Efeito da suplementação da vitamina E (
α
α
α
α
-tocoferol) ou D
3na expressão
gênica de TLR4 e adipocinas. Estudos
in vivo
e
in vitro.
Tese apresentada à Universidade Federal de São Paulo para obtenção do título de Doutor em Ciências.
JOÃO FELIPE MOTA
Efeito da suplementação da vitamina E (
α
α
α
α
-tocoferol) ou D
3na expressão
gênica de TLR4 e adipocinas. Estudos
in vivo
e
in vitro.
Tese apresentada à Universidade Federal de São Paulo para obtenção do título de Doutor em Ciências.
Orientador: Profa. Dra. Lila Missae Oyama
Co-orientador: Profa. Dra. Cláudia Maria da Penha Oller do Nascimento
Mota, JF.
Efeito da suplementação da vitamina E (αααα-tocoferol) ou D3 na expressão gênica de
TLR4 e adipocinas. Estudos in vivo e in vitro. João Felipe Mota – São Paulo, 2011. Tese de Doutorado – Universidade Federal de São Paulo - UNIFESP.
Departamento de Fisiologia – Disciplina de Fisiologia da Nutrição Programa de Pós-Graduação em Nutrição.
Título em inglês: Effect of supplementation of vitamin E ( -tocopherol) or D3 on gene
expression of TLR4 and adipokines. In vivo and in vitro
Efeito da suplementação da vitamina E (
α
α
α
α
-tocoferol) ou D
3na expressão
gênica de TLR4 e adipocinas. Estudos
in vivo
e
in vitro.
Comissão Julgadora da Tese para obtenção do grau de Doutor
Profa. Dra. Lila Missae Oyama
(Orientadora) Assinatura
Profa. Dra. Patrícia de Oliveira Carvalho Assinatura
Profa. Titular Silvia Maria Franciscato
Cozzolino Assinatura
Profa. Dra. Débora Estadella Assinatura
Profa. Dra. Liana Lins Melo Assinatura
Profa. Dr. Marcelo Lima Ribeiro
(Suplente) Assinatura
Profa. Dra. Marília Seelaender
(Suplente) Assinatura
Agradeço a Deus pela força em superar os obstáculos e pela luz do conhecimento.
Aos meus pais, João de Souza Mota e Maria de Fátima Mota, pela compreensão, carinho e apoio que sempre me dedicaram. Pelos ensinamentos e exemplos de vida que tanto contribuem com o meu crescimento como pessoa. Por isso ao me canso de falar “Eu os amo demais!”
A minha querida família: irmão, avós, avôs, tias, tios, primos
e primas pelo carinho e pelos incentivos sempre tão importantes.
À Elaine Cristina Leite Pereira pelo amor, dedicação e apoio para superar os obstáculos.
Agradecimentos
Aos professores Dra. Patrícia de Oliveira Carvalho e Dr. Marcelo Lima Ribeiro pelo auxílio em procedimentos experimentais e considerações nos artigos.
Às alunas de mestrado da Universidade São Francisco Camila Morais Gonçalves da Silva e Alline Araújo Curiel pelo auxílio em procedimentos laboratoriais.
Aos amigos do laboratório de Fisiologia da Nutrição pelo companheirismo e ajuda nos momentos necessários.
À Fabíola, secretária da pós-graduação da Nutrição, pelo compromisso e disponibilidade em ajudar o próximo.
Ao técnico de laboratório Valter Boldarine pelo disposição em auxiliar os procedimentos experimentais. À todos os funcionários do laboratório de Fisiologia da Nutrição, em especial à Ana Lúcia e ao Mauro.
À FAPESP pela concessão do auxílio pesquisa.
Aos meus amigos da Universidade São Francisco pela convivência, amizade e força para superar a batalha de realizar uma tese desta proporção e dar aula em três cursos de graduação, além de coordenar o curso de Nutrição, Campus Bragança Paulista/ SP.
Muito bom saber que uma força maior (DEUS) está ao nosso lado.
Na minha vida nada aconteceu por acaso, tudo teve um motivo.
Foi assim, pois era o melhor para mim.
Às vezes me assustei com os olhares de maldade com que me encaravam.
Mas sabia que estava amparado e que o bem sempre prevalece.
As conquistas se devem a fé e a confiança em si mesmo.
Para isso é preciso acreditar!
Sumário
Lista de siglas e abreviaturas ... 15
Resumo ... 18
Abstract ... 20
Introdução ... 22
Vitamina E e os estados pró-oxidativo e inflamatório ... 26
Vitamina D e sua relação com a obesidade ... 29
Objetivos ... 34
Objetivo geral ... 34
Objetivos específicos ... 34
Material e métodos ... 36
Animais ... 36
Grupos experimentais ... 36
Preparação da dieta ... 37
Controle do peso e consumo alimentar ... 38
Sacrifício e coleta de amostras ... 38
Adipócitos 3T3-L1 ... 39
Dosagens bioquímicas ... 40
Determinação do conteúdo de gordura e proteína nas carcaças ... 40
Determinação das concentrações séricas de glicose, insulina e adiponectina ... 40
Determinação das concentrações séricas das vitaminas E e D3 ... 40
Determinação do conteúdo de gordura hepática... 41
Determinação das substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) ... 41
Determinação da atividade da catalase ... 41
Extração de RNA e síntese do DNA complementar ... 42
PCR em tempo real ... 42
Análise da expressão protéica por Western blotting ... 43
Análise estatística ... 44
Resultados ... 46
ARTIGO 1. Vitamin D alleviates high-fat diet-induced obesity by down-regulating TLR4 expression ... 47
ARTIGO 2. Vitamin E supplementation improves body composition and reduces inflammatory and oxidative stress in mice feeding high fat diet ... 68
ARTIGO 3. Supplementing alpha-tocopherol (vitamin E) and vitamin D3 in high fat diet decrease IL-6 production in murine epididymal adipose tissue and 3T3-L1 adipocytes following LPS stimulation ... 90
Conclusões Gerais ... 96
Referências ... 100
Lista de siglas e abreviaturas
1,25(OH)2D3: 1,25-diidroxi-colecalciferol
AGL: Ácidos graxos livres
C/EBP Proteína ligante ao amplificador CCAAT beta CD142: Fator tecidual de coagulação
CuZnSOD: Superóxido dismutase dependente de cobre/ zinco DCV: Doença Cardiovascular
DM2: Diabetes Melito tipo 2
G6PD: Glicose-6-fosfato desidrogenase GLUT: Transportador de glicose
GPx: Glutationa peroxidase IkB-a: Inibidor do NF-kB IL-1: Interleucina-1 IL-6: Interleucina-6 IL-8: Interleucina-8
IRAK Receptor de IL-1 associado à quinase LDL: Lipoproteína de baixa densidade LPS: Lipopolissacarídeo
MAPK: Proteína quinase ativada por mitógeno MCP-1: Proteína quimioatrativa de monócitos-1
MnSOD: Superóxido dismutase dependente de manganês MyD88: Fator de diferenciação mielóide 88
NF-κκκκB: Fator nuclear kappa B
PCR: Proteína C reativa PKC: Proteína C quinase θθθθ
PPAR- : Proliferador de peroxissoma gama RI: Resistência à insulina
ROS: Espécies reativas ao oxigênio
SHIP: Src Homology 2 Domain-Containing Inositol-5-Phosphate SM: Síndrome Metabólica
SOD: Superóxido dismutase
TBARS: Substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico TLR: Receptor toll-like
TNF- : Fator de necrose tumoral-alfa
TRAF6: Fator 6 associado ao receptor de TNF-UCP: Proteínas desacopladoras
Resumo
A alta ingestão de dieta hiperlipídica induz obesidade e resistência à insulina, aspectos relacionados à inflamação crônica. A ativação do receptor toll like 4 (TLR4) induz uma upregulation das vias inflamatórias intracelulares. Baixas concentrações séricas de vitaminas
E e D3 são encontradas em indivíduos obesos. Existem evidências que a vitamina E pode
reduzir os estresses oxidativo e inflamatório e que a vitamina D3 pode induzir a morte celular
de adipócitos por apoptose, sendo uma estratégia para a prevenção e tratamento da obesidade. O objetivo do estudo foi avaliar os efeitos da suplementação de vitaminas E ou D3 sobre a
massa corporal, expressões gênica e protéica de TLR4, superóxido dismutase (SOD), catalase e glutationa peroxidase (GPx), bem como as concentrações de proteínas de TRAF6 e MyD88 no tecido adiposo epididimal de camundongos. Camundongos suíços machos de 30 dias foram alimentados com dieta controle ou hiperlipídica (20% óleo de soja) suplementada ou não com vitaminas E (0,9 g/kg de dieta) ou D3 (0,05 g/kg de dieta) por 60 dias. O sangue, a
carcaça e os tecidos adiposos foram coletados e analisados. Foi observado que a suplementação de vitaminas E ou D3 reduziu o ganho de massa coporal e o peso relativo dos
tecidos. As concentrações séricas de glicose e hepáticas de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico foram menores nos grupos suplementados. As vitaminas E ou D3 reduziram a
expressão gênica de TLR4 no depósito epididimal. A vitamina E também reduziu a expressão gênica de TNF- . As concentrações de mRNA de GPx foram upregulated pelas vitaminas E e
D3 e a catalase somente pela vitamina D3. As expressões protéicas de TLR4, TRAF6 e
MyD88 foram reduzidas pelas vitaminas E e D3, enquanto que a suplementação aumentou as
de GPx e SOD. Em conclusão, o presente estudo demonstrou que a suplementação de vitamina E ou D3 possui atividade anti-obesidade in vivo. A suplementação de vitamina E e
Abstract
High fat diet intake can induce obesity and insulin resistance, features related to chronic inflammation. Toll-like receptor 4 activation induces upregulation of intracellular inflammatory pathways. Low serum concentrations of vitamin E and vitamin D3 are found in
obese individuals. There are evidences that vitamin E can reduce oxidative and inflammatory stresses and that vitamin D3 can induce apoptotic cell death providing a strategy for
prevention and treatment of obesity removing adipocytes via apoptosis. The aim of this study was to evaluate the effect of vitamin E or D3 supplementation on weight, gene and protein expressions of TLR4, superoxide dismutase (SOD), catalase and glutathione peroxidase (GPx), and the protein levels of TRAF6 and MyD88 in epididymal adipose tissue of mice. Swiss male mice of 30 days were fed with control diet or high-fat diet (20% soybean oil) and supplemented or not with vitamin E (0.05 g/kg of diet) or vitamin D3 (0.05 g/kg of diet) for 60
days. Blood, carcass and white adipose tissues were collected and analyzed. We observed that vitamin E or D3 supplementation reduced body weight gain and relative adipose tissue weight.
Serum glucose and thiobarbituric acid-reactive hepatic levels were lower in supplemented groups. Vitamins E or D3 decreased TLR4 expression in the epididymal depot. Vitamin E also
reduced TNF- gene expression. The mRNA GPx gene was upregulated by vitamin E or D3
and mRNA catalase only by vitamin D3. The proteins expressions of TLR4, TRAF6 and MyD88 were decreased by vitamins E or D3, whereas supplementation increased the GPx and
SOD. In conclusion, this study reports that vitamin E or D3 supplementation has potent
antiobesity activity in vivo. We observed that the treatment decreased the TLR4 inflammatory pathway related to the obesity process. The supplementation of vitamin E and D3 reduced the
Introdução
A dieta hiperlipídica induz obesidade e desordens metabólicas como a resistência à insulina (RI), hiperlipidemia e esteatose hepática (BUETTNER et al., 2007; BUENO et al., 2008). A obesidade e a síndrome metabólica (SM) são consideradas grandes problemas de saúde pública no mundo. A prevalência de excesso de peso aumentou significativamente nas últimas décadas e contribui como fator de risco para o diabetes mellitus tipo 2 (DM2)
(HOSSAIN et al., 2007).
No Brasil, de acordo com o IBGE (2010), a prevalência da obesidade em indivíduos com idade superior a 20 anos é alta e crescente. Mais de 1,6 bilhões de adultos em todo o mundo apresentam excesso de peso e 400 milhões são obesos. As estimativas são que em 2015 tenhamos 2,3 bilhões com excesso de peso e 700 milhões de obesos (WHO, 2006).
O tecido adiposo, considerado importante órgão secretor (ZHANG et al., 1994), produz diversos hormônios e fatores denominados adipocinas. Estas, em sua grande maioria, estão relacionadas, direta ou indiretamente, com as doenças crônicas não transmissíveis, ou seja, representam o elo entre adiposidade, SM e doenças cardiovasculares (DCV) (HERMSDORFF & MONTEIRO, 2004; KERSHAW & FLIER, 2004).
Dentre as adipocinas, destacam-se o fator de necrose tumoral-alfa (TNF-α),
interleucina-1 (IL-1), interleucina-6 (IL-6), inibidor do ativador de plasminogênio-1 (PAI-1), proteína quimioatrativa de monócitos-1 (MCP-1), proteína C reativa (PCR), visfatina e resistina (HERMSDORFF & MONTEIRO, 2004; GUZIK et al., 2006).
Tais adipocinas, pró-inflamatórias, quando em valores elevados, promovem o início da cascata de eventos degenerativos na parede vascular que rematam com o desenvolvimento da aterosclerose. Em semelhança do que ocorre com o TNF-α, a IL-1 atua sobre a célula alvo,
similares na resposta inflamatória (BROWLEE et al., 1988; MONTENEGRO & FECCHIO, 1999; OLEXA et al., 2002).
Nos macrófagos, fibroblastos e outras células, a IL-1 aumenta a síntese de prostaglandinas; de interleucina-8 (IL-8) que atua como fator quimiotático para neutrófilos; de IL-6 que, no fígado, aumenta a síntese de proteínas de fase aguda como a PCR, potencializando a inflamação; do TNF-α e da própria IL-1 (BROWLEE et al., 1988;
MONTENEGRO & FECCHIO, 1999; OLEXA et al., 2002).
Concentrações séricas de adipocinas pró-inflamatórias apresentam forte correlação com o grau de obesidade, presença de RI e SM. Em contraposição, as concentrações de adiponectina apresentam-se reduzidas nesses indivíduos (PUTZ et al., 2004; MALIK et al., 2005; MLINAR et al., 2007).
A adiponectina é o hormônio responsável pela ativação da enzima AMP quinase que no músculo (via receptor ativado por proliferadores de peroxissoma gama, PPARγ) promove
maior -oxidação, captação de ácido graxo e também de glicose (via transportador de glicose 4, GLUT-4), além de aumentar a glicólise e diminuir a gliconeogênese hepática e a síntese de colesterol (KADOWAKI & YAMAUCHI, 2005; WHITEHEAD et al., 2006). YAMAGUCHI et al.(2005) demonstraram que a adiponectina inibiu a indução do fator nuclear kappa B
(NF-κB) em macrófagos de camundongos.
Segundo KOLB & MANDRUP-POULSEN (2005), o excesso de ácidos graxos livres (lipotoxicidade) e de glicose (glicotoxicidade) contribuem na patogênese do DM2, mecanismo mediado pelo aumento do estresse oxidativo. Estudos em vivo demonstraram que o estresse
De acordo com EVANS et al. (2003), estudos in vitro indicam que o excesso de AGL
promove efeitos adversos na função mitocondrial como a desacoplação da fosforilação oxidativa com geração de espécies reativas de oxigênio (ROS). Tal situação pode ainda ser exacerbada, pois os AGL também são capazes de diminuir as defesas antioxidantes, reduzindo a glutationa intracelular, mecanismos envolvidos na ativação do NF-κB. Este efeito também
pode estar relacionado à ativação da proteína C quinase (PKC) θ, única isoforma das PKC que
apresenta habilidade em ativar o NF-κB.
Em células endoteliais, a ativação do NF-kB contribui com o aumento das ROS (MALONEY et al., 2009). Obesidade e estresse oxidativo sistêmico estão intimamente relacionados (WU et al., 2009). A concentração intracelular de ROS depende da produção e/ou remoção do sistema antioxidante. As células contêm grande quantidade de antioxidantes para prevenir ou reparar os danos causados pelas ROS, bem como para regular as vias de sinalização redox-sensíveis. Três das enzimas antioxidantes primárias contidas em células de mamíferos são superóxido dismutase (SOD), catalase e a glutationa peroxidase (GPx) (WEYDERT et al., 2010). Todavia, estas concentrações podem variar conforme a alimentação. Em um recente estudo, KOBAYASI et al. (2010) observaram que a dieta hiperlipídica causa redução na expressão protéica de SOD, do inibidor do NF-kB (IkB-a) e aumento na de TNF- . Outro estudo mostrou que a diminuição da atividade da GPx pode estar envolvida com a patogênese da RI na obesidade (KOBAYASHI et al., 2009).
Recentemente, foram descritos mecanismos associados à primeira fase de defesa do organismo, ou seja, o início de toda etapa de ativação do NF-κB e produção de citocinas
pró-inflamatórias. Nesta primeira fase de defesa estão envolvidos os receptores toll-like (TLR)
(CRISTOFARO & OPAL, 2006; KÖNNER et al., 2011).
patógenos (PAMP) durante a resposta inflamatória. Os TLR são considerados a “linha de frente” do sistema de defesa (imunidade inata) contra patógenos. Sob estresse oxidativo (exemplo: infecção), células antigênicas, como as dendríticas e macrófagos, expressam TLR que se ligam aos PAMP. Em seqüência, inicia-se a via de sinalização que estimula o sistema de defesa por meio da indução de ROS e espécies reativas de nitrogênio, ativando o NF-κB (CRISTOFARO & OPAL, 2006).
Dessa forma, os TLR também estimulam a imunidade adaptativa, pois induzem a produção de citocinas pró-inflamatórias e upregulating moléculas co-estimuladoras
(CRISTOFARO & OPAL, 2006; KÖNNER et al., 2011).
MADAMANCHIET et al. (2005) e HAIDARA et al. (2006), em revisão, destacaram que a superprodução de ROS sob condições patológicas está relacionada ao desenvolvimento de DCV. Além disso, as ROS são responsáveis por várias vias de sinalização que envolvem a inflamação vascular no processo de aterogênese, desde o desenvolvimento da estria de gordura até a ruptura da placa de ateroma.
Existem evidências que o TLR4, além de reconhecer lipopolissacarídeos (LPS), proteoglicanos, LDL oxidada e heat shock protein 60 (CRISTOFARO & OPAL, 2006),
também, são ativados por ROS (ASEHNOUNE et al., 2004) e AGL (LEE et al., 2003; SONG et al., 2006). KIM et al.(2011) observaram que o consumo de dieta rica em gordura induziu a
expressão de TLR4 no tecido adiposo epididimal e subcutâneo de camundongos. Outros autores demonstraram que a ativação de TLR4 por AGL ou LPS em adipócitos esta envolvida no desenvolvimento da RI na obesidade e DM2 (SONG et al., 2006).
A sinalização intracelular do TLR4 induz upregulation de vias inflamatórias
(OO-) e de óxido nítrico (NO-), com a conseqüente geração de peroxinitrito (ONOO-), levando à alteração das estruturas celulares e funções (HOECK & PALL, 2011).
A RI tem sido, cada vez mais, reconhecida como estado de inflamação crônica, apresentando similaridades com o processo de aterosclerose, compartilhando mecanismos fisiopatológicos no que concerne à ação de citocinas inflamatórias como o TNF-α e a IL-6 (BASTARD et al., 2006). Em estudos prospectivos foi verificada associação positiva entre o desenvolvimento do DM2 e marcadores inflamatórios (PCR, IL-6 e TNF-α), sugerindo que o
processo inflamatório atua na gênese do DM2 (PRADHAN et al., 2001; TUTLE et al., 2004; MALIK et al., 2005).
Alguns estudos têm demonstrado que a perda de função do TLR4, causada por mutação, protege contra o desenvolvimento da obesidade e RI induzidos por dieta hiperlipídica (DAVIS et al., 2008; TSUKUMO et al., 2009). Todavia, a ausência de função do TLR4 prejudica o sistema de defesa contra doenças infecciosas (TULIC et al., 2007; GASPARTOTO et al., 2010). Logo, a estratégia para controlar a obesidade e melhorar a sensibilidade à insulina parece ser a downregulation da expressão de TLR4 e não o bloqueio
de sua função.
Vitamina E e os estados pró-oxidativo e inflamatório
Muito se tem discutido sobre o papel dos antioxidantes na redução do estresse oxidativo e inflamatório com consequente melhora nas anormalidades clínicas proporcionadas pelas doenças crônicas não transmissíveis (CLARK, 2002). Em revisão, BONNEFONT-ROUSSELOT (2004) destacou a importância dos micronutrientes antioxidantes na prevenção das complicações do diabetes.
a defesa antioxidante, quanto ação no controle glicêmico. Além disso, baixas concentrações de vitamina E foram encontradas em portadores de DM2 e podem representar risco para o seu desenvolvimento. BOTELLA-CARETERO et al. (2010) também encontraram associação inversa entre as concentrações séricas de -tocoferol e o Índice de Massa Corporal na obesidade mórbida. MANNING et al. (2004) e SUTHERLAND et al. (2007) mostraram que a suplementação de vitamina E em obesos diminui o estresse oxidativo sistêmico.
A vitamina E, cuja forma mais prevalente e ativa é o alfa-tocoferol, é a vitamina lipossolúvel predominante nos tecidos e nas lipoproteína de baixa densidade (LDL). A vitamina E é antioxidante extremamente potente, que captura radicais peroxila, interrompendo a cadeia de peroxidação lipídica. Ela protege os lípides poliinsaturados da lesão pelos radicais livres e parece essencial à proteção das lipoproteínas circulantes e ao funcionamento adequado das membranas celulares. No plasma, a vitamina E aumenta a resistência das LDL à oxidação (CATANIA et al., 2009).
RYAN et al. (2010) observaram que a suplementação de antioxidantes (vitaminas C e E) melhora os índices de estresse oxidativo e aumentam as concentrações de proteína muscular de SOD dependente de manganês (MnSOD), SOD dependente de cobre/ zinco (CuZnSOD), GPx e catalase em ratos submetidos à carga repetitiva crônica.
Em alguns estudos, a suplementação de -tocoferol em ratos mostrou melhora significativa no controle glicêmico. O mecanismo pressuposto foi que o antioxidante protege as células β pancreáticas contra as ROS e reduz a oxidação da LDL, diminuindo as
complicações micro e macrovasculares (BONNEFONT-ROUSSELOT, 2004).
grandes eventos cardiovasculares e que poderia aumentar o risco de insuficiência cardíaca (LONN et al., 2005).
Assim, os efeitos da suplementação de vitamina E ainda continuam conflitantes e necessitam de maiores investigações. WU et al. (2007) observaram que a suplementação de tocoferóis (alfa e gama) reduz o estresse oxidativo sistêmico em portadores de DM2, sugerindo que a suplementação de vitamina E é benéfica. Esses resultados não foram observados nos indivíduos com o DM2 controlado.
CUSCHIERI et al. (2007) também verificaram que as células pré-tratadas com vitamina E inibiam a fosfatase celular SHIP (Src Homology 2 Domain-Containing
Inositol-5-Phosphate) mediada por endotoxina, a qual se eleva na presença de LPS, reduzindo a ativação
da via aterogênica da proteína quinase ativada por mitógeno (MAPK) e a formação de
TNF-α.
Em outro estudo, ASEHNOUNE et al. (2004) observaram que neutrófilos pré-tratados com -tocoferol e n-acetil cisteína reduziam a translocação nuclear do NF-κB e a produção de
citocinas pró-inflamatórias (TNF-α, proteína inflamatória de macrófago-2, IL-1β), além de
inibirem a ativação do receptor de IL-1 associado à quinase (IRAK) e IRAK-4, vias de sinalização do TLR4. YANG et al. (2009) mostraram que a vitamina E inibiu significativamente a expressão gênica de TLR4 em adipócitos 3T3-L1.
Vitamina D e sua relação com a obesidade
Uma nova discussão é a relação entre a vitamina D, obesidade e SM. A vitamina D é um micronutriente essencial envolvido com o complexo sistema endócrino. Em revisão bibliográfica, MARTINI & WOOD (2006) mostraram que quanto maiores as concentrações plasmáticas de 25-hidroxivitamina D (calcidiol) menor o risco relativo de se ter SM (dados referentes ao NHANES III e ao Women’s Healthy Study). Além disso, concentrações
reduzidas de vitamina D parecem estar associadas à obesidade, deficiência na secreção de insulina, menor clearence de glicose, elevação da pressão arterial, dislipidemias e maior
produção de citocinas pró-inflamatórias (MARTINI & WOOD, 2006; AASHEIM et al. 2008, KONRADSEN et al., 2008).
HAHN et al. (2006) observaram que em mulheres portadoras de ovário policístico baixas concentrações de 25-hidroxivitamina D estão associadas com a obesidade e RI. No estudo de coorte 1958 British Birth (2002-2004) foi verificado que o peso corporal é um forte
determinante das concentrações de 25-hidroxivitamina D e que essas concentrações estão envolvidas com a homeostase glicêmica (HYPPÖNEN & POWER, 2006). FOSS (2009) sugere que a deficiência de vitamina D é uma das causas da obesidade e que essa poderia ser revertida pelo aumento nas concentrações da vitamina.
Em outro estudo, SADEGHI et al. (2006) demonstraram que a vitamina D3 [1α
,25-diidroxicolecalciferol, 1,25(OH)2D3] suprimiu a expressão de TLR2 e TLR4 em monócitos,
por mecanismo dependente de receptor de vitamina D (VDR). Além disso, as células tratadas com 1,25(OH)2D3 diminuíram a produção de TNF-α e de fator tecidual de coagulação
A vitamina D3 é um importante hormônio esteróide responsável pela regulação da
homeostase do cálcio corporal, promovendo a diferenciação das células mielóides em monócitos/ macrófagos. O VDR pertence a uma família de receptores nucleares que media ações genômicas da vitamina D3. Assim, por regulação da expressão gênica, os VDR
desempenham importante papel na modulação dos eventos celulares como a diferenciação, apoptose e crescimento (PRAMANIK et al., 2004).
No estudo de PRAMANIK et al. (2004), o LPS inibiu as funções do VDR em linhagem de monócitos humanos, THP-1. A forma ativa da vitamina D3 [1,25(OH)2D3]
induziu os VDR após 24 horas de tratamento, enquanto que o LPS inibiu esta indução, afetando a habilidade da 1,25(OH)2D3 em induzir a diferenciação mielóide em monócitos/
macrófagos.
As concentrações intracelulares de 1,25(OH)2D3 podem desempenhar um importante
papel na promoção ou inibição da adipogênese. Na presença de 1,25(OH)2D3, os VDR
bloqueiam a adipogênese por downregulation da expressão de mRNA da proteína ligante ao
amplificador CCAAT beta (C/EBPβ) e das concentrações de proteína nuclear C/EBPβ. Além
disso, a 1,25(OH)2D3 upregulated o co-repressor do C/EBPβ. Em contraste, a ausência de
1,25(OH)2D3 e conseqüente não ligação com seu receptor parece associar-se ao acúmulo de
lipídios (BLUMBERG et al., 2006). Outro mecanismo envolvido seria a estimulação do proliferador de peroxissoma gama (PPAR ) (SUN & ZEMEL, 2007; ZEMEL & SUN, 2008).
No entanto, camundongos knockout para o receptor de vitamina D têm maiores taxas
de oxidação dos ácidos graxos e de expressão de proteínas desacopladoras (UCP) 1, 2 e 3 no tecido adiposo branco. Além disso, em cultura primária de gordura marrom, a 1,25(OH)2D3
suprimiu a expressão das UCPs. Os autores concluíram que a vitamina D3 está envolvida no metabolismo energético e na biologia dos adipócitos in vivo, em parte, por meio da regulação
SUN & ZEMEL (2007) mostraram que o calcitriol (vitamina D3) aumenta a produção
de ROS por inibir a expressão de UCP2 e estimular o influxo de cálcio intracelular, resultando na síntese de ácidos graxos e inibição da lipólise. No entanto, os mesmos autores em um estudo posterior (ZEMEL & SUN, 2008) sugeriram que o calcitriol exerce um impacto dose-dependente na apoptose dos adipócitos, indicando que dose baixa fisiológica inibe a apoptose e dose terapêutica estimula a apoptose. Portanto, o efeito significativo da vitamina D sobre a massa corporal parece estar associado à suplementação com doses elevadas.
O mecanismo de ação da vitamina D3 no DM2 é mediado não somente pela regulação
dos concentrações de cálcio plasmático, que regulam a síntese e secreção de insulina, mas também por meio da ação direta sobre a função das células -pancreáticas (TAKIISHI et al., 2010, MAXWELL & WOOD, 2011). Mecanismos inflamatórios têm sido frequentemente associados com RI e disfunção da célula- , características principais do DM2 (TAKIISHI et al., 2010).
MUSCOGIURI et al. (2010) examinaram o efeito de 25-hidroxivitamina D3 na
sensibilidade à insulina em indivíduos obesos e encontraram correlação linear entre elas. ALVAREZ et al. (2010) verificaram em coorte de mulheres saudáveis que a concentração de 25-hidroxivitamina D3 foi independentemente associada a sensibilidade à insulina do corpo
inteiro, indicando que estas variáveis podem influenciar a sensibilidade à insulina por meio de mecanismos independentes.
HOECK & PALL (2011) sugeriram que a 1,25(OH)2D3 pode agir como pró-oxidante
em alguns casos por reduzir a fluidez da membrana celular, mas também como potente antioxidante, reduzindo a peroxidação lipídica dependente de ferro. A 1,25(OH)2D3 aumenta a
atividade da gama-glutamil transpeptidase, a síntese de glutationa, induz GPx e MnSOD. Além disso, a 1,25(OH)2D3 induz a produção de metalotioninas, prevenindo o estresse
1,25(OH)2D3 também é capaz de agir contra o estresse oxidativo. Todas essas habilidades de
equilíbrio do estado redox são importantes para o downregulation do NF-kB. No entanto, a
1,25(OH)2D3 pode reduzir a glutationa redutase, potencial efeito pró-oxidante. Mas, este
efeito parece ser pequeno perto das inúmeras respostas antioxidantes (HOECK & PALL, 2011).
TARCIN et al. (2009) observaram que a deficiência de 25-hidroxivitamina D3 está
associada com a disfunção endotelial e o aumento da peroxidação lipídica. Os autores sugerem que a deficiência de vitamina D pode ser considerada fator de risco independente para aterosclerose. HAMDEM et al. (2009) demonstraram que a administração de 1,25(OH)2D3 em ratos diabéticos induzido por aloxana aumentou as atividades enzimáticas
de SOD, catalase e GPx (207, 52 e 72%, respectivamente) e diminuíram as concentrações de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS), ou seja, reduzindo a peroxidação lipídica. Os autores concluem que a 1,25(OH)2D3 pode ser útil no tratamento e prevenção do
DM2.
Em um recente estudo publicado pelo nosso grupo, demonstramos que as vitaminas E e D3 possuem efeito antiinflamatório, diminuindo a produção de IL-6 no tecido adiposo
epididimal de camundongos e em adipócitos 3T3-L1 estimulados com LPS (LIRA et al., 2011).
Considerando o exposto acima, levantamos a hipótese de que alterações nas adipocinas podem ser mediadas por ativação dos TLR4 e que as vitaminas E e D3 podem
Objetivos
Objetivo geral
Avaliar o efeito da suplementação das vitaminas E (α-tocoferol) ou D3 na expressão
gênica e protéica de TLR4 e adipocinas.
Objetivos específicos
Em camundongos controles e tratados com dieta hiperlipídica suplementados ou não com vitamina E ou vitamina D3 avaliamos:
Massa corporal e consumo energético; Conteúdo de lipídios e proteína da carcaça;
Concentrações plasmáticas de glicose, insulina e adiponectina; Concentrações séricas de vitamina E e vitamina D3.
No tecido adiposo epididimal destes animais avaliamos: Peso relativo;
mRNA para TLR4, TNF- ;
Expressão protéica de TLR4, MyD88, TRAF6, Catalase, GPx, SOD. No fígado dos camundongos avaliamos:
Peso relativo;
Atividade da catalase;
Concentração de TBARS.
Em cultura de adipócitos 3T3-L1 analisamos:
Se adição de α-tocoferol ou vitamina D3 no meio de cultura modifica o efeito de LPS
Material e métodos
Animais
Para realização do estudo foram utilizados 72 camundongos machos da linhagem suíça, com um mês de idade, procedentes do biotério central da Universidade Federal de São Paulo – Escola Paulista de Medicina (UNIFESP-EPM). O estudo somente teve início após a aprovação do comitê de ética (n. 0388/07, anexo). Os animais foram mantidos no biotério do Laboratório de Fisiologia de Nutrição (UNIFESP-EPM), sob condições de ciclo de luz controladas (12 horas claro e 12 horas escuro) e temperatura constante (24 + 1º C). Durante todo o período experimental, os animais tiveram livre acesso à água e alimentação segundo os grupos descritos abaixo.
Grupos experimentais
Grupo C: constituído por camundongos que receberam diariamente por quatro semanas, dieta controle, contendo 7% de óleo de soja na sua composição.
Grupo H: constituído por camundongos que receberam diariamente, por quatro semanas, dieta hiperlipídica, contendo 20% de óleo de soja na sua composição.
Após este período os animais foram distribuídos em seis grupos:
Grupo C: constituído por camundongos que continuaram recebendo diariamente, por quatro semanas, dieta controle.
Grupo C+D: constituído por camundongos que receberam diariamente, por quatro semanas, dieta controle enriquecida com 1,25(OH)2D3 (0,05mg/ kg).
Grupo C+E: constituído por camundongos que receberam diariamente, por quatro semanas, dieta controle enriquecida com vitamina E (0,9g/ kg).
Grupo H+D: constituído por camundongos que receberam diariamente, por quatro semanas, dieta hiperlipídica enriquecida com 1,25(OH)2D3 (0,05mg/ kg).
Grupo H+E: constituído por camundongos que receberam diariamente, por quatro semanas, dieta hiperlipídica enriquecida com vitamina E (0,9g/ kg).
O desenho experimental do estudo pode ser observado abaixo:
Preparação da dieta
A dieta controle foi elaborada de acordo com as recomendações do American Institute
of Nutrition (AIN93) (REEVES, 1993). A dieta hiperlipídica seguiu a formulação da dieta
Tabela 1. Composição das dietas (g/Kg) Controle
AIN-93 G
Hiperlipídica AIN-93 G
Controle AIN-93 M
Hiperlipídica AIN-93 M
Amido 629 399 720 460
Óleo de soja 70 300 40 200
Caseína 200 200 140 140
L-cistina 3 3 1,8 1,8
Celulose 50 50 50 50
Mistura de minerais* 35 35 35 35
Mistura de vitaminas*† 10 10 10 10
Bitartarato de colina 2,5 2,5 2,5 2,5
BHT(antioxidante) 0,014 0,014 0.008 0.008 * Mistura de minerais e vitaminas (Rhoster®). † Nos grupos C+D e H+D foi utilizado mistura de vitaminas enriquecida com 1,25(OH)2D3 (0,05mg/ kg). Nos grupos C+E e H+E foi
utilizado mistura de vitaminas enriquecida com vitamina E (0,9g/ kg).
Controle do peso e consumo alimentar
A massa corporal de todos os animais foi avaliada semanalmente e o consumo alimentar a cada três dias durante todo o período experimental.
Sacrifício e coleta de amostras
-70oC para posterior extração do RNA e de proteína. O sangue foi coletado em tubos secos, e o soro estocado a -70oC para análises bioquímicas posteriores. Parte dos animais de cada grupo permaneceu intacta para determinação do conteúdo de gordura e proteínas das carcaças.
Adipócitos 3T3-L1
As células 3T3-L1 foram obtidas a partir da American Type Culture Collection e
congeladas em nitrogênio líquido até o dia de uso quando foram então descongeladas à temperatura ambiente. As células foram mantidas em meio de crescimento contendo os seguintes constituintes: meio Dulbecco´s Eagle modificado (DMEM) com 25mM de glicose,
1,0mM de piruvato, 4,02 de mM L-alanyl-glutamina e 10% de soro fetal bovino (Sigma) e cultivadas a 37°C em atmosfera umidificada com 5% CO2 / 95% ar. O meio de cultura foi
trocado a cada quatro dias no máximo até a confluência das células quando então foi feita a diferenciação destas células utilizando-se, por quatro dias, meio de diferenciação contendo 0,25µM de dexametasona, 0,5mM de 3-isobutyl-1-methyl-xanthine, 5µg/mL de insulina (Sigma), penicilina e estreptomicina (1mL para cada 100mL de meio). Após os quatro dias com o meio de diferenciação, as células foram cultivadas por oito dias em meio de alimentação contendo DMEM modificado e 5µg/mL insulina.
No oitavo dia da diferenciação os adipócitos foram tratados com meio de incubação acrescido de vitamina D3 (10-7M), α-tocoferol (50µM) por 24 horas. Após este período, as
Dosagens bioquímicas
Determinação do conteúdo de gordura e proteína nas carcaças
O conteúdo de gordura nas carcaças foi determinado pelo método gravimétrico descrito por OLLER DO NASCIMENTO & WILLIAMSON (1986). Para isso, as carcaças foram previamente amolecidas em autoclave, e a seguir homogeneizadas em água na proporção 1:3 (p:v). De alíquotas de aproximadamente três gramas do homogeneizado foram extraídos os lipídios pelo método de STANSBIE et al. (1976). O conteúdo de proteína das carcaças foi determinado pelo método descrito por LOWRY et al. (1951). Os resultados foram expressos em mg/ 100mg de carcaça.
Determinação das concentrações séricas de glicose, insulina e adiponectina
As concentrações séricas de glicose foram determinadas utilizando o kit Glucose PAP
Liquiform (Labtest®) e as de insulina (Linco®) e adiponectina (R&D System®) foram
determinadas por ELISA.
Determinação das concentrações séricas das vitaminas E e D3
As concentrações séricas de tocoferol foram mensuradas por cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC) de acordo com a metodologia descrita por HATAM et al. (1979), usando (±) -tocoferol (Sigma T3251, HPLC>96%) como padrão externo. As concentrações séricas de 1,25(OH)2D3 também foram determinadas por HPLC de acordo com BJORKHEM
Determinação do conteúdo de gordura hepática
O fígado dos camundongos foram removidos após o sacrifício e estocados na temperatura de -70°C. O conteúdo de gordura hepática foi extraída por clorofórmio: metanol (2:1, v/v) de acordo com a metodologia descrita por FOLCH et al. (1957).
Determinação das substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS)
As concentrações de TBARS foram determinadas no homogenato do fígado (OHKAWA et al., 1979). 250 ul de amostra foram misturados com 25 ul de 4% butil-hidroxitolueno em metanol, 1 ml de TCA 12%, 1ml de ácido tiobarbitúrico 0,73% e 750 ul de tampão 0,1 M-2-amino-2-hidroximetil-propano-1,3-diol-HCl contendo 0,1 mM, EDTA (pH 7,4). Após 60 minutos de incubação a 100°C, as amostras foram resfriadas em gelo, adicionou 1,5 mL de n-butanol. Para misturar foram vorticadas por 30 segundos e, posteriormente centrifugadas a 1000g por 10min. A absorbância do sobrenadante foi medida em 532nm. O método foi padronizado com 1,1,3,3 tetramethoxypropane (malondialdeído bis acetil dimetil), usado como padrão. A concentração de produtos de peroxidação lipídica foi expressa em mg de malondialdeído (MDA) equivalentes por grama de amostra (mg MDA/g).
Determinação da atividade da catalase
A atividade da catalase hepática foi mensurada por kit comercial (CAT 100, Sigma®). A taxa de decomposição do H2O2 substrato foi monitorada em 240 nm. A absortividade molar
de 40 mM-1cm-1 para H2O2 foi utilizada para calcular a atividade. Foi estabelecido que uma
Determinação das concentrações de IL-6 e IL-10
As concentrações de IL-6 e IL-10 foram quantificadas pelo método ELISA (DuoSet ELISA, R & D Systems, Minneapolis, MN) no tecido adiposo epididimal e no meio de
cultura. A sensibilidade da IL-6 (DY506) e IL-10 (DY522) foi de 5,0 pg/ml na faixa de 31,2 – 2000 pg/ml. No tecido adiposo, a variabilidade intra e inter ensaio dos kits de IL-6 e IL-10 foi de 2,7-5,2% e 4,9-9,5%, respectivamente. No meio de cultura, a variabilidade intra ensaio dos kits de IL-6 e IL-10 foi 2,0-4,2%, e a variabilidade inter ensaio foi 3,3-6,4%. Todas as amostras foram feitas em duplicate.
Extração de RNA e síntese do DNA complementar
O RNA total foi isolado de amostra de tecido adiposo epididimal usando Trizol (Invitrogen®) de acordo com as recomendações do fabricante. As concentrações das amostras de RNA foram determinadas pela medida da absorbância em 260nm. A pureza das amostras de RNA foi determinada por meio do cálculo das razões compreendidas entre 260 e 280nm e por eletroforese utilizando gel de brometo de etídio manchada. Para a transcrição reversa, 1 g de RNA total foi reverso transcrito usando um kit M-MLV da transcriptase reversa (Promega ®) e as condições de reação foram 65°C por 10min, 37°C por 60min e 65°C por 10min.
PCR em tempo real
Todas as amostras de RNA foram tratadas com DNase para remover qualquer resíduo de DNA genômico. 1 g de RNA total de cada amostra foi submetida à transcrição reversa, gerando cDNA, em um volume final de 50 L, utilizando-se um M-MLV Reverse
Transcriptase kit (PROMEGA).
O método de detecção foi com a utilização do fluoróforo SyberGreen (Applied Biosystems).
As concentrações de mRNA para HPRT (hipoxantina fosforibosiltransferase-1) foi
similarmente medido e utilizado como o gene de referência.
As informações foram gravadas com o software Sequence Detector (Applied
Biosystems). As concentrações de mRNA de TNF-α e TLR4 foram normalizados para os valores dos genes controles e os resultados foram expressos como número de vezes das alterações relativas, utilizando-se o método 2− Ct (LIVAK & SCHMITTGEN, 2001). Os seguintes primers de camundongos foram utilizados: TLR4 forward, 5’- CCG CTC TGG
CAT CAT CTT CAT TGT-3’, e reverse, 5’-TCC TCC CAT TCC AGG TAG GTG TTT-3’;
TNF-α forward, 5’ TAG CCA GGA GGG AGA ACA GA-3’, e reverse, 5’-TTT TCT GGA
GGG AGA TGT GG-3’; SOD forward, 5’TCA ATG GTG GGG GAC ATA TT-3’, e reverse,
5’GCT TGA TAG CCT CCA GCA AC-3’; CAT forward, 5’-CCT CGT TCA GGA TGT
GGT TT-3’, e reverse, 5’- TCTGGTGATATCGTGGGTGA-3’; GPx forward, 5’-GGT TCG
AGC CCA ATT TTA CA-3’, e reverse, 5’-CAT TCC GCA GGA TAA AG-3’; HPRT
forward, 5’-CTC ATG GAC TGA TTA TGG ACA GGA C-3’, e reverse, 5’-GCA GGT CAG
CAA AGA ACT TAT AGC C-3’.
Análise da expressão protéica por Western blotting
Electrotransferência das proteínas do gel para uma membrana de nitrocelulose foi realizada por 1h em (tensão constante) 120V usando aparelho de transferência semi-seca (Bio-Rad®). Ligação protéica não específica para a nitrocelulose foi reduzida por pré-incubação de 2h em tampão de bloqueio (1% BSA, 10mM Tris, 150mM NaCl e 0,02% Tween 20). As membranas de nitrocelulose foram incubadas overnight a 4°C com anticorpos contra o
TLR4, MyD88, TRAF6, CAT, GPx e SOD (1:1.000; Santa Cruz Biotechnology®) ou -tubulina (mouse) (1:3.000; Santa Cruz Biotechnology®), que foram diluídos em tampão de
bloqueio combinado com agarose a 1% dos bovinos e, em seguida, lavados por 30min em tampão de bloqueio sem BSA. As membranas foram então incubadas com anticorpo secundário, antirabbit para TLR4, MyD88, TRAF6, GPx e CAT (1:5.000) ou antimouse para
-tubulina e SOD (1:5.000), da Santa Cruz Biotechnology®. Os blots foram posteriormente
incubados com um anticorpo secundário conjugado com peroxidase por 1h a 22°C. Para avaliação da carga de proteínas, as membranas sofreram stripping e reincubados com um
anticorpo anti-alfa-tubulina. Bandas específicas foram detectadas por quimioluminescência e a visualização/captura foi realizada pela exposição das membranas a filmes de RX. As intensidades das bandas foram quantificadas por densitometria óptica de autoradiografias desenvolvidos (software Scion Image Scion Corporation®).
Análise estatística
Resultados
Os resultados dessa tese estão apresentados na forma de três artigos científicos:
1. Vitamin D alleviates high-fat diet-induced obesity by down-regulating TLR4
expression. (Submetido à revista The Journal of Nutritional Biochemistry)
2. Vitamin E supplementation improves body composition and reduces inflammatory and
oxidative stress in mice feeding high fat diet. (Submetido à revista The Journal of Nutritional Biochemistry)
3. Supplementing alpha-tocopherol (vitamin E) and vitamin D3 in high fat diet decrease
IL-6 production in murine epididymal adipose tissue and 3T3-L1 adipocytes following
LPS stimulation. (Publicado na revista Lipids in Health and Disease)
ARTIGO 1. Vitamin D alleviates high-fat diet-induced obesity by
down-regulating TLR4 expression
Running title: Vitamin D reduces body weight gain
João F. Mota1; Carolina Biz1; Cristiane Oliveira1; Débora Estadella1; Eliane B. Ribeiro1; Patricia de O. Carvalho2; Marcelo L. Ribeiro3; Camila M.G. da Silva2; Lila M. Oyama1; Claudia M. O. do Nascimento1.
1Departamento de Fisiologia, Universidade Federal de São Paulo, Brazil 2Laboratório Multidisciplinar de Pesquisa, Universidade São Francisco, Brazil
3Unidade Integrada de Farmacologia e Gastroenterologia, Universidade São Francisco, Brazil
Correspondence to:
Claudia Maria Oller do Nascimento
Departamento de Fisiologia, Universidade Federal de São Paulo, Brasil. Rua Botucatu 862, 2º andar, São Paulo, SP, Brasil. CEP: 04023-060. e-mail address: claudia.oller@unifesp.br
This work was supported by FAPESP (grants nº 07/53444-2)
Abstract
1. Introduction
Insulin resistance and obesity are associated with an abnormal inflammatory and oxidative state. The increase in adipose tissue induces systemic inflammation due to secretion of proinflammatory factors by adipocytes. These bioactive substances are known to exert a variety of effects on glucose and lipid metabolism [1].
Toll-like receptors (TLRs) play a critical role in the activation of innate immune responses in mammals by recognizing pathogen-associated molecular patterns [2]. TLR4 is a subclass of TLRs that can be activated by lipopolysaccharide (LPS) and by nonbacterial agonists, such as reactive oxygen species (ROS) and free fatty acids [2-4]. The activation of TLR4 signaling induces upregulation of intracellular inflammatory pathways related to the induction of insulin resistance, such as myeloid differentiation primary response gene-88 (MyD88), tumoral necrose factor receptor associated factor-6 (TRAF6) and nuclear factor-kB (NF-kB) [2].
The oxidative stress which accompanies feeding, particularly when there is excessive ingestion of fat and/or other macronutrients without concomitant ingestion of antioxidant-rich foods/beverages, may contribute to inflammation attributed to obesity and diabetes type 2 [5]. Vitamin D has evolved from that of an essential micronutrient to that of a hormone involved in a complex endocrine system. Low concentrations of 25-hydroxyvitamin D have been associated with an increased risk of diabetes and other cardiovascular disease risk factors [6]. In previous study, we demonstrated that vitamin D had an anti-inflammatory effect by decreasing IL-6 production in epididymal adipose tissue in mice and in 3T3-L1 adipocytes stimulated with LPS [7]. Foss [8] speculated that vitamin D deficiency is the cause of common obesity, and obesity can be reversed by improving the levels of vitamin D.
pathways and antioxidants enzymes. The aims of this study were to investigate the effects of vitamin D supplementation on weight, TLR4 expression and protein levels of TLR4, MyD88, TRAF6, catalase (CAT), glutathione (GPx) and superoxide dismutase (SOD) in epididymal adipose tissue of mice provided with a HF.
2. Materials and Methods 2.1. Animals
The Experimental Research Committee of the São Paulo Federal University approved all procedures for the care of the animals used in this study (protocol nº 2007/0388). Thirty-day-old male Swiss mice were used in this study and were kept under controlled conditions (12 h light: 12 h dark cycle with lights on at 07:00; 22°C ± 1°C). During the experimental period, the animals were group-housed and provided water and a specific diet ad libitum. The
animals were treated for eight weeks as follows: 1) C - Twelve animals were treated for eight weeks with a control diet based on the AIN93 formulation with 5% of the fat from soybean oil. 2) HF - Twelve animals were treated for eight weeks with a hyperlipidic diet based on the AIN93 formulation with 20% of the fat from soybean oil; 3) C+D - Twelve animals were treated for four weeks with a control diet based on the AIN93 formulation with 5% of the fat from soybean oil and an additional four weeks with the same diet supplemented with 1,25(OH)2 vitamin D3 (0.05 mg/kg of diet) and 3) HF+D - Twelve animals were treated for
four weeks with a hyperlipidic diet based on the AIN93 formulation with 20% of the fat from soybean oil and an additional four weeks with the same diet supplemented with 1,25(OH)2
2.2. Sample collection
After eight weeks the animals were euthanized by decapitation without sedation. Retroperitoneal, mesenteric and epididymal fat pads were removed and weighed to estimate the degree of adiposity. Samples of epididymal white adipose tissue were dissected, immediately frozen in liquid nitrogen and stored at -80°C.
2.3. Biochemical serum analysis
Commercial ELISA kits were used to measure the serum levels of adiponectin (R&D System®) and insulin (Linco®). Blood glucose levels were determined using the Glucose PAP Liquiform kit (Labtest®). Serum 1,25(OH)2 vitamin D3 was determinate by
high-performance liquid chromatography (HPLC) according to BjOrkhem et al. [9].
2.4. Hepatic content of total lipids
The liver of mice was removed after sacrificed and stored at -80°C. Liver lipids were extracted by chloroform: methanol (2:1, v/v) and determined according to Folch et al.[10].
2.5. Thiobarbituric acid-reactive (TBARS) substances measurement
used as a standard. The concentration of lipid peroxidation products was expressed in mg malonaldehyde (MDA) equivalents per g of sample (mg MDA/g).
2.6. CAT activity measurement
CAT activity in liver was determined by using a catalase assay kit (CAT 100, Sigma®). The decomposition rate of the substrate H2O2 was monitored at 240nm. A molar
absorptivity of 40 mM-1cm-1 for H2O2 was used to calculate the activity. One unit is equal to
1µmol of H2O2 decomposition/min (µmol/min) [12].
2.7. Carcass lipid and protein contents
Carcasses were eviscerated, weighed, and stored at −20°C. The lipid content was measured [13] and standardized [14] as previously described. Briefly, the eviscerated carcasses were autoclaved at 120°C for 90 min and homogenized with a double body weight of water. Aliquots of this homogenate were taken in triplicate, weighed and digested in 3 ml 30% KOH and 3 ml ethanol for at least 2 h at 70°C in capped tubes. After cooling, 2.5ml 6N H2SO4 was added, and the samples were washed 3 times with petroleum ether for lipid
extraction. Results are expressed as grams of lipid per 100g of carcass. For protein measurements, aliquots of the same homogenate (weighing approximately 1g) were heated to 37°C for 1h in 0.6 N KOH with constant shaking. After clarification by centrifugation, protein content was measured according to a previously described method [15].
2.8. RNA extraction and complementary DNA synthesis
samples was determined by calculating the absorbance ratios between 260 and 280nm and by electrophoresis using an ethidium bromide-stained gel. For reverse transcription, 1 g of total RNA was reverse transcribed using an M-MLV reverse transcriptase kit (Promega®) and the following reaction conditions: 65°C for 10 min, 37°C for 60 min and 65°C for 10 min.
2.9. Real-time PCR
The relative levels of TLR4, TNF- , SOD, CAT and GPx were measured in duplicate by real-time PCR using SYBR green dye and an ABI Prism 7300 sequence detection system (Applied Biosystems®). Reactions were incubated as follows: an initial denaturation step at 95°C for 10min followed by 40 cycles of 95°C for 15s and 60°C for 1min and culminating with melt curve analysis. All results were normalized to the values of the housekeeping gene hypoxanthine phosphoribosyltransferase (HPRT) and expressed as the fold change relative to the control group using the 2- Ct method [16]. The following mouse primer sets were used: TLR4 forward, 5’- CCG CTC TGG CAT CAT CTT CAT TGT-3’, and reverse, 5’-TCC TCC CAT TCC AGG TAG GTG TTT-3’; TNF-α forward, 5’ TAG CCA GGA GGG AGA ACA
2.10. Protein analysis by western blotting
Samples of epididymal adipose tissue (0.3g) were homogenized in 1.0 mL extraction buffer (100mM Trizma, pH7.5, 10mM EDTA, 1% SDS, 10mM sodium pyrophosphate, 100mM sodium fluoride, 10mM sodium orthovanadate, 2mM PMSF and 0.25 mg aprotinin protease inhibitor). The lysates were incubated with 10% Triton X-100 for 30 min and then centrifuged at 14,000 rpm for 30 min at 4°C. The supernatant was collected, and protein concentration was determined using a Bradford assay using bovine serum albumin (BSA) as a reference standard.
2.11. Statistical analysis
All results are presented as means ± standard error of the mean (SE). Statistical significances of the differences between the means of the four groups of samples were assessed using two-way analysis of variance (ANOVA), followed by the Tukey's test. Differences were considered to be significant when P<0.05.
3. Results
3.1. Body weight, biochemical analysis and hepatic lipid content
Eight-month old mice fed a HF+D weighed on average 30% less than HF-fed control mice. When mice were fed with of control diet, the body fat gain was 34.3% lower in groups supplemented with vitamin D (Table 1). The carcass fat content was higher in HF group than control (19.64%) and supplemented groups (C+D: 37.8% and HF+D: 22.4%, Table 1). Furthermore, relative retroperitoneal, epididymal and mesenteric fat pad weights was lower in control and vitamin D supplemented groups than HF. The same was observed with relative liver weight (Table 1). The mean of energy intake was similar in HF and HF+D but these groups had higher consumption than C and C+D (Table 1). The consumption of vitamin D was higher in supplemented groups (Table 1). Serum 1,25(OH)2 vitamin D3 was lower in HF
group than others groups (Table 2).
Serum concentrations of glucose and insulin were lower in C+D (25.3% and 60.9%) and HF+D (15.6% and 57.3%) when compared with yours control groups (Table 2). The same was observed in TBARS levels (malonaldehyde equivalents). Hepatic lipid content was also decreased (P<0.05) by vitamin D supplementation compared with HF (Table 2). An analysis
3.2. Vitamin D and mRNA expression
The mRNA expression levels of TLR4, TNF- , SOD, CAT and GPx were determined in epididymal WAT isolated from the previously described animals. In WAT, HF caused an upregulation of the TLR4 gene (97%) and vitamin D supplementation decreased TLR4 expression (-110%) in the epididymal depot among HF groups (Table 3). The mRNA expression of TNF- did not differ among groups. Vitamin D supplementation upregulated the CAT and GPx genes. SOD expression was higher in HF+D group (Table 3).
3.3. Vitamin D and the expression of TLR4, TRAF6, MyD88, CAT, GPx and SOD
TLR4 was measured in epididymal adipose protein content by western analysis using an antibody targeted. Vitamin D reduced the expression of TLR4, TRAF6 and MyD88 (P<0.05, Figure 1). Protein levels of GPx and SOD were significantly high with vitamin D
supplementation (P<0.05, Figure 1). CAT protein levels were higher in control group than
other groups (P<0.05, Figure 1). 4. Discussion
In this study, we show that vitamin D supplementation reduces obesity and insulin resistance by decreasing TLR4 expression and lipoperoxidation. Furthermore, body weight gain, carcass lipid content, relative adipose tissue weight and hepatic lipid content were higher in mice feeding HF than HF+D. Serum vitamin D concentration decreased in HF group. Several studies had shown an inverse association of serum vitamin D levels with adiposity and body mass index [17,18]. It has been proposed that increased metabolic clearance and enhanced uptake of vitamin D in adipose tissue accounts for the low serum levels of 25(OH)2 vitamin D3 in obesity. The serum level of 1,25(OH)2 vitamin D3 depends
on the renal hydroxylation of 25(OH)2 vitamin D3 and in obeses there is not substrate
It has been demonstrated that blockade of 3T3-L1 cell differentiation by vitamin D involves C/EBP suppression, PPAR upregulation, and antagonist function of PPAR activity [19,20].
However, vitamin D receptor-null mice have a higher rate of fatty acid beta-oxidation and an upregulation of uncoupling protein (UCP) 1, 2 and 3 expressions in the white adipose tissue. In primary brown fat culture, 1,25-dihydroxyvitamin D directly suppressed the expression of the UCPs. The authors concluded that vitamin D3 is involved in energy metabolism and adipocyte biology in vivo in part through regulation of beta-oxidation and
UCP expression [18].
Sun and Zemel [19] showed that calcitriol increased production of ROS by inhibiting UCP2 expression and stimulating intracellular calcium influx, resulting in fatty acid synthesis and lipolysis inhibition. However, the same authors in a post study [20] suggested that calcitriol exerts a dose-dependent impact on adipocyte apoptosis, indicating that a low physiological dose inhibits apoptosis and a pharmacological dose stimulates apoptosis. Therefore, the significant effects of vitamin D on body weight appear to be associated with high dose supplementation.
In recent study published by our research group, we demonstrated that vitamin D had an anti-inflammatory effect by decreasing IL-6 production in epididymal adipose tissue in mice and in 3T3-L1 adipocytes stimulated with LPS [7]. Also, we showed that vitamin D supplementation decreased TLR4 expression and your protein levels. TLR4 down-regulation is associated with insulin sensitivity and lower body fat gain [24]. Muscogiuri et al.[25] examined the effect of 25-hydroxyvitamin D on insulin sensitivity in obese subjects and found a linear correlation between them. Alvarez et al. [26] verified that 25-hydroxyvitamin D concentration was independently associated with whole-body insulin sensitivity in a cohort of healthy women, which suggested that these variables may influence insulin sensitivity through independent mechanisms.
TLR4 signaling also induces upregulation of intracellular inflammatory pathways such as IkB kinase complex (IKKB), inhibitor of nuclear factor-kB (IkBa) and NF-kB [2]. NF-kB activation induces the production of high levels of reactive oxygen species (ROS), like superoxide (OO-) and of nitric oxide (NO-), with resulting generation of peroxynitrite (ONOO-), thus leading to altered cellular structures and functions [27]. Here, vitamin D reduced TBARS levels and increased GPx and SOD protein levels in epididymal adipose tissue. mRNA levels of GPx and CAT was upregulated by vitamin D supplementation and SOD expression was higher in HF+D group compared to HF. In part, this effect may be associated with the reduction in TLR4 expression. Hoeck & Pall [27], in a review study, suggested that 1,25(OH)2 vitamin D3 can act as a pro-oxidant in appropriate cases, but also as
a potent antioxidant. Like cholesterol, 1,25(OH)2 vitamin D3 is able to reduce the fluidity of
the cell membrane and to prevent iron-dependent lipid peroxidation. It increases the activity of gamma-glutamyl transpeptidase, supports glutathione synthesis, induces GPx, and manganese dependent superoxide dismutase (Mn-SOD). Furthermore, 1,25(OH)2 vitamin D3
preventing metal derived oxidative stress. By enhancing activity of glucose-6-phosphate-dehydrogenase (G6PD) 1,25(OH)2 vitamin D3 is able to act also against oxidative stress. All
these redox balancing abilities serve as another contribution to down-regulation of NF-kB activation. However, 1,25(OH)2 vitamin D3 is able as well to lower glutathione reductase with
a potentially pro-oxidant effect. But being relatively modest and being found with all of the antioxidant responses, it is not likely to be a major influence [27].
Tarcin et al. [28] showed that 25(OH)D deficiency is associated with endothelial dysfunction and increased lipid peroxidation. Replacement of vitamin D had favorable effects on endothelial function and decreased TBARS levels significantly. The authors suggested that vitamin D deficiency can be seen as an independent risk factor of atherosclerosis.
Hamdem et al. [29] demonstrated that the administration of 1,25(OH)2 vitamin D3 in
alloxan-induced diabetic rats enhanced SOD, CAT and GPx activities (by 207, 52 and 72%, respectively) and decreased TBARS levels. They concluded that 1,25(OH)2 vitamin D3 might
be useful for the therapy and prevention of diabetes. In our study, CAT activity in liver did not change among groups. The activity of CAT is highest in the liver and kidney and lowest in connective tissues [30,31]. The difference may be due to the type of tissue analyzed or stress induced.
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