Teores de proteína verdadeira, aminoácido e açúcar

A análise dos teores de proteína verdadeira, aminoácidos, aminoácidos livres totais e açúcares livres totais e a separação e dosagem dos aminoácidos livres foi realizada no Instituto de Biologia da Universidade Estadual de Campinas durante o mês de julho de 2003.

3.2.3.1. Extração de aminoácidos livres totais, açúcares livres totais e proteína verdadeira

Para extração dos aminoácidos livres totais e açúcares livres totais, aproximadamente 2 g de cada alimento foram misturados com 20 ml de MCW (metanol: clorofórmio: água), na proporção de 12:5:3, conforme Bieleski & Turner (1966). Após 24 h, o extrato foi centrifugado a 2.500 rpm por 30 minutos e a fração sobrenadante foi recuperada em proveta. Para cada 4 ml dessa fração, acrescentou-se 1,0 ml de clorofórmio e 1,5 ml de água. Após agitar-se a mistura vigorosamente, a mesma foi deixada em repouso por 24 h, para que houvesse a separação das fases. A fase de clorofórmio inferior foi descartada e a fase aquosa superior foi retirada com o auxílio de pipeta Pasteur, submetida ao banho-maria a 38o_{C por cerca de 15 h (para a eliminação} do resíduo de clorofórmio e concentração das amostras) e centrifugada a 14.000 rpm/5 min. Após esse período, mediu-se o volume e congelou-se a amostra, para posteriores dosagens (Figura 2).

Para a extração de proteína utilizou-se o método de Sousa & Sodek (2002), onde o primeiro precipitado obtido foi ressuspenso em 10 ml de NaOH 0,1 N, homogeneizado com o auxílio de bastão de vidro, ficando em repouso por 24 h. Após esse período o extrato foi centrifugado a 2.500 rpm/30 min e o sobrenadante, contendo a fração protéica, foi coletado (Figura 2).

3.2.3.2. Dosagem do teor de açúcares solúveis totais (AST)

O método usado para dosagem de AST foi baseado em Graham & Smydzuk (1965), que consistiu em tomar 1 ml de cada amostra, de um branco (água) e dos padrões (15 -150 g de glicose/ml), em tubos de ensaio mantidos em banho de gelo. Em seguida adicionou-se a cada tubo de ensaio 3 ml de solução de antrona (0,15% em H2SO4 concentrado) resfriada, cobrindo-os com bolinhas de vidro. Após 15 minutos os tubos foram agitados e incubados em banho-maria a 90o_{C durante 20 minutos.} Terminada a incubação, os tubos foram transferidos para um ambiente escuro até atingir

a temperatura ambiente e novamente agitados. A densidade ótica (D.O.) dos padrões e amostras foi medida a 620 nm contra o branco.

A determinação de proteínas seguiu a metodologia estabelecida por Bradford (1976), utilizando-se como reagente 100 mg de coomasie brilliant G dissolvido em 50 ml de etanol 95%, ao qual foi acrescentado 100 ml de H3PO4 85% p/v, completando-se o volume com água para 1 litro e filtrando-se, posteriormente, a vácuo, em papel de filtro. Em seguida foi pipetado 0,1 ml do branco (água), amostras e padrões (10-100 g

Figura 2: Esquema da metodologia utilizada para extração dos aminoácidos, açúcares solúveis totais e proteína.

material (2 g) extração em MCW (20 ml/24 h) centrifugação (2.500 rpm/30 min.) sobrenadante precipitado cada 4 ml + 1 ml de clorofórmio + 1,5 ml de água repouso (24 h) fase clorofórmio (descartada) fase aquosa Aminoácidos

Açúcares solúveis totais

NaOH 0,1N (10 ml/24 h) centrifugação (2.500 rpm/30 min.) repouso (24 h) sobrenadante (proteína)

de O-Bis trimetylsilylacetamido - BSA) para tubos de ensaio e adicionados 5,0 ml do reagente de Bradford. Os tubos foram agitados para determinar a D.O. das amostras e padrões a 595 nm contra o branco.

3.2.3.4. Separação de aminoácidos livres por cromatografia líquida de alta resolução (CLAE)

A separação de aminoácidos livres por CLAE foi realizada pelo método da fase reversa, utilizando-se os derivados do o-fitaldialdeído (OPA), conforme Jarret et al. (1986). O aparelho de CLAE utilizado era constituído por 2 bombas (A e B) da marca LKB modelo 2150, controladas por um gerador de gradiente da marca LKB modelo 2152.

Os solventes utilizados para a formação do gradiente foram:

 Tampão da bomba A: tampão fosfato (CH3COONa 3H2O + Na2HPO4 7H2O) pH 7,25 a 50 mM, + 20 ml/L de tetrahydrouran + 20 ml/L de metanol específico para HPLC;

 tampão da bomba B: metanol específico para HPLC 65% em H2O.

Ambos os tampões foram deaerados e o tampão A foi filtrado a vácuo, em filtro Millipore, através de membrana PVDF, com 0,45 µm de diâmetro.

A taxa de fluxo foi fixada a 0,8 ml/min e o gradiente (Figura 3) foi gerado da seguinte forma:

 20-60% de B entre 0-24 min;  60-75% de B entre 25-31 min;  75-100% de B entre 31-61 min.

Figura 3: Perfis de eluição de derivados OPA-aminoácidos do padrão Sigma AAS-18, enriquecido com Asn, Gln e Gaba, em coluna cromatográfica Spherisorb ODS-2 (4,6 mm X 250 mm) por HPLC. Taxa de fluxo - 0,8 ml/min;  exc. -250 nm;  em. - 480 nm; tampão A - Na2HPO4 50 mM pH 7,25; tampão B - metanol 65%; gradiente - 20 a 100% de B em 61 min.

Para preparação do reagente OPA, foi diluído 50 mg de OPA em 1 ml de metanol específico para HPLC e misturado a 6,5 ml de tampão borato pH 9,5 (ácido bórico 2,4% p/v em H2O; pH ajustado com NaOH 2 N), filtrando-se em seguida (filtro Millipore, em PVDF de 0,22 µm). Após a filtragem, foram acrescentados 5 µl de mercaptoetanol a 625 µl da mistura.

Para cada 20 µl da amostra (filtrada em membrana PVDF, 0,22 µm, da Millipore ou padrão, em eppendorf) juntou-se 60 µl do reagente OPA agitando-se manualmente. Após 2 minutos, tempo suficiente para formar os derivados aminoácidos-OPA, injetou- se 10 µl dessa mistura na câmara de injeção de amostra do aparelho de CLAE. Em seguida foi iniciada a corrida cromatográfica, por meio da eluição da mistura em gradiente de 2 tampões (A e B), bombeados pelas bombas A e B do aparelho, através da coluna cromatográfica (Waters Spherisorb ODS-2; 5 µm, 4,6 mm X 250 mm, da

SUPELCO INC.). Ao passar pela coluna cromatográfica, os derivados aminoácidos- OPA foram detectados por um monitor de fluorescência da marca SHIMADZU modelo RF-530, no qual foram fixados λ de excitação de 250 nm e λ de emissão de 480 nm. O registro da área e do tempo de retenção de cada derivado foi realizado por um integrador da marca LKB modelo 2221.

Cada aminoácido das amostras foi identificado pelo seu tempo de retenção na coluna cromatográfica, tomando-se por base o padrão de aminoácidos Sigma AAS-18, que contém 15 aminoácidos protéicos, ao qual foram adicionados os aminoácidos asparagina, glutamina e ácido γ-aminobutírico (Figura 3).

O resultado obtido em proporção de mol (mol %) foi transformado em micrograma multiplicando-se o peso molecular do aminoácido (PMaa) pela proporção de micromoles por grama de aminoácido da substância (μmoles/g) na quantidade total de aminoácidos do alimento testado. O valor total de aminoácido em cada substância foi determinado pela fórmula:

g moles mol AA g AA  %  /