Validação do Método Analítico

Os procedimentos de análise empregados para quantificar o valproato nas amostras de plasma humano, com uso da técnica de HPLC-ESI-MS/MS, foram validados de acordo com a RDC 27/2012110. A credibilidade de um procedimento bioanalítico para aplicação em um estudo de bioequivalência precisa ser validada através de alguns itens a serem observados, como estabilidade dos compostos e soluções, sensibilidade, linearidade, precisão, especificidade e reprodutibilidade.

3.4.2.1. Sensibilidade

A sensibilidade é notada pelo Limite Inferior de Quantificação (LIQ), que é a menor concentração do analito na curva de calibração110, observado do método. Os seguintes critérios devem estar presentes para sua validade: a) Carência de influência ou resposta cinco vezes mais que qualquer interferência presente em brancos nos tempos de retenção em uso; b) Curva do analito com pico identificável, observado precisão de 20%, com cálculo pelo coeficiente de variabilidade da importância quantificada para cinco alíquotas originárias de um mesmo controle padronizado, bem como da correspondente duplicata da curva de calibração em uso. c) Acurácia de 80% a 120% do valor nominal da concentração do controle padrão utilizado, bem como da correspondente duplicata da curva de calibração em uso.

3.4.2.2. Especificidade

A especificidade representa a capacidade que um procedimento possui em não proporcionar influência na resposta do analito, independentemente fonte. Empregaram-se quatro amostras de plasma de diversos voluntários, um plasma hiperlipêmico e um plasma hemolizado. Caso constatada a ausência de interferência direta no tempo de retenção da droga, metabólitos ou padrão interno, e em comparação dos cromatogramas advindos de solução aquosa do medicamento em apreciação em concentração semelhante ao limite de quantificação do método, a especificidade é comprovada.

Visando avaliação da especificidade, durante a validação pré-estudo, foram executadas diversas amostras de diferentes voluntários, sendo 4 amostras de plasma normal, 2 de plasma lipêmico branco e 2 de plasma hemolizado branco.

O LIQ regularizado foi a concentração mais baixa na qual especificidade e acurácia apresentaram-se menores a 20% e resposta de analito de ao menos 5 vezes o ruído de linha de base.

3.4.2.3. Reprodutibilidade

Realizada através da determinação da precisão e acurácia de três lotes provenientes de matrizes biológicas distintas.

3.4.2.4.Exatidão e Precisão

A exatidão é definida pela presença de concordância entre os resultados individuais e o valor utilizado como referência. Já como precisão temos a reprodutibilidade sendo idêntica ou muito semelhante apresentando os mesmos resultados de análises individuais, sendo aplicadas inúmeras vezes em mesma amostra homogênea. Eles são obtidos utilizando a quantificação de concentrações padrão distintas dos controles de qualidade CQA, CQB, CQD e CQM10_.

CQA: amostra de controle de qualidade de alta concentração: amostra de matriz acrescentada do analito em concentração entre 75 (setenta e cinco) e 90% (noventa por cento) da maior concentração da curva de calibração.

CQB: amostra de controle de qualidade de baixa concentração: amostra de matriz acrescentada do analito em concentração até 3 (três) vezes o limite inferior de quantificação do método (LIQ).

CQD: amostra de controle de qualidade de diluição: amostra de matriz acrescentada do analito em concentração acima da maior concentração da curva de calibração (LSQ), analisada por meio de método e proporção de diluição pré-definidos pelo laboratório bioanalítico.

CQM: amostra de controle de qualidade de média concentração: amostra de matriz acrescentada do analito em concentração próxima à média entre as limitações inferior e superior de quantificação.

No atual estudo, as amostras de controle de qualidade foram utilizadas para avaliação da exatidão e da precisão do método proposto. A exatidão foi definida como a percentagem de erro relativo, com a seguinte equação: RE (%)= (E-T) (100/T), tendo E como concentração determinada experimentalmente e T como concentração teórica.

Já precisão definida como o desvio padrão relativo, com a equação: RSD (%) = 100 (SD/M), tendo M é a média e SD como desvio padrão de M. A exatidão deverá estar entre a porcentagem de 85 a 115 de concentração nominal; já a precisão deve ser inferior a 15%, excetuando-se LIQ.

3.4.2.5.Linearidade

Definida pela probabilidade de o método apresentar resultados proporcionais à concentração do analito, em que sua avaliação se dá pela linearidade da curva de calibração utilizada. Observam-se as seguintes características para tanto: 1) Ao mínimo quatro de seis padrões de cada concentração nominal apresentando desvio menor do que 15% da concentração nominal em pelo menos uma das duplicatas, incluso LIQ e padrão de maior concentração; 2) Coeficiente da correlação de curva igual ou maior que 0.98.

Neste estudo foi estabelecido uma regressão linear com procedimento dos quadrados mínimos e um índice de peso de 1/x foi buscado sobre as razões da área de pico de valproato de sódio e padrão interno versus concentrações de valproato de sódio em oito padrões de calibração de plasma (2, 10, 20, 30, 40, 50, 65, 80 ng/mL) em duplicata, visando a geração de curvas de calibração. Ademais, duas amostras foram realizadas em duplicata, assegurando a inexistência de interferências (1 amostra de branco de plasma e 1 amostra de plasma branco espiculada apenas com o padrão interno). O coeficiente de correlação deve ser maior do que 0,98.

3.4.2.6. Estabilidade dos compostos

A estabilidade dos compostos é analisada em decorrência do espaço temporal indispensável para que as amostras sejam preparadas e do armazenamento ambiental, neste caso temperatura, utilizado. Utilizam-se duas concentrações diversas para serem dosadas e que passarão por testes abaixo mencionados:

- Estabilidade no auto injetor: Através de momento temporal semelhante de uma corrida analítica e com a temperatura observada no aparelho, é possível definir a estabilidade do fármaco e do padrão interno durante fase móvel.

- Ciclos de congelamento e descongelamento: Após 3 ciclos de congelamento de cerca de 24 horas e descongelamento da amostra, é possível definir a estabilidade plasmática do fármaco

- Estabilidade de curta duração em temperatura ambiente: Através de momento temporal semelhante de uma corrida analítica, mas agora com temperatura ambiente, é possível definir a estabilidade plasmática do fármaco.

- Estabilidade de longa duração: Em espaço temporal semelhante ao dia da primeira coleta ao dia da última análise das amostras e com temperatura de congelamento destas, é possível definir a estabilidade plasmática do fármaco.

- Estabilidade das soluções de trabalho: Em momento correspondente à utilização das amostras durante o estudo e mantendo a temperatura em que são armazenadas, com o uso das soluções preparadas de trabalho é possível definir a estabilidade do fármaco e do padrão interno.

Empregando o controle de qualidade, a curva de calibração e quantificação do analito em amostras foi possível estabelecer a corrida analítica. Destacando que para os controles de qualidade, o coeficiente máximo de variação aceito de 15%, tendo a possibilidade, durante a corrida analítica, de 2 rejeições, caso não possuir mesma concentração.

Já para o limite inferior de quantificação, o coeficiente máximo de variação aceito foi de 20%. O coeficiente máximo de variação da curva de calibração foi de 15%, a se apresentar entre 5 a 7 concentrações; ainda para a curva de calibração, no caso da menor concentração, o coeficiente máximo de variação foi de 20%.

3.4.2.7. Transferência e efeito matriz

Duas amostras de plasma normal branco tiveram sua transferência avaliada após a injeção de amostra de controle de qualidade de alta concentração. Transferência esta que deve inferiormente limitar-se entre 20%, no caso do analito, e 5%, no caso do padrão interno, do limite inferior de quantificação.

As amostras de controle de qualidade de baixa concentração e alta concentração feitas com 12 plasmas normais, 6 plasmas lipêmicos e 6 plasmas hemolisados, para cada concentração dos controles, tiveram sua utilidade ao avaliar os efeitos da matriz. De acordo com cada amostra, foi estabelecido o padrão de matriz de fatores (FMS), em que sua precisão deve ser inferior a 15%, utilizando-se da fórmula que prevê igualdade do padrão de matriz de fatores frente ao resultado final de uma equação que coloca o resultado das respostas de analito dividido elo padrão interno em matriz sobre resposta de analito dividido pelo padrão interno em solução.

3.4.2.8. Estabilidade

As 3 amostras de controle de qualidade de alta concentração passaram por 4 testes de estabilidade. Primeiramente, realizado 3 ciclos de congelamento-descongelamento, com temperatura de -20ºC até à temperatura ambiente. Posteriormente, realizada o teste de curto prazo, mantendo a amostras por 7 h à temperatura ambiente. Em seguida, o teste a longo prazo, que visou o descongelamento e extração para ser averiguada após 456 dias. Por último, o teste do auto-amostrador, permanecendo 48:13h a 8ºC.

Após tais testes, visando delimitar a precisão e acurácia, houve a medição das concentrações do analito e foram comparadas com 3 amostras frescas.