Replicação do DNA in vivo

A replicação de DNA é semiconservativa e extraordinariamente fidedigna. Inicia-se em origens fixas e geralmente é bidirecional a partir de cada origem de replicação. A média de erro é de apenas um por bilhões de nucleotídeos incorporados.

Replicação Semiconservativa de Moléculas de DNA

A estrutura em dupla-hélice e a complementaridade das bases nitrogenadas é o fundamento do processo de duplicação do DNA. Na replicação, a dupla-hélice se desenrola e os filamentos se separam, orientando a produção de uma nova fita complementar. A sequência de bases de cada fita parental serve como molde. Observe na imagem a seguir a replicação semiconservativa do DNA.

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Leia o texto Câncer e agentes antineoplásicos ciclo-celular específicos e ciclo-celular não e faça uma correlação importante sobre específicos que interagem com o DNA: uma introdução

o ciclo celular e os processos de carcinogênese e tratamentos antineoplásicos. Disponível em: <http://www.scielo.br/pdf/qn/v28n1/23048.pdf/>.

Figura 2 - Replicação semiconservativa do DNA. Cada filamento parental é conservado e serve de molde para a síntese de um novo filamento complementar.

Fonte: Snustad; Simmons, 2017, p. 214.

Cada nucleotídeo contêm uma única base nitrogenada: adenina e guanina (purinas); timina e citosina (pirimidinas). A base está ligada ao carbono 1’, o grupo fosfato ao carbono 5’ e há uma hidroxila (-OH) no carbono 3’ da desoxirribose.

DNA-polimerases são enzimas que associam os nucleotídeos na formação de uma fita simples. Essas enzimas só conseguem adicionar um novo nucleotídeo na hidroxila no carbono 3’ do açúcar anterior, catalisando ligações covalentes entre o carbono 3’ de um nucleotídeo e o grupo fosfato do carbono 5’ do nucleotídeo incorporado.

covalentes entre o carbono 3’ de um nucleotídeo e o grupo fosfato do carbono 5’ do nucleotídeo incorporado. Essa ação possibilita a formação de uma estrutura açúcar-fosfato. Nessa fita, o carbono “inicial” é 5’ do primeiro nucleotídeo. A posição nova é do carbono 3’ do último nucleotídeo (DNA é polimerizado no sentido 5’→ 3’), conforme você pode observar abaixo.

Figura 3 - Mecanismo de ação das DNA-polimerases com a extensão covalente de um filamento iniciador de DNA no sentido 5' → 3'.

Fonte: Snustad; Simmons, 2017, p. 214.

Para aprender mais sobre a replicação semiconservativa de moléculas de DNA, clique nas setas.

Na molécula de DNA dupla fita, a parte externa de pentose-fosfato das fitas complementares é antiparalela. Uma é orientada de 5’ → 3’ e a fita oposta é orientada de 3’ → 5’. Essas orientações são importantes para o processo de replicação e para o mecanismo de identificação e transcrição de genes.

A hélice de DNA possui duas fendas, sendo uma maior e a outra menor. A fenda maior tem as bases do DNA em contato com meio aquoso (com água) e com proteínas regulatórias. Essas proteínas se ligam ao DNA em fita simples (SSB, de single-stranded DNA-binding proteins), impossibilitando o reestabelecimento da ligação das duas fitas de DNA afastadas na origem da replicação. Dessa forma, servem de molde de fita simples necessário para as polimerases e proteção contra a ação das nucleases.

Na separação em fitas simples para a nova síntese de DNA, a ocorrência de superenrolamento (supertorsão) e a relevância de que as fitas são polimerizadas somente nas extremidades 3’ dos moldes das fitas, fazem com que a replicação seja um processo complexo e necessite de enzimas especiais; observe na imagem abaixo.

Figura 4 - Alongamento das fitas contínuas e descontínuas de DNA e a ação das enzimas de replicação. Fonte: Harvey; Ferrier, 2015, p. 400.

Quando rompidas as ligações de hidrogênio pela DNA-helicase, as fitas simples são separadas em dois moldes complementares. Uma curta sequência de RNA, denominada de iniciador ou primer, é sintetizada pela RNA- primase. A DNA-polimerase III pode usar a posição 3’-OH de um nucleotídeo do primer como ponto de inserção do primeiro nucleotídeo no DNA. A replicação ocorre em direções contrárias nas duas fitas-molde, formando as forquilhas de replicação. Na fita líder (leading ou contínua), na qual o molde é orientado com a extremidade 5’ próxima à forquilha de replicação, a síntese de fita nova e complementar é contínua, uma vez que são

3’-OH. Na outra fita, retardatária ( , lenta ou descontínua),

adicionados nucleotídeos na sua extremidade lagging

porém, a síntese ocorre à medida que um novo molde é aberto pela DNA-helicase com a criação de sequências de iniciadores de RNA periódicos, conhecidos como fragmentos de Okazaki (aproximadamente 1.000 a 2.000 nucleotídeos em bactérias e 100 a 200 nucleotídeos em eucariotos). Para completar a síntese, na fita descontínua, os primers devem ser removidos e seus nucleotídeos devem ser substituídos por nucleotídeos de DNA, para ligação final entre as sequências adjacentes. Nas células procarióticas, a DNA-polimerase I remove os iniciadores e insere os nucleotídeos de DNA. A DNA-ligase, como o próprio nome diz, catalisa a formação das ligações covalentes que finalizam o processo de associação de fragmentos de Okazaki.

A DNA-helicase e a RNA-primase podem se associar e formar primossomos, que separam as fitas parentais e originam primers espaçados ao longo da cadeia descontínua. O primossomo se associa a duas moléculas de DNA- uma para a fita contínua e outra para a fita descontínua (replissomo). Uma vez que a DNA- polimerase III,

polimerase da fita descontínua finaliza um fragmento de Okazaki, a mesma é libertada do molde e migra para o próximo iniciador de RNA. Mesmo parecendo preciso, o processo é passível de erros. Dessa forma, quando as enzimas envolvidas no processo falham, aumentam as chances de mutações associadas a doenças genéticas. Esses erros, porém, na grande maioria das vezes são detectados e corrigidos durante e logo após a replicação. Em bactérias há uma única origem de replicação. A replicação segue bidirecionalmente pelas forquilhas de replicação (duas) no cromossomo bacteriano circular. Nos seres eucarióticos, os cromossomos são constituídos por fitas de DNA maiores e lineares e múltiplas origens de replicação são necessárias para aumentar a rapidez do

(ver a seguir). processo

Figura 5 - Replicação do DNA: origens e forquilhas de replicação. A: Pequeno DNA circular procariótico. B: DNA eucariótico muito longo.

Fonte: Harvey; Ferrier, 2015, p. 400.

VOCÊ QUER VER?

Reforce seu entendimento sobre a replicação semiconservativa do DNA assistindo à animação . Disponível em: <

Replication fork coupling https://www.youtube.com/watch?

>.

Fonte: Harvey; Ferrier, 2015, p. 400.

Assim como nas origens de replicação procarióticas, nos eucariontes há grande proporção de bases A e T. Dessa forma, as enzimas separam com relativa facilidade essas regiões em moldes. Os eucariotos têm várias DNA- polimerases, sendo algumas aparentemente responsáveis por correção e reparo de danos de DNA. Além disso, os cromossomos dos eucariontes são lineares, por isso, há a necessidade de gerenciar a replicação nas suas extremidades. A DNA-polimerase precisa de nucleotídeo 3’-OH preexistente para adicionar o primeiro nucleotídeo de DNA no molde. Assim, não é possível replicar a extremidade 3’ inicial do cromossomo, uma vez que não existe local para a síntese de um primer (independentemente de o primer ser colocado na extremidade, a DNA-polimerase não consegue substituir os nucleotídeos de RNA mais afastados sem o 3’-OH). Dessa forma, para impedir a diminuição do DNA a cada replicação, os cromossomos eucarióticos possuem sequências repetitivas em tandem (TTAGGG) em uma região chamada de telômero em cada extremidade. Essa sequência extra do DNA é o local um para a inserção de iniciadores e, assim, é evitado o encurtamento do DNA que codifica informações genéticas.

Antes de dar continuidade aos seus estudos, o ciclo celular e a replicação do DNA, leia com atenção o texto abaixo e aprenda mais sobre o tema.

Ainda neste tópico, temos uma última dica de estudo para você, confira abaixo!

VOCÊ SABIA?

Amostras puras de regiões específicas do DNA podem ser obtidas pela manipulação do processo de replicação do DNA in vitro, como na reação em cadeia da polimerase ou PCR (do inglês, Polymerase Chain Reaction). Na reação, iniciadores (oligonucleotídeos) são preparações de aproximadamente 18 a 22 bases que flanqueiam a região a ser amplificada (sintetizados a partir de qualquer região genômica).

Durante a PCR, esses componentes são manipulados em uma solução tamponada em ciclos repetitivos de aquecimento e resfriamento que resultam na amplificação da região de interesse do DNA. Para isso, uma quantidade de DNA genômico previamente extraído é aquecida a 94 ou 95°C para desfazer as ligações de hidrogênio e separar a dupla-hélice em fitas simples. Na sequência, a temperatura é abaixada para 52°C ou 58°C (ou mais), para que ocorra a hibridização dos iniciadores nas fitas moldes.

Logo a temperatura é aumentada para 72°C, quando uma DNA-polimerase, Taq polimerase termorresistente (obtida do microrganismo Thermus aquaticus , ) realiza a extensão da nova fita (cerca de 1.000 bases) e pode tolerar altas temperaturas sem sofrer desnaturação.

Novamente a temperatura é reduzida, sendo esse ciclo de aquecimento e resfriamento repetido por muitas vezes (25 a 35), garantindo uma grande quantidade de cópias da amostra de DNA (veja a seguir).

O próximo tópico de estudo é sobre a morte celular. Fique atento!

4.1.3 Mitose

No início da mitose, os cromossomos duplicados se apresentam como filamentos duplos, conhecidos como cromátides-irmãs, intimamente associadas pelo centrômero.

Os cromossomos duplicados são encaminhados às células-filhas. Essa distribuição é organizada e executada por microtúbulos do citoesqueleto. A formação do fuso pelos microtúbulos está associada aos centros organizadores de microtúbulos (MTOC), presentes no citoplasma de células eucariontes, geralmente perto do núcleo. Em células animais, os MTOC são diferenciados em centrossomos duplicados durante a interfase. Cada centrossomo contém dois centríolos (perpendiculares). Em torno dos centrossomos surgem microtúbulos radiais denominados áster. Os centrossomos se movem até as regiões opostas das células em divisão, definindo os polos celulares.

Figura 6 - A: Fuso mitótico de uma célula em cultura. B: Micrografia eletrônica de centríolos. Fonte: Snustad; Simmons, 2017, p. 16.

O fuso é formado da mesma forma que ocorre a fragmentação de organelas membranosas como o retículo endoplasmático e o complexo golgiense. O nucléolo, corpo denso que participa da síntese de RNA no núcleo, desaparece. Porém, as mitocôndrias continuam íntegras.

O envelope nuclear se fragmenta em vesículas diminutas. Alguns microtúbulos se fixam nos cinetócoros, estruturas proteicas associadas aos centrômeros dos cromossomos duplicados. A fixação dos microtúbulos do fuso nos cinetócoros indica o início da metáfase da mitose.

Durante a metáfase, os cromossomos duplicados se deslocam até o ponto médio entre os polos. O fuso mitótico

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Acesse o link disponível em: <https://learn.genetics.utah.edu/content/labs/pcr/> e se divirta aprendendo a PCR no laboratório virtual.

Durante a metáfase, os cromossomos duplicados se deslocam até o ponto médio entre os polos. O fuso mitótico também possui microtúbulos fixados aos cinetócoros.

O deslocamento cromossômico para um plano único no meio da célula (plano equatorial) é denominado placa metafásica. Nesse estágio, cada cromátide-irmã está conectada a um polo diferente. O alinhamento polar das cromátides-irmãs é importante para a distribuição equitativa do material genético entre as células-filhas (escolha para análise citogenética).

As cromátides-irmãs se separam na anáfase por diminuição dos microtúbulos e as cromátides-irmãs são puxadas em direção aos polos celulares. Ao mesmo tempo que os cromossomos se deslocam para os polos, os próprios polos começam a se afastar. Esse movimento divide os grupos de cromossomos em espaços distintos na célula em divisão. Uma vez separados, os cromossomos se descondensam e formam a cromatina e as organelas são reconstituídas, características da telófase. Quando a mitose é finalizada, é formada uma membrana entre as células-filhas e elas finalmente são separadas, o que caracteriza a citocinese. Para aprender mais sobre o tema, confira o objeto a seguir.

Fique atento e, na sequência, aprenda sobre a meiose.

4.1.4 Meiose

A reprodução está associada a um processo que reduz à metade o número de cromossomos. Assim, o número de cromossomos de um gameta é designado pela letra n como estado haploide e os 2n cromossomos do zigoto, que se formam após a fecundação, como o estado diploide. Sendo assim, a meiose o mecanismo que reduz a célulaé

para haploide, com .

diploide metade do número de cromossomos

VOCÊ QUER VER?

Assista a divisão celular mitótica de células renais. Disponível em: <https://www.youtube.com

/>.

/watch?v=N97cgUqV0Cg

Assista também as divisões celulares de um embrião após uma fertilização in vitro. Disponível em: <https://www.youtube.com/watch?v=KkeDMhMYHlc/>.

Por fim, não deixe de revisar as fases da mitose no ciclo de células na animação. Disponível em: <https://www.youtube.com/watch?v=ofjyw7ARP1c/>.

Figura 7 - Comparação entre mitose e meiose. Fonte: Snustad; Simmons, 2017, p. 16.

Sem a meiose, o número de cromossomos dos organismos eucarióticos seria duplicado a cada geração, situação que logo se tornaria insustentável em face das limitações de tamanho e capacidade metabólica das células. As células somáticas humanas têm 46 pares de cromossomos (23 pares). Membros de um par são cromossomos homólogos que têm conjuntos iguais de genes, embora possam ter diferentes alelos desses genes (alelos são genes que ocupam o mesmo lócus de cromossomos homólogos). Já os cromossomos de diferentes pares são reconhecidos como heterólogos (veja a seguir).

Figura 8 - Os 23 pares de cromossomos homólogos presentes nas células humanas. Os pares numerados de 1 a 22 são classificados como cromossomos autossomos, já o X é um par sexual (cariótipo feminino).

Fonte: Snustad; Simmons, 2017, p. 16.

A meiose ocorre de maneira que cada uma das células haploides formadas recebe exatamente um membro de cada par de cromossomos. Na meiose há duas divisões celulares cuja sequência de eventos é: duplicação cromossômica; divisão meiótica I; e divisão meiótica II, que objetivam a redução do número diploide de cromossomos (2n) para haploide (n).

Meiose I

A primeira divisão da meiose inicia quando os cromossomos já foram duplicados; consequentemente, cada um deles tem duas cromátides-irmãs. A prófase da meiose I é dividida em cinco estágios (observe a ilustração).

Figura 9 - Meiose I em progresso. Fonte: Snustad; Simmons, 2017, p. 16.

Fonte: Snustad; Simmons, 2017, p. 16.

Leptóteno (filamentos delgados – leptonema) é o primeiro estágio da prófase I. Durante o leptóteno há condensação dos cromossomos duplicados. À medida que os cromossomos são condensados, a célula passa ao zigóteno (filamentos emparelhados – zigonema). Durante o zigóteno, os homólogos se aproximam e ocorre o pareamento num processo denominado sinapse. A sinapse forma uma estrutura de três cilindros paralelos, o complexo sinaptonêmico, que liga os cromossomos lateralmente (veja a seguir).

Figura 10 - Complexo sinaptonêmico. Fonte: Snustad; Simmons, 2017, p. 16.

Agora, clique nas interações abaixo e aprenda mais sobre o tema.

À medida que a sinapse avança, os cromossomos adquirem volumes menores por estarem ainda mais condensados no paquíteno (filamentos espessos – paquinema).

Nessa fase, é fácil ver os cromossomos pareados ao microscópio óptico. Cada par é constituído de dois homólogos duplicados, cada um deles formado por duas cromátides-irmãs.

Durante o paquíteno, os cromossomos pareados podem trocar material. Cada cromátide-irmã pode ser fragmentada durante o paquíteno e os pedaços podem ser permutados entre as cromátides.

Logo, a quebra e a reunião podem levar à recombinação de material genético entre os cromossomos pareados ( ).

crossing over

A ocorrência do crossing over é evidenciada no diplóteno (dois filamentos – diplonema), em que os cromossomos pareados se separam, mantendo estreito contato nas regiões de crossing over. Observe na figura os quiasmas entre duas das quatro cromátides da tétrade.

Figura 11 - Quiasmas em bivalente cromossômico em estágio diplóteno da prófase I da meiose. Fonte: Snustad; Simmons, 2017, p. 16.

Durante a metáfase I, cada cromossomo pareado segue em direção aos polos da célula. No fim da prófase I e durante a metáfase I, os quiasmas nos bivalentes deslizam para as extremidades dos cromossomos. Nesse fenômeno, chamado de terminalização, observa-se uma repulsão entre cada par de cromossomos. Durante a anáfase I, os cromossomos se afastam definitivamente. Essa separação, denominada disjunção cromossômica, é mediada pela ação do fuso. Quando os cromossomos separados se agrupam nos polos opostos, está concluída a primeira divisão meiótica. No próximo estágio, a telófase I, o fuso se desfaz, as células-filhas são separadas por membranas, os cromossomos são descondensados e um núcleo se forma ao redor dos cromossomos de cada célula-filha. As células produzidas por meiose I são haploides, mas ainda contêm duas cromátides-irmãs (geneticamente diferentes, uma vez que podem ter permutado segmentos cromossômicos na prófase I).

Meiose II

Na meiose II, os cromossomos novamente são condensados e se associam a novos fusos (prófase II), migrando até o plano equatorial celular (metáfase II). Seus centrômeros se dissociam e as cromátides-irmãs seguem até os polos opostos (anáfase II) numa disjunção de cromátides. Durante a telófase II, as cromátides separadas (cromossomos) se agrupam nos polos e surgem núcleos-filhos com número haploide de cromossomos. A meiose II é muito semelhante à mitose. No entanto, as células resultantes são haploides e diferentes geneticamente (na mitose as células são diploides e geneticamente iguais), conforme você pode acompanhar na figura a seguir.

Figura 12 - Meiose I em progresso. Fonte: Snustad; Simmons, 2017, p. 16.

Agora, vamos estudar sobre outro tema interessante: a formação dos gametas. Siga em frente!