FACULDADE DE MEDICINA DE BOTUCATU
Efeito
in vitro
de inibidores de proteases sobre
trofozoítos de
Giardia duodenalis
Orientadora: Profª Drª Semíramis Guimarães Ferraz Viana
Co-orientadora: Profª Drª Teresa Cristina G. Oliveira-Sequeira
Tese apresentada ao Programa de
Pós-Graduação em Doenças Tropicais
da Faculdade de Medicina de
Botucatu/Unesp, para obtenção do
título de doutor em Doenças
Tropicais.
Efeito
in vitro
de inibidores de proteases
sobre trofozoítos de
Giardia duodenalis
Orientadora: Profª Drª Semíramis Guimarães Ferraz Viana
Co-orientadora: Profª Drª Teresa Cristina G. Oliveira-Sequeira
Tese apresentada ao Programa de
Pós-Graduação em Doenças Tropicais
da Faculdade de Medicina de
Botucatu/Unesp, para obtenção do
título de doutor em Doenças
Tropicais.
DIVISÃO TÉCNICA DE BIBLIOTECA E DOCUMENTAÇÃO - CAMPUS DE BOTUCATU - UNESP BIBLIOTECÁRIA RESPONSÁVEL: ROSEMEIRE APARECIDA VICENTE
Carvalho, Thaís Batista.
Efeito in vitro de inibidores de proteases sobre trofozoítos de Giardia duodenalis / Thaís Batista de Carvalho. – Botucatu : [s.n.], 2012
Tese (doutorado) - Universidade Estadual Paulista, Faculdade de Medicina de Botucatu
Orientador: Semíramis Guimarães Ferraz Viana
Co-orientador: Teresa Cristina Goulart Oliveira-Sequeira Capes: 40101096
1. Giardia. 2. Doenças parasitárias – Tratamento. 3. Serina proteinases.
“Bem aventurado o homem cuja força está em ti, em
cujo coração se encontram os caminhos aplanados, o
qual, passando pelo vale árido, faz dele um
manancial; de bençãos o cobre a primeira chuva”.
DEDICATÓRIA
Aos meus pais Célia e Erintos
Por toda a dedicação, pelos exemplos de força,
coragem, honestidade e caráter. Obrigada por me
incentivarem em todos os momentos a alcançar os meus
objetivos. Vocês são meus heróis!
À minha irmã Thalita
Exemplo de coragem, carinho e amizade. Maior
presente da minha vida!
À minha avó Judith (in memoriam)
A
À Deus por me iluminar nos momentos de dificuldade.
À Professora Dra Semíramis Guimarães Ferraz Viana pela orientação, amizade e ensinamentos compartilhados.
À Professora Dra Teresa Cristina G. Oliveira-Sequeira pela co-orientação, pela ideia inicial deste projeto, pelas correções e amizade.
Às companheiras de laboratório Érica, Ana Paula, Gabriela e Patrícia, pela amizade, favores prestados, experiências compartilhadas e pelo apoio em todos os momentos. Vocês tornaram o trabalho no laboratório muito mais divertido.
Ao amigo Gabriel Manolio pela colaboração nas etapas iniciais deste projeto.
Às amigas, Camila Marconi, Talísia Moreto, Juliana De Fazio, Lidiane Nagoshi, Mariana Braz e Daniela Moris pelo companheirismo, apoio e incentivo em todos os momentos.
Aos coordenadores do Programa de Pós-graduação em Doenças Tropicais, Dr Paulo Câmara Marques Pereira e Dra Sueli Aparecida Calvi, pela contribuição durante a execução deste trabalho.
À Professora Dra Daniela Carvalho dos Santos pelo auxílio na realização das análises ultraestruturais.
Ao Professor Dr José Eduardo Corrente do Grupo de Apoio à Pesquisa/FMB/Unesp pela realização da análise estatística.
Valdir Ângelo Paniguel, Antônio Roberto Gonzalez e Alessandra Ragozo pela amizade e por todos os favores prestados.
Aos funcionários do Centro de Microscopia Eletrônica do IBB/Unesp, Claudete dos Santos Tardivo, Lígia Barbosa Costa, Maria Helena, Tiago dos santos Tardivo e Rodrigo Ferreira, pela amizade e auxílio durante as etapas de processamento e análise ultraestrutural das amostras.
À pós-graduanda Lívia Lacorte pela amizade e auxílio com a montagem das pranchas de microscopia eletrônica.
Às pós-graduandas, Érica Zika e Giovana pela convivência e amizade.
À secretária da pós-graduação do Departamento de Doenças Tropicais Solange Sako Cagliari, pelas explicações, esclarecimento das dúvidas e pelos favores prestados.
À secretária do Grupo de Apoio à Pesquisa da FMB/Unesp, Juliana Cristina Interdonato pelos favores prestados.
Aos funcionários da Secção de Pós-graduação da Faculdade de Medicina de Botucatu, em particular à Regina, pela atenção e pelo pronto esclarecimento de todas as dúvidas.
À bibliotecária Rosimeire Aparecida Vicente pela confecção da ficha catalográfica.
Às senhoras Roseli e Valdirene pela amizade e limpeza do laboratório.
À CAPES pela concessão da bolsa de estudos.
LISTA DE ABREVIATURAS
LISTA DE FIGURAS
LISTA DE TABELAS
RESUMO ... i
ABSTRACT ... ii
1.INTRODUÇÃO ... 1
1.1.Aspectos gerais sobre Giardia duodenalis ... 2
1.2.Manifestações clínicas da giardíase... 4
1.3. Fisiopatologia da giardíase ... 6
1.4.Tratamento da giardíase ... 7
1.5.Proteases ... 10
1.6.Inibidores de proteases ... 13
2. OBJETIVOS ... 16
3. MATERIAL E MÉTODOS ... 18
3.1.Delineamento experimental ... 19
3.2.Cepa de Giardia duodenalis ... 20
3.3.Manutenção da cepa de G. duodenalis e obtenção da massa de trofozoítos ... 20
3.4.Inibidores sintéticos de proteases ... 20
3.5.Atividade in vitro de inibidores de proteases sobre trofozoítos de G. duodenalis .. 22
3.5.1.Atividade sobre o crescimento dos trofozoítos ... 22
3.5.2.Atividade sobre a aderência dos trofozoítos ... 22
3.5.3.Atividade sobre a viabilidade dos trofozoítos ... 23
3.5.4.Análise ultraestrutural dos trofozoítos por microscopia eletrônica de transmissão ... 24
3.5.4.1.Preparo das amostras ... 25
3.5.4.2.Processamento das amostras ... 25
duodenalis ... 28
4.1.1.Atividade dos inibidores de cisteína-proteases... 28
4.1.2.Atividade dos inibidores de serina-proteases ... 31
4.2.Atividade dos inibidores de proteases sobre a aderência dos trofozoítos de G. duodenalis ... 36
4.2.1.Atividade dos inibidores de cisteína-proteases... 36
4.2.2.Atividade dos inibidores de serina-proteases ... 39
4.3.Atividade dos inibidores de proteases sobre a viabilidade dos trofozoítos de G. duodenalis nos ensaios de crescimento e aderência ... 43
4.3.1.Atividade dos inibidores de cisteína-proteases... 43
4.3.2.Atividade dos inibidores de serina-proteases ... 46
4.4.Efeito dos inibidores de proteases sobre a ultraestrutura dos trofozoítos de G. duodenalis ... 49
4.4.1.Culturas não tratadas ... 49
4.4.2.Efeito dos inibidores de cisteína-proteases ... 52
4.4.3.Efeito dos inibidores de serina-proteases... 58
5.DISCUSSÃO ... 63
6.CONCLUSÕES ... 76
Å angstrom
CNT controle não tratado
DNA ácido desoxirribonucléico
DO densidade óptica
E-64 trans-epoxisuccinil-L-leucilamido (4-guanidino) butano
g gravidade
HCl ácido clorídrico
IAA iodoacetamida
P
Pg micrograma P
Pl microlitro P
Pm micrômetro P
PM micromolar mg miligrama
ml mililitro
MTT 3-(4,5-dimetiltiazol-2-yl)-2,5-difenil brometo de tetrazolium
MTZ metronidazol
nm nanômetro
OMS Organização Mundial da Saúde
PFOR Ferrodoxina piruvato oxidorredutase
PMS metassulfato de fenazina
Figura 1. Esquema do protocolo experimental. ... 19 Figura 2. Efeito in vitro do inibidor IAA (µM) sobre o crescimento de trofozoítos de G. duodenalis. Cultivos não tratados (CNT) e tratados com metronidazol (MTZ) a 40 µg/ml foram incluídos como controles. Os valores correspondem ao nº médio de trofozoítos (x105) ± o
desvio padrão em ensaios realizados em triplicata. ... 29 Figura 3. Efeito in vitro do inibidor E-64 (µM) sobre o crescimento de trofozoítos de G. duodenalis. Cultivos não tratados (CNT) e tratados com metronidazol (MTZ) a 40 µg/ml foram incluídos como controles. Os valores correspondem ao nº médio de trofozoítos (x105) ± o
Figura 11. Efeito in vitro do inibidor TLCK (µM) sobre a aderência de trofozoítos de G. duodenalis. Cultivos não tratados (CNT) e tratados com metronidazol (MTZ) a 40 µg/ml foram incluídos como controles. Os valores correspondem ao nº médio de trofozoítos (x105) ± o
desvio padrão em ensaios realizados em triplicata ... 42 Figura 12. Viabilidade (teste de MTT) de G. duodenalis após incubação com diferentes concentrações dos inibidores IAA (A) e E-64 (B). Cultivos tratados com metronidazol (MTZ) a 40 µg/ml foram incluídos como controles. Os valores correspondem às médias ± o desvio padrão em ensaios realizados em triplicata ... 45 Figura 13. Viabilidade (teste de MTT) de G. duodenalis após incubação com diferentes concentrações dos inibidores antipaina (A), leupeptina (B) e TLCK (C). Cultivos tratados com metronidazol (MTZ) a 40 µg/ml foram incluídos como controles. Os valores correspondem às médias ± o desvio padrão em ensaios realizados em triplicata. ... 48 Figura 14.Micrografias mostram, em secção transversa, o aspecto típico do citoplasma, os dois núcleos (N), o disco adesivo (D), os três pares de axonemas (AX), a franja ventrolateral (FVL), as vesículas periféricas (VP) e o retículo endoplasmático (RE). ... 51 Figura 15. Microgafias de trofozoítos de G. duodenalis expostos à IAA na concentração de 10 µM. Em A, trofozoítos caracterizam-se pela desorganização dos axonemas (AX), pela presença
de espaços vazios no citoplasma (área circulada) e pela presença de “blebs” na membrana
celular (asterisco). A partir de 48 horas (B), notar a internalização do disco adesivo (seta) e a alteração na forma dos trofozoítos. Condensação da cromatina pôde ser visualizada a partir de 72 horas (cabeça de seta) ... 53 Figura 16. Micrografias de trofozoítos de G. duodenalis expostos ao E-64 na concentração de 10 µM. Características visíveis incluem após 24 horas (A), a presença de espaços vazios no citoplasma (área circulada); e (B-C) o deslocamento dos axonemas flagelares (AX) após 48 e 72 horas. Notar em C, a condensação da cromatina nuclear (cabeça de seta) e a formação de
pequenos “blebs” (seta) na membrana celular ... 54
Figura 19. Micrografias de trofozoítos de G. duodenalis expostos à leupeptina na concentração de 10 µM. Características visíveis após o tratamento incluem a alteração na forma celular, o deslocamento dos axonemas flagelares (AX) e a presença de espaços vazios na matriz citoplasmática, semelhantes a fendas (seta) ou orifícios (área circulada). Em C nota-se a condensação da cromatina (cabeça de seta) e a manutenção da integridade da membrana nuclear ... 59 Figura 20. Micrografias de trofozoítos de G. duodenalis expostos à leupeptina na concentração de 100 µM. Após tratamento com essa concentração, trofozoítos apresentaram alterações ultraestruturais marcantes, como: (A) presença de vacúolo próximo ao disco adesivo (seta) e vesículas periféricas repletas de material elétron denso (VP cabeça de seta). Em (B-C) notam-se, respectivamente, a presença de corpo lamelar no citoplasma (área circulada), a fragmentação do disco adesivo (D) e a desorganização dos axonemas flagelares (AX) ... 60 Figura 21. Micrografias de trofozoítos de G. duodenalis expostos ao TLCK nas concentrações de 10 e 100 µM. As alterações ultraestruturais induzidas por esse inibidor foram semelhantes nas duas concentrações avaliadas. As características visualizadas em maior frequência foram
a presença de espaços vazios no citoplasma (área circular), formação de “blebs” (cabeça de
Tabela 1. Número médio de trofozoítos (n x105/ml) de
G. duodenalis recuperados em
cultivos tratados com IAA, segundo a concentração do inibidor e o período de incubação ... 29 Tabela 2. Número médio de trofozoítos (n x105/ml) de
G. duodenalis recuperados em
cultivos tratados com E-64, segundo a concentração do inibidor e o período de incubação ... 30 Tabela 3. Porcentagem média de inibição do crescimento de trofozoítos de G.
duodenalis em cultivos tratados com IAA e E-64, segundo a concentração do inibidor e
o período de incubação ... 31 Tabela 4. Número médio de trofozoítos (n x 105/ml) de
G. duodenalis recuperados em
cultivos tratados com antipaina, segundo a concentração do inibidor e o período de incubação ... 32 Tabela 5. Número médio de trofozoítos (n x 105/ml) de
G. duodenalis recuperados em
cultivos tratados com leupeptina, segundo a concentração do inibidor e o período de incubação ... 33 Tabela 6. Número médio de trofozoítos (n x 105/ml) de
G. duodenalis recuperados em
cultivos tratados com TLCK, segundo a concentração do inibidor e o período de incubação. ... 34 Tabela 7. Porcentagem média de inibição do crescimento de trofozoítos de G.
duodenalis em cultivos tratados com antipaina, leupeptina e TLCK, segundo a
concentração do inibidor e o período de incubação. ... 35 Tabela 8. Número médio de trofozoítos aderidos (n x 105/ml) de
G. duodenalis
recuperados em cultivos tratados com IAA, segundo a concentração do inibidor e o período de incubação. ... 37 Tabela 9. Número médio de trofozoítos aderidos (n x 105/ml) de
G. duodenalis
recuperados em cultivos tratados com E-64, segundo a concentração do inibidor e o período de incubação. ... 38 Tabela 10. Porcentagem média de inibição da aderência de trofozoítos de G.
duodenalis em cultivos tratados com IAA e E-64, segundo a concentração do inibidor e
o período de incubação. ... 40 Tabela 12. Número médio de trofozoítos aderidos (n x 105/ml) de
G. duodenalis
recuperados em cultivos tratados com leupeptina, segundo a concentração do inibidor e o período de incubação. ... 41 Tabela 13. Número médio de trofozoítos aderidos (n x 105/ml) de
G. duodenalis
recuperados em cultivos tratados com TLCK, segundo a concentração do inibidor e o período de incubação. ... 42 Tabela 14. Porcentagem média de inibição da aderência de trofozoítos de G.
duodenalis em cultivos tratados com antipaina, leupeptina e TLCK, segundo a
concentração do inibidor e o período de incubação. ... 43 Tabela 15. Porcentagem de trofozoítos viáveis de G. duodenalis determinada pelo
teste de MTT nos ensaios de crescimento após tratamento com IAA e E-64, segundo a concentração do inibidor e o período de incubação. ... 45 Tabela 16. Porcentagem de trofozoítos viáveis de G. duodenalis determinada pelo
teste de MTT nos ensaios de aderência após o tratamento com IAA e E-64, segundo a concentração do inibidor e o período de incubação. ... 46 Tabela 17. Porcentagem de trofozoítos viáveis de G. duodenalis determinada pelo
teste de MTT nos ensaios de crescimento após tratamento com antipaina, leupeptina e TLCK, segundo a concentração do inibidor e o período de incubação. ... 47 Tabela 18. Porcentagem de trofozoítos viáveis de G. duodenalis determinada pelo
teste de MTT nos ensaios de aderência após o tratamento com antipaina, leupeptina e TLCK, segundo a concentração do inibidor e o período de incubação. ... 49
Entre os alvos mais promissores para o desenvolvimento de novos agentes
antiparasitários, destacam-se as proteases que nos protozoários participam de processos
metabólicos e fisiológicos, atuando como importantes fatores de virulência. Como a
atividade dessas moléculas pode ser controlada por inibidores específicos, essas
substâncias têm sido avaliadas quanto ao potencial terapêutico em diferentes infecções
parasitárias, inclusive por Giardia. O presente estudo foi desenvolvido com o objetivo de
avaliar o efeito in vitro dos inibidores de cisteína (IAA e E-64) e serina-proteases
(antipaina, leupeptina e TLCK) sobre o crescimento, aderência, viabilidade e ultraestrutura
de trofozoítos de cepa de Giardia isolada e axenizada em Botucatu. Para isso, trofozoítos
foram incubados em meio contendo os inibidores a diferentes concentrações durante 24,
48 e 72 horas. Nos ensaios de crescimento e aderência, o número de trofozoítos foi
estimado a partir de contagens em hemocitômetro, enquanto que a viabilidade celular e as
alterações ultraestruturais foram avaliadas, respectivamente, pelo método de redução do
MTT e por microscopia eletrônica de transmissão. De acordo com as observações feitas
no presente estudo, todos os inibidores de proteases apresentaram efeito sobre o
crescimento, aderência e viabilidade dos trofozoítos. Entretanto, melhor desempenho
quanto à capacidade de reduzir os parâmetros avaliados foi demonstrado nos ensaios com
os inibidores de cisteína-proteases, especialmente a IAA. As maiores porcentagens de
inibição do crescimento e aderência e as menores taxas de viabilidade foram observadas
após o tratamento com IAA. Da mesma forma, as alterações ultraestruturais mais
marcantes ficaram a cargo deste inibidor, principalmente após exposição a 100 µM,
quando foi possível demonstrar acentuada desorganização nuclear e citoplasmática, além
de alterações drásticas em estruturas do citoesqueleto como o disco adesivo e axonemas
flagelares. Os resultados deste estudo revelam que inibidores de proteases, em especial,
cisteína-proteases, interferem em aspectos cruciais para a sobrevivência do parasita e
abrem perspectivas para investigações futuras, a fim de que se confirme o real potencial
The quest for new antiparasitic alternatives has led researchers to base their studies on
insights into biology, host-parasite interactions and pathogenesis. In light of this, the
proteolytic enzymes or proteases have excited the researcher’s interest, once they have
been identified as important virulence factors as well as potential chemotherapeutic targets
in parasites. Considering that proteases are naturally regulated by specific inhibitors, these
substances have been evaluated for their therapeutic potential in parasitic infections
including Giardia. In this way, we proposed to evaluate the in vitro effect of inhibitors of
cysteine (IAA and E-64) and serine proteases (antipain, leupeptin and TLCK) on growth,
adherence, viability and ultrastructure of Giardia trophozoites of a strain isolated and
axenized in Botucatu. For this, trophozoites were incubated in medium containing the
inhibitors at various concentrations for 24, 48 and 72 hours. In growth and adherence
assays, the number of trophozoites was estimated microscopically in a haemocytometer,
whereas cell viability and ultrastructural changes were evaluated, respectively, by the
method of MTT and transmission electron microscopy. In this study, all protease inhibitors
showed effect on growth, adherence and viability of trophozoites. However, better
performance in their ability to reduce the parameters assessed was demonstrated in
experiments with cysteine proteases inhibitors, especially IAA. The highest rates of growth
and adhesion inhibition and the lowest rates of viability were detected in the IAA-treated
cultures. Likewise, ultrastructural changes were most marked with this inhibitor, especially
after exposure to 100 µM, when it was possible to demonstrate strong nuclear and
cytoplasmic disorganization and drastic changes in cytoskeleton structures as the adhesive
disc and flagellar axonemes. The results of this study show that protease inhibitors, in
particular the cysteine ones interfere in some crucial processes to the parasite survival and
it opens perspectives for future investigations in order to confirm the real giardicidal
1. INTRODUÇÃO
1.1. Aspectos gerais sobre Giardia duodenalis
O gênero Giardia inclui protozoários flagelados que parasitam o intestino
delgado de várias espécies de vertebrados, incluindo mamíferos, aves, répteis e anfíbios. Embora, já se tenha passado mais de 300 anos da sua descoberta por Anton van Leeuwenhoek, Giardia ainda é considerado um dos 10 principais parasitas que
infectam o homem, principalmente, nos países em desenvolvimento, onde é uma das causas mais comuns de diarréia infecciosa1,2. Nas nações desenvolvidas, a giardíase
é frequentemente referida como uma doença re-emergente dada a sua participação em surtos diarréicos em creches e a associação de sua veiculação pela água de consumo1.
Após a criação do gênero Giardia por KUNSTLER3, vários nomes foram
atribuídos às espécies, entre eles, Giardia intestinalis, Giardia duodenalis, Giardia
lamblia e Giardia enterica. Vale destacar que as denominações G. lamblia, G.
duodenalis e G. intestinalis têm sido empregadas como sinonímia, particularmente
para isolados de origem humana.
Apesar de ter sido observada pela primeira vez em 1681, Giardia apenas
começou a despertar maior interesse dos pesquisadores em 1932, quando o parasitologista Charles Stiles suspeitou de que havia uma relação entre a infecção pelo protozoário e a ocorrência de casos de diarréia4. A partir de então, apesar de ter
sido um dos parasitas mais investigados, ainda persistem inúmeros questionamentos em relação à sua taxonomia, patogenicidade e ao potencial zoonótico.
Ainda hoje, a taxonomia desse protozoário é controversa e a determinação das espécies tem se baseado em critérios como hospedeiro de origem e características morfológicas. Entretanto, diferentes autores acreditam que considerar o hospedeiro não constitui um critério válido, uma vez que pela análise do DNA, espécies de Giardia
mesma espécie hospedeira podem ser marcantemente diferentes5. Diante disso, a
classificação proposta por FILICE6 em 1952 tem sido a mais aceita, sendo que, de
acordo com este sistema, o gênero Giardia é dividido em três espécies: G. duodenalis
que infecta mamíferos, inclusive o homem, aves e répteis, G. muris que infecta
roedores, aves e répteis e G. agilis, parasita de anfíbios. Além destas, três outras
espécies foram propostas nas décadas de 80 e 90 tendo por base a morfologia dos cistos e a análise do RNA ribossômico: G. psittaci7 e G. ardeae8 descritas em
periquitos e garças azuis, respectivamente e G. microti, encontrada em roedores
conhecidos como camundongo-do-campo e rato-almiscarado9,10.
Além do homem, G. duodenalis pode infectar outros mamíferos, incluindo
animais de companhia como cães e gatos e uma variedade de animais domésticos e silvestres. Estudos moleculares recentes têm revelado que G. duodenalis inclui
isolados morfologicamente indistinguíveis, porém geneticamente distintos. Até o momento, isolados obtidos do homem e de outros mamíferos foram incluídos em oito genótipos principais, denominados “assemblages” (A até H) que apresentam diferentes padrões de especificidade pelos hospedeiros, além de outras diferenças fenotípicas. As observações feitas através de estudos moleculares revelam que o homem e outras espécies de mamíferos podem ser infectados pelos genótipos identificados como A e B que incluem isolados considerados potencialmente zoonóticos2,11.
No que se refere à biologia, o gênero Giardia apresenta apenas duas formas
evolutivas estruturalmente e bioquimicamente distintas, o trofozoíto e o cisto. Os trofozoítos são as formas flageladas responsáveis pelas manifestações clínicas da giardíase, enquanto os cistos representam o estágio infectante, pois exibem uma rígida parede protetora que permite a sobrevivência do parasita fora do hospedeiro12.
água e alimentos contaminados ou diretamente de pessoa a pessoa. Após a ingestão dos cistos, o ambiente ácido do estômago promove a ruptura da parede cística, liberando consequentemente, os trofozoítos no duodeno, onde ocorrem a replicação do parasita e as alterações no tecido do hospedeiro13,14.
A infecção por Giardia apresenta ampla distribuição mundial, afetando
anualmente cerca de 280 milhões de pessoas15. Segundo a Organização Mundial da
Saúde16, estima-se que 200 milhões de pessoas residentes na Ásia, África e América
Latina apresentem giardíase sintomática, sendo 500 mil novos casos registrados a cada ano. As maiores taxas de prevalência ainda são observadas nas populações que habitam países em desenvolvimento, especialmente em crianças. As taxas de infecção podem variar de 8 a 30% e raramente se apresentam abaixo de 4%16. Com
relação aos indivíduos residentes em países desenvolvidos, como por exemplo, os Estados Unidos, Giardia é o enteropatógeno mais comumente diagnosticado, sendo a
prevalência estimada entre 2 a 5%17. Nessas áreas, além das altas prevalências
constatadas em grupos específicos, como em viajantes e homens homossexuais, a infecção por Giardia é a causa mais frequente de surtos epidêmicos de diarréia
associados à água para consumo18.
Devido a sua característica cosmopolita e por estar intimamente associada às precárias condições sócio-econômicas e higiênico-sanitárias, a giardíase está inserida,
desde 2004, no grupo “WHO Neglected Diseases Initiative” que reúne doenças
negligenciadas nos países em desenvolvimento e que guardam estreita relação com a pobreza, com a falta de saneamento básico e com a qualidade da água de consumo19.
1.2. Manifestações clínicas da giardíase
A infecção por Giardia apresenta um espectro clínico diverso, entretanto dois
terços dos indivíduos infectados permanecem assintomáticos20. Nas infecções
os sintomas desaparecem em algumas semanas21. A diarréia pode vir acompanhada
em alguns casos por outros sintomas, como a síndrome de má absorção, náuseas, vômitos e perda de peso. Embora raras, as reações de hipersensibilidade, como prurido, urticária, sinovite e sensibilização a determinados alimentos, podem ocasionalmente ocorrer22,23,24,25,26.
Os fatores de risco para a aquisição das parasitoses são similares para indivíduos imunocompetentes e imunossuprimidos. Todavia, a resposta imune tem um papel fundamental no estabelecimento de tais infecções, no controle ou disseminação da doença e na eliminação do parasita, visto que indivíduos imunossuprimidos têm um risco aumentado para desenvolver giardíase crônica27,28. Além da imunidade, outros
fatores podem contribuir para a diversidade clínica observada em indivíduos infectados
por Giardia. Entre eles incluem-se aqueles inerentes ao hospedeiro, tais como idade,
exposição prévia, dieta e microbiota intestinal e aqueles próprios do parasita, como velocidade de multiplicação, proteínas de superfície variantes específicas, resistência aos quimioterápicos e evasão à resposta imune do hospedeiro29.
O maior impacto clínico da infecção por Giardia é observado em indivíduos
malnutridos, imunossuprimidos e em crianças, especialmente aquelas em idade pré-escolar30. Determinados pacientes imunossuprimidos, como por exemplo, aqueles com
hipogamaglobulinemia, deficiência de imunoglobulina A ou com doenças linfoproliferativas que envolvem o trato gastrointestinal, parecem ser bastante suscetíveis à giardíase e nestes casos, frequentemente, as infecções são difíceis de curar31,32. Nas crianças, a cronicidade da giardíase pode promover retardo no
1.3. Fisiopatologia da giardíase
A adesão dos trofozoítos à mucosa intestinal é uma etapa primordial no estabelecimento e manutenção da colonização. O envolvimento do disco ventral e de outros componentes de superfície do parasita, como as giardinas, as lectinas, as proteínas contráteis do citoesqueleto e as cisteína-proteases são de fundamental importância nesse processo33,34,35.
Diferentemente do que ocorre em outras infecções parasitárias, Giardia pode
determinar alterações morfológicas e fisiológicas do epitélio intestinal sem que haja invasão tecidual e celular. A colonização do intestino pelo parasita pode alterar a arquitetura da mucosa intestinal, especialmente, no que diz respeito à organização das microvilosidades. Análises histopatológicas de biópsias intestinais obtidas de animais inoculados experimentalmente e de indivíduos infectados têm revelado alterações que podem variar desde o achatamento até a atrofia das microvilosidades36,37, levando
consequentemente a má digestão e absorção. Outras alterações já evidenciadas na fisiologia do epitélio intestinal e que contribuem para a produção de diarréia, incluem a apoptose dos enterócitos, a ruptura da barreira epitelial e o aumento da permeabilidade celular28. Estudos
in vivo têm demonstrado que as elevações na
permeabilidade celular e no consumo de macromoléculas coincidem com o pico de colonização dos trofozoítos, sendo que esses índices retornam às condições basais com a eliminação do parasita38.
A infecção por Giardia pode provocar também, modificações em sítios
extraintestinais, sendo já descritas nos olhos39, músculos40, pele41 e circulação25.
Essas modificações ocorrem na ausência de disseminação extraintestinal do parasita, evidenciando a participação da imunidade nesse processo. Ainda não estão claros os mecanismos que levam a tais condições, entretanto, acredita-se que a ruptura da barreira epitelial tenha uma participação efetiva28. Evidências recentes indicam que a
doença gastrointestinal crônica bastante comum, caracterizada por náuseas, dor abdominal, flatulência, diarréia ou constipação intestinal42.
Mesmo que os mecanismos envolvidos na fisiopatologia da infecção por
Giardia ainda não tenham sido completamente compreendidos, a grande maioria dos
pesquisadores concorda que a interação entre o parasita e a resposta imune do hospedeiro seja uma das causas dos distúrbios intestinais associados à giardíase.
Estudos bioquímicos e de biologia molecular têm possibilitado a identificação de moléculas do parasita que participam da patogênese da giardíase. Atualmente, os pesquisadores têm chamado a atenção para o fato de que a atividade de produtos do parasita sobre a mucosa intestinal pode alterar a permeabilidade das células, e com isso, quebrar a função do epitélio como barreira43,44. Até o presente, sabe-se que
trofozoítos de Giardia apresentam uma variedade de substâncias potencialmente
tóxicas, entre as quais se destacam proteínas, inclusive aquelas excretadas ou secretadas e lectinas que podem ser responsáveis por causar injúrias no epitélio intestinal45,46,47.
1.4. Tratamento da giardíase
A intervenção medicamentosa para indivíduos com infecção aguda ou para aqueles portadores crônicos tem sido recomendada como estratégia preventiva para limitar a transmissão e reduzir a giardíase em áreas endêmicas48. Atualmente,
algumas medidas terapêuticas têm sido disponibilizadas na prática clínica para o tratamento da giardíase, sendo que entre elas incluem-se os medicamentos tradicionalmente utilizados, como os 5-nitroimidazóis (metronidazol, tinidazol, ornidazol e secnidazol), a quinacrina, a furazolidona e a paromicina e outros agentes recentemente introduzidos como os benzomidazóis (albendazol e mebendazol) e a nitazoxanida49.
particularmente, a alta incidência de falência terapêutica, as recaídas e a produção de efeitos colaterais indesejáveis32,50. Algumas evidências têm sugerido que a resistência
às drogas, seja devido à seleção e evolução de cepas resistentes, às reinfecções ou às anormalidades farmacocinéticas do indivíduo infectado, pode representar um dos mecanismos responsáveis pela falha terapêutica31,32.A refratariedade aos tratamentos
convencionais para giardíase já foi documentada tanto em indivíduos imunocompetentes quanto imunossuprimidos, apesar de ser mais comumente observada em grupos portadores de alguma imunodeficiência. Assim, alguns indivíduos com aids e que apresentam contagem de linfócitos TCD4+ menor do que
200 células/mm3 de sangue podem, por exemplo, desenvolver giardíase grave e não
costumam responder à terapia convencional31.
De todas as drogas antigiardíase disponíveis, as mais amplamente utilizadas têm sido os nitroimidazóis, particularmente o metronidazol e os benzomidazóis, como o albendazol. Desde a sua descoberta, em 1955, os nitroimidazóis mostraram-se efetivos contra inúmeras infecções ocasionadas por protozoários, entre os quais,
Trichomonas vaginalis e Entamoeba histolytica51. Entretanto, apenas a partir de 1962,
DARBON et al.52 reportaram que esse quimioterápico poderia ser utilizado, também,
no tratamento da giardíase. Quanto ao albendazol, estudos clínicos e in vitro têm
fornecido resultados conflitantes. A suscetibilidade in vitro de trofozoítos de Giardia ao
albendazol apresenta-se inferior àquela observada pelos nitroimidazóis. Casos de resistência in vitro têm sido associados às mudanças no citoesqueleto do parasita,
visto que os benzomidazóis exercem seus efeitos tóxicos após a ligação à tubulina presente nessa estrutura49. Em países em desenvolvimento, onde predominam
precárias condições higiênico-sanitárias e encontram-se habitualmente populações poliparasitadas, o albendazol tem ocupado lugar de destaque no tratamento da giardíase53.
inicial na ativação do metronidazol ocorre após a transferência de elétrons para o grupo 5-nitro presente em sua estrutura química. Como resultado dessa ativação, ocorre redução desse grupo químico para a forma tóxica ativada (radical nitro). Uma enzima específica presente no metabolismo anaeróbio dos trofozoítos de Giardia,
denominada ferrodoxina piruvato oxidorredutase (PFOR) e a proteína ferrodoxina são consideradas as principais fontes doadoras de elétrons para essa reação. Uma vez reduzido, o metronidazol liga-se ao DNA da célula promovendo a perda da estrutura helicoidal e a desestabilização da molécula, levando consequentemente à morte do trofozoíto. Além disso, são liberados radicais tóxicos que têm a capacidade de interferir no metabolismo celular54. Como o metronidazol mostra-se efetivo apenas
sobre as formas trofozoíticas, cistos viáveis continuam sendo excretados para o ambiente durante o tratamento48.
Os efeitos colaterais mais constatados após o tratamento com o metronidazol incluem cefaléia, vertigem, náusea e gosto metálico desagradável ao paladar. Sintomas mais graves, como pancreatite, neutropenia reversível e toxicidade ao sistema nervoso central já foram, também, atribuídos a esse nitroimidazol. Mutagenicidade e carcinogenicidade posteriores ao emprego de altas dosagens do composto durante longos períodos, apesar de já descritas, respectivamente, em bactérias e roedores, ainda não foram evidenciadas em humanos49.
Estima-se que a prevalência de resistência clínica ao metronidazol seja de 20%, sendo reportadas taxas de recorrência em até 90% dos casos32. Um dos
mecanismos de resistência ao metronidazol em Giardia e em outros protozoários
anaeróbios envolve a redução na atividade da enzima ferrodoxina piruvato oxidorredutase e a consequente diminuição na transferência de elétrons para a ferrodoxina, apesar dessas substâncias serem fundamentais para a produção de energia para esses organismos55,56,57. Além desse mecanismo, LIU et al.58 já
demonstraram diminuição nos níveis de ferrodoxina do tipo I em isolados de Giardia
autores sugerem que tanto a redução nos níveis da ferrodoxina quanto na atividade da enzima PFOR comprometem a ativação e limitam a eficácia do metronidazol no tratamento da giardíase.
1.5. Proteases
As proteases são enzimas amplamente distribuídas na natureza, podendo ser identificadas em diferentes sistemas biológicos, desde os vírus até os vertebrados. Essas moléculas, também denominadas enzimas proteolíticas, caracterizam-se pela capacidade de catalisar a hidrólise das ligações entre os peptídeos de uma proteína59.
Há alguns anos, as proteases dos parasitas, incluindo Giardia, têm despertado
grande interesse dos pesquisadores, sendo que a identificação e a caracterização dessas enzimas abrangem um grande volume de investigações, em especial, no que se refere às proteases ligadas à superfície e àquelas excretadas e/ou secretadas47,60,61,62.
As proteases constituem uma grande família e geralmente têm sido classificadas com base em dois critérios principais: o tipo de reação catalisada e a natureza química do sítio catalítico. De acordo com a posição da ligação peptídica a ser clivada na cadeia, as proteases podem ser subdivididas em endopeptidases e exopeptidases. Além disso, baseando-se no grupo funcional presente no sítio ativo, as endopeptidases podem ser subclassificadas em cinco grupos principais: cisteína-proteases ou tiol cisteína-proteases, serina-cisteína-proteases, metalo-cisteína-proteases, aspartil-cisteína-proteases59 e
treonina-proteases63.
moléculas no ciclo de vida de organismos patogênicos tem tornado-as alvo para o desenvolvimento de quimioterápicos e vacinas contra algumas infecções64. No que se
refere à Giardia, pouco ainda é conhecido, apesar de existirem evidências de que a
proteólise esteja envolvida na sua nutrição, desenvolvimento e patogenicidade60.
Recentemente, foram identificadas a partir de sequências homólogas, 73 proteases pertencentes a cinco classes catalíticas no genoma de Giardia da cepa
referência WB (clone C6). DAVIDS et al.65 evidenciaram através da análise do
transcriptoma que as enzimas se dispõem na seguinte frequência: cisteína-proteases (49,3%), sendo seguida por metalo (24,7%), serina (13,7%), treonina (9,6%), asparto (1,35%) e tipos catalíticos desconhecidos (1,35%). Portanto, verificou-se que aproximadamente 1,46% do genoma de Giardia é composto pelas peptidases e seus
homólogos inativos, os quais provavelmente atuam na regulação da atividade dessas enzimas65.
A incidência global das infecções parasitárias aliada à emergência da resistência às drogas têm favorecido o desenvolvimento de novos agentes terapêuticos. As proteases, especialmente as cisteínas estão entre os alvos mais promissores para o desenvolvimento desses tratamentos59.
As cisteína-proteases são consideradas importantes fatores de virulência por desempenharem um papel primordial no ciclo de vida de muitos microorganismos, participando do crescimento, da diferenciação e sobrevivência no hospedeiro66. Além
disso, representam o grupo de enzimas proteolíticas que se expressam em maior quantidade nos protozoários parasitas, podendo contribuir para a produção de doença ao atuarem como toxinas67. Dada a sua característica imunogênica, essas enzimas
têm sido também, exploradas como marcadores diagnósticos para algumas doenças infecciosas e parasitárias66.
terapêuticos para diferentes e variadas patologias devido a sua elevada distribuição em processos fisiopatológicos. Nos protozoários, tais proteínas podem desempenhar suas funções tanto em compartimentos intracelulares como em ambiente extracelular. Essa seletividade biológica tem sido explorada para o desenvolvimento de substâncias capazes de inibir a atividade de proteases presentes em diferentes parasitas, especialmente nos protozoários, Entamoeba histolytica, Toxoplasma gondii,
Trypanosoma cruzi e Plasmodiumfalciparum66,68.
Em relação à Giardia, aproximadamente 27 genes para cisteína-proteases já
foram identificados no seu genoma, sendo que as enzimas codificadas por esses genes distribuem-se em três classes principais, a saber, catepsina B-like, catepsina C-like e catepsina K/L-like. No entanto, sabe-se que os genes pertencentes à família das
catepsinas B-like se expressam com maior frequência do que os das demais classes69.
YEE e NASH70 conseguiram estabelecer que as catepsinas
B-like de Giardia
localizam-se em compartimentos intracelulares semelhantes ao retículo endoplasmático, sendo que essa organela parece ser de fundamental importância na endocitose das proteínas do hospedeiro pelo parasita69.
Resultados obtidos a partir de ensaios in vitro desenvolvidos em diferentes
investigações, inclusive por nosso laboratório, têm demonstrado a presença de proteases, principalmente cisteína-proteases em lisados de trofozoítos de
Giardia61,71,72,73 e nos produtos por eles secretados47,62. Diante disso, tem-se
especulado sobre as possíveis funções dessas enzimas. Uma delas parece estar associada ao ciclo evolutivo do parasita, visto que WARD et al.74 relataram que uma
protease catepsina B-like de 30 kDa está envolvida no desencistamento, atuando
provavelmente na quebra da parede cística.
protéicos, como colágeno, imunoglobulina A e hemoglobina, principalmente por cisteínas presentes em lisados33,61 e produtos de excreção/secreção de trofozoítos de
Giardia47,62.
As proteases de Giardia também podem estar envolvidas no desencadeamento
da resposta imune do hospedeiro, visto que JIMÉNEZ et al.75 verificaram a produção
local e sistêmica de anticorpos em camundongos após o tratamento oral com cisteínas excretadas e secretadas pelos trofozoítos. Mais recentemente, ao analisar esplenócitos de camundongos estimulados com produtos excretados e secretados por esse flagelado, os mesmos autores demonstraram a elevada produção das citocinas IL-4, IL-5 e IL-10 e diminuição nos níveis de INF-J, evidenciando um provável
mecanismo de escape desse parasita ao desviar o padrão de resposta imune para o perfil Th276.
1.6. Inibidores de proteases
Nos seres vivos, incluindo os organismos patogênicos, a atividade das proteases é naturalmente regulada por inibidores específicos. Diante disso, o emprego dessas substâncias em diferentes ensaios tem possibilitado a investigação das propriedades bioquímicas e das funções biológicas das mais diversas proteases77.
Os inibidores de proteases começaram a receber especial destaque como quimioterápicos, a partir do emprego de bloqueadores de aspartil-proteases no tratamento de indivíduos HIV positivos. Atualmente, vários inibidores têm sido desenvolvidos e avaliados quanto a possível utilização no tratamento de patologias como hipertensão, diabetes, trombose, osteoporose, câncer e doenças infecciosas78.
Por serem moléculas direcionadas contra as enzimas responsáveis pela virulência de vários agentes patogênicos, os inibidores têm sido vistos como uma das estratégias mais promissoras no desenvolvimento de novos agentes terapêuticos em muitas infecções parasitárias79. Considerando que proteases homólogas podem
determinadas situações, um único inibidor poderia ser utilizado como alternativa terapêutica78.
Nos últimos anos, têm-se realizado várias investigações com o intuito de avaliar o potencial terapêutico dos inibidores de proteases em infecções parasitárias, como por exemplo, malária e doença de Chagas. Assim sendo, o tratamento e a cura dessas infecções têm sido demonstrados em animais de experimentação, mediante o emprego de inibidores de cisteína-proteases80,81,82. Esses estudos têm fornecido
importantes evidências de que essas substâncias podem eliminar seletivamente os microorganismos sem, contudo, provocarem efeitos tóxicos para o hospedeiro. Ainda nesse contexto, estudos in vitro têm demonstrado a eliminação dos parasitas T.
vaginalis e Leishmania major após o tratamento dos cultivos com os inibidores de
cisteína-proteases83,84.
No que diz respeito à Giardia, até o presente, existem apenas dois estudos que
avaliam a atuação dos inibidores sobre as formas de vida do parasita. Em uma dessas investigações, DUNN et al.85 observaram que o tratamento dos cultivos com um
inibidor antirretroviral de proteases comercialmente disponível (Kaletra£) promove a
inibição no crescimento dos trofozoítos e o bloqueio no desenvolvimento do parasita durante a fase de citocinese. Mais recentemente, ao avaliar o efeito terapêutico do inibidor E-64 sobre cultivos axênicos e em ensaios in vivo, HUSSEIN et al.86
evidenciaram, respectivamente, a redução das taxas de desencistamento e de excreção das formas císticas. Esses resultados são relevantes, principalmente do ponto de vista clínico, dada a elevada prevalência da infecção por Giardia em
indivíduos HIV positivos e a emergência de cepas resistentes ao tratamento convencional com o metronidazol.
a ação de novos quimioterápicos. Dessa forma, o estudo de compostos que sejam capazes de inibir a atividade dessas enzimas consiste em uma alternativa promissora para o tratamento de uma variedade de infecções causadas por parasitas, inclusive
Giardia. Considerando que os inibidores de proteases são compostos muito seletivos,
a utilização dessas substâncias como antiparasitários poderia ser importante para a redução da morbidade e resistência clínica ao tratamento convencional recomendado na giardíase, principalmente em crianças e indivíduos com deficiência nutricional e imunológica, nos quais são frequentes as formas sintomáticas da infecção.
A avaliação do potencial antiparasitário de qualquer substância requer modelos adequados que possibilitem identificar os processos biológicos sobre os quais essas substâncias atuam. Os ensaios in vitro constituem uma etapa preliminar
nos estudos desenvolvidos para avaliar o potencial antiparasitário de diferentes princípios ativos. Assim, com o advento e a implementação do cultivo axênico de trofozoítos de Giardia, avanços significativos na avaliação in vitro do efeito giardicida
de várias substâncias têm sido alcançados, especialmente, quando avaliadas quanto à capacidade de determinar alterações morfológicas e do metabolismo, induzir morte celular e interferir na viabilidade, crescimento e aderência do parasita.
Diante dessas considerações, propusemos para o presente projeto, um estudo
in vitro visando avaliar a atividade antiparasitária de inibidores de proteases sobre
trofozoítos de cepa de G. duodenalis isolada e axenizada em Botucatu, a partir de
2. OBJETIVOS
Objetivo geral
Avaliar in vitro o efeito de inibidores de cisteína-proteases e
serina-proteases sobre trofozoítos de G. duodenalis de cepa isolada e axenizada em
Botucatu.
Para este fim, foram avaliados os seguintes parâmetros:
x A atividade dos inibidores de proteases sobre o crescimento e a aderência dos trofozoítos;
x A atividade dos inibidores de proteases sobre a viabilidade dos trofozoítos aderidos e em processo de replicação;
3. MATERIAL E MÉTODOS1
3.1. Delineamento experimental
Para a realização do presente trabalho, foi adotado o protocolo apresentado na Figura 1.
Cultivo axênico de Giardia duodenalis
Cepa BTU-11
Massa de trofozoítos
105trofozoítos/ml
Culturas tratadas com
metronidazol
Culturas não tratadas
Culturas tratadas com Inibidores de
proteases
E-64 IAA Antipaina Leupeptina
TLCK
Parâmetros analisados
Crescimento Aderência Viabilidade Alterações
ultraestruturais
1Aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Faculdade de Medicina de Botucatu/Unesp. Protocolo no
579/10-CEP.
3.2. Cepa de Giardia duodenalis
Foram empregados trofozoítos de G. duodenalis [BTU-11 (91/JFC)] isolados e
axenizados pela Dra Maria Inês T. L. Sogayar no Laboratório de Giardíase do Departamento de Parasitologia do Instituto de Biociências/UNESP/Botucatu/SP, a partir de cistos de indivíduo do sexo masculino, proveniente de São Paulo, apresentando giardíase sintomática e crônica, caracterizada por diarréia frequente, flatulência e dor abdominal, além de marcante resistência à terapêutica convencional.
3.3. Manutenção da cepa de G. duodenalis e obtenção da massa de
trofozoítos
Os cultivos axênicos de trofozoítos de Giardia foram mantidos em tubos
Vacutainer (4,5 ml), contendo meio TYI-S-33 suplementado com bile bovina, em
estufa a 37qC87. Para a manutenção dos cultivos, os repiques foram feitos a cada
72-96 horas, retirando-se do meio exaurido uma suspensão de trofozoítos (aproximadamente 104 trofozoítos/0,01 ml) e transferindo-a para um tubo contendo
meio novo.
Massas de trofozoítos foram produzidas a partir de repiques em lotes de seis a oito tubos de cultura. Após incubação por 72 horas, os tubos foram colocados em gelo por 10 minutos e, em seguida foram centrifugados a 250g durante 15 minutos a 4°C. Os trofozoítos obtidos foram contados em câmara de Neubauer (hemocitômetro).
3.4. Inibidores sintéticos de proteases
Neste estudo foram utilizados inibidores sintéticos de proteases (Sigma) pertencentes às classes de cisteína e serina-proteases. A concentração de cada inibidor empregado foi escolhida considerando-se a faixa de atividade de cada uma das substâncias, de acordo com BEYNON & SALVESEN88 e após os resultados
Quadro 1. Inibidores sintéticos de proteases.
Inibidores
Fórmula
molecular
Fórmula
estrutural
Concentração
efetiva (µM)
Concentração nos
ensaios (µM) Proteases-alvo
Trans-epoxisuccinil-L-leucilamido (4-guanidino)
butano (E-64)
C15H27N5O5 1-10 10-50-100 cisteína-proteases
Iodoacetamida (IAA) C2H4INO 10-100 10-50-100 cisteína-proteases
Antipaina C27H44N10O6 1-100 10-100-200 serina-proteases
algumas cisteína-proteases
Leupeptina
trifluoroacetato C20H38N6O4 10-100 10-100-200 serina-proteases
algumas cisteína-proteases
Nα-p-tosyl-L-lisina clorometil cetona hidroclorídrico (TLCK)
C14H21ClN2O3S.HCl 10-100 10-100-200-1000* serina-proteases
algumas cisteína-proteases
3.5. Atividade in vitro de inibidores de proteases sobre trofozoítos de G.
duodenalis
3.5.1. Atividade sobre o crescimento dos trofozoítos
Para avaliar o efeito dos inibidores de proteases sobre o crescimento de G.
duodenalis, trofozoítos obtidos como descrito no item 3.3 foram contados em câmara
de Neubauer, e 105 parasitas/ml foram inoculados em tubos contendo meio TYI-S-33
(4,5 ml) e os inibidores diluídos em tampão fosfato 0,1 M (pH 7,2) e filtrados em membrana esterilizante 0,22 Pm.
Os trofozoítos expostos aos inibidores, nas referidas concentrações (Quadro 1), foram incubados a 37°C durante 24, 48 e 72 horas. Decorridos os períodos de incubação, os tubos foram mantidos em gelo por 10 minutos, centrifugados a 250g (10 minutos a 4°C) e os trofozoítos obtidos foram contados em câmara de Neubauer. Em todos os ensaios, culturas não tratadas (cultivos puros) e culturas tratadas com metronidazol (Flagyl®) a 40
Pg/ml foram incluídas como controles.
Os ensaios foram realizados em triplicata e a atividade dos inibidores sobre o crescimento de G. duodenalis foi avaliada, comparando-se as médias dos números de
organismos recuperados nas culturas tratadas com as culturas controle. O efeito de cada inibidor nas suas respectivas concentrações foi expresso em porcentagem.
3.5.2. Atividade sobre a aderência dos trofozoítos
O efeito de inibidores de proteases sobre a aderência dos trofozoítos foi avaliado segundo a metodologia descrita por EDLIND et al.89, com modificações.
Trofozoítos obtidos como descrito no item 3.3 foram contados em câmara de Neubauer e 105 parasitas/ml, inoculados em tubos contendo meio TYI-S-33, foram
(Quadro 1). Os trofozoítos expostos aos inibidores foram, então, incubados a 37°C durante 24 e 48 horas. Ao final da incubação, o meio de cada tubo foi substituído por 4,5 ml de tampão fosfato 0,1 M (pH 7,4), os tubos foram mantidos em gelo por 10 minutos e centrifugados a 250g (10 minutos a 4°C). O número de trofozoítos aderidos foi determinado em câmara de Neubauer. Em todos os ensaios, culturas não tratadas (cultivos puros) e culturas tratadas com metronidazol a 40 Pg/ml foram incluídas como
controles.
Os ensaios foram realizados em triplicata e a atividade dos inibidores sobre a aderência dos trofozoítos de G. duodenalis foi avaliada, comparando-se as médias dos
números de organismos aderidos recuperados nas culturas tratadas com as culturas controle. O efeito de cada inibidor nas suas respectivas concentrações foi expresso em porcentagem.
3.5.3. Atividade sobre a viabilidade dos trofozoítos
Para determinar a viabilidade dos trofozoítos expostos aos inibidores de proteases, empregou-se o método colorimétrico MTT, cujo princípio baseia-se na redução do sal de tetrazólio MTT a cristais de formazan pelas células viáveis, segundo metodologia descrita por PONCE-MACOTELA et al.90, com modificações. A viabilidade
foi determinada tanto nos ensaios de crescimento quanto naqueles de aderência, após incubação dos trofozoítos apenas nos tempos de 48 e 72 horas e 48 horas respectivamente. Isso porque após 24 horas de exposição aos inibidores, a quantidade de células mostrou-se insuficiente para a determinação desse parâmetro.
Após contagem em câmara de Neubauer (itens 3.5.1 e 3.5.2), os trofozoítos incubados com os inibidores de proteases nas suas referidas concentrações (Quadro 1) durante 48 e 72 horas e os respectivos controles (culturas não tratadas e tratadas com metronidazol a 40 Pg/ml) foram transferidos para microtubos de 2 ml e lavados
remoção do meio de cultivo. Em seguida, os organismos recuperados foram incubados, na ausência de luz, durante uma hora a 37°C em 1 ml de tampão fosfato 0,1 M (pH 7,4) acrescido de 40 Pl de solução de MTT (Sigma) a 5 mg/ml e de 20 Pl de
solução do catalisador PMS (Sigma) a 2,5 mg/ml. Após a incubação, os trofozoítos foram centrifugados (250g por 10 minutos a 4ºC) e o produto formado (cristais de
formazan) foi dissolvido pela adição de 1 ml de isopropanol acidificado (HCl a 0,04 M). Do sobrenadante, 150 Pl foram transferidos para microplacas de polipropileno e a
leitura das reações foi realizada determinando-se as unidades de densidade óptica (DO) a 540 nm.
Os ensaios foram realizados em triplicata e a atividade das diferentes concentrações dos inibidores sobre a viabilidade dos trofozoítos foi determinada, empregando-se a seguinte equação:
% viabilidade = DO (teste)
x 100 DO (controle)
Onde, “DO (teste)" representa a leitura da densidade óptica nas reações com
os trofozoítos previamente expostos a uma determinada concentração do inibidor e "DO (controle)", a leitura da densidade óptica nas reações com os trofozoítos não tratados (culturas puras).
3.5.4. Análise ultraestrutural dos trofozoítos por microscopia eletrônica
de transmissão
3.5.4.1. Preparo das amostras
Trofozoítos (105) obtidos como descrito no item 3.3 foram incubados a 37ºC
durante 24, 48 e 72 horas com os inibidores de proteases nas concentrações de 10 e 100 µM. Após 10 minutos em banho de gelo, os tubos foram centrifugados a 250g por 10 minutos a 4°C. Após desprezar o sobrenadante, o sedimento contendo os trofozoítos foi transferido para microtubos de 1,5 ml e centrifugado (2000g, 10 minutos a 4°C) em tampão fosfato 0,1 M gelado (pH 7,4), a fim de se remover o meio de cultivo remanescente. Posteriormente, os trofozoítos foram fixados em glutaraldeído (Merck) a 2,5% diluído em tampão fosfato 0,1 M (pH 7,3) durante três horas a temperatura ambiente. Transcorrido esse período, os trofozoítos foram corados com azul tripan a 0,2% e permaneceram sob refrigeração por pelo menos 24 horas. Em seguida, os tubos foram novamente centrifugados (2000g, 10 minutos a 4°C), sendo acrescentada à massa celular, uma solução de gelatina (Merck) a 6% preparada em tampão fosfato 0,1 M (pH 7,3). Finalmente, essa suspensão foi armazenada a 4°C em tubos contendo glutaraldeído a 2,5%. Culturas controle (cultivos não tratados) foram processadas sem a adição dos inibidores de proteases.
3.5.4.2. Processamento das amostras
(4) acetona 100% (três vezes, 15 minutos). Em seguida, as células foram mantidas
“overnight” em uma solução de resina de Araldite com acetona 100% (v/v). No dia
seguinte, após mais uma hora de incubação em resina pura a 37ºC, o material foi incluído em moldes contendo uma nova solução de resina pura e incubado a 60°C durante 48 horas. Após a confecção dos blocos, o material foi trimado e submetido ao
corte em secções ultrafinas (600 Ǻ) utilizando ultramicrótomo Ultracult UCT (Leica). Os
cortes ultrafinos obtidos foram analisados em microscópio eletrônico de transmissão CM 100 (Philips) e Tecnai Spirit (FEI Company).
3.6. Análise estatística
Para avaliar a atividade dos inibidores de proteases sobre o crescimento e a aderência de trofozoítos de Giardia, empregou-se o ajuste de um esquema fatorial
4. RESULTADOS
4.1. Atividade dos inibidores de proteases sobre o crescimento dos
trofozoítos de G. duodenalis
4.1.1. Atividade dos inibidores de cisteína-proteases
O efeito de diferentes concentrações (10, 50 e 100 µM) dos inibidores IAA e E-64 foi avaliado sobre o crescimento dos trofozoítos após 24, 48 e 72 horas de incubação e estão apresentados nas Tabelas 1 a 3 e nas Figuras 2 e 3.
Quanto à atividade da IAA, os resultados revelaram acentuada redução no crescimento dos trofozoítos expostos às concentrações de 50 e 100 µM (p<0,05) a partir de 48 horas de incubação, quando o número de parasitas recuperados após o tratamento foi menor que o obtido nas culturas controle (p<0,05) (Tabela 1, Figura 2). Taxas de inibição do crescimento similares àquelas obtidas após o tratamento com o metronidazol (p>0,05) foram observadas nos cultivos expostos às maiores concentrações de IAA avaliadas (Tabela 3). Vale destacar que o efeito inibitório da IAA foi observado a partir de 24 horas e atingiu taxas superiores a 90% ao final do período experimental (Tabela 3). Durante a contagem dos parasitas tratados com as concentrações de 50 e 100 µM de IAA, foi possível verificar que os trofozoítos apresentavam alterações morfológicas tais como: aumento de volume celular, vacuolização citoplasmática e perda da motilidade flagelar.
respectivo inibidor (Tabela 3). Apesar do E-64 promover a redução do número de trofozoítos a partir da menor concentração avaliada e de induzir um efeito dose-resposta sobre o crescimento dos cultivos, não foram observadas alterações marcantes na morfologia dos trofozoítos durante as contagens em câmara de Neubauer.
Tabela 1. Número médio de trofozoítos (n x105/ml) de G. duodenalis recuperados em cultivos tratados com IAA, segundo a concentração do inibidor e o período de incubação.
Tempo CNT* MTZ**
IAA (µM)
10 50 100
24 h 1,50 ± 0,25 0,24 ± 0,06 1,25 ± 0,25 0,29 ± 0,06 0,28 ± 0,03 A a A a A a A a A a
48 h 47,00 ± 0,75 0,57 ± 0,17 41,58 ± 2,98 0,66 ± 0,04 1,43 ± 0,16 A b B a A b B a B a
72 h 124,17 ± 18,76 1,69 ± 0,14 112,50 ± 5,00 0,37 ± 0,10 0,55 ± 0,07 A c B a A c B a B a
Resultados expressam a média e o desvio padrão obtidos em um experimento realizado em triplicata segundo a distribuição de Poisson (p<0,05). (*) Cultivos não tratados e (**) cultivos tratados com metronidazol a 40 μg/ml. (1)
Médias seguidas da mesma letra maiúscula em cada uma das linhas não diferem entre si e (2) médias seguidas da mesma letra minúscula em cada uma das colunas não diferem entre si.
0 20 40 60 80 100 120 140 160
CNT MTZ 10 μM 50 μM 100 μM
N ú m e ro de t rof oz oí to s ( X 1 0 5/ml ) IAA 24 h 48 h 72 h
Figura 2. Efeito in vitro do inibidor IAA (µM) sobre o crescimento de trofozoítos de G. duodenalis. Cultivos
Tabela 2. Número médio de trofozoítos (n x105/ml) de G. duodenalis recuperados em cultivos tratados com E-64, segundo a concentração do inibidor e o período de incubação.
Tempo CNT* MTZ**
E-64 (µM)
10 50 100
24 h 1,58 ± 0,58 0,90 ± 0,13 1,33 ± 0,29 1,00 ± 0,43 1,00 ± 0,43 A a B a A C a B C a B C a
48 h 8,67 ± 0,14 0,93 ± 0,16 7,50 ± 1,75 3,58 ± 0,52 2,25 ± 0,25 A b B a A b C b D b
72 h 15,75 ± 1,09 0,70 ± 0,15 9,92 ± 1,04 4,75 ± 1,09 3,17 ± 0,88 A c B a C b D b E c
Resultados expressam a média e o desvio padrão obtidos em um experimento realizado em triplicata segundo a distribuição binomial negativa (p<0,05). (*) Cultivos não tratados e (**) cultivos tratados com metronidazol a 40 Pg/ml.
(1) Médias seguidas da mesma letra maiúscula em cada uma das linhas não diferem entre si e (2) médias seguidas da mesma letra minúscula em cada uma das colunas não diferem entre si.
0 20 40
CNT MTZ 10 μM 50 μM 100 μM
N ú m e ro de t rof oz oí to s ( X 1 0 5/ml )
E-64
24 h 48 h 72 hFigura 3. Efeito in vitro do inibidor E-64 (µM) sobre o crescimento de trofozoítos de G. duodenalis.
Cultivos não tratados (CNT) e tratados com metronidazol (MTZ) a 40 µg/ml foram incluídos como controles. Os valores correspondem ao nº médio de trofozoítos (x105) ± o desvio padrão em ensaios
Tabela 3. Porcentagem média de inibição do crescimento de trofozoítos de G. duodenalis em cultivos tratados com IAA e E-64, segundo a concentração do inibidor e o período de incubação. Tempo Tratamento/Inibição (%) 24 h MTZ*
83,78 ± 4,02 Aa
IAA 10 µM
16,67 ± 16,67 Ba
IAA 50 µM
80,89 ± 4,02 Aa
IAA 100 µM
81,55 ± 1,68 Aa
48 h 98,79 ± 0,35 Aa 11,53 ± 6,34 Bab 98,60 ± 0,08 Ab 96,96 ± 0,33 Ab
72 h 98,64 ± 0,12 Aa 9,82 ± 4,01 Bb 99,71 ± 0,08 Ab 99,56 ± 0,06 Ab
MTZ* E-64 10 µM E-64 50 µM E-64 100 µM
24 h 42,83 ± 7,91 Aa 15,61 ± 18,27 Ba 36,70 ± 27,41 Aa 36,71 ± 27,40 Aa
48 h 89,24 ± 1,85 Ab 16,69 ± 14,74 Ba 58,67 ± 6,01 Cb 74,05 ± 2,89 Db
72 h 95,56 ± 0,96 Ab 37,04 ± 6,60 Bb 69,84 ± 6,92 Cb 79,89 ± 5,57 Cb
Resultados expressam a média e o desvio padrão obtidos em experimentos independentes para cada inibidor e realizados em triplicata segundo a distribuição de Poisson (p<0,05). Para cada experimento, (1) médias seguidas da mesma letra maiúscula em cada uma das linhas não diferem entre si e (2) médias seguidas da mesma letra minúscula em cada uma das colunas não diferem entre si.(*) Cultivos tratados com metronidazol a 40 Pg/ml.
4.1.2. Atividade dos inibidores de serina-proteases
Os resultados obtidos nos ensaios com os inibidores antipaina, leupeptina e TLCK estão apresentados nas Tabelas 4 a 7 e nas Figuras 4 a 6.
considerando o número de parasitas recuperados após o tratamento com antipaina, a maior taxa de inibição do crescimento (71%), inclusive estatisticamente similar ao metronidazol (p>0,05), foi observada nos cultivos expostos à concentração de 200 µM após 24 horas de tratamento. Nos demais períodos de incubação, esse efeito inibitório sofreu decréscimo, apresentando-se entre 60 e 65% (Tabela 7).
Tabela 4. Número médio de trofozoítos (n x 105
/ml) de G. duodenalis recuperados em cultivos tratados com antipaina, segundo a concentração do inibidor e o período de incubação.
Tempo CNT* MTZ**
Antipaina (µM)
10 100 200
24 h 3,50 ± 0,66 1,04 ± 0,06 2,42 ± 0,72 1,50 ± 0,66 1,00 ± 0,43 A a B a C a D a B a
48 h 23,33 ± 3,82 0,70 ± 0,08 15,00 ± 2,50 8,42 ± 0,52 8,00 ± 1,30 A b B b C b D b D b
72 h 81,67 ± 8,78 0,78 ± 0,15 77,50 ± 9,01 32,17 ± 2,57 31,17 ± 1,13 A c B b A c C c C c
Resultados expressam a média e o desvio padrão obtidos em um experimento realizado em triplicata segundo a distribuição binomial negativa (p<0,05). (*) Cultivos não tratados e (**) cultivos tratados com metronidazol a 40 μg/ml.
(1) Médias seguidas da mesma letra maiúscula em cada uma das linhas não diferem entre si e (2) médias seguidas da mesma letra minúscula em cada uma das colunas não diferem entre si.
0 20 40 60 80 100
CNT MTZ 10 μM 100 μM 200 μM
N ú m e ro de t rof oz oí tos ( X 1 0 5/ml ) Antipaina 24 h 48 h 72 h
Figura 4. Efeito in vitro do inibidor antipaina (µM) sobre o crescimento de trofozoítos de G. duodenalis.
Cultivos não tratados (CNT) e tratados com metronidazol (MTZ) a 40 µg/ml foram incluídos como controles. Os valores correspondem ao nº médio de trofozoítos (x105) ± o desvio padrão em ensaios
