P r o d u ç ã o
d e P r o te ín a s p a r a E s tu d o s E s tr u tu r a is
e B io te c n o ló g ic o s
SRQPONMLKJIHGFEDCBA
T e x to q u e s is te m a tiz a
nmlkjihgfedcbaZYXWVUTSRQPONMLKJIHGFEDCBA
o
tr a b a lh o c ie n tífic o d a c a n d id a ta p a r aa
o b te n ç ã o d o títu lo d e L iv r e D o c ê n c iaP r o fa . O r a . A n a P a u la U lia n d e A r a ú jo
Departamento de Física e Informática
Instituto de Física de São Carlos
zyxwvutsrqponmlkjihgfedcbaZYXWVUTSRQPONMLKJIHGFEDCBA
Março de 2008.
S u m á r i o
I N T R O D U Ç Ã O
dcbaZYXWVUTSRQPONMLKJIHGFEDCBA
1C A P Í T U L O 1 :
zyxwvutsrqponmlkjihgfedcbaZYXWVUTSRQPONMLKJIHGFEDCBA
PULCHELLINA 1-11.1INTRODUÇÃO E RELEV ÃNCIA 1-1
1.2PUBLICAÇÕES GERADAS A PARTIR DESSE TRABALHO 1-12
1.3REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1-12
C A P Í T U L O 2 : SEPTINAS 2-1
2. 1INTRODUÇÃO E RELEV ÃNCIA 2-1
2.2PUBLICAÇÕES GERADAS A PARTIR DESSE TRABALHO 2-4
2.3REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 2-4
C A P Í T U L O 3 :P R O T E Í N A S L I G A N T E S D E C Á L C I O 3-1
3.1INTRODUÇÃO E RELEVÂNCIA 3-1
3.1PUBLICAÇÕES GERADAS A PARTIR DESSE TRABALHO 3-5
3.2REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 3-5
C A P Í T U L O 4 : O U T R O S T R A B A L H O S RELEVANTES 4-1
4.1 INIBIDORES DE PROTEINASES VEGETAIS 4-1
mlkjihgfedcbaZYXWVUTSRQPONMLKJIHGFEDCBA
Publicações geradas a partir desse trabalho 4-3
4.2 EXPRESSÃO DE PEPTÍDEOS RECOMBINANTES 4-4
Publicações geradas a partir desse trabalho 4-5
4.3 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 4-5
I F S ( U
C lI)S E R V iÇ O DE B I8 ~ IO T E C ADedicatória
zyxwvutsrqponmlkjihgfedcbaZYXWVUTSRQPONMLKJIHGFEDCBA
AgradecimentoszyxwvutsrqponmlkjihgfedcbaZYXWVUTSRQPONMLKJIHGFEDCBA
Meu infinito obrigada ao Grupo de Biofísica, particularmente
à profa. Leila M.
Beltramini, aos profs. Otaciro R. Nascimento e Antônio J. da Costa-Filho, pela amizade,
apoio e estímulo para que esse trabalho se tomasse real.
Ao prof. Richard
C. Garrat pela dedicação,
competência
e oportunidade
de
trabalharmos juntos, tomando as reuniões de projeto quase que em família.
Aos técnicos do Grupo de Biofísica: Bel, Andressa, João e Femando que sempre
fizeram o impossível
se tomar possível, caso fosse necessário. E é claro, à Ester, pela
ajuda com a burocracia administrativa
e principalmente com memorial!
À profa. Heloísa S. S Araújo, pela amizade e por não me deixar desanimar!
A todos os colaboradores,
os quais me permitiram "aventuras" em outras áreas;
Aos meus alunos e ex-alunos, com quem eu aprendo mais dia-a-dia;
Aos meus pais, irmãos,
aos "Crestana
Guardia"
e toda minha família, pelo
incentivo e carinho sempre.
Ao Hélio, Nina e Ian pela compreensão, ajuda e pelo amor incondicional.
I n t r o d u ç ã o
zyxwvutsrqponmlkjihgfedcbaZYXWVUTSRQPONMLKJIHGFEDCBA
A expressão de proteínas tem sido um dos principais focos desde o advento da
tecnologia
do DNA recombinante
na década de 1980. Um exemplo
disso está na
produção
de insulina recombinante
para uso clínico, em 1982, a qual até então era
disponível de fontes como pâncreas porcino ou bovino [Villa-Komaroff
et al., 1980]. A
produção
de insulina humana em
mlkjihgfedcbaZYXWVUTSRQPONMLKJIHGFEDCBA
Escherichia colifoi um dos principais
eventos na
medicina
[Falzon et al., 2006]. Poucas proteínas
estão disponíveis
em abundância
suficiente que permitam
seu isolamento
direto e purificação
a partir dos tecidos nos
quais ocorrem. Assim, a produção heteróloga de proteínas tem possibilitado
produzir
importantes
fármacos (por ex. hormônio de crescimento),
bem como proteínas para a
indústria e para a pesquisa
científica. Nesse contexto,
a disponibilidade
de proteína
purificada é um pré-requisito
para sua caracterização bioquímica, biofísica e estrutural.
Escherichia coli
é o hospedeiro
mais atraente para a produção
de proteínas
recombinantes,
principalmente
devido
à facilidade
de uso, robustez
e baixo custo
[Grãslund et al., 2008]. Porém, existem desvantagens em usar
E. colicomo hospedeiro
para a expressão.HGFEDCBA
E . colinão é capaz de produzir
modificações
pós-traducionais
eucarióticas, tais como glicosilação, as quais podem ser críticas para produzir a proteína
de interesse enovelada e ativa. Ainda, algumas proteínas, especialmente
aquelas maiores
e proteínas de membrana não são expressas em
E. coliou expressam de forma insolúvel
como corpos de inclusão [Villaverde
dcbaZYXWVUTSRQPONMLKJIHGFEDCBA
&Carrio, 2003].
Estudos têm indicado que cerca de 50% de proteínas provenientes de Eubacteria
ou Archaea
e somente
cerca de 1
o{
de proteínas
de Eukarya
podem
ser expressas
solúveis em
E. coli[Braun
&LaBaer, 2003]. Além disso, a probabilidade
de sucesso na
expressão de uma proteína solúvel em
E. colidiminui consideravelmente
para massas
I FS( ..USP
S E R V iÇ O D e . B J ó ':,U fE C PIntrodução
dcbaZYXWVUTSRQPONMLKJIHGFEDCBA
1 1zyxwvutsrqponmlkjihgfedcbaZYXWVUTSRQPONMLKJIHGFEDCBA
acima de ~60kDa (figura 1.1). Adicionalmente,
é bem estabelecido
que os níveis de
expressão e o grau de solubilidade
de uma proteína recombinante
expressa em
E. colipodem
ser grandemente
influenciados
por uma variação
sutil nas seqüências
de
aminoácidos
nas regiões N- and C-terminais
[Bjõrnsson
et al.,1996; Peti
&Page,
2007]. Domínios protéicos isolados muitas vezes têm mais sucesso na expressão que
proteínas relativamente
grandes, compostas de vários domínios, sendo por isso alvos de
expressão e purificação preferenciais nesses casos.
0.7
0.2
D o c lo n e s o lú v e l àp r o te ín a p u r ific a d a -p e q u e n a e s c a la ( 1 m L ) 0.6
0.5
ZYXWVUTSRQPONMLKJIHGFEDCBA
-
A
, - - ,
,'-...,
. . • • ....,--.
-.
•••••
-. •
D o c lo n e àp r o te ín a p u r ific a d a c o m s u c e s s o e m la r g a e s c a la • • • • ••
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• •••••••••••••••
• ••••••••••
o
CIl CIl
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L L
0.4
0.3
D a p r o te ín a p u r ific a d a à
d e te r m in a ç ã o d a e s tr u tu r a
0.1
Or--'--~--~---r---r---r--.---'---.--.
O 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1,000
T a m a n h o d a c o n s tr u ç ã o
Figura L I : S o l u b i l i d a d e e m f u n ç ã o d o t a m a n h o d a c o n s t r u ç ã o ( e m a m i n o á c i d o s ) . Existem relativamente poucas proteínas alvo com comprimentos maiores que 800 aminoácidos, assim, essas frações foram extrapoladas e são mostradas em cinza [Figura adaptada de Structural G enom ics C onsortium et al., 2008].
Outras
bactérias
tais
como
Bacillus subtilis,fungos
como
Saccharom ycescerevisiae
e
Pichia pastoris,sistemas de células de insetos usando Baculovírus e células
de mamíferos
vêm sendo opções alternativas
para contornar
problemas
que podem
surgir quando se usaHGFEDCBA
E . colicomo célula hospedeira [Falzon et al, 2006]. Ainda, para
expressar proteínas tóxicas à célula hospedeira e proteínas de membrana, sistemas livres
Introdução
dcbaZYXWVUTSRQPONMLKJIHGFEDCBA
I I IzyxwvutsrqponmlkjihgfedcbaZYXWVUTSRQPONMLKJIHGFEDCBA
expressão em
E. coli
sejam duas: i) a falta de um sistema eficiente de secreção para o
meio de cultura, característica
compartilhada com outras bactérias Gram-negativas,
masHGFEDCBA
\ , ; r,~ M
não com as Gram-positivas,
o que toma
Bacillus[Georgiou
&Segatorf
e
Lactococcuslactis
[Morello
et al., 2008]
sistemas
atraentes
se a idéia é secretar
o produto
recombinante;
ii) em bactérias Gram-negativas,
a membrana externa, a qual serve como
um barreira que previne a entrada de moléculas tóxicas, apresenta lipopolissacarídeos
[Nikaido, 2003] que podem contaminar
o produto recombinante
após a purificação.
Contudo,
E. colié ainda hoje o hospedeiro
mais utilizado na produção de proteínas
recombinantes
e alguns dos problemas associados podem ser contornados.
De modo geral, os sistemas de expressão mais usados atualmente,
visando à
biologia estrutural, são baseados na expressão em
Escherichia coliou células de insetos
infectadas
com Baculovírus.
Na maioria
dos casos, algum desses dois sistemas
é
aplicável
para a expressão
de quase todas as proteínas
solúveis,
em quantidades
aceitáveis para estudos estruturais
[Lundstrom, 2007]. Entretanto,
quando se trata de
proteínas de membrana, a situação é bem diferente. Essas proteínas quando produzidas
exibem baixos rendimentos e estabilidade, o que tem levado a um aumento nos esforços
para o desenvolvimento
de vetores e sistemas de expressão alternativos.
Dos sistemas de expressão em
E. colicomumente utilizados, aqueles baseados
no promotor do bacteriófago
T7 (vetores pET) [Studier et al., 1990] são certamente os
mais populares na produção de proteínas recombinantes
(os vetores pET participaram
de mais de 90% das preparações
protéicas depositadas no PDB até 2003) [Sorensen,
2005].
Mais
de 50 diferentes
plasmídeos
da geração
pET
estão
comercialmente
disponíveis,
sendo
que
o sistema
inclui
promotores
híbridos,
múltiplos
sítio. de -:
clonagem
para
a
incorporação
de
diferentes
parceiros
de
fusão
e
sítios
de
reconhecimento
de proteases.
A caracterização
estrutural de proteínas geralmente requer um produto puro e
altamente homogêneo. Nesse sentido, a engenharia genética tem facilitado imensamente
o processo de purificação
pela introdução de vários "tags" de afinidade no N- ou
C-terminais ou mesmo dentro da seqüência codificante do gene de interesse. Os "tags"
mais comuns
usados são as caudas de histidinas
(peptídeos
com 6 ou 10 resíduos
Introdução
zyxwvutsrqponmlkjihgfedcbaZYXWVUTSRQPONMLKJIHGFEDCBA
IVafinidade por metal imobilizado
(lMAC). Outros "tags" comuns são MBP
(m altosebinding protein),
cuja purificação é baseada na cromatografia de afinidade em coluna de
maltose;
GST (glutationa
S-transferase),
FLAG, entre muitos
outros.
dcbaZYXWVUTSRQPONMLKJIHGFEDCBA
Éclaro que,
quando possível, a cromatografia
de afinidade é a primeira escolha para purificação.
Outros meios de purificação
incluindo etapas de precipitação
e gradientes
requerem
grandes quantidades
de material e não são adequados
para proteínas
recombinantes
expressas
em baixos níveis. Adicionalmente,
cromatografias
de exclusão
molecular,
interação
hidrofóbica,
troca-iônica
e fase-reversa
são consideradas
na purificação.
Naturalmente,
se não há um "tag" (recombinante
ou nativo), a purificação
seguirá um
caminho "clássico", o qual será proteína-dependente.
Finalizando
essa breve introdução, um sistema de expressão ideal só pode ser
selecionado
se a produtividade,
a atividade,
a utilização
e as características
físico-químicas da proteína de interesse são levadas em consideração
[Yin
et ai.,2007]. Em
outras palavras: os sistemas de expressão também são proteína-dependentes.
Esta tese traz uma série de trabalhos publicados ou aceitos que exemplificam
o
quanto a expressão
heteróloga
pode contribuir para os estudos estruturais.
Diversas
estratégias para a produção de proteínas, expressas em vetores compatíveis com
E. colie em geral com alto rendimento permitiram estudos estruturais e/ou funcionais.
Além
disso,
a purificação
das proteínas
recombinantes
e, em alguns
poucos
casos, de
proteínas nativas também surgem nos trabalhos como um ponto decisivo para atingir a
qualidade
necessária
para os estudos
estruturais
e funcionais.
Estes, por sua vez,
complementam
grande parte da história apresentada e passaram assim a fazer parte de
minha rotina de trabalho.
No capítulo
1 é feita
uma breve revisão
sobre proteínas
inativadoras
de
ribossomos
(RIPs)
e são apresentados
os resultados
de minha
principal
linha de
pesquisa
hoje:
estudos
de biologia
molecular,
celular,
bioquímicos
e biofísicos
envolvendo a pulchellina, uma proteína inativadora de ribossomos altamente tóxica.
O segundo
capítulo
traz uma breve introdução
e os resultados
da produção
heteróloga e estudos estruturais da septina 4 humana (SEPT4), uma proteína expressa
Introdução
zyxwvutsrqponmlkjihgfedcbaZYXWVUTSRQPONMLKJIHGFEDCBA
v
As mudanças
conformacionais
Ca
2+-induzidas
são o foco do capítulo
3, em
trabalhos envolvendo
a produção
recombinante
e os estudos estruturais
de proteínas
ligantes de cálcio.
No quarto
capítulo,
a expressão
heteróloga
e purificação
visando
supnr
a
demanda da produção
de proteínas
são mostradas em trabalhos em colaboração
com
outros pesquisadores.
ZYXWVUTSRQPONMLKJIHGFEDCBA
R e f e r ê n c i a s B i b l i o g r á f i c a s
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C a p í t u l o 1 . P u l c h e l l i n a
ZYXWVUTSRQPONMLKJIHGFEDCBA
1 . 1 I n t r o d u ç ã o e r e l e v â n c i a
zyxwvutsrqponmlkjihgfedcbaZYXWVUTSRQPONMLKJIHGFEDCBA
Até o fim do século XIX, acreditava-se que a atividade tóxica do extrato bruto
de sementes
maduras
de
mlkjihgfedcbaZYXWVUTSRQPONMLKJIHGFEDCBA
Abrus precatoriusera devido à contaminação
por toxinas
bacterianas. Nesta época, os estudos com sementes tóxicas tinham enfoque médico. Em
1884, Warden
dcbaZYXWVUTSRQPONMLKJIHGFEDCBA
&Waddel mostraram que a toxicidade de sementes de
Abrus precatoriusera devido a uma fração protéica que podia ser precipitada com álcool a partir de um
extrato aquoso, excluindo
a possibilidade
da toxicidade ser creditada à contaminação
bacteriana. A seguir, Stillmark (1888) baseado em dados experimentais
de uma proteína
isolada
de sementes
de
Ricinus com m unis,atribuía
a toxicidade
à capacidade
da
proteína
aglutinar
eritrócitos
in vitro.Somente no início da década de 70, estudos
mostraram
que
as preparações
daquela
época
eram
referentes
a uma
Proteína
[nativadora
de Ribossomos
(RIP), formada por uma citotoxina
e uma hemaglutinina
[Olsnes
&Pihl, 1973].
As proteínas inativadoras
de ribossomos (RIPs) são uma classe de enzimas (EC
3.2.2.22) que catalisam
especificamente
a clivagem da ligação N-glicosídica
entre a
ribose
e a adenina
numa
seqüência
conservada
da subunidade
28S dos rRNAs
eucarióticos
[Endo
&Tsurugi,
1987]. Endo
et aI.(1987) verificaram
que todos os
resíduos
de adenina
clivados
estavam
localizados
em um
loopde uma seqüência
específica
do RNA
ribossomal
(A
4324,em ribossomos
de fígado
de ratos).
Esta
C apítulo
dcbaZYXWVUTSRQPONMLKJIHGFEDCBA
1-Pulchellina 1 - 2zyxwvutsrqponmlkjihgfedcbaZYXWVUTSRQPONMLKJIHGFEDCBA
RIPs na célula promove
um dano irreversível
no ribossomo,
o qual impossibilita
a
ligação dos fatores de elongação
EF-l
e EF-2, impedindo
o passo de elongação na
tradução e, conseqüentemente,
bloqueando a síntese protéica.
Após a atividade enzimática das RIPs ter sido reconhecida
[Endo
et al.,HGFEDCBA
1 9 8 7 ;Endo
&Tsurugi, 1987], a atividade rRNA N-glicosilase tomou-se sua principal marca e
ainda
é usada
para
identificar
essas
proteínas
tóxicas.
Porém,
existem
trabalhos
relatando
que a maioria
das RIPs possui também
uma atividade
polinucleotídica
adenosina glicosilase (APG). Algumas RIPs liberam mais de um resíduo de adenina dos
ribossomos, outras ainda agem nas espécies de RNA a parte do RNA ribossomal e em
regiões poli A [Barbieri
et al.,1997]. No entanto, a eficiência dessa atividade APG é
consideravelmente
menor que a atividade RNA N-glicosilase
nos ribossomos
e, dessa
forma, a ação citotóxica não pode ser atribuída a essa atividade. De qualquer forma, a
observação das RIPs depurinarem também DNA e outros ácidos nucléicos [Peumans
etai,
2001] abriu novas perspectivas
sobre o mecanismo de como essas toxinas matam a
célula.
ZYXWVUTSRQPONMLKJIHGFEDCBA
C l a s s i f i c a ç ã o d a s R I P s
Segundo Mundy
etai
(1994), as RIPs estão classificadas
de acordo com suas
propriedades físicas e estruturais em três grupos :
RIP tipo 1: são enzimas monoméricas que possuem um único domínio RNA
N-glicosilase,
sendo
que a maioria
possui
tamanho
aproximado
de 30 kDa
[Barbieri
et al.,1993], como a saporina (de
Saponaria officinalis)e a PAP, uma
proteína
antiviral
de
Phytolacca am ericana.Apesar
das RIPs tipo
1 serem
distintas na sua seqüência
primária como um todo e
nas modificações
pós-traducionais,
elas compartilham
uma estrutura terciária
altamente
conservada
[Lord
et al., 1 9 9 4 ] .RIP tipo 2: são proteínas heterodiméricas,
na sua maioria altamente tóxicas, com
propriedades
lectínicas e enzimáticas em subunidades polipeptídicas
separadas,
porém expressas como prepro-proteínas.
Cada subunidade tem cerca de 30 kDa,
sendo um polipeptídeo
com atividade RIP (cadeia A), ligado por meio de uma
C apítulo I -Pulchellina
zyxwvutsrqponmlkjihgfedcbaZYXWVUTSRQPONMLKJIHGFEDCBA
1-3se ligar a glicoproteínas
ou glicolipídeos da superfície de células eucarióticas e
mediar o transporte da cadeia A para o citosol [Beaumelle
et al.,1993]. Uma vez
no citosol, a
ZYXWVUTSRQPONMLKJIHGFEDCBA
R I Ptem acesso a maquinaria de tradução e rapidamente interrompe
a síntese protéica. Alguns exemplos pertencentes
a esta classe são a abri na, de
Abrus precatorius,
a ricina, de
Ricinus com m unise a pulchellina,
de
Abruspulchellus.
Van Damme
et al.,2001 incluíram as RIPs tipo 2 clássicas como uma
categoria de quimero-RIPs,
a qual possui tanto os dímeros ligados como não
ligados covalentemente
(por exemplo, as aglutininas de sementes de
R. com unise
A. precatorius),além das RIPs tetraméricas de
Polygonatum m ultiflorum(na
qual os monômeros
são não covalentemente
associados)
e de
Sam bucus nigra(SNAl),
que os monômeros
são unidos por meio de ligações dissulfeto entre as
cadeias B.
R I P
tipo 3: são sintetizadas como precursores inativos (pro-RIPs) que requerem
um processamento
proteolítico entre os aminoácidos envolvidos na formação do
sítio ativo [Mundy
et al.,1994]. Essas RIPs são bem menos prevalentes que os
outros dois tipos. Até o momento, foram caracterizada
R I Ptipo 3 somente em
milho e cevada [Bass
etHGFEDCBA
a l . , 1 9 9 2 ] .Apesar de elementos da estrutura do domínio das
R I Ptipo 1 serem encontrados
em outras proteínas
ligantes
de RNA, como a RNase H de
Escherichia colie da
transcriptase reversa retroviral [Ready
et ai,1988], nenhum domínio parecido com o de
N-glicosilase tem sido encontrado em outras proteínas.
Diferente
do domínio
N-glicosilase
da cadeia A, a estrutura
{J-treefoildos
domínios individuais
da cadeia B é amplamente distribuído e extremamente
antigo. A
cadeia B das RIPs tipo 2 e lectinas relacionadas consistem de cópias duplicadas de um
peptídeo ligante a galactose tripartido, denominado
subdomínios
a,
p
e y, sendo cada
subdomínio composto por 40 resíduos de aminoácidos. Os sítios de ligação a açúcares
são formados por meio de uma dobra acentuada no esqueleto da estrutura formada pelas
seqüências
Asp, VaI e Arg, mais um resíduo aromático variável, o qual promove a
C apítulo I -Pulchellina
dcbaZYXWVUTSRQPONMLKJIHGFEDCBA
1 - 4zyxwvutsrqponmlkjihgfedcbaZYXWVUTSRQPONMLKJIHGFEDCBA
dois eventos de inserção de duplicação em
tandem ,o qual ocorreu antes de sua fusão
com o domínio ancestral N-glicosilase
[Rutenber
et ai,1987]. Ou seja, acredita-se que
as RIPs tipo 2 tenham surgido por meio da fusão de um ancestral da RIP tipo 1 com
uma lectina, originando as cadeias A e B respectivamente.
ZYXWVUTSRQPONMLKJIHGFEDCBA
A t i v i d a d e d a s R I P s
As RIPs podem
ter grande potencial
terapêutico
como toxinas
quiméricas,
obtidas por meio de manipulações
genéticas [Lappi
et ai,1994] ou bioquímicas,
como
as imunotoxinas
(RIPs ligadas a anticorpos
capazes de direcioná-las
seletivamente
contra alvos celulares
específicos)
[Falini
et ai,1992] ou toxinas conjugadas
(RIPs
ligadas a moléculas
carreadoras
específicas )[Casscells
et ai,1992; Cavallaro
et ai,1993] tomando-as
seletivamente
tóxicas para um dado tipo de célula alvo. As toxinas
usadas são muito potentes e por causa de sua função catalítica, mesmo que poucas
moléculas
alcancem
o citosol
da célula alvo já será letal.
Diferente
dos agentes
quimioterápicos,
as
toxinas
levam
a
morte
tanto
células
quiescentes
quanto
proliferativas
[Fracasso
et al.,2004]. Dessa forma, podem ser úteis no tratamento de
câncer [Pryme
etHGFEDCBA
a l . ,2006], além do uso no combate de doenças auto-imunes e também
contra a infecção por HIV [Wang, 2002].
As diferenças observadas na citotoxicidade
de diferentes RIPs são maiores que
as descritas para a atividade enzimática, possivelmente
devido a diferenças estruturais
que a proteína deve sofrer para atingir o alvo intracelular para exibir sua ação tóxica
[Battelli, 2004].
A ausência da cadeia B com propriedades lectínicas nas RIPs tipo 1 é
apontada como a responsável
pela diferença na citotoxicidade
entre RIPs tipo 1 e 2
[Barbieri
et al.,1993]. A presença da cadeia B asseguraria a ligação à superfície celular,
facilitando
o processo
de endocitose
[Olsnes
&Pihl,
1973]. De fato, vem sendo
mostrado que a cadeia B da RIP tipo 2 media a entrada da cadeia A para dentro da
célula através de uma interação do receptor lectínico glicosilado. Porém, a presença de
um sítio ligante
de RIP na superfície
da célula
não garante
que a toxina
será
intemalizada
e que a síntese protéica seja abolida [Refsnes
et al.,1974]. Além disso, a
C apítulo I -Pulchellina
zyxwvutsrqponmlkjihgfedcbaZYXWVUTSRQPONMLKJIHGFEDCBA
1-5exemplo, modecina é tão tóxica a células como a ricina e a abrina [Stirpe
et al.,1985] e,
como essas toxinas,
ela pode ligar-se às moléculas
contendo
resíduos
de galactose
terminais
na membrana,
contudo,
liga-se à receptores
diferentes
dos receptores
de
abrina e presentes em número bem menor.
Comparações
entre a estrutura das RIPs e a citotoxicidade
tomaram-se
ainda
menos lineares quando uma nova classe de RIP tipo 2 emergiu. Apesar da presença da
cadeia lectínica, essa classe possui citotoxicidade
similar as RIP tipo 1. O destino da
RIP após a intemalização
parece
ser de grande relevância
para a sua toxicidade
[Sandvig
dcbaZYXWVUTSRQPONMLKJIHGFEDCBA
&van Deurs, 1996]. A falta da toxicidade das RIP tipo 2 não tóxicas pode ser
atribuída às características
da cadeia B, influenciando a distribuição subcelular
e então
o destino da cadeia A após a intemalização.
Por exemplo, a baixa toxicidade de nigrina
b comparado com a ricina tem sido pelo menos em parte explicado pela alta degradação
da nigrina b pelas células, resultando
em uma baixa concentração
remanescente
no
interior das células e pelo diferente caminho intracelular
seguido pelas duas lectinas
[Battelli
et al.,1997]. Portanto,
as RIPs tipo 2 também
possuem
uma toxicidade
altamente
variável,
que pode ser ocasionada
principalmente
pelas diferenças
no seu
destino intracelular.
A atividade
enzimática
das diferentes
RIPs
pode
vanar
dependendo
das
diferenças estruturais no sítio ativo e em outros domínios relacionados
à atividade que
determinam
a especificidade
a substratos, por meio da influência da interação de cada
RIP
com
diferentes
alvos
subcelulares
[Battelli,
2004].
A
atividade
adenina
polinucleotídeo
glicosilase
(APG) não está distribuída
uniformemente
nas diferentes
RIPs e nem está corre1acionada a ação no rRNA [Battelli, 2004].
Ainda, uma atividade
lipolítica foi associada à ricina [Lombard
etHGFEDCBA
a l . , 2 0 0 1 ] ,atividade esta que pode estar envolvida no processo de envenenamento
pela toxina. A
etapa de interação lipídeo-proteína
parece ser devido principalmente
à presença de uma
atividade não lectínica na cadeia B, no caso da ricina [Moulin
et al.,1994]. Mutações e
estudos estruturais sugerem que a presença ou a ausência dessa atividade pode justificar
a diferente toxicidade entre as RIP tipo 2 tóxicas e não tóxicas. Os diferentes efeitos e
lesões observados
in vivoapós a administração
de várias RIP tipo 2 tóxicas pode
C apítulo
zyxwvutsrqponmlkjihgfedcbaZYXWVUTSRQPONMLKJIHGFEDCBA
1-Pulchellina 1-6da célula, (ii) o caminho e o destino intrace1ular, e (iii) a distribuição dentre os diversos
tipos celulares, e conseqüentemente
entre os órgãos diferentes.
dcbaZYXWVUTSRQPONMLKJIHGFEDCBA
A
ZYXWVUTSRQPONMLKJIHGFEDCBA
s í n t e s e d a s R I P sGrande parte do que se sabe a respeito da síntese e processamento
das RIPs tipo
2 baseia-se
em estudos
com a ricina. A ricina é sintetizada
como uma molécula
precursora única (preproricina),
na qual as cadeias A e B da toxina madura estão unidas
por um peptídeo
de ligação de 12 aminoácidos.
A porção N-terminal
da cadeia A
madura é precedida por 35 resíduos na sua "pré-seqüência"
e os primeiros 26 resíduos
mediam a translocação
co-traducional
do precursor nascente para o lúmen do retículo
endoplasmático
(RE). A seqüência sinal é c1ivada durante esta etapa. A pro-ricina é
glicosilada e as pontes dissulfeto estabilizadas. No RE a pro-ricina é transportada
via
vesículas
do Complexo
de Golgi para os vacúolos
de estocagem
protéica,
onde é
processada por uma proteinase para atingir sua forma madura [Lord
eHGFEDCBA
t al.,1994].
I n t e r n a l i z a ç ã o d a s R I P s
o
mecanismo
de entrada das RIPs nas células ainda é alvo de especulação.
Atualmente
muitas
evidências
sugerem
que elas entram
e distribuem-se
por vias
específicas. A primeira etapa de intemalização
das RIPs é a interação RIP-célula, que
consiste na ligação dessas proteínas
aos sítios receptores
presentes
na superfície da
membrana
celular [Battelli, 2004]. O número de sítios de ligação nas células varia
bastante para as diferentes RIPs tipo 2 [van Deurs
et ai,1985]. Essas proteínas podem
ser captadas por um maior número de células devido à presença de glicoconjugados
na
superfície celular [Peumans
&Van Damme, 1995]. Outro processo de reconhecimento
é
a interação de receptores com as cadeias laterais de carboidratos presentes nas proteínas
[Frigerio
et al.,1998]. Esta também é a hipótese considerada para as RIPs tipo l, além
daquela delas entrarem nas células por meio da fase fluídica da endocitose, sendo então
---_. -
mlkjihgfedcbaZYXWVUTSRQPONMLKJIHGFEDCBA
C apítulo 1-Pulchellina 1-7
Para alcançar
os substratos
citosólicos,
várias toxinas
são transportadas
não
somente
para
endossomos,
mas
fazem
um transporte
retrógrado
para
o retículo
endoplasmático
(RE) antes de serem translocadas através da membrana do RE. A cadeia
B da ricina é uma lectina galactose específica que é responsável pela ligação da ricina
nos galactosídios
da superfície da célula [Olsnes
et ai.,
1974]. Uma porção da ricina
migra dos endossomos
recentes para o sistema trans-Golgi e de lá para o RE [Lord
dcbaZYXWVUTSRQPONMLKJIHGFEDCBA
&Roberts, 1998; Sandvig
et ai.,
2004; Lord
et aI.
2005]. No lúmem do RE, as cadeias A e
B se separam, possivelmente
pela ação da enzima dissulfeto isomerase. A cadeia A
liberada pode interagir com lipídeos negativamente
carregados na membrana do RE e,
quando parcialmente
enovelada, será apresentada como um substrato ERAD (proteínas
associadas à degradação
no RE), levando-a a ser transportada
através da membrana do
RE para o cito sol. Estudos espectroscópicos
com a cadeia A da ricina demonstraram
mudanças significativas
na estrutura secundária da proteína como um resultado de sua
interação
com
lipossomos
contendo
fosfolipídeos
negativamente
carregados.
Essa
mudança, induzida pela ligação ao lipídeo, acarreta em perda da atividade da cadeia A
de
se
ligar
à
adenina.
Desta
forma,
Day
et
ai
(2002)
especularam
que
o
desenovelamento
parcial da cadeia A induzido pela interação com a membrana da célula
durante
o processo
de internalização
pode facilitar
seu reconhecimento
como um
substrato
ERAD.
A
cadeia
A
nativa
é
extremamente
resistente
à degradação
proteolítica,
porém
parcialmente
enovelada
é bem
mais
sensível.
A
cadeia
A
parcialmente
enovelada
no citosol será susceptível
a degradação
proteossomal.
Foi
calculado que aproximadamente
5
%da quantidade total de ricina dentro das células
podem alcançar o compartimento
subcelular que permitirá a translocação para o citosol
[van Deurs
et ai.,
1988]. Porém, uma porção da cadeia A é resistente a esta degradação
por meio do seu renovelamento,
que se torna possível
pela sua interação
com o
ribossomo,
ficando
a molécula
cataliticamente
ativa
e capaz
de
depurinar
sua
subunidade
28S [Argent
et ai.,
2000]. Desta forma, o ribossomo
exerce o papel de
C apítulo I -Pulchellina
zyxwvutsrqponmlkjihgfedcbaZYXWVUTSRQPONMLKJIHGFEDCBA
1-8A
ZYXWVUTSRQPONMLKJIHGFEDCBA
P u l c h e l l i n aUma nova
R I Pfoi isolada de sementes de
Abrus pulchellus,em 1998, por
Ramos e colaboradores.
Tratava-se de uma
R I Ptipo 2 heterodimérica,
composta de uma
cadeia enzimática
com atividade RNA N-glicosilase
(~ 29 kDa, designada cadeia A)
ligada, através de uma ponte dissulfeto, a uma cadeia lectínica galactose-ligante
(~31
kDa, a cadeia B). Esta nova
R I Ptipo 2 apresentou uma toxicidade alta para mamíferos
(DLso= 30llg/Kg
de peso corpóreo),
comparável
a ricina e a abrina. A partir desses
dados e do incentivo do prof. Renato de Azevedo Moreira, iniciamos um projeto nesta
linha de pesquisa.
O primeiro
resultado
deste
trabalho
conjunto
está
apresentado
no artigo
publicado
na revista
Toxicon[Silva
et al.,2003]. Neste, batizada
de pulchellina,
a
toxina foi isolada de uma cultura de calos, estabelecida a partir de explantes imaturos de
cotilédones
de
Abrus pulchellus(figura
1.1). A idéia inicial
era obter uma fonte
alternativa para a produção
da toxina, independente
das sementes, uma vez que não
tínhamos
acesso
à planta
mãe. Havia dúvidas
se a expressão
da pulchellina
seria
mantida em tecidos indiferenciados,
pois já sabíamos que a toxina no vegetal estava
presente
somente
nas sementes.
Para excluir a possibilidade
de que a pulchellina
extraída
dos
calos
fosse
ainda
remanescente
das células
iniciais
dos
explantes,
monitoramos a expressão da cadeia A da pulchellina nas culturas por RT-PCR, além da
atividade tóxica. Os resultados indicaram que a pulchellina estava sendo sintetizada nos
calos, o que permitiu sua purificação
a partir destes, abrindo uma nova frente para a
produção da toxina a partir da cultura de tecidos.
Entretanto,
a idéia de ter uma fonte ilimitada da toxina, objetivando
tanto os
estudos estruturais quanto suas aplicações como imunotoxinas,
levou-nos a clonagem e
expressão da pulchellina. Na época, clones para várias
R I Ptipo 2, como ricinas e abrina
já haviam sido descritos em diversos laboratórios
[Evensen
etai.
1991; Wood
etai.
1991; Hung
etai.
1994] e revelavam
que essas proteínas pertenciam
a uma família
multigênica
que não possuía
íntrons. Baseada nesta informação,
nossa estratégia de
clonagem
pressupôs
que uma situação similar ocorreria
para a pulchellina,
dada à
C a p í t u l o 1 - P u l c h e l l i n a
nmlkjihgfedcbaZYXWVUTSRQPONMLKJIHGFEDCBA
1-9zyxwvutsrqponmlkjihgfedcbaZYXWVUTSRQPONMLKJIHGFEDCBA
seqüências primárias já descritas para abrina e ricina [Wood
e t a l .1991]. Assim, usamos
oligonucleotídeos
degenerados,
baseados nas seqüências publicadas das cadeias A e B
de isoformas de abrina, para amplificar a seqüência genômica específica desejada.
Figura 1.1:A b r u s
SRQPONMLKJIHGFEDCBA
p u lc h e llu s t e r n u i j l o r u s : a espécie é uma trepadeira perene, com ramosgeralmente finos, pouco lenhosos, possuindo folhas compostas, cujo comprimento pode variar de 5 a 10
cm. O fruto é um legume de 3 a 5 em de comprimento, deiscente, contendo de 3 a 6 sementes marrom
claras por fruto. Detalhes da flor ampliada (à esquerda) e parte da planta (à direita).
C apítulo I -Pulchellina
dcbaZYXWVUTSRQPONMLKJIHGFEDCBA
1 -1 0zyxwvutsrqponmlkjihgfedcbaZYXWVUTSRQPONMLKJIHGFEDCBA
dicroísmo
circular, o qual mostrou uma estrutura secundária
com predominância
de
folhas
13,
em concordância
com a estrutura
da cadeia B de abrina.
Ao final do
renovelamento,
a proteína apresentava-se
monomérica.
Havia, portanto, um resíduo de
cisteína livre e reativo, para o acoplamento
de outras moléculas (fármacos ou sondas)
visando à internalização
destes no citosol de células alvo. Esse trabalho foi o primeiro
desafio em termos de expressão solúvel e seu insucesso levou a um grande aprendizado
com relação ao uso de linhagens alternativas para expressão visando à solubilização,
bem como aos métodos de renovelamento.
A cadeia B, em especial, tem ~ 30 kDa e
conta com 9 cisteínas, sendo oito dessas participantes de ligações dissulfeto intracadeia.
o
outro artigo foi focado na produção da cadeia A da pulchellina ativa, visando
a possibilidade
de seu uso em imunotoxinas
[Silva
et al.,2005]. Um fragmento de DNA
genômico
contendo
a seqüência
que codifica a cadeia A foi inserido num vetor de
expressão bacteriano para produzir a cadeia A, fusionada a GST, em
Escherichia coli.Após a expressão e purificação,
a atividade da proteína recombinante
foi determinada
pela sua capacidade de depurinação de rRNA
in vitro.Também
in vitro,a cadeia A foi
associada a cadeia B, ambas recombinantes,
para produzir um heterodímero
ativo
invivo,
com toxicidade comparável a pulchellina nativa. Esses resultados abriram espaço
para a utilização da cadeia A recombinante
em preparações
de imunoconjugados
com
potencial terapêutico, numa parceria com a empresa
N anocore(Campinas, SP).
Ainda decorrente
da produção heteróloga
da cadeia B da pulchellina
(rPBC),
surge uma nova questão: a proteína recombinante
era capaz de ligar-se a determinadas
células, mas ainda retinha a capacidade de ser endocitada?
Para responder tal dúvida,
teve início um projeto em colaboração coma profa. Heloías S. Selistre-Araújo
(UFSCar)
para determinar células de mamíferos que tinham sua adesão promovida pela rPBC. A
partir daí, microscopia> de fluorescência
e confocal foram usadas para determinar
a
x
localização
intracelular
'da pulchellina
nativa (controle)
e da rPBC.
Os resultados
suportam
a hipótese
que
internalização
via endossomos
e o transporte
retrógrado
através do Complexo de Golgi são usados por ambas proteínas [Goto
etal.,
2007].Voltando
um pouco no tempo, durante o processo
de clonagem
genômica,
informações sobre as porções N e C-terminais da pulchellina haviam sido perdidas. Para
C apítulo I -Pulchellina
dcbaZYXWVUTSRQPONMLKJIHGFEDCBA
1 - 1 1cD N A Ends)
zyxwvutsrqponmlkjihgfedcbaZYXWVUTSRQPONMLKJIHGFEDCBA
e, a partir das seqüências obtidas novas clonagem foram feitas por
RT-PCR. Analisando os diversos cDNAs amplificados vimos que existiam diferenças entre
eles, as quais poderiam ser referentes a isoformas. Paralelamente,
estávamos isolando a
pulchellina nativa para caracterizar melhor sua atividade e haviam também indícios de
isoformas. Várias isoformas de abrina já tinham sido descritas, de modo que não era
surpreendente
o que
estávamos
encontrando.
Porém,
será que nossa
escolha
na
clonagem havia sido acertada? As toxicidades das isoformas diferiam entre si. Teríamos
escolhido a melhor (mais tóxica)? Em que elas diferiam? A busca das respostas para tais
questões nos levou a um estudo bioquímico mais profundo da pulchellina nativa, o qual
está em parte contido na publicação recente da revista
FEBS Journal[Castilho
et al.,2008]. Neste trabalho, foi possível o isolamento de 4 isoformas da pulchellina (P I, P Il,
P
A
I I Ie P IV) utilizando cromatografias
diversas. Havíamos isolado sete cDNA distintos
e purificado
quatro isoformas
da pulchellina
nativa, sendo a relação entre cDNAs e
isoformas o nosso desafio. As proteínas foram então submetidas à digestão tripsínica e
analisadas por espectrometria
de massas. As seqüências geradas foram correlacionadas
às isoformas usando um banco de dados composto das seqüências
dos cDNA dos 7
clones. Os valores de ICso e LDso indicaram que P I e P II são mais tóxicas que P
I I Ie P
IV. Os resultados
suportam
a hipótese
que as diferenças
na toxidade
podem
ser
relacionadas
às diferenças
na cadeia
B (ligante)
que media
as interações
com a
superfície celular.
Este trabalho mais recente com a pulchellina
(em parte ainda não publicado)
contou com uma nova colaboradora: a profa. Lynne M. Roberts
(U niversity ofW arw ick,C oventry, U K ).
O grupo da Profa. Roberts possui uma linha de pesquisa bastante
consolidada
com
RIPs
[Lord
et al.,2005a; Lord
et al.,2005b; Smith
et al., 2006;Spooner
et al.,2006], contribuindo
para a elucidação dos mecanismos
de transporte da
ricina no interior da célula [Roberts
&Smith, 2004; Di Cola
et aI.,2005]. Assim, o
estabelecimento
dessa colaboração tem nos permitido aprender e produzir contribuições
significativas
no tema,
culminando
no convite do prof. Mike Lord
(U niversity ofW arw ick, U K ),
para redigir um capítulo sobre a pulchellina no livro da série
Plant C ellM onographs
publicado
pela
Springer,que trará revisões
sobre proteínas
vegetais
C apítulo
dcbaZYXWVUTSRQPONMLKJIHGFEDCBA
1-Pulchellina 1 - 1 2zyxwvutsrqponmlkjihgfedcbaZYXWVUTSRQPONMLKJIHGFEDCBA
1.2 Publicações geradas a partir desse trabalho
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• Silva A L C, Goto, L S, Dinarte, A R, Hansen, D, Moreira, R A, Beltramini, L M, Araujo, A P U. Pulchellin, a highly toxic type 2 RIP from Abrus pulchellus: cloning, heterologous expression of A-chain and structural studies. FEBS Journal, 272: 1201
-1210,2005.
• Goto, L. S, Castilho, P. V, Cominetti, M.R, Selistre-Araújo, H. S, Ulian Araújo, A P. Endocytosis of Pulchellin and its recombinant B-chain into K-562 cells: binding and uptake studies. Biochim ica et Biophysica Acta (General Subjects), 1770, 1660 - 1666, 2007.
• Castilho, P V, Goto, L S, Roberts, LM, Araújo, A P U. Isolation and characterization of four type 2 ribosome inactivating pulchellin isoforms from Abrus pulchellus seeds.
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C apítulo 1 -Pulchellina
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Abrus pulchellus
ribosome-inactivating protein
from seeds callus culture
André Luis C. Silva
a,*,
Ana Cecília G. Horta
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b,
Renato A. Moreira'',
Leila M. Beltramini", Ana Paul a U. Araújo"
"G rupo de Biofisica M oleeular e Espeetroseopia, Instituto de Físiea de São C arlos, U niversidade de São Paulo, C aixa Postal 369,
São C arlos, SP C EP /3560-970, Brazil
bLaboratório de Leetinas e G lieoeonjugados, D epartam ento de Bioquím ica e Biologia
HGFEDCBA
M o l e c u l a r , U niversidade Federal do C eará, C aixa Postal 6020, Fortaleza, C E C EP 60455-900, BrasilReceived 28 October 2002; accepted 19 February 2003
Abstract
Ribosome inactivating proteins (RIPs) were isolated from callus culture that were established from seed explants ofAbrus
pulchellus. Cotyledon segments of immature seeds were inoculated in basal medium MS supplemented with different
concentrations of auxin (2,4-D), citokinin (kinetin and BA) and sucrose in order to determine the best callus induction. A .
pulchellus type 2 RIP (pulchellin) expression was monitored in callus cultures by RT-PCR and biological activity. The calli
obtained after 35 days were freeze dried, macerated and submitted to extraction of total RNA and proteins (0.1 M Tris-HCI pH 7.6 buffer, containing 0.15 M NaCI, 3 h at room temperature). A specific DNA fragment codifying the A-chain pulchellin was amplified from callus RNA suggesting the presence of the protein. This was confirmed in the calli crude extract that showed haemagglutinating activity against rabbit blood cells and a high intraperitoneal toxicity to mice. The crude extract was also submitted to affinity chromatography on a Sepharose-4B column. The retained protein, peak released by 0.1 M galactose, appeared to be composed of two main bands in polyacrylamide gel electrophoresis, in denaturating conditions, with a similar pattern to that obtained with seeds.
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K eyw ords: Abrus pulehellus; Leguminosae; Callus; Lectin; Ribosome-inactivating protein
1. Introduction
Abrus pulchellus, sub-species tenuiflorus, belonging to
the family Leguminosae, sub-family Papilionoideae, con-tains a seed lectin (pulchellin), specific for galactose and galactose-containing sugars, showing haemagglutinanting and toxic activities (Ramos et aI., 1998). Pulchellin is a ribosome inactivating protein (RIP) type 2. Type 2 RWs are a combination of lectin B subunit and toxic A subunit held together via a disulfide bond (Olsnes and Pihl, 1981; Hedger and Podder, 1997). Each subunit plays a distinct role during their action on eukaryotic cells (Olsnes and Sandvig, 1988;
• Corresponding author. Tel./fax: +55-16-271-53-81. Esm ail address: a1coelho@if.sc.usp.br (A.L.e. Silva).
Leah et al., 1991; Swimmer et al., 1992; Steeves et al., 1999). The B subunit, which contains two galactose binding sites, binds the toxin to cell surface glycoproteins and/or glycolipids containing terminal galactose and helps endo-cytosis and subsequent transport of the A subunit into cytosol (Olsnes and Pihl, 1982; Beaumelle et al., 1993; Sandvig and VanDeurs, 1994). The A subunit is an enzyme that, when free in cytosol, depurinates a single base, adenine 4324, of the 28S rRNA in mice, thereby inactivating protein synthesis (Endo et al., 1987; Endo and Tsurugi, 1987).
The detection of RIPs and agglutinins in tissues and organs of unrelated plants has been widely reported (Pratt et al., 1990; Datta et al., 1991; Singh and Singh, 2000). The highest concentrations have been found in plants belonging to families of Asparagaceae (Bolognesi et al., 1990), 0041-0101/03/$ - see front matter © 2003 Elsevier Science Ltd. All rights reserved.
