILGLSKLSN
--- MAELKVSAIKEGTVIDHIPAGKGLKVIEILKLGKLTN
--- VRELWSKIKEGTVIDHINAGKALLVLKILKIQPGTD
MKGNRGCPFPIQRQIIRGMDMKKPFELRVKPIKNGTVIDHITANRSLNVLNILGLPDGRS
--- MIPMEELKVKKITNGTVIDHIDAGKALMVFKVLNVPKETS
--- MTHDNKLQVEAIKCGTVIDHIPAQIGFKLLTLFKLTATDQ
--- MTHDNKLQVEAIKCGTVIDHIPAQVGFKLLSLFKLTETDQ
--- MTHDNKLQVEAIKRGTVIDHIPAQIGFKLLSLFKLTETDQ
---MKSNHMQVEAICNGYVIDHIPSGQGVKILRLFSLTDTKQ
* * * *****
50 60 70 80 90
-FRIALVINVDSKKMGKKDIVKIEDKEISDTEANLITLIAPTATINIVREYEWKKTKLE
GGSVLLAMNVPSKKLGRKDIVKVEGKFLSEEEVNKIALVAPTATVNIIRNYKWEKFKVE
GGAVLLAMNVPSKKLGRKDIVKVEGRFLSEEEVNKIALVAPNATVNIIRDYKWEKFKVE
-LTVSMAMNVPSSKMGKKDIVKVEGMFIRDEELNKIALISPNATINLIRDYEIERKFKVS
—KVTVAMNMDSSQLGSKDIVKIENRELKPSEVDQIALIAPRATINIVRDYKIVEKAKVR
---VMIAINVPSKKKGKKDILKIEGIELKKEDVDKISLISPDVTINIIRNGKWEKLKPQ
—RITIGLNLPSNELGRKDLIKIENTFLTEQQANQLAMYAPKATVNRIDNYEWRKLTLS
—RITIGLNLPSGEMGRKDLIKIENTFLTEEQVNQLALYAPQATVNRIDNYDWGKSRPS
—RITIGLNLPSGEMGRKDLIKIENTFLSEDQVDQLALYAPQATVNRIDNYEWGKSRPS
—RVTVGFNLPSHDGTTKDLIKVENTEITKSQANQLALLAPNATVMIIENFKVTDKHSLA
. . *. * **..*.* . ....* *.*. . *
100 110 120 130 140 150
VPKWKGILKCPNPYCITSNDVE-AIPTFKTLTEKP-LKMRCEYCETIIDENEIMSQILGANNK
VPEVIEGILKCGNPNCITNY—EYVTTKFYVISKNP-LKVRCHYCERTMEEEEILANL---
VPDVIEGILRCGNPNCITNH—EYVTTKFYVISREP-LKVRCHYCERTMEEEEILANL---
PPEWEGVLKCPNHACISNAEREPITPKFYIKTEEMRATARCHYCGRKIENLDNYIS---
LMDEVRGILRCPNPNCITNSD-EGVENRFYVISEEP-VLLRCYYCERLIEADEIESQF---
IPDEIEGTLKCTNPNCITNK—EKVRGKFKIESKNP-LKIRCYYCEKFLNEVIFE---
LPDHIDGVLTCPNGNCISRS—EPVRSSFSVKSRGGEVHLKCRYCEKEFEHQWLQAD---
LPERINNVLVCPNSNCISHA—EPVSSSFAVKKRANDIALKCKYCEKEFSHYWLAN---
LPERIDNVLVCPNSNCISHA—EPVSSSFAVRKRANDIALKCKYCEKEFSHNWLAN---
LPKEVENVFPCPNSNCITHG—EPVISSFTIKMIKGNIGLKCKYCEKTFSKEIVTAQV---^ ir ic "kLa numérotation est basée sur les séquences codant pour l'ATCase d'B. coli.
Sulac : Sulfolobus acidocaldarius', Pyrho ; Pyrococcus horikoschii', Pyrab : Pyrococcus
abyssi; Arcfu ; Archaeoglobus fulgidus} Metau : Methanobacterium thermoautotrophicum;
Metja : Methanococcus jannashii; Salti ; Salmonella tiphimurium; Serma ; Serratia
maritima} E.coli; E. coli: Vibrio: Vibrio sp.
l'arginine 65 est remplacée par une asparagine dans l'ATCase de S.
acidocaldarius.
On note également que:
-le glutamate 37 et la lysine 40, bien conservés dans les enzymes issues
des entérobactéries, de Vibrio sp. et des archaea du genre Pyrococcus (P.
furiosus et P. abyssi), ne sont pas conservés dans les enzymes des autres
archaea.
-l'aspartate 75 n'est conservé que dans les enzymes issues des
entérobactéries et des méthanogènes.
-l'histidine 41 et l'asparagine 78 conservées dans les enzymes
d'entérobactéries et de Vibrio sp., ne sont pas conservées dans les ATCases
d'archaea, l'histidine 41 étant remplacée par une glycine,
b) Sous unités régulatrices:
Un alignement des sous-unités régulatrices a révélé que la majorité des
résidus impliqués dans la liaison des effecteurs nucléotidiques à l’ATCase
é'E. coli sont conservés (figure 31 b). Cependant, le glutamate en position 9
est remplacé par une lysine ou par une sérine dans les enzymes issues
d'archaea méthanogènes et des autres archaea; l'alanine 10 n'est conservée
qu'au niveau des enzymes issues des entérobactéries, de Vibrio et des
archaea du genre Pyrococcus et la leucine 58, résidu spécifiquement
impliqué dans la liaison de l'ATP, est remplacée par une isoleucine chez
l'ensemble des ATCases d’archaea.
Cet alignement révèle également que les 4 cystéines impliquées dans la
liaison de l'atome de Zinc nécessaire à l'association des sous-unités
catalytiques et régulatrices sont toujours conservées.
vi) Sous-clonage des gènes codant pour l'ATCase de
S. acidocaldarius dans E. coli.
Deux sous-clonages ont été réalisés:
i) le gène pyrB codant pour les sous-unités catalytiques a été amplifié par
PCR et cloné dans le vecteur pTRC99A sous le contrôle d'un promoteur
inductible à l'IPTG. Cependant, les sous-unités catalytiques exprimées dans
E. coli n'étant pas thermostables (voir § II, xa), leur expression a également
été effectuée dans la levure par clonage du gène pyrB dans le vecteur pYX222
sous le contrôle d'un promoteur fort de levure.
ii) le gène pyrB et le gène pyrl, codant pour la sous-unité régulatrice, ont
également été tous deux clonés dans le vecteur pTRC99A. L'activité
spécifique de l'ATCase à 55°C atteint 45,8 +/- 9,1^0 unités/mg de protéine
20 SD= V[Ix2 - (Ix)2/n] / (n-1); n=6
c'est-à-dire environ 144 fois plus que l'activité spécifique observée dans
l'hôte natif.
vii) Estimation du poids moléculaire des sous-unités catalytiques
et régulatrices de l'ATCase issue de S. acidocaldarius.
Un gel d'électrophorèse en conditions dénaturantes a été utilisé pour
estimer le poids moléculaire des deux sous-unités de l'ATCase exprimées
dans E. coli. Après thermodénaturation 15 min à 85°C d'un extrait brut d'£.
coli contenant les gènes pyrBI, apparaît une bande de poids moléculaire
36.6 kD c'est-à-dire proche du poids moléculaire de la sous-unité catalytique
calculé sur base de la séquence (34 kDa). Les sous-unités régulatrices, non
visibles à faible concentration en protéine (étant plus petites, leur révélation
au bleu de Coomassie est plus délicate), ne peuvent pas être distinguées à
plus forte concentration car une série de bandes de poids moléculaires
proches de celui de la sous-unité régulatrice estimé sur base de la séquence
(17,911 kDa) apparaissent.
Pour visualiser clairement les sous-unités régulatrices, différents extraits ont
été réalisés:
a) un extrait brut d'E. coli contenant les gènes pyrB et pyrl
b) un extrait brut d'E. coli contenant le gène pyrB
c) un extrait brut d'E. coli contenant le vecteur pTRC99A
Les extraits sont thermodénaturés à 60°C 2i et déposés sur gel. Une bande
correspondant à un poids moléculaire de 18,2 kDa apparaît alors
uniquement au niveau de l'extrait provenant du clone pyrBI. ■
viii) Test d'induction à l'IPTG.
Afin de déterminer les conditions optimales d’induction de la production
d’ATCase, de l’IPTG (0,4 mM) a été ajouté à une culture de la souche
recombinante en phase exponentielle (D.O. 0,5) et en milieu riche (plus 50
|ig /ml d’ampicilline). Des prélèvements sont effectués à différents
intervalles de temps et l’activité ATCase est mesurée.
L'addition d'IPTG provoque un arrêt net de la croissance. La période
d'induction optimale par l'IPTG est de 3 heures, où l'activité spécifique est
2.5 fois plus élevée dans les cellules induites que dans les cellules non
induites (voir table ci-dessous).
La thermodénaturation ne dépasse pas 60°C car les sous-unités catalytiques seules (clone pyrB) sont instables
à plus haute température voir § x,a
Activité spécifique*
Temps d'induction + IPTG -IPTG
non induit 1.5 1
30 min 3.12 1.59
1 h 4.73 1.94
2h 4.63 1.83
3h 5.73 2.3
4h 3.31 2.9
*Dosage ATCase à 37°C en présence de tampon Tris HCl pH 8.5, 20mM Aspartate et
2mM CP.
ix) Purification de l’ATCase de 5. acidocaldarius exprimée dans
E. coli:
La purification de l'ATCase de S. acidocaldarius est réalisée à partir d’une
culture de la souche recombinante d'E. coli contenant le gène pyrB et le gène
pyrl sous le contrôle du promoteur inductible à l'IPTG. Aucune purification
de cette enzyme n'ayant été entreprise précédemment, la purification de
l'ATCase a nécessité un certain nombre de tests visant essentiellement à
améliorer le rendement de purification de l'enzyme, le taux de purification
étant en général bon (l'activité spécifique varie entre 1130 et 1840
unités/mg).
Mises au point d’un protocole de purification de l'ATCase de S .
acidocaldarius.
i) Premier essai de purification de l’ATCase.
Après centrifugation de 5 litres de culture, les cellules sont resuspendues
dans 25 ml de tampon phosphate 100 mM pH7,3 additionné de DNase et
d'inhibiteurs de protéase et sont soumises aux ultra-sons 6 min puis
centrifugées pendant 10 minutes à 12.000 rpm. L'extrait acellulaire est
incubé 15 minute à 85°C, centrifugé et dialysé contre du tampon Tris/HCl
20 mM pH7,3. Après dialyse, l'extrait est placé sur colonne de
DEAE-Sépharose conditionnée au préalable avec du tampon Tris/HCl 20 mM
pH7,3. L'activité ATCase est éluée par un gradient 0-0,5 M KCl dans du
tampon Tris/HCl 20 mM pH7,3. Les fractions contenant l’activité ATCase
sont rassemblées et dialysées contre du tampon Tris/HCl 20 mM pH 8,5 et
ehargées sur colonne de Mono-Q HR 10/10 (FPLC). Après élution de l'activité
ATCase par un gradient 0-0,5 M NaCl dans du tampon Tris/HCl 20 mM
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A expressão do espaço dinâmico no português : linguagem e multiculturalismo
(páginas 80-85)