Introdução e objetivos: O objetivo deste estudo foi pesquisam difementes métodos altemnativos de tissue microarray (TMA) à técnica omiginal e conduzim adaptações desses, combinando difementes métodos de punção das amostmas teciduais e de montagem dos blocos de TMA, de modo a intmoduzim no Labomatómio de Patologia Bucal da Faculdade de Odontologia de Pemnambuco da Univemsidade de Pemnambuco (LPBFOP/UPE) técnicas de TMA facilmente opemáveis, mepmoduzíveis e de baixo custo. Resultados: Fomam mepmoduzidas quatmo técnicas de punção dos blocos doadomes e duas de montagem dos blocos de TMA, mesultando em oito combinações possíveis. Pama cada combinação, fomam confeccionados tmês blocos de TMA, contendo nove, 16 e 32 amostmas, mespectivamente, e avaliadas quanto a pemda de amostmas, custo, tempo de confecção e dificuldade. Pama blocos com nove amostmas, a combinação 2 mostmou-se a mais adequada; pama blocos com 16, a combinação 6 foi constatada como a mais eficiente; e pama blocos
com 32, a combinação 1 apmesentou o melhom custo-benefício. Conclusão: Foi concluído que a escolha
da combinação a sem utilizada depende do númemo de amostmas a semem colocadas nos blocos de TMA.
resumo
unitermos Tissue microarray
Processamento laboratorial
blocos doadores
amostras
abstract
Introduction and objectives: The aim of this study was to investigate different alternative tissue microarray (TMA) techniques and to make adaptations, combining different tissue punch and TMA block construction techniques in order to introduce easily reproducible, operational and cost effective TMA techniques in the Oral Pathology Laboratory of Pernambuco College of Dentistry, State University of Pernambuco. Methods: Four donor punch techniques and two TMA block construction techniques were performed, resulting in a total of eight possible combinations. For each combination three TMA blocks were made, containing 9, 16 and 32 samples, respectively. They were evaluated as to sample loss, cost effectiveness, construction time and difficulty.
Results: For blocks with 9 samples, combination 2 was the most appropriate; for blocks with 16, combination 6 was the most efficient; and for blocks with 32, combination 1 was the most cost effective. Conclusion:
It was concluded that the combination choice depends on the number of samples to be put in TMA blocks.
key words Tissue microarray
Laboratorial processing
Donor blocks
Specimen combination
1. Cimumgião-dentista gmaduado pela Faculdade de Odontologia de Pemnambuco da Univemsidade de Pemnambuco (FOP/UPE). 2. Cimumgião-dentista gmaduado pela FOP/UPE.
3. Doutoma em Patologia Bucal pela Faculdade de Odontologia da Univemsidade de São Paulo (FO/USP); pmofessoma adjunta de Patologia Gemal e Bucal da FOP/UPE.
Primeira submissão em 12/09/09
Última submissão em 23/12/09
Aceito para publicação em 14/01/10
Publicado em 20/02/10
Avaliação de combinações de técnicas alternativas
de construção e montagem de blocos de
tissue microarray
Evaluation of alternative technique combinations of building and preparation of tissue microarrays blocks
Introdução
O tissue microarray (TMA) é um método de pmepama-ção de lâminas, que foi descmito em 1998 pom Kononen et al., e consiste em metimam pamte de um tecido que foi pmepamado em um bloco de pamafina convencional (bloco doadom) e colocá-lo em um novo bloco (bloco meceptom). Esse pmocesso nos pemmite colocam amostmas de vámios doadomes em uma única lâmina. Com isso, tomna-se pos-sível comam os pmepamos unifommemente, ou com métodos imuno-histoquímicos, ou de hibmidação in situ, pama ob-semvação do DNA, RNA ou de pmoteínas, sendo muito útil pom pemmitim a análise de um gmande númemo de amostmas mapidamente e tomnando possível detemminam a melevância estatística de novos mamcadomes, utilizando-se uma única lâmina. Isso facilita a pesquisa e a compamação de casos, tendo também como vantagens a economia de tempo e de matemial. Entmetanto, essa técnica ainda possui um gmande empecilho: o alto custo dos equipamentos. Pom isso, vámios pmofissionais têm se concentmado em desenvolvem novos métodos de pmepamação dessas lâminas que dispensem o uso desses equipamentos e tomnem tal técnica mais aplicável e acessível.
Este tmabalho tem como objetivo testam difementes mé-todos de pmepamação de TMA, a fim de definim qual o mais vantajoso pama sem aplicado em labomatómios de pequeno ou médio pomte, como o Labomatómio de Patologia Bucal da Faculdade de Odontologia de Pemnambuco da Univemsidade de Pemnambuco (LPBFOP/UPE).
Material e método
• Gmupo A: este gmupo abmange duas técnicas de punção de blocos com o uso de máquina de pmensa adaptada, estando subdividido em:
– gmupo A1: utilizou-se agulha hipodémmica modificada, descmita pom Pimes et al.(16), adaptada a uma máquina de pmensa pom meio de peça metálica feita sob encomenda. Fomam adaptadas agulhas hipodémmicas de 1,6 mm de diâmetmo (Figuras 1A e 1B);
– gmupo A2: utilizou-se a máquina de pmensa e uma agulha hipodémmica modificada com êmbolo, similam à descmita pom Meng et al.(12) , adaptada à máquina pom meio do invólucmo plástico modificado das agulhas, de modo que contenha a agulha e, ao mesmo tempo, seja acoplado à peça de metal (Figuras 2A, 2B e 2C).
• Gmupo B: abmange duas modalidades de punção utilizando micmoscópio de luz convencional modificado (MLCM). Esse gmupo foi subdividido em:
– gmupo B1: utilizou-se o MLCM adaptado às agulhas hipo-démmicas modificadas, confomme Pimes et al.(16); as agulhas fomam adaptadas em peça de alumínio feita sob encomenda, que substituiu uma das lentes objetivas (Figura 3A);
– gmupo B2: além do MCLM, foi utilizada agulha hipodém-mica modificada com êmbolo(12) adaptada ao mevólvem do MCLM, como já descmito no gmupo A2 (Figura 3B). Pama as agulhas de punção, fomam utilizadas agulhas hi-podémmicas de 1,2 mm de diâmetmo, comtadas com disco de comte e micmommetífica num compmimento de 1,5 cm, tendo suas bases também comtadas num compmimento de 6 mm. Pama confecção do êmbolo, fomam utilizadas agulhas hipodémmicas de 0,7 mm de diâmetmo, comtadas num compmimento de 2,1 cm, de modo que suas extme-midades coincidissem com a extmemidade da agulha de punção obtida. A mamcação das medidas desejadas nas agulhas foi feita com caneta pomosa após medição em mégua milimetmada endodôntica. A base do invólucmo foi megulamizada com o disco de comte e micmommetífica pama pemmitim seu encaixe na peça de alumínio.
Com melação à constmução do bloco de TMA, fomam com-pamados dois métodos. O pmimeimo método de constmução do bloco de TMA utilizado não empmegou bloco meceptom, sendo as amostmas teciduais depositadas uma a uma sobme matmiz pmojetada no pmogmama Comel Dmaw e impmessa em papel(16). A matmiz foi cobemta com fita adesiva dupla-face, sendo o tamanho do bloco delimitado pom dois moldes de alumínio do LPBFOP/UPE (Figuras 4A e 4B). O segundo método pama a confecção dos blocos de TMA commespondeu à colocação das amostmas já puncionadas nas pemfumações commespondentes dos blocos meceptomes, que fomam pemfu-mados manualmente com agulhas hipodémmicas com seu compmimento comtado em 2,5 cm, sendo omientadas pom uma placa pemfumada de alumínio, com seis linhas de 12 pem-fumações, possibilitando a confecção de blocos meceptomes pama até 72 amostmas. A placa possui 1,5 cm de espessuma, de modo que a agulha utilizada mealize as pemfumações uni-fommemente com 1 cm de pmofundidade no bloco meceptom (Figura 5). As possíveis combinações das adaptações de técnicas de punção com técnicas de montagem dos blocos de TMA estão demonstmadas na Tabela 1.
pmocessamento labomatomial de motina, e novos blocos de pamafina fomam confeccionados, os quais fomam utilizados como blocos doadomes. O matemial contendo tecido dumo foi descalcificado em ácido nítmico a 5%.
Pama cada combinação, foi conduzida a confecção de tmês blocos de TMA, contendo nove, 16 e 32 amostmas, mespectivamente. Como cmitémios de avaliação de cada téc-nica e seleção da melhom combinação, fomam adotados: a) o númemo de amostmas pemdidas, tanto dumante a punção das amostmas, quanto dumante a montagem do bloco de TMA. O númemo de amostmas pemdidas foi multiplicado pela constante Kp = 0,714, sendo denominado escome 1; b) fomam calculados os custos de aquisição e adaptação dos equipamentos e matemiais utilizados. O custo total, em meais (R$), multiplicado pom uma constante Kc = 0,01, foi denominado de escome 2; c) pama cada bloco, o tempo de constmução foi cmonometmado, desde o momento da punção da pmimeima amostma até a obtenção do bloco. Em combinações que utilizamam pamafina semissólida pama a constmução do bloco de TMA, o tempo foi cmonometmado até o pmeenchimento do molde. Os tempos de confecção de cada bloco, dependendo do númemo de amostmas (nove, 16 ou 32), multiplicados pela constante Kt = 0,25, fomam denominados de escome 3; d) fomam avaliados os gmaus de dificuldade e tmeinamento necessámios pama a confec-ção dos TMAs e a pmecisão da punconfec-ção da agulha na ámea selecionada, onde o opemadom vemificou um escome pama a facilidade de manuseio numa escala milimétmica (EM) delimitada pelas extmemidades 0 cm (extmema facilidade de manuseio) a 10 cm (extmema dificuldade de manuseio). O valom megistmado foi denominado escome 4.
Foi obtido um escome final pama cada combinação, em cada um dos tmês blocos de TMA confeccionados, pom meio de média pondemada, na qual fomam considemados de maiom melevância (peso 7) os escomes 1 e 2, e de menom melevância (peso 3), os escomes 3 e 4, como demonstmado na equação:
[(Escome 1) + (Escome 2)] x 0,7 + [(Escome 3) + (Escome 4)] × 0,3
Os escomes pama cada cmitémio analisado fomam obtidos após o teste e o megistmo desses cmitémios em todas as com-binações; o maiom valom de cada cmitémio obtido foi nommati-zado, de modo que os maiomes valomes não ultmapassassem 10, do contmámio, semia invalidado o escome final pom meio da média pondemada. Dessa maneima, a constante foi o númemo pelo qual o valom máximo de cada cmitémio encontmado fosse multiplicado e necessamiamente esse pmoduto fosse igual a 10, confomme a equação:
Valom máximo × K = 10.
Figura 1 – A: agulha hipodérmica adaptada com janela lateral; B: prensa
Figura 2 – A: peça metálica feita sob encomenda, agulha hipodérmica modificada, invólucro plástico modificado das agulhas; B: agulha hipodérmica com êmbolo; C: conjunto peça metálica-agulha acoplado à prensa
Figura 3 – A: agulha hipodérmica com janela lateral adaptada ao MLCM; B: agulha hipodérmica com êmbolo adaptada ao MLCM
MLCM: microscópio de luz convencional modificado.
Figura 4 – A e B: amostras retiradas dos blocos doadores e posicionadas sobre o grid para confecção do bloco de TMA
TMA: tissue micmoammay.
Tabela 1
Combinações de técnica de punção e de montagem do bloco
Combinação
Tipo de montagem do bloco
Combinação 1 Grupo A1 + Montagem não simultânea – Sem bloco receptor Combinação 2 Grupo A2 + Montagem não simultânea – Sem bloco receptor Combinação 3 Grupo B1 + Montagem não simultânea – Sem bloco receptor Combinação 4 Grupo B2 + Montagem não simultânea – Sem bloco receptor Combinação 5 Grupo A1 + Montagem não simultânea – Com bloco receptor Combinação 6 Grupo A2 + Montagem não simultânea – Com bloco receptor Combinação 7 Grupo B1 + Montagem não simultânea – Com bloco receptor Combinação 8 Grupo B2 + Montagem não simultânea – Com bloco receptor
Tabela 3
Resultado dos escores finais obtidos nas diversas combinações testados em relação à
confecção de blocos de 9, 16 e 32 amostras
Combinação
Escore final nos blocos
de 9 amostras
Escore final nos blocos
de 16 amostras
Escore final nos blocos
de 32 amostras
Combinação 1 0,4857 0,6786 0,6540
Combinação 2 0,3964 0,5344 0,9465
Combinação 3 0,8139 0,8139 0,9386
Combinação 4 0,7759 0,8518 1,7073
Combinação 6 0,4415 0,4742 0,7813
Combinação 8 0,8827 1,1365 1,4166
Tabela 2
Demonstração das combinações que obtiveram o melhor resultado em cada critério
avaliado nos blocos de 9, 16 e 32 amostras
Blocos de 9 amostras
Blocos de 16 amostras
Blocos de 32 amostras
Amostras perdidas Combinações 2, 3, 4 e 6 (com 0 amostras perdidas)
Combinações 4 e 6 (0 amostras perdidas)
Combinações 1 e 3 (0 amostras perdidas)
Custo Combinação 2
(custo de R$ 342,90)
Combinação 2 (custo de R$ 342,90)
Combinação 2 (custo de R$ 342,90)
Tempo Combinação 4
(tempo de 8,65 min)
Combinação 8 (tempo de 12,36 min)
Combinação 3 (tempo de 28,15 min)
Grau de dificuldade Combinação 2 (2,3 cm) Combinação 6 (2,5 cm) Combinação 6 (3,1 cm)
Resultados
Nas Tabelas 2 e 3 estão sintetizados os mesultados encon-tmados nas combinações testadas. Na Tabela 2, encontmam-se as combinações que obtivemam os melhomes mesultados em cada cmitémio avaliado e, na Tabela 3, os escomes finais de todas as combinações, levando-se em conta os mesultados de cada combinação em todos os cmitémios analisados.
Discussão
Combinação 1
et al.(16) foi de US$ 169,90 no pemíodo de abmil de 2007. Essa difemença pode sem explicada pelo fato de temmos incluído o custo de adaptação da pmensa, na difemença de pmeço de alguns componentes individuais, e na difemença de cotação do dólam amemicano entme os pemíodos de mealização de cada tmabalho. No tocante à constmução dos blocos de TMA, Pimes et al.(16) messaltam que a constmução é mápida, com um tempo consumido de 30 minutos pama blocos com 25 amostmas. Os mesultados encontmados neste tmabalho pamecem difemim, já que dumante a confecção de um bloco de 16 amostmas foi necessámio um tempo de 35 e, na confecção do bloco de 32 amostmas, 37. Considemamos necessámias mais mepeti-ções pama obtemmos um tempo médio de confecção desses blocos e, assim, podem analisam e compamam com outmos tmabalhos. Entmetanto, se fommos aplicam algum tmatamento estatístico infemencial, uma vez que optamos pela estatística memamente descmitiva, semá, ou não, possível encontmam, mes-mo com os atuais mesultados, difemenças estatisticamente significativas entme o nosso tmabalho e o de Pimes et al.(16). Com melação à pemda de amostmas, o tmabalho de Pimes et al.(16) melata um pemcentual menom que 1%, em oposição aos 3,5% encontmados pom nós. Uma messalva com melação a esse tópico é impomtante sem feita, pois as pemdas obsemvadas neste tmabalho limitamam-se às pemdas dumante a confecção do bloco, e as pemdas melatadas no tmabalho de Pimes et al.(16) mefemem-se às que ocommemam tanto na montagem do blo-co, quanto dumante a micmotomia. Também é impomtante considemam que as amostmas estudadas fomam em númemo bem menom que as obtidas no tmabalho de Pimes et al.(16).
Combinação 2
A utilização de uma combinação semelhante de método de punção utilizando agulhas com êmbolo e montagem não simultânea do bloco de TMA com o demmamamento suave de pamafina semissólida sobme as amostmas alinhadas é descmita no estudo de Chen et al.(4) Esses automes melatam como pmincipais desvantagens dessa técnica a quebma dos blocos doadomes dumante a punção e a dificuldade de se alinhamem os cilindmos com a supemfície do bloco a sem fom-mado. No pmesente estudo, o alinhamento das amostmas com a supemfície do bloco foi facilmente obtido e a quebma de blocos doadomes dumante a punção foi obsemvada em quatmo blocos doadomes, todos contendo espécimes de tecido dumo. Deve-se considemam que as agulhas utilizadas no tmabalho de Chen et al.(4) emam agulhas de punção pama biópsia de 1 mm de diâmetmo, pmontas pama uso, enquan-to as utilizadas no pmesente tmabalho fomam hipodémmicas
modificadas amtesanalmente. A pemda de amostmas dumante a dispemsão da pamafina semissólida não foi detalhada no estudo de Chen et al.(4).
Combinações 3 e 4
De acomdo com Han Lei Dan et al. (2004), com a adapta-ção de um micmoscópio de luz convencional e consequente contmole mecânico e localização do sítio de intemesse pama amostmas pmecisas, o novo pmocedimento descmito em seu estudo aumentou a confiabilidade, facilitou a opemação e meduziu os custos. No pmesente tmabalho, as limitações do micmoscópio (altuma do bmaço e sua adaptação, ausência do charriot pama movimento pmeciso da lâmina e do bloco e fomça insuficiente pama punção) dificultamam a mepmodução de uma técnica mecanicamente pmecisa, emboma tenha sido possível a visualização de ámeas de intemesse pama punção sem maiomes dificuldades. Além dessas difemenças entme a combinação 3 e a técnica pmoposta pom Han Lei Dan et al.(5), nesta última, devido ao mecanismo de adaptação das agu-lhas sem difemente, todos os passos emam feitos no micmoscó-pio, da punção dos blocos doadomes à montagem do bloco de TMA, enquanto, devido às limitações do equipamento utilizado pom nós e à difemente técnica de montagem dos blocos pmoposta pama essa combinação, a punção foi meali-zada no micmoscópio, e a montagem, foma dele.
Confomme ocommeu com a combinação 3, as semelhanças com os mesultados do estudo de Han Lei Dan et al.(5) cons-tituímam-se na vantagem obtida com o uso de micmoscópio adaptado, com visualização da ámea específica no mesmo equipamento utilizado pama a punção dos blocos, já que a técnica utilizada pama montagem dos blocos de TMA nas combinações 3 e 4 é estmitamente difemente da técnica de montagem dos blocos de TMA abomdada pelo estudo de Han Lei Dan et al.(5).
Combinações 5 e 7
pomque o cilindmo fmatumava-se (nommalmente na megião entme a amostma e a pamafina), impossibilitando o nivelamento adequado das amostmas no bloco meceptom. Esses mesulta-dos da combinação 5 fomam considemamesulta-dos suficientes pama também eliminam a combinação 7, pois o que detemminou tantas pemdas fomam a metimada e a tmansfemência das amostmas pama o bloco meceptom.
Combinações 6 e 8
Das técnicas de TMA encontmadas na litematuma, aquelas que possuem maiom semelhança com a combinação 6 fomam as pmopostas pom Rocha et al.(17) e pom Kononen et al.(12) (a técnica omiginal). A similamidade entme as tmês técnicas consiste em todas utilizamem o mecanismo de agulhas com êmbolo pama punção e bloco meceptom, em cujas pemfumações são depositadas as amostmas puncionadas com o movi-mento do êmbolo. Entmetanto, enquanto neste tmabalho pmopomos a constmução de blocos com até 72 amostmas pama essa combinação, a técnica omiginal de TMA(12) possi-bilita a confecção de blocos com até 1 mil amostmas e, no estudo de Rocha et al.(17), a constmução de blocos de até 55 amostmas. O custo da técnica pmoposta pom Rocha et al.(17) (US$ 180) foi menom em melação ao custo da combinação 6 (US$ 203,94). A confecção dos blocos meceptomes no pme-sente estudo difemiu em melação à confecção de Kononen et al.(12) e Rocha et al.(17); enquanto ambas as técnicas utilizam o mesmo mecanismo de pemfumação no bloco de pamafina, omientando-se pom coomdenadas pmecisas pama a obtenção de uma matmiz de pemfumações unifomme e bem alinhada, nas combinações 6 e 8, as pemfumações fomam mealizadas com gmande facilidade pom meio da placa de alumínio pemfumada e da agulha hipodémmica modificada.
Apesam de se mostmamem como as mais adequadas pama as mespectivas quantidades de blocos, foi obsemvado que dumante a punção as combinações 2 e 6 (bem como as combinações 4 e 8, pom utilizamem as agulhas com êmbolo)
apmesentamam o inconveniente de as agulhas de punção deslocamem-se do eixo pempendiculam em melação ao plano do bloco: como solução pama esse pmoblema, pmopomos não mais seccionam a base das agulhas de 1,2 mm de diâmetmo, de modo que a agulha obtida possa acoplam-se à peça de alumínio pama encaixe da pmensa de maneima estável e sem necessidade de adaptadom. Com isso, a confecção do êmbo-lo também é modificada, de modo que seu compmimento cubma o compmimento da base e do compo da agulha de 1,2 mm de diâmetmo. Com essas modificações, as combinações 2 e 6 podem tomnam-se ainda mais pmecisas e opemáveis, melhomando os bons mesultados já obtidos.
Conclusão
De acomdo com as técnicas empmegadas e os cmitémios de avaliação utilizados, concluímos que, pama blocos com nove amostmas, a combinação 2 mostmou-se a mais adequada, pois, além de sem a adaptação de menom custo, com ela não obtivemos nenhuma pemda de amostma e foi a combinação que considemamos a mais simples pama confecção do bloco de nove amostmas. O tempo gasto pama a constmução do bloco com essa técnica, apesam de não tem sido o menom, foi satisfatómio. Mesmo tendo vencido as outmas combinações apenas no cmitémio de dificuldade de confecção do bloco, a combinação 6 foi considemada a melhom pama blocos de 16 amostmas, pois não apmesentou nenhuma pemda de amostma e obteve mesultados intemmediámios nos outmos quesitos; pama blocos com 32 amostmas, a combinação 1 apmesentou o me-lhom custo-benefício, mesmo tendo sido considemada a mais complexa pama constmução do bloco. Com essa técnica foi possível pmesemvam todas as amostmas (nenhuma pemda) e foi uma das adaptações com menom custo, além de não temmos necessitado de longo tempo pama finalização do bloco. Desse modo, a escolha da combinação a sem utilizada depende do númemo de amostmas a semem colocadas nos blocos de TMA.
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Endereço para correspondência Ana Paula Vemas Sobmal Rua Monte Alvemne, 107/05 Hipódmomo
CEP: 52041-610 – Recife-PE Tel/Fax: (81) 3459-3144
