fenólicas e aumentar a eficiência da PCR. Portanto, o protocolo de extração utilizando DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen) com as modificações sugeridas por Rachmayanti et al. (2006), que fez uso do PVP, mostrou melhor desempenho, possivelmente, pela ação coadjuvante como agente antioxidante na etapa de extração.
6.2.2 Identificação de espécies utilizando marcadores microssatélites do genoma do cloroplasto (cpSSR)
O DNA extraído da madeira geralmente é bastante degradado (DEGUILLOUX et al., 2002) e no caso de madeira processada, a degradação das moléculas de DNA é ainda maior (RACHMAYANTI et al., 2009). Como consequência, a amplificação, por meio de PCR, de fragmentos intactos de tamanhos maiores de DNA muitas vezes é dificultada a partir do DNA degradado. Assim, a utilização de marcadores moleculares informativos que amplificam fragmentos de DNA de tamanhos menores (< 200 pb), como é o caso dos microssatélites (WEISING & GARDNER, 1999), facilitariam as análises genéticas a partir de DNA extraído de madeira. Nesse sentido, marcadores de DNA microssatélites presentes no genoma nuclear têm sido amplamente utilizados como ferramenta molecular informativa, sobretudo por meio da técnica de DNA fingerprinting, em estudos sobre verificação da origem geográfica de estoques, rastreabilidade e análises forenses para espécies madeireiras (CRAFT et al., 2007; FINKELDEY et al., 2010; TANAH et al., 2010; JOLIVET & DEGEN, 2012;
DEGEN et al., 2013; LOWE & CROSS, 2011; DORMONTT et al., 2015; TEREBA et al., 2017; VLAM et al., 2018).
Apesar da ampla utilização dos marcadores de DNA microssatélites localizados no genoma nuclear, como ferramenta para caracterização genética de estoques e na identificação individual em espécies madeireiras, esses marcadores não têm sido utilizados na identificação no nível de espécies. Isso se deve principalmente em função das características desses marcadores e genoma: (1) altas taxas de mutação dos locos SSR e (2) a ocorrência de recombinação no genoma nuclear. No entanto, a descoberta da presença de microssatélites no genoma do cloroplasto, um genoma mais conservado nas plantas, possibilitou a utilização dessa classe de marcadores no contexto da biossistemática, podendo ser aplicados na investigação sobre relações entre variedades e espécies de plantas (PROVAN et al., 1996; 1999; LEE et al., 2018). Marcadores de DNA microssatélites
do cloroplasto (cpSSR) encontram-se amplamente distribuídos, em sua maioria, ao longo das regiões não codificadoras do genoma cloroplastidial e apresentam alta variação em suas sequências (POWELL et al., 1995). Além disso, os marcadores cpSSR desenvolvidos a partir de uma espécie podem ser usados para amplificar regiões homólogas entre táxon relacionados, em função das regiões adjacentes aos locos cpSSR serem bastante conservadas entre espécies proximamente relacionadas filogeneticamente (PROVAN et al., 2001).
No presente estudo, as análises genéticas utilizando marcadores microssatélites (cpSSR) evidenciaram a formação de onze haplótipos distintos, com a ocorrência de haplótipos exclusivos para oito das nove espécies estudadas, exceção feita à espécie Pterocarpus rohrii que apresentou três haplótipos. Os resultados revelam a propriedade desses locos na discriminação e identificação inequívoca das madeiras de: Senna multijuga, Albizia pedicellaris, Anadenanthera colubrina, Cassia ferruginea, Inga lanceifolia, Piptadenia gonoacantha, Lonchocarpus cultratus e Tachigali denudata, coletadas no Parque Estadual da Ilha Grande R.J., esses resultados foram confirmados pela estatística do Fst e corroborados pelas análises utilizando marcadores de regiões mais conservadas do genoma do cloroplasto, as regiões intergênicas trnL-F e psbA-trnH, para o mesmo conjunto de espécies. Dessa forma, os resultados aqui obtidos evidenciam o alto conteúdo informativo dos marcadores cpSSR como ferramenta auxiliar na identificação de espécies de madeiras, constituindo-se pioneiro na área. Esses resultados corroboram os obtidos por RACHMAYANTI et al. (2006), utilizando os mesmos marcadores para a identificação de espécies de madeiras de Dipterocarpaceae.
6.2.3 Identificação de espécies utilizando regiões intergênicas do genoma do cloroplasto (cpDNA) por meio do TaxonDNA
A vantagem de se utilizar regiões padronizadas, oriundas de sequências não codificadoras, como o código de barras de DNA, é que elas diferem muito entre as espécies, mas são muito semelhantes entre indivíduos dentro de uma determinada espécie (DEGEN & FLADUNG 2007). Ou seja, as diferenças interespecíficas são bem maiores que as variações intraespecíficas, o que torna o método de código de barras de DNA uma ferramenta ideal para a discriminação e identificação de espécies.
Segundo Meier et al. (2006), os métodos estatísticos best match, best close match e all species barcodes, implementados pelo programa TaxonDNA, podem ser utilizados para avaliar o sucesso na identificação de espécies. Nesse sentindo, vários autores têm utilizado essa ferramenta em estudos empregando a abordagem de DNA barcoding (ASHFAQET et al., 2013; VIVAS et al., 2014; YU et al., 2017; JIAO et. al., 2018)
No presente estudo, o loco trnL-F foi o que apresentou a maior eficiência como código de barras único para a discriminação e identificação das nove espécies de leguminosas analisadas. A discriminação de espécies para esse loco apresentou as maiores taxas pelos métodos best close match (94,44%) e all species barcodes (86,48%), quando comparado ao loco psbA-trnH. Portanto, os resultados confirmam que a região trnL-F do genoma do cloroplasto é altamente informativa e mostrou-se adequada para a discriminação e identificação da madeira das espécies em questão e pode ser utilizada com sucesso na investigação de problemas taxonômicos. Tais resultados também corroboram com outros estudos que utilizaram este marcador com fins taxonômicos (GAO et al., 2016; LIU et al., 2011; JIAO et al. 2014, MOHAMED et al., 2014). Nesse sentido, Ferri et al. (2014) também sugeriram o uso de trnL-F como código de barras devido à alta variação de suas sequências, possibilitando maior recuperação de identificação, sobretudo em casos de degradação do DNA, como ocorrem em amostras de madeira. JIAO et al. (2014) em estudo sobre a identificação de espécies a partir de amostras de madeira de Dipterocarpaceae também relataram grande variabilidade interespecífica para o loco trnL-F, quando comparado a outros locos plastidiais.
A região intergênica psbA-trnH do cpDNA também mostrou forte potencial como código de barras, evidenciando alta taxa de discriminação entre as nove espécies analisadas nos três métodos, conforme avaliado pelo TaxonDNA. Segundo Hollingsworth et al. (2011), avaliando códigos de barras de DNA, este marcador demonstrou alto desempenho em comparação com outros marcadores na discriminação de espécies em diferentes famílias de plantas. A alta taxa de recuperação de espécies em psbA-trnH pode ser explicada pela grande variação no comprimento das sequências entre as espécies de Leguminosae analisadas, possibilitando maior divergência genética entre as espécies, como também foi observado por Yan et al. (2015) principalmente devido à presença de inserções e deleções.
A utilização da combinação dos dois locos psbA-trnH+trnL-F gerou identificações superiores a 82% em todas as análises utilizando os três métodos (best match, best close match e all species barcodes), no presente estudo. Segundo Ferri et al. (2009) em análise multiloco de DNA barcoding (utilizando dois marcadores) em espécies de 33 famílias distintas, o uso combinado de psbA-trnH e trnL-F mostrou a melhor capacidade de formar grupos monofiléticos. Nesse sentido, Bhagwat et al.
(2015) e Jiao et al. (2018) realizando análises de DNA barcoding com os gêneros Pterocarpus e Dalbergia, respectivamente, constataram melhores resultados combinando marcadores, numa abordagem multiloco, utilizando diferentes combinações com o marcador matK, outra região não codificadora do genoma do cloroplasto de Angiospermas.
6.2.4 Identificação de espécies utilizando regiões intergênicas do genoma do cloroplasto (cpDNA) pelo método Neighbor-Joining
Com base nas análises das árvores Neighbor-Joining para as sequências psbA-trnH, trnL-F e psbA-trnH+trnL-F, observamos a formação de grupos monofiléticos para as nove espécies analisadas. No entanto, foram observadas diferentes linhagens para os indivíduos de Pterocarpus rohrii. Segundo Saitou & Nei (1987) e Van Velzen et al. (2012) o método Neighbor-Joining tem baixa resolução de espécies, pois procura encontrar sequencialmente vizinhos que minimizem o comprimento total da árvore. Entretanto, este método é amplamente utilizado em trabalhos de DNA barcoding (LIU et al., 2012; VAN VELZEN et al., 2012; JIAO et al., 2015; LEE et al., 2016; YU et al., 2017; JIAO et al., 2018). Como sugerido por YAN et al., 2015, uma vez que o poder de resolução de espécies é um parâmetro importante na avaliação do método de código de barras de DNA é importante que métodos complementares sejam considerados na análise.
6.2.5 Comparação entre os métodos de discriminação e identificação de espécies
Estudos com avaliação de DNA barcoding têm utilizado diferentes métodos para discriminação de espécies (YAN et al., 2015). As análises realizadas no presente estudo mostraram resultados análogos para os três métodos utilizados (TaxonDNA, árvores Neighbor-Joining e Network), evidenciando o alto poder de discriminação e
identificação de espécies desses métodos, para as nove espécies estudadas. Embora o método TaxonDNA seja descrito como de maior poder de discriminação, pois esse método tem como base para identificação das espécies a correspondência das sequências analisadas a partir da distância genética observada e a comparação com sequências em base de dados (MEIER et al., 2006; BOLSON et al., 2015; HARTVIG et al., 2015; AUSTERLITZ et al., 2009; HUANG et al., 2015), os outros métodos utilizados (Network e árvores Neighbor-Joining) também apresentaram alta eficiência na identificação das espécies.
6.2.6 A identificação de Pterocarpus rohrii
A análise de rede (network) utilizando o método Median-Joining para os marcadores microssatélites (cpSSR), bem como a análise network para as duas regiões intergênicas do cpDNA analisadas em conjunto, mostraram a existência de múltiplos haplótipos para os indivíduos amostrados de Pterocarpus rohrii. Essa alta variação genética observada para a espécie também refletiu em agrupamentos genéticos distintos na análise filogenética pelo método Neighbor-Joining. Em estudo filogenético do gênero Pterocarpus, Saslis-Lagoudakis et al. (2011) sugeriram uma revisão taxonômica para Pterocarpus rohrii em decorrência de ser uma espécie extremamente variável e polifilética.
Embora tenham sido observadas baixas taxas de recuperação de identificação para Pterocarpus rohrii, pelo método all species barcodes, o loco trnL-F se mostrou mais informativo que o locotrnH-psbA. Portanto, trnL-F pode ser um loco promissor para estudos com a espécie, como mencionado por Klitgard et al. (2013) e Saslis- Lagoudakis et al. (2011). Entretanto, Jiao et al. (2018) analisando seis espécies de Pterocarpus, apresentaram combinação multiloco matK + ndhF-rpl32 + ITS2 como a mais adequada para análises de DNA barcoding em espécies Pterocarpus.