Produtividades e análise qualitativa

A data da colheita foi estabelecida pelo produtor e teve lugar no dia 10 de setembro. Os frutos foram colhidos segundo as respetivas modalidades e ramos identificados, foram colhidos 20 frutos por tratamento e colocados em caixas devidamente identificadas.

A análise qualitativa teve lugar no dia seguinte na Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro, foram selecionados 15 frutos por tratamento para posteriormente serem pesados, medidos os seus diâmetros equatoriais e longitudinais (mm), determinado o seu teor de

sólidos solúveis (ºBrix), a acidez (pH), a acidez titulável, a textura e firmeza, a cor da epiderme e a percentagem de matéria seca (% MS).

O peso dos frutos foi obtido com uma balança de precisão (Kern EW2200-2NM, Balingen, Alemanha) e de seguida foi usado um paquímetro digital eletrónico (EMC, UK) (Figura 9 - a) para o registo dos diâmetros equatoriais e longitudinais (mm). Para a realização do teste da cor foi usado um colorímetro Chroma Meter CR300 (Minolta, Chiyoda, Japão) (Figura 9 - b), com este foram realizados 8 disparos por maçã no total de 15 maçãs por tratamento. A medição da coloração foi realizada utilizando o sistema L*a*b*. O parâmetro L* mede a luminosidade e varia de 100 (branco) a 0 (preto), aproximadamente como o olho avalia estas cores. O a* mede o vermelho quando positivo e o verde quando negativo, o b* mede o amarelo quando este é positivo e azul quando negativo. O ângulo hue (hº) foi calculado com arctangent (a*/b*) e expresso em graus de 0 a 360º onde 0º = vermelho, 90º = amarelo, 180 º = verde e 270º = azul. A textura e a firmeza do fruto foi obtida através do analisador de textura TA.XT.Plus (Stable Micro-System, Godalming, Surrey, UK) (Figura 10 – a) onde se utilizaram células de carga de 30 kg, foram utilizadas duas sondas cilíndricas (P6 e P2N), para se determinar a força média (N) e a percentagem de deformação num deslocamento de 15 mm e velocidade de 5 mm/s (P6) e um deslocamento de 5 mm e velocidade de 2 mm/s (P2N). O teor dos sólidos solúveis totais (SST), expresso em ºBrix, foi quantificado através do índice refratométrico (IR) com o refratómetro PR-101 (ATAGO, Tokyo, Japão), para isso as maçãs foram cortadas individualmente e trituradas com uma Trituradora Elea (Tefal, Sercelles, França) obtendo-se assim o sumo de cada maçã. A determinação da acidez foi quantificada diretamente pelo valor de pH com o potenciómetro pH Meter 3310 (Jenway, Staffordshire, UK) (Figura 10 – b). Depois destas medições juntou-se o sumo de cada 5 maçãs num gobelé e retiram-se três amostras de sumo para se determinar a acidez titulável com o Titulador Titroline easy (SCHOTT, Mainz, Alemanha) até pH 8,2 sendo NaHO 0,1N o titulante.

A percentagem de matéria seca (% MS) foi obtida através da desidratação dos frutos a 65 °C em estufas.

O teor médio em flavonóides totais foi determinado pelo método colorimétrico do cloreto de alumínio (Liu et al., 2002; Chun et al., 2004).

A partir de cada uma das amostras pesou-se cerca de 0,4 g de peso seco para microtubos (com tampa) de centrífuga com 2 mL de capacidade e adicionou-se 1 mL de metanol a 70 %. Seguidamente, as amostras foram agitadas no vortéx e colocadas numa placa de aquecimento (Thermobloc) a 75°C durante 30 minutos. Decorrido este tempo, cada uma das amostras foi a

Figura 9 – a) Paquímetro digital eletrónico (EMC); b) Colorímetro Chroma Meter CR300

(Minolta).

Figura 10 – a) Analisador de textura TA.XT.Plus (Stable Micro-Systems); b) Potenciómetro pH

Meter 3310 (Jenway).

centrifugar a 4000 rpm, 15 minutos e 4 ºC num eppendorf. O sobrenadante foi retirado para vials de vidro e armazenados a -20ºC até subsequente análise, o precipitado foi rejeitado. Após esta extração, uma alíquota de 1 mL de cada um dos extratos foi transferido para frascos de 10 mL de capacidade com tampa e rosca e adicionou-se a cada um 4 mL de água ultra-pura (Isomantle-Isopad) e 0,3 mL de 5% NaNO2 (Sigma-aldrich, Tauferkichen, Alemanha).

Agitou-se a mistura e deixou-se em repouso durante 5 minutos no escuro e à temperatura ambiente. Após este período de tempo, adicionou-se 0,3 mL 10% AlCl3 (Sigma-aldrich,

Tauferkichen, Alemanha), agitaram-se os frascos novamente no vortex e deixaram-se em repouso, no escuro e à temperatura ambiente por mais 6 minutos. Seguidamente, adicionou-se 2 mL NaOH (Sigma-aldrich, Tauferkichen, Alemanha) a 1 M e completou-se o volume de 10 mL com água ultra-pura. Homogeneizou-se a mistura e precedeu-se de imediato à leitura das absorvâncias das amostras a 510 nm contra branco (solvente de extração-metanol 70%, em vez de amostra) (Hitachi U-2000, Hitachi, Japão). A quantificação foi feita com base numa

curva de calibração previamente realizada com o padrão comercial catequina (Extrasynthese, Genay, França). Os resultados forma expressos em mg/100g peso seco.

O teor médio em açúcares totais foi determinado espectrofotometricamente segundo o método clássico do fenol-sulfúrico, adaptado de Dubois et al. (1956) com várias modificações.

A partir de cada uma das amostras pesou-se para frascos 10 mL de capacidade com rosca 5 mg de extrato seco e adicionou-se 1 mL de H2SO4 (Sigma-aldrich, Tauferkichen, Alemanha)

a 12 M. Os frascos foram colocados a 35ºC (Thermobloc, Fisher Instruments) durante 1 hora, com agitação intermitente de 10 em 10 minutos. Posteriormente, a cada uma das amostras foi adicionado 5 mL de água ultra-pura e os respetivos frascos foram colocados a 100 ºC (Thermobloc, Fisher Instruments) durante 2 horas. Seguidamente, retirou-se 1 mL de cada extrato para novos frascos de 10 mL de capacidade e adicionou-se 1 mL de reagente de fenol (Sigma-aldrich, Tauferkichen, Alemanha) a 5 % (preparado em água ultra-pura) e 5 mL de H2SO4 puro (98%). Os frascos foram agitados no vortéx e colocados em repouso à

temperatura ambiente durante 25 minutos. Seguidamente, procedeu-se à medição dos valores de absorvância a um comprimento de onda de 490 nm (Hitachi U-2000, Hitachi, Japão) contra um branco (todos os reagentes excepto amostra). A quantificação foi feita com base numa curva de calibração, previamente realizada às amostras, com uma solução padrão de glucose, com uma concentração variável entre 0 e 120 µg/mL. Os resultados finais forma expressos em mg/100 g de peso seco.

A determinação do teor médio em vitamina C em cada uma das amostras foi realizada por HPLC-DAD-UV/VIS, de acordo com o método de Hernández et al. (2006) com ligeiras modificações.

A partir das amostras iniciais, pesou-se 0,2 g de peso seco para frascos escuros. Seguidamente, a cada amostra adicionou-se 5 mL de solvente de extração, composto por 3% ácido metafosfórico (Sigma-aldrich, Tauferkichen, Alemanha), 8 % ácido acético (Sigma- aldrich, Tauferkichen, Alemanha) e 1 mm de tert-butylhydroquinone (TBHQ, 112941-100G, Sigma-Aldrich, Tauferkichen, Alemanha) (16,62 mg/100 mL). A mistura foi a homogeneizar (ultra turrax) e a centrifugar durante 2 minutos a 4000 rpm e 4 ºC. Seguidamente, cada uma dos extratos foram filtrados em Spartan 13, 0,2 µm (refª: 10436040) para vials âmbar de HPLC e imediatamente injetados no HPLC (Gilson). Todo o processo de extração bem como o posterior processo de identificação e quantificação em HPLC decorreu às escuras ou com luz muito reduzida. Assim que extraídas, as amostras foram então injetadas no sistema binário

de HPLC (Gilson), com um volume de injeção de 20 µL, equipado com uma coluna C18 (dimensão 250 × 4.6 mm, 5 μm) (ACE), um gradiente isocrático composto por uma fase móvel de 0,2 % de ácido ortofosfórico (Sigma-Aldrich, Tauferkichen, Alemanha), fluxo de 1,2 mL/minuto, temperatura da coluna de 25 ºC e uma deteção da vitamina C a 245 nm (varrimento entre 200 e 700 nm). A quantificação foi feita com base numa curva externa de calibração, utilizando o ácido ascórbico (vitamina C) (Sigma-Aldrich, Tauferkichen, Alemanha) como padrão. Os resultados finais foram expressos em µg/100g de peso seco.

O teor médio em ácidos orgânicos foi determinado por HPLC-DAD-UV/VIS pelo método de Philips et al. (2010) com ligeiras modificações.

Na primeira fase, a partir das amostras iniciais pesou-se 1 g de peso seco para frascos 10 mL de capacidade com rosca, seguido de uma adição de 10 mL de água ultra pura. Seguidamente, os frascos foram agitados no vortéx e colocados no sonicador (RK 31 H, BANDELIN electronic GmbH & Co. KG, Berlim, Alemanha) durante 5 minutos. Decorrido este período de tempo, agitaram-se as amostras novamente no vortéx e centrifugaram-se durante 15 minutos a 4000 rpm e temperatura ambiente. Após a centrifugação, cada amostra foi filtrada (Filtro whatman Nº 1) recolhendo-se o sobrenadante e rejeitando-se o precipitado. O sobrenadante foi novamente filtrado utilizando filtros Spartan 13, 0,2 µm (refª: 10436040) para vials âmbar de HPLC e imediatamente injetados no HPLC (Gilson).

Na segunda fase as amostras foram injetadas a um volume de injeção de 20 µL num sistema binário de HPLC, equipado por uma coluna ACE C18 (250 x 4,5 mm id) (ACE),

utilizando um gradiente isocrático com fase móvel composta por uma solução de dihidrogenofosfato de potássio (Sigma-aldrich, Tauferkichen, Alemanha) a 70 g/L e sulfato de amónio (Sigma-aldrich, Tauferkichen, Alemanha) a 14 g/L, com pH ajustado a 2,1 por adição de ácido ortofosfórico (Sigma-aldrich, Tauferkichen, Alemanha) a 85% (ρ20 = 1.71 g/L). O tempo de corrida utilizado foi de 20 minutos, com um fluxo de 0,8 mL/minuto, uma temperatura de coluna de 20ºC e um comprimento de onda de 210 nm. A identificação dos ácidos orgânicos foi realizada com base na comparação dos espectros cromatográficos obtidos com os respetivos padrões comerciais (Extrasynthese, Genay, França), que foram injetados previamente às amostras a uma concentração de 5 g/L. A quantificação foi efetuada com base em curvas externas de calibração para cada um dos ácidos orgânicos identificados e os resultados forma expressos em mg/100g de peso seco.