CRHISTIANE ANDRESSA DA SILVA
SAGUIS (
Callithrix jacchus
) SOB CICLO
CLARO-ESCURO
DE
21
H:
UM
MODELO
DE
DESSINCRONIZAÇÃO
FORÇADA
EM
PRIMATA
DIURNO
Tese apresentada à Universidade Federal do Rio Grande do Norte para obtenção do título de Doutora em Psicobiologia.
Orientador: Prof. Dr. John Fontenele Araujo Co-orientadora: Profª. Drª. Carolina V. Macedo Azevedo
NATAL
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SAGUIS (
Callithrix jacchus
) SOB CICLO
CLARO-ESCURO
DE
21
H:
UM
MODELO
DE
DESSINCRONIZAÇÃO
FORÇADA
EM
PRIMATA
DIURNO
CRHISTIANE ANDRESSA DA SILVA
Tese apresentada à Universidade Federal do Rio Grande do Norte para obtenção do título de Doutora em Psicobiologia.
Orientador: Prof. Dr. John Fontenele Araujo Co-orientadora: Profª. Drª. Carolina V. Macedo Azevedo
NATAL
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Dedico este trabalho aos meus orientadores John e Carolina, pois foram, são e sempre serão
meus grandes mestres!
Em especial, também dedico este trabalho a minha avó Inês, que era professora e sempre ensinou
a seus filhos e netos o valor do estudo e do conhecimento! Ela sempre me incentivou a aprofundar
minha formação acadêmica e a estudar sempre! Tenho certeza que, onde quer que esteja, está muito
orgulhosa em ver a primeira doutora nessa família de origem humilde, mas muito esforçada e
5 “As pedras que surgem em nossos caminhos podem ser utilizadas como desculpas para não seguirmos adiante, ou como degraus para
ajudar nossa subida por um caminho ainda melhor!”.
6
Agradecimentos
Primeiramente, agradeço a John por ter me orientado durante todo o Doutorado, além de ter
sido um grande incentivador para que eu sempre alçasse vôos mais altos na Cronobiologia! Sou muito
grata pela confiança que sempre depositou em mim e por sempre ter me estimulado à contínua busca
pelo conhecimento! Em especial, agradeço pelo grande apoio que me deu quando meu irmão esteve
doente!
A Profa. Carolina, que me “aguentou” na Graduação, no Mestrado e não conseguiu se livrar de mim no Doutorado! Tudo o que aprendi com ela formou a base principal do meu conhecimento em
Cronobiologia! Também foi com ela que aprendi a gostar de ensinar!
A Toni e Trini que foram simplesmente maravilhosos me acolhendo em Barcelona! Não tenho
palavras para descrever como foi especial e enriquecedor nosso curto convívio... Em especial, agradeço a
Trini por se disponibilizar a vir ao Brasil para participar do momento tão importante que foi a Defesa
desta Tese!
Aos Professores Menna-Barreto, Frenando Louzada e Alexandre Menezes pelas suas
contribuições com sugestões e correções para esta Tese.
A todos os amigos e colegas que foram imprescindíveis para o cuidado e manutenção dos
animais e realização dos experimentos! Em especial, agradeço a Kathiane, que além de me ajudar
enormemente com os saguis sempre foi meu ombro amigo, fosse para farras ou para desabafos!
Ao pessoal do Núcleo de Primatologia, Flávio, Edinólia, Luiz, Geniberto, Zé Rubens,
Francisco, Tota e Márcio pela ajuda no cuidado com os saguis.
Aos meus pais Ademir e Margarete por sempre terem incentivado a mim e meus irmãos a estudar
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que quiséssemos desde que nos esforçássemos para isso! E mais do que ensinar apenas com palavras, nos
passaram esses e muitos outros ensinamentos com suas atitudes!
As minhas avós Julita, Inês e Zefa: três pessoas guerreiras, muito batalhadoras e honestas, que
nunca dependeram de ninguém para alcançar seus objetivos! Elas e meus pais são meus exemplos de
vida! Neles me espelho e procuro sempre dar o melhor de mim em tudo que faço!
Aos meus irmãos pelo apoio e ajuda imprescindíveis ao longo do Doutorado! Várias vezes só
pude ir a universidade com a ajuda deles.
A Vinício por ser meu companheiro amoroso que sempre me apoiou, mesmo quando ficamos
meses separados pela distância, e continua apoiando na realização dos meus sonhos, além de me
aguentar mesmo quando eu estava triste ou de mal humor por causa das dificuldades em escrever esta
Tese.
A Life, Mel, Jeffer, Clara e Luma, mais conhecida como “terrorista”, pelo carinho e momentos
divertidos que me proporcionaram, principalmente quando colocavam um sorriso em minha face com
suas travessuras ou me deixavam relaxada com suas massagens especiais nos pés enquanto eu
trabalhava! Em especial agradeço a Melzinha, que é minha companheirinha fiel, estando ao meu lado o
tempo todo!
A Coordenadoria de Aperfeiçoamento de Pessoal e do Ensino Superior (CAPES), pela concessão
das bolsas de Doutorado e Doutorado-Sanduíche.
Finalizando, um agradecimento muito especial a Bia, Safira, Perla, Jailda, Orange, Orquídea,
Obama, Fleury, Bastos, Fatinha, Fizi, Orestes e Flora que tornaram este trabalho tão prazeroso e
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Resumo
Silva, C.A. (2012). Saguis (Callithrix jacchus) sob ciclo claro-escuro de 21 h: um modelo de dessincronização forçada em primata diurno. Tese de Doutorado, Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Natal.
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Abstract
Silva, C.A. (2012). Marmosets (Callithrix jacchus) under light-dark cycle of 21 h: a primate model for forced desynchronization. PhD Thesis, Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Natal.
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SUMÁRIO
INTRODUÇÃO... 11
Ritmos Biológicos... 11
Sistema Circadiano... 13
Sistema de Múltiplos Osciladores... 14
OBJETIVOS... 19
METODOLOGIA... 21
Sujeitos... 21
Condições de Manutenção... 21
Coleta dos Dados de Atividade Motora... 22
Experimento 1... 22
Experimento 2... 24
RESULTADOS... 27
Experimento 1... 27
Experimento 2... 29
DISCUSSÃO... 49
CONCLUSÕES... 56
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS... 57
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Introdução
Ritmos Biológicos
Ritmos biológicos são oscilações periódicas na expressão de comportamentos e funções da matéria viva, presentes em todos os eucariotos e também em procariotos como as cianobactérias. Usualmente são classificados de acordo com Halberg (1959) em circadianos, ultradianos ou infradianos. Os ritmos circadianos apresentam um ciclo recorrendo a cada 24 horas (períodos em torno de 24 ± 4 horas) e estão associados ao ciclo claro-escuro, como o ritmo de atividade e repouso dos animais. Os ritmos ultradianos apresentam mais de um ciclo recorrendo dentro de um dia (períodos menores que 20 horas), como o ritmo de liberação de cortisol e de insulina, secretados em intervalos de aproximadamente 1 hora (Refinetti 2006), enquanto os ritmos infradianos recorrem em intervalos superiores a um dia (períodos maiores que 28 horas), como o ciclo estral dos animais (Rotenberg, Marques, Menna-Barreto 2003). Porém, devido à supervalorização dos ritmos circadianos e por não haver um significado funcional nessa classificação, Araujo e Marques (2003) propõem a divisão dos ritmos biológicos em duas categorias: ritmos com correlatos com ciclos geofísicos, relacionados funcionalmente com a antecipação de uma mudança no ambiente, e ritmos sem correlatos com ciclos geofísicos, relacionados com a antecipação de uma mudança no meio interno. Os ritmos biológicos que possuem um correlato ambiental são os mais estudados, tanto pela sua obviedade quanto pela facilidade proporcionada pelo fato de se conhecer as principais frequências das oscilações. Dentre eles, os mais estudados e, portanto, mais bem descritos e conhecidos, são os ritmos circadianos (Marques et al. 2003).
Os ritmos circadianos mantêm uma relação de fase estável com o ciclo claro-escuro, possibilitando que os estados dos ritmos fisiológicos e comportamentais estejam associados às fases mais propícias do ambiente para a sobrevivência da espécie. Dessa forma, a ritmicidade circadiana é uma característica extremamente importante por promover uma organização temporal interna na fisiologia dos seres vivos e possibilitar a sincronização ao ambiente externo, auxiliando-os a “predizer” e se preparar para as
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Davidson & Menaker 2003). Assim, favorece um funcionamento ótimo do sistema biológico, com maior eficiência, desempenho e bem-estar (Weinert 2005).
Considera-se que os ritmos circadianos estão sincronizados ao ambiente quando são expressos com o mesmo período do zeitgeber* em uma relação de fase estável. Esse processo pode ocorrer através dos mecanismos de arrastamento ou mascaramento (Daan & Aschoff 2001; Marques, Golombek, Moreno 2003).
No arrastamento, o período e a fase do ritmo biológico são ajustados por meio de deslocamentos de fase provocados pelos zeitgebers. A nova sincronização é conseguida gradualmente, após um ou mais ciclos transientes, durante os quais se podem observar atrasos ou adiantamentos de fase. São propostos dois modelos de arrastamento, o modelo discreto ou não paramétrico e o modelo contínuo ou paramétrico. O primeiro se baseia no efeito fásico ou discreto que pulsos do zeitgeber provocam sobre o oscilador biológico. Dependendo da fase do ritmo em livre-curso na qual é aplicado, o pulso vai provocar atraso, adiantamento ou pode não ter efeito sobre o ritmo. Por outro lado, o segundo modelo propõe que um ritmo circadiano pode ser sincronizado por um ciclo ambiental completo pelo efeito contínuo deste sobre o período do oscilador biológico. Esta ação seria alternadamente de aceleração e de retardo na velocidade do oscilador, conforme o ciclo do zeitgeber incidisse nas diferentes fases circadianas. Em ambiente natural o arrastamento parece ser resultante da combinação dos dois modelos (Aschoff 1999; Daan & Aschoff 2001; Johnson et al. 2003; Marques et al. 2003; Pittendrigh 1960).
No mascaramento, a sincronização é decorrente de efeitos diretos do zeitgeber sobre a expressão dos ritmos circadianos, sem envolvimento do oscilador biológico (Aschoff 1999; Daan & Aschoff 2001; Marques et al. 2003). Esse fenômeno confere plasticidade ao sistema circadiano, pois possibilita ao organismo responder instantaneamente a um estímulo ambiental, proporcionando uma flexibilidade não permitida no lento fenômeno
* Zeitgeber – denominação dada ao ciclo ambiental que promove a sincronização dos ritmos biológicos (Marques et al. 2003). Foi proposta por Aschoff (1951, 1954) e tem como sinônimos agente arrastador, proposto por Pittendrigh
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do arrastamento, além de refinamento e aceleração do ajuste do organismo ao ambiente (Marques et al. 2003, Marques & Waterhouse 1994).
O principal zeitgeber para a maioria das espécies é o ciclo claro-escuro (CE), que é o sinal temporal mais preciso na maioria dos ambientes. Porém, outros fatores ambientais podem atuar como zeitgeber, principalmente em espécies que não têm contato com o ciclo CE em seu habitat natural, como os organismos que vivem em cavernas ou no fundo do mar, embora haja pouca informação sobre a sincronização nessas condições (Daan & Aschoff 2001). Exemplos de ciclos ambientais importantes como zeitgebers para várias espécies são os ciclos de disponibilidade de alimento, temperatura, umidade relativa, pistas sociais, entre outros (Carneiro & Araujo 2009, 2011; Chandrashekaran 1982; Davidson & Menaker 2003; Marques et al. 2003; Silva 2007). Portanto, em ambiente natural o ajuste diário dos ritmos circadianos deve resultar da integração de várias pistas ambientais, fóticas e não fóticas, com pistas homeostáticas (Challet & Pévet 2003). O sistema fisiológico responsável por essa integração, pela geração e sincronização da ritmicidade circadiana é denominado sistema circadiano.
Sistema Circadiano
O sistema circadiano corresponde ao conjunto de estruturas neurais especializadas que estabelecem uma organização temporal dos processos fisiológicos e comportamentais dentro de padrões de eventos recorrentes precisos. Dessa forma, é o responsável pela geração e sincronização dos ritmos circadianos. Consiste em pelo menos três componentes: (1) receptores e vias aferentes (sincronizadoras) que transmitem informações do meio ambiente; (2) marca-passos, que geram oscilações circadianas; (3) vias eferentes, através das quais o marca-passo regula a expressão dos diversos ritmos (Goldman 1999; Moore 1999).
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funcionalmente distintas, designadas regiões dorsomedial e ventrolateral. A região dorsomedial caracteriza-se pela existência de neurônios bastante pequenos com árvores dendríticas mais esparsas que contêm diversos pepitídeos como neurotransmissores, a arginina vasopressina (AVP) ou a angiotensina II (AII), a calretinina (CAR) e o ácido gama-amino-butírico (GABA) e seus aferentes originam-se do hipotálamo, prosencéfalo basal e córtex límbico, tálamo e tronco cerebral. A região ventrolateral, também denominada cerne, possui neurônios maiores com árvores dendríticas mais extensas que contêm como neurotransmissor o polipeptídeo intestinal vasoativo (VIP), o peptídeo liberador de gastrina (GRP) e o GABA, e recebe as aferências sincronizadoras (Moore, 1999; Moore, Speh & Leak 2002).
As principais vias sincronizadoras que transmitem informações ambientais para o NSQ são o trato retino-hipotalâmico (TRH), o trato genículo-hipotalâmico (TGH) e a via rafe-NSQ (Challet & Pévet 2003; Moore 1999). A principal via efetora do NSQ dirige-se para outros núcleos do hipotálamo, para a rafe, o tálamo e a área pré-óptica. Essas projeções estão relacionadas com o envio do sinal circadiano para os sistemas nervoso e endócrino, que o repassam para o restante dos órgãos e sistemas (Golombek & Aguilar-Roblero 2003). Outra via efetora do NSQ regula a secreção de melatonina pela glândula pineal. Esse hormônio é liberado apenas na fase de escuro, pois sua secreção é inibida pelo claro. Dessa forma, a melatonina é um sinal fidedigno das durações do dia e da noite para o organismo (Goldman 1999; Golombek & Aguilar-Roblero 2003; Moore 1999).
Sistema de Múltiplos Osciladores
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tendo o NSQ como oscilador principal que se mantém acoplado aos osciladores periféricos por meio de conexões nervosas do sistema nervoso autônomo e por sinais humorais (Brandstaetter 2004; Weinert 2005).
Além dessas evidências celulares, também existem evidências fisiológicas e comportamentais para a natureza multioscilatória do sistema circadiano. Uma delas é a divisão do ritmo circadiano em dois componentes, fenômeno conhecido como bipartição. Esse fenômeno foi observado nos ritmos de atividade motora de saguis (Schardt et al. 1989) e de atividade motora e temperatura de hamsters sob condições de iluminação constante (de la Iglesia et al. 2000; Pickard et al. 1984). Esses últimos também apresentaram bipartição no ritmo circadiano da atividade motora quando estavam sob ciclo CE simétrico de 12 h, sendo a intensidade luminosa do escuro em torno de 0,04 lux, (Evans, Elliot, Gorman 2005). Camundongos submetidos a um avanço de 8 h exibiram os ritmos circadianos de atividade e temperatura em dois componentes durante a ressincronização, um ajustando por avanço de fase e o outro por atraso. Além de darem suporte à ideia de que o ritmo circadiano da atividade motora é controlado por pelo menos dois osciladores, esses resultados indicam que esses osciladores têm propriedades diferentes e estão acoplados ao ciclo CE de maneiras diferentes (Weinert, Sturm, Waterhouse 2002). Essa ideia foi confirmada em estudo posterior (Weinert & Weinert 2003) que reforça o modelo de Pittendrigh e Daan (1976), segundo o qual existem pelo menos dois osciladores, um matutino, sincronizado ao acender das luzes ou nascer do sol, e um vespertino, sincronizado ao apagar das luzes ou por do sol. Além disso, o ritmo circadiano da atividade eletrofisiológica no NSQ apresentou dois picos quando foi seccionado em pedaços num plano horizontal, sendo um pela manhã, após o nascer do sol simulado, e outro à noite, em torno do horário do por do sol simulado, que podem estar refletindo a organização dos osciladores matutino e vespertino no NSQ (Jagota, de la Iglesia, Schwartz 2000).
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Outra evidência é a dissociação em dois componentes do ritmo da atividade motora de ratos, um sincronizado a um ciclo CE diferente de 24 h e o outro em livre-curso, provavelmente gerados pela atividade de pelo menos dois grupos de osciladores. Considerando que o sistema circadiano é formado por uma população de osciladores elementares, cada um com uma frequência circadiana, nem todos devem ter a mesma capacidade de sincronizar a certas condições externas. Aqueles capazes de sincronizar a um ciclo externo com período T serão os que oscilam com um período próximo a T, enquanto os com períodos mais distantes de T não sincronizarão. Quando o T do ciclo externo é semelhante ao período endógeno do sistema, a maioria dos osciladores sincronizará e a atividade se manifestará sob apenas um ritmo, ou seja, o número de osciladores sincronizados é o que determina o período do sistema (Campuzano, Vilaplana, Cambras & Díez-Noguera 1998; Honma et al. 2004).
Dando suporte a essa hipótese, camundongos sob modelos de jet lag crônico e T21 assimétrico (CE 12:9) (Casiraghi et al., 2012) e ratos expostos a T22 simétrico (Cambras
et al. 2007; Campuzano et al. 1998; Neto et al. 2008; Schwartz et al. 2009) expressam a atividade motora com dois períodos diferentes, um sincronizado ao período externo e o outro em livre-curso. Somado a isso, observou-se que em ratos o ciclo vigília-sono e o sono de ondas lentas podem se dissociar dos ritmos de temperatura corporal e do sono paradoxal (Cambras et al. 2007), a regulação circadiana da liberação de melatonina pode ser dissociada de sua inibição pela luz (Schwartz et al. 2009) e pode ocorrer déficit na tarefa de esquiva passiva, provavelmente devido a um efeito da dessincronização interna sobre componentes emocionais relacionados ao medo e à avaliação de risco (Neto et al. 2008). Octodon degus, roedor endêmico do centro do Chile que pode ser diurno ou noturno e alternar entre os cronotipos (Otalora et al. 2010; Vivanco et al. 2010), também apresenta dissociação da atividade motora e da temperatura sob ciclo CE simétricos de 28 h e da atividade motora sob ciclo CE simétrico de 21 h, sendo o componente dependente da luz mais evidente nos animais noturnos (Vivanco et al. 2010).
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que esses ritmos reflitam atividades separadas de dois osciladores nas subdivisões dorsomedial e ventrolateral, visto que em dias de coincidência, quando há sobreposição do dia do CE com o dia biológico do animal, ocorre expressão de Per1 em todo o NSQ, enquanto praticamente não há expressão de BMAL1 no NSQ; em noites de coincidência, quando há sobreposição da noite do CE com a noite biológica do animal, não há expressão de Per1 no NSQ, enquanto há expressão de BMAL1 em todo o NSQ; em dias de não coincidência, quando há sobreposição do dia do CE com a noite biológica do animal, ocorre expressão de Per1 apenas na região ventrolateral e de BMAL1 apenas na região dorsomedial, ou seja, a região ventrolateral tem expressão gênica correspondente à fase de claro, enquanto a dorsomedial tem expressão gênica correspondente à fase de escuro; e em noites de não coincidência, quando há sobreposição da noite do CE com o dia biológico do animal, ocorre expressão de Per1 na região dorsomedial do NSQ e de
BMAL1 na região ventrolateral, ou seja, a dorsomedial tem expressão gênica
correspondente à fase de claro enquanto a ventrolateral tem expressão gênica correspondente à fase de escuro. Dessa forma, sugere-se que a região dorsomedial seja responsável pela geração e estabilidade da ritmicidade circadiana, enquanto a ventrolateral seja responsável pela sincronização ao ciclo ambiental externo (de la Iglesia
et al. 2004; Nakamura, Honma, Shirakawa, Honma 2001).
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É de grande importância se estudar essa dessincronização interna porque várias situações cotidianas como o horário de verão, o trabalho em turno e as viagens transmeridianas, que provocam os sintomas de jet lag (Waterhouse, Reilly, Atkinson, Edwards 2007) como fadiga diurna, insônia noturna, falta de apetite, irritabilidade, dores de cabeça, entre outros, promovem a dessincronização entre os osciladores endógenos de humanos pela exposição a diferentes fotoperíodos em curtos intervalos de tempo. Essa dessincronização interna provoca distúrbios na ritmicidade circadiana que podem gerar muitas doenças, inclusive distúrbios do sono. O conhecimento do mecanismo de acoplamento entre as células do NSQ é essencial para se entender a sincronização e a expressão dos ritmos circadianos e, dessa forma, propiciar o desenvolvimento de novos tratamentos para todos esses distúrbios da ritmicidade circadiana (Campuzano et al. 1998, Neto et al. 2008). Neto e colaboradores (2008) sugerem que o modelo de dissociação do ritmo circadiano da atividade motora sob CE de 22h desenvolvido por Campuzano et al. (1998) seja um bom modelo animal para se estudar esses mecanismos.
Apesar da imensa contribuição que os modelos de dessincronização forçada podem fornecer, os mesmos só existem para roedores, ainda não existindo nenhum modelo para primatas não humanos. Portanto, com o objetivo de obter um modelo de dessincronização forçada para primatas não humanos diurnos, foi utilizado o modelo da dissociação do ritmo circadiano da atividade motora sob ciclos CE menores que 24h em Callithrix
jacchus. Essa espécie foi escolhida por ser um primata diurno com várias características
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Objetivos Geral
Avaliar o padrão do ritmo circadiano de atividade motora de saguis, Callithrix
jacchus, em ciclos claro-escuro próximos ao limite inferior de sincronização.
Específicos
Determinar a duração do ciclo CE em que o ritmo circadiano expresse dois componentes.
Avaliar a contribuição dos processos de arrastamento e mascaramento na expressão dos dois componentes rítmicos durante a dessincronização.
Avaliar se há diferença de gênero na dissociação da ritmicidade circadiana.
Hipóteses e Predições
H1) O sistema circadiano de primatas é semelhante ao de roedores, sendo composto por pelo menos dois grupos de osciladores que atuam acoplados entre si. Contudo, ciclos claro-escuro próximos ao limite de sincronização promovem o desacoplamento dos osciladores levando à ocorrência de dois ritmos circadianos, um sincronizado ao claro-escuro e outro com período diferente do ciclo claro-escuro.
P1) O sagui, sob ciclos claro-escuro próximos ao limite inferior de sincronização expressará o ritmo circadiano da atividade motora com dois componentes, sendo um com o período do ciclo escuro e outro com o período diferente do ciclo claro-escuro.
H2) A dissociação da atividade motora dos saguis é decorrente de sincronização parcial e não apenas de mascaramento.
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Metodologia
Sujeitos: Foram estudados 13 saguis adultos oriundos do Núcleo de Primatologia da
UFRN. A fêmea Safira, de origem selvagem, foi o único animal presente em todas as etapas do experimento (Quadro 1).
Quadro 1: Sujeitos experimentais com as respectivas idades que estavam no início do experimento e a média e o desvio padrão de seus pesos corpóreos ao longo do experimento. Safira está grifada e localizada na intersecção das etapas experimentais, pois foi o único animal que participou de todas as etapas.
Nome Idade no Início dos Experimentos Peso Médio ± DP (g)
Exp e ri m e n to 1
♀ Orquídea 4 anos 447 ± 20
♀ Orange 4 anos 454 ± 29
♀ Jailda 4 anos 448 ± 18
♀ Perla 3 anos 447 ± 32
♀ Bia 4 anos 439 ± 24
♀ SafiraS 3 anos 377 ± 16
Exp e ri m e n to 2
♀ Fleury 2 anos 393 ± 4
♀ Fatinha 3 anos 406 ± 1
♀ Flora 3 anos 441 ± 8
♂ Bastos 4 anos 380 ± 4
♂ ObamaS 2 anos 349 ± 9
♂ Fizi 3 anos 360 ± 1
♂ Orestes 3 anos 373 ± 16
S animais de origem selvagem.
O estado de saúde dos animais foi acompanhado através de medidas dos pesos corporais e da observação dos padrões de atividade motora e comportamento. Todos apresentaram bom estado de saúde e peso regular durante todo o experimento (Quadro 1).
Condições de Manutenção: Os animais foram mantidos em gaiolas individuais, porém
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sendo pela manhã entre 06:00 e 11:00 h e à tarde entre 12:30 e 18:00 h. Pela manhã recebiam papa à base de leite, ovos cozidos, pão, vitaminas e aminoácidos e à tarde, uma porção de batata-doce cozida ou de frutas da época tais como banana, melancia, mamão e manga, entre outras. Adicionalmente, recebiam jujuba sem açúcar, ovo cozido, sementes de girassol e tenébrio 3 vezes por semana, e granola 4 vezes por semana, juntamente com a alimentação da tarde, como formas de suplementação alimentar e enriquecimento ambiental.
Todos os animais ficaram numa sala com atenuação do som externo, aparelho de ar-condicionado para controlar a temperatura e a umidade e um exaustor de ar ligado todo o tempo para a renovação do ar. A temperatura média da sala foi 25,7 ± 2,3 ºC e a média da umidade relativa do ar foi 63 ± 10%.
Coleta dos dados de atividade motora: Registro contínuo por meio de sensores de movimento por infravermelho instalados sobre as gaiolas e conectados a um computador através de uma placa de aquisição de dados da National Instruments (NI PCI – 6025E). Os dados foram totalizados e registrados em intervalos de 5 minutos pelo software Aschoff (desenvolvido pelo Laboratório de Cronobiologia – UFRN).
Experimento 1- Determinação do ciclo T promotor de dissociação
Sujeitos: Foram estudadas seis fêmeas, sendo uma de origem selvagem, Safira, e duas irmãs gêmeas, Orange e Orquídea (Quadro 1). Os demais não tinham relação de parentesco.
Condições de Manutenção: Cada animal ficou em uma gaiola de arame cinza com 58 cm
de altura X 70 cm de largura X 30 cm de profundidade. Para iluminação da sala foram utilizadas quatro lâmpadas fluorescentes de luz branca, sendo duas com consumo de 40 watts e duas de 20 watts, equivalentes a lâmpadas incandescentes de 100 W. A intensidade da luz durante a fase de claro foi de 247 ± 43 lux, enquanto a fase de escuro consistiu em escuro total.
Procedimentos: Para determinação da duração do ciclo CE promotor da dissociação dos
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21, 21,5, 22 h. Esses períodos foram escolhidos por serem menores que 23 h, descrito por Harter & Erkert (1993) como sendo o limite inferior de sincronização dessa espécie. Inicialmente ficaram sob T24 durante 14 dias, sendo a fase de claro entre 06:00 e 18:00 h. Em seguida, foram submetidas ao T21, T21,5 e T22 durante o número de dias suficientes para que a dissociação fosse bem evidente sendo de 60, 35 e 48 dias, respectivamente. Para finalizar, foram novamente submetidas ao T24 para ressincronização, sendo a fase de claro entre 07:00 e 19:00 h (Figura 1).
Coleta dos dados de vocalizações: Gravação contínua e simultânea das vocalizações de
todos os animais em conjunto por meio de um microfone instalado na sala de experimentos, conectado a um computador. Os dados da frequência de emissão das vocalizações foram totalizados em intervalos de 15 min.
Análise dos dados de atividade motora e vocalizações: Para determinação da duração do ciclo CE promotor da dissociação dos ritmos circadianos, a atividade motora de cada sagui foi analisada por meio de inspeção visual dos actogramas e dos perfis médios diários, do cálculo dos períodos significantes expressos e da potência espectral, tendo como indicador a porcentagem da variância, dos respectivos períodos para cada T ao longo do experimento. Essas mesmas análises foram realizadas para a frequência das vocalizações, com exceção apenas dos perfis médios diários.
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médias entre dois grupos em que os mesmos sujeitos estiverem presentes nas duas condições experimentais (Field, 2009).
A duração do ciclo CE promotor da dissociação dos ritmos circadianos foi escolhida com base na análise das variáveis descritas acima, realizada por meio do programa El
Temps© (Antoni Díez-Noguera, Universitat de Barcelona, http://www.el-temps.com),
sendo o periodograma Sokolove-Bushell utilizado para o cálculo dos períodos com suas potências espectrais, indicadas pela porcentagem da variância.
O nível de significância considerado para todos os testes estatísticos foi de 95% (p 0,05).
Pelos resultados desse experimento, apresentados adiante, o T21 foi determinado como o período de ciclo CE promotor de dissociação dos ritmos circadianos em saguis. Por essa razão o T21 foi utilizado no Experimento seguinte.
Experimento 2- Avaliação das propriedades da dissociação do ritmo de atividade motora
Sujeitos: Foram estudados 4 machos e 4 fêmeas, sendo um macho e uma fêmea de origem selvagem, Obama e Safira, e três irmãs de diferentes ninhadas, Flora, Fleury e Fatinha (Quadro 1). Os demais não tinham relação de parentesco.
Condições de Manutenção: Cada animal ficou em uma gaiola de arame branca com 84
cm de altura (na parte mais alta) e 70 cm de altura (na parte mais baixa) X 68 cm de largura X 42 cm de profundidade, contendo cestinhas e brinquedos de plásticos para enriquecimento ambiental. Para iluminação da sala foi utilizada uma lâmpada de leds de luz branca acima de cada gaiola, com consumo de 3 W (KONGYO, modelo JY-388-42), sendo cada uma delas equivalente a uma lâmpada incandescente de 25 W. Além disso, havia três lâmpadas de luz branca fluorescentes com consumo de 25 W, sendo cada uma delas equivalente a uma lâmpada incandescente de 100 W. A intensidade da luz durante a fase de claro foi de 225 ± 43 lux enquanto a fase de escuro consistiu em escuro total.
Procedimentos: Para avaliar a contribuição dos processos de arrastamento e
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durante a dissociação, machos e fêmeas foram submetidos ao T21 por 24 dias e depois ficaram sob CC durante 18 dias, a partir de um dia de coincidência para a maioria dos animais. Posteriormente, voltaram ao T21 por mais 24 dias e depois ficaram sob CC durante 14 dias, a partir de um dia de não coincidência para a maioria dos animais (Figura 1).
Análise dos dados de atividade motora: O ritmo circadiano da atividade motora de cada
sagui foi analisado por meio da inspeção visual dos actogramas e do cálculo do período endógeno (τ) e da potência espectral do total da atividade motora dos períodos expressos pelos animais sob cada T21 e cada CC. Essas análises foram realizadas por meio do programa El Temps©, sendo o periodograma Sokolove-Bushell utilizado para calcular o período do ritmo de atividade com sua potência espectral, indicado pela porcentagem da variância.
Para avaliar uma possível influência da condição de CE prévia sobre a dissociação dos ritmos circadianos durante os dois T21, visto que o primeiro T21 ocorreu em seguida à condição de T24, enquanto o segundo T21 ocorreu em seguida à condição de CC, foi utilizado o Teste de Wilcoxon para comparar períodos e potências espectrais entre o primeiro e o segundo T21. Esse teste foi escolhido porque o n de cada variável era muito pequeno, sendo esse o teste não paramétrico indicado para testar diferenças entre duas ou mais condições experimentais em que os mesmos participantes foram utilizados em todas as condições (Field 2009).
Com o objetivo de avaliar a contribuição dos processos de arrastamento e mascaramento na expressão dos dois componentes rítmicos durante a dissociação, foi utilizado o teste de Rayleigh para avaliar a aleatoriedade da distribuição do início da fase de atividade sob CC após um dia de coincidência e após um dia de não coincidência no
T21. Somado a isso, os períodos e potências espectrais foram comparados entre os dois
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de correlação não paramétrico indicado quando se tem um conjunto pequeno de dados com um grande número de postos empatados (Field 2009), caso da variável analisada com esse teste.
Para avaliação de uma possível diferença de gênero na dissociação dos ritmos circadianos utilizou-se o teste de Mann-Whitney nas comparações dos períodos e potências espectrais dos componentes circadianos da atividade motora entre machos e fêmeas durante cada T21 e CC. Esse teste foi utilizado devido ao n de cada variável ser pequeno, sendo então necessário um teste não paramétrico para testar diferenças entre duas condições com diferentes sujeitos em cada condição (Field 2009).
O nível de significância considerado para todos os testes estatísticos foi de 95% (p 0,05).
Figura 1: Desenho experimental com a duração de cada etapa. (T24b = antes (before) dos Ts menores que 24h; T24a = depois
(after) dos Ts menores que 24h).
Experimento 1 Experimento 2
T24b
T21 (60 dias)
T21,5 (35 dias)
T22 (48 dias)
T24a
T24
T21 (24 dias)
CC (18 dias)
T21 (24 dias)
CC (14 days)
T24
Dia de Coincidência
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Resultados
Experimento 1- Determinação do ciclo T promotor de dissociação
Durante os Ts menores que 24 h todos os animais mantiveram a fase ativa predominantemente na fase de claro (Figuras 2 a 4), sugerindo um processo de sincronização, sendo a relação da fase ativa com a fase de claro bem evidente nos actogramas nos módulos dos Ts e nos perfis médios diários (Figuras 2 a 7). Porém, em algumas condições de Ts menores que 24 h o padrão rítmico era composto por dois componentes.
A análise do padrão de ritmicidade realizada pela técnica de periodogramas também mostrou o padrão rítmico com dois componentes, sendo um ritmo com a mesma periodicidade do ciclo CE, nomeado componente sincronizado pela luz* (CSL), e outro com periodicidade diferente do ciclo CE, com valor aproximado a 23,5h, nomeado componente não sincronizado pela luz* (CNSL; Tabelas 1 e 3). Os componentes foram assim denominados por ter sido essa a denominação utilizada pelos autores de Campuzano et al. (1998).
Durante o T21 todos os animais apresentaram os dois componentes (Figuras 5 a 8; Tabelas 2 e 3). Já no T21,5, cinco animais (83,3%) apresentaram os dois componentes enquanto uma, Safira, apresentou apenas o CSL. Nesta última o início da atividade ocorreu aproximadamente 4,5h após o acender das luzes (Figuras 5 a 7; Tabelas 2 e 3). No T22 somente dois animais (33,3%) apresentaram os dois componentes (Figura 6), enquanto quatro apresentaram apenas o CSL. Dessas quatro, duas, Safira e Jailda, estavam arrastadas, sendo o início da atividade aproximadamente 3h após o acender das luzes (Figura 5), e duas, Bia e Perla, estavam em coordenação relativa com o CE (Figura 7; Tabelas 2 e 3). Estes resultados indicam que o T21 corresponde à duração do ciclo CE promotor de dissociação em saguis.
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provavelmente foi influenciada pelo fato das vocalizações terem sido registradas de todos os animais em conjunto (Tabela 1).
Uma avaliação da fase de atividade nos diferentes Ts mostrou modificações na duração do alpha (Figuras 2 a 9), sendo que em alguns dias ocorria alargamento da fase ativa, dias de coincidência, e em outros ocorria um encurtamento da fase ativa, dias de não coincidência. Adicionalmente observamos uma redução da fase de atividade gerando compensação nos diferentes Ts que levaram à ocorrência de atividade e vocalizações na fase de escuro (Figuras 2 a 7, 11 e 12; Tabela 3), de modo que quanto mais curto era o T, como no T21, menor era a quantidade de atividade na fase de claro (Teste de Wilcoxon entre T21,5 e T21: z = -1,9, p < 0,05; entre T22 e T21,5, T22 e T21: z = -2,2, p < 0,05), embora a maior parte da fase ativa tenha continuado na fase de claro. Além disso, observamos que, ao voltarem ao T24, o alpha estava mais curto em comparação ao que apresentavam durante o T24 anterior às mudanças de Ts (t[83] = 11,8; p < 0,01), e foi aumentado gradualmente (Figura 9).
A potência espectral do CSL variou de acordo com o ciclo T, aumentando conforme o
T se aproximava de 24h (Teste de Wilcoxon: z = -2,2, p < 0,05). Por outro lado, não
houve diferença entre as potências espectrais do CNSL dos Ts menores que 24h (Teste de Wilcoxon entre T21 e T21,5: z = -1,2; entre T21 e T22, T21,5 e T22: z = -1,3; todos os ps > 0,05; Figura 10; Tabelas 2 e 3). O período do CNSL diminuiu de T21 para o T21,5 (Teste de Wilcoxon: z = -2,0, p < 0,05), contudo não houve diferença do T21,5 para o
T22 (Teste de Wilcoxon: z = -1,3, p > 0,05; Tabelas 1 e 3).
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Experimento 2- Avaliação das propriedades da dissociação do ritmo de atividade motora
Em suporte aos resultados do Experimento 1, observou-se no Experimento 2 que todos os animais apresentaram dois componentes circadianos na atividade motora, o CSL e o CNSL, durante as duas etapas de T21(Figuras 13 a 18; Tabela 5). Vale salientar que no Experimento 2 houve algumas mudanças que poderiam levar a resultados diferentes dos encontrados no Experimento 1, tais como: as gaiolas eram maiores; a intensidade luminosa era um pouco mais baixa e emitida por lâmpadas de leds juntamente com lâmpadas fluorescentes; o experimento foi realizado com animais diferentes, à exceção apenas de Safira, e com a presença de machos e fêmeas. Mas, apesar de todas essas mudanças, os períodos e potências espectrais do CSL e do CNSL dos machos e fêmeas do Experimento 2 (Tabela 5) foram semelhantes aos apresentados pelas fêmeas durante o
T21 do Experimento 1 (Tabela 3).
Portanto, a obtenção dos resultados do Experimento 2 semelhantes aos do Experimento 1, com animais diferentes, em condições ambientais e de manutenção diferentes, e com a adição de machos reforçou nossa proposta do protocolo de T21 como limite inferior de duração do ciclo claro-escuro promotor da dissociação dos ritmos circadianos em saguis.
No Experimento 2, observamos claramente nos T21 a presença dos dois componentes rítmicos, CSL e CNSL. Este fenômeno foi observado indiferentemente da condição de fotoperíodo anterior, ou seja, tanto após o T24 quanto após o CC. Porém, foram observadas algumas diferenças nas características rítmicas dos componentes: no T21 após o CC a potência espectral do CSL foi maior (Teste de Wilcoxon: z = -1,8, p < 0,05; Tabela 5) e o período e a potência espectral do CNSL foram menores em relação ao T21 após o T24 (Teste de Wilcoxon: tau: z = -2,4; potência espectral: z = -2,1; todos os ps < 0,05; Tabela 5).
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dia de não coincidência (Figuras 13, 14, 17 e 18). Durante as duas etapas de CC os saguis exibiram a atividade motora com apenas um componente circadiano com periodicidade e potência espectral aproximadas de 23,5h e 26%, respectivamente, sem diferença entre o primeiro e o segundo CC (Teste de Wilcoxon: tau: z = -0,8; potência espectral: z = -1,2; todos os ps > 0,1) e sem correlação com os períodos do CNSL no T21 (Teste Tau de Kendall: primeiro T21 e CC: τ = 0,13; segundo T21 e CC: τ = 0,11; todos os ps > 0,05; Tabela 5). Além disso, o período do CNSL da maioria dos animais foi diferente do expresso sob CC, como é possível observar nos periodogramas das Figuras 17 e 18.
Já pelo teste de Rayleigh observou-se um agrupamento do início da fase de atividade para todos os 6 animais que entraram em CC após um dia de coincidência, apesar desse resultado ter sido estatisticamente significativo para apenas 5 desses animais (Figuras 17 e 19). Também foi observado um agrupamento do início da fase de atividade para 3 (Fleury, Fatinha e Safira) dos 5 animais que entraram em CC após um dia de não coincidência, embora esse agrupamento tenha sido estatisticamente significativo para 4 desses animais (Figuras 18 e 19). Adicionalmente, observamos nos primeiros dias de ambos os CC após T21 que a atividade motora de Orestes, um animal com o período endógeno muito próximo a 24 h, continuou avançando por seu período endógeno estar menor que 24h, e foi aumentando gradualmente até ficar bem próximo ou maior que 24h (Figura 14).
33 Figura 4: Actogramas em módulo de 24 h da atividade motora de Bia e Perla sob ciclos CE simétricos com períodos de 21, 21,5, 22 e 24h, correspondentes ao Experimento 1. As colunas brancas representam a fase de claro e as cinzas representam a fase de escuro. (T24b = antes (before) dos Ts menores que 24h; T24a =
34 Figura 5: Actogramas, periodogramas (Sokolove-Bushell) e perfis médios diários da atividade motora de Jailda e Safira durante o Experimento 1. Safira já passou a apresentar apenas um componente circadiano durante o T21.5 e ambas apresentaram sincronização estável sob T22. Os actogramas estão no módulo do respectivo T.
Da esquerda para a direita as colunas correspondem ao T24b, T21, T21,5, T22 e T24a (ver legenda da Figura 3). Os perfis médios diários da atividade motora estão
representados sob o período do ciclo CE externo respectivo. Os dados estão totalizados em intervalos de 5min.
35 Figura 6: Actogramas, periodogramas (Sokolove-Bushell) e perfis médios diários da atividade motora de Orange e Orquídea durante o Experimento 1. Eram os únicos animais com relação de parentesco, pois eram irmãs gêmeas, e foram as únicas que apresentaram os dois componentes na atividade motora sob T21, T21.5 e T22. Os actogramas estão no módulo do respectivo T. Da esquerda para a direita as colunas correspondem ao T24b, T21, T21,5, T22 e T24a (ver legenda da Figura
3). Os perfis médios diários da atividade motora estão representados sob o período do ciclo CE externo respectivo. Os dados estão totalizados em intervalos de 5min.
36 Figura 7: Actogramas, periodogramas (Sokolove-Bushell) e perfis médios diários da atividade motora de Perla e Bia durante o Experimento 1. Ambas apresentaram um padrão de coordenação relativa sob T22. Os actogramas estão no módulo do respectivo T. Da esquerda para a direita as colunas correspondem ao T24b, T21, T21,5, T22 e T24a (ver legenda da Figura 3). Os perfis médios diários da atividade motora estão representados sob o período do ciclo CE externo respectivo. Os
dados estão totalizados em intervalos de 5min.
37 Figura 8: Actogramas da atividade motora de Perla sob T21. O da esquerda está no módulo de 21 h e o da direita no
39 Tabela 1: Valores do período do componente não sincronizado pela luz
(CNSL) da atividade motora de cada animal durante o Experimento 1. Todos os valores foram estatisticamente significativos (Sokolove-Bushell, p 0,05).
Animal Período do CNSL (h)
T21 T21,5 T22
Safira 23,4 - -
Jailda 23,7 23,0 -
Bia 23,6 23,1 -
Perla 23,8 23,4 -
Orange 23,9 23,6 23,3
Orquídea 23,9 23,8 23,4
Todos 23,7 ± 0,2 23,4 ± 0,3 23,3 ± 0,1
Tabela 2: Valores da porcentagem da variância dos componentes da atividade motora durante o Experimento 1. A porcentagem da variância indica a potência espectral do componente da atividade motora. Todos os valores foram estatisticamente significativos (Sokolove-Bushell, p 0,05). (CSL – componente sincronizado pela luz; CNSL –
componente não sincronizado pela luz; T24b – porcentagem da variância dos 14 dias anteriores (before) ao T21).
Animal Variância (%)
T24b T21 CSL T21,5 CSL T22 CSL T21 CNSL T21,5 CNSL T22 CNSL
Safira 50,2 8,7 18,0 31,3 5,8 – –
Jailda 37,5 6,8 11,9 35,5 7,4 5,2 –
Bia 35,6 7,4 13,7 25,5 11,0 12,9 –
Perla 56,8 8,1 16,2 24,9 20,2 9,3 – Orange 50,5 10,0 14,0 16,9 12,0 11,8 10,8 Orquídea 39,2 8,1 11,6 14,7 15,8 15,7 13,0
40 Tabela 3: Média e desvio padrão do período, da porcentagem de variância, que é indicador da potência espectral, e da porcentagem da atividade na fase de claro em relação ao total de atividade em um ciclo do zeitgeber da atividade motora das saguis durante o Experimento 1. (CSL – componente sincronizado pela luz; CNSL –
componente não sincronizado pela luz; T24b – valores para os 14 dias anteriores (before) ao T21; T24a – valores para os 14 dias em seguida (after) ao T22).
Atividade Motora T24b T21 T21.5 T22 T24a
CSL CSL CNSL CSL CNSL CSL CNSL CSL
Período (h) 24 21 23,7 ± 0,2 21,5 23,4 ± 0,3 22 23,3 ± 0,1 23,9 ± 0,05
Variância (%) 45,0 ± 8,7 8,2 ± 1,1 12,0 ± 5,3 14,2 ± 2,5 10,9 ± 3,9 24,8 ± 8,0 11,9 ± 1,5 39,5 ± 5,7
Atividade na Fase de Claro (%) 98,7 ± 1,1 81,9 ± 4,4 86,3 ± 3,8 93,3 ± 3,7 97,8 ± 0,9
Tabela 4: Período, porcentagem da variância, que é indicador da potência espectral, e porcentagem da frequência das vocalizações na fase de claro em relação ao total das vocalizações em um ciclo do zeitgeber de todas as saguis sob ciclos CE simétricos com períodos de 21, 21,5, 22 e 24h, durante o Experimento 1. (ver legenda da Tabela 2).
Vocalizações T21 T21.5 T22 T24f
CSL CNSL CSL CNSL CSL CNSL CSL
Período (h) 20,7 23,6 21,5 22,25 22 23,2 24
Variância (%) 16,6 9,3 13,9 4,0 10,7 4,2 32,4
Frequência na Fase de Claro (%) 95,2 95,0 98,3 98,5
Tabela 5: Média e desvio padrão do período e da porcentagem da variância, que é indicador da potência espectral, para a atividade motora dos saguis durante o Experimento 2.
T21C CSL T21C CNSL CCC T21N CSL T21N CNSL CCN
Período (h) 21 23,9 ± 0,1 23,5 ± 0,3 21 23,5 ± 0,3 23,5 ±0,2
Variância (%) 8,7 ± 1,4 15,8 ± 4,0 26,3 ± 0,1 10,8 ± 3,9 12,5 ± 5,3 28,8 ± 10,4 T21C - primeiro T21; CCC - claro constante iniciado após um dia de coincidência; T21N - segundo T21; CCN - claro constante
41 Figura 10: Potência espectral, indicada pela porcentagem da variância da atividade motora explicada pelos CSL e CNSL. Cada ponto representa o valor médio com o desvio padrão para os animais durante cada ciclo T
no Experimento 1. (%VSP –variance of significant period; T24b – porcentagem da variância dos 14 dias
anteriores (before) ao T21; T24a – valores correspondentes aos 14 dias seguintes (after) ao T22). 0
10 20 30 40 50 60
T24b T21 T21.5 T22 T24a
%
VS
P
Ciclos CE
CSL
42 Figura 11: Actograma da frequência das vocalizações de todas as saguis sob ciclos CE simétricos com períodos de 21, 21,5, 22 e 24h, correspondentes ao Experimento 1. As colunas brancas representam a fase de claro e as cinzas representam a fase de escuro. As ausências de dados durante o T22 ocorreram devido a problemas no registro. Os dados estão totalizados em
intervalos de 15 min.
Figura 12: Actogramas e periodogramas (Sokolove-Bushell) da frequência das vocalizações de todas as saguis em conjunto sob T21 (esq.), T21.5 (meio) e T22 (dir.) durante o Experimento 1. As ausências de dados no
actograma do T22 entre os dias 16 e 18, 34 e 40, 46 e 49, ocorreram devido a problemas no registro. Os
actogramas estão nos módulos dos respectivos Ts. Os dados estão totalizados em intervalos de 15 min. (1240
min = 20.7 h; 1415 min = 23.6 h; 1290 = 21.5 h; 1335 min = 22.2 h; 1320 min = 22 h; 1390 min = 23.2 h).
48 Figura 19: Fase de início do ritmo de atividade motora em livre-curso sob CC após um dia de coincidência em T21 (esq.) e após um dia de não coincidência em T21 (dir.). Cada ponto representa a fase de um animal. (Teste de Rayleigh).
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Discussão
Estudos anteriores relatam que ciclos CE simétricos diferentes de 24 h e próximos aos limites de sincronização são capazes de induzir a expressão de um padrão rítmico com dois componentes circadianos simultâneos em roedores (Cambras et al. 2007; Campuzano et al. 1998; Neto et al. 2008; Schwartz et al. 2009; Vivanco et al. 2010). Os saguis do presente estudo também apresentaram dois ritmos circadianos nos ritmos de atividade motora e de vocalizações quando estavam sob ciclos CE com periodicidades de 21, 21.5 e 22 h. Assim como descrito nos estudos anteriores (Cambras et al. 2007; Campuzano et al. 1998; Neto et al. 2008; Schwartz et al. 2009; Vivanco et al. 2010), um componente apresentava o mesmo período do ciclo CE, sendo então denominado componente sincronizado pela luz (CSL), enquanto o outro estava em livre-curso, sendo então denominado componente não-sincronizado pela luz (CNSL).
Uma possível explicação para o surgimento desses dois componentes é que os saguis não sincronizaram a esses Ts, expressando a atividade motora em livre-curso, refletida pelo CNSL, mas sob forte mascaramento pelo escuro que inibe a atividade motora, provocando a expressão do componente com o mesmo período do ciclo CE. Uma evidência de mascaramento é o alongamento brusco do alpha no primeiro dia em CC após um dia de não coincidência. Outra evidência é que havia uma redução brusca tanto na atividade motora quanto nas vocalizações quando o dia biológico coincidia com a fase de escuro do ciclo CE, o que pode ter levado a um aumento na potência espectral do CSL, assim como à diminuição da potência espectral do CNSL. Além disso, os animais exibiram picos reativos nas transições de CE, sendo um logo após o acender das luzes e outro logo após o início do escuro, ou seja, ocorreram em resposta a uma mudança ambiental, sendo essa uma característica típica de mascaramento.
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capaz de alterar os parâmetros do marcapasso circadiano, mas não é forte o bastante para promover uma sincronização estável; 3) o alongamento gradual do alpha na ressincronização ao T24 após os ciclos CE menores que 24 h; 4) o período do CNSL da maioria dos animais ser diferente do expresso sob CC; 5) pelo teste de Rayleigh ter sido encontrado um agrupamento significativo do início da fase de atividade para a maioria dos saguis em CC, tanto após um dia de coincidência quanto um dia de não coincidência no T21; 6) a atividade motora de Orestes que sob CC continuou avançando por alguns dias a partir da relação de fase que mantinha com o ciclo CE anterior de 21 h. Como o sagui sob condições ambientais constantes apresenta naturalmente uma tendência para encurtar o período endógeno, devido ao seu período endógeno ser em torno de 23,3 ± 0,4 h (Erkert 1989; Glass et al. 2001; Silva et al. 2005), então fica difícil separar se o encurtamento do período endógeno sob CC foi devido à expressão de sua ritmicidade endógena ou se foi efeito do CE anterior. Contudo, a atividade motora de Orestes é particularmente interessante por ele apresentar um período endógeno muito próximo, às vezes até maior que 24 h, e ter continuado avançando sob CC. Seu período endógeno estava menor que 24h e foi aumentando gradualmente até ficar bem próximo ou maior que 24h, sendo esta uma clara evidência de alterações rítmicas por influência do T21.
Com base nas evidências expostas acima, propomos que os dois componentes circadianos simultâneos surgem nos ritmos de atividade motora e vocalizações dos saguis devido a uma sincronização parcial do sistema circadiano, estando pelo menos um grupo de osciladores sincronizado ao ciclo CE pelos processos de mascaramento e coordenação relativa, resultando no CSL, enquanto pelo menos outro grupo de osciladores continua expressando a ritmicidade endógena, embora também sob influência de mascaramento pelo ciclo CE.
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(Cambras et al. 2007; Campuzano et al. 1998; de la Iglesia et al. 2004; Vivanco et al. 2010). Os resultados que mais fortalecem essa hipótese são os do trabalho de de la Iglesia e colaboradores (2004), que mostraram uma dissociação morfofuncional no NSQ. Eles demonstraram que a expressão gênica no NSQ de ratos sob T22 refletia a expressão dos dois componentes, ou atividades separadas de dois grupos de osciladores, sendo um na subdivisão dorsomedial, responsável pela geração do CNSL, e outro na subdivisão ventrolateral, responsável pela geração do CSL.
Contudo, a partir dos resultados desse trabalho, propomos que o mascaramento atua sobre a expressão dos dois componentes, CSL e CNSL, diferentemente dos outros autores que propõem que o mascaramento atua somente sobre a expressão do CSL, sendo a expressão do CNSL relacionada apenas com a ritmicidade endógena do marcapasso (Campuzano et al. 1998; Vivanco et al. 2010). Alguns autores até denominam o CNSL como não dependente da luz (Vivanco et al. 2010). Para nós, os trabalhos com roedores não mostram a evidência do mascaramento no CNSL pelo fato dos sujeitos experimentais serem polifásicos, apresentando vários episódios de atividade na fase de claro apesar de serem noturnos. Por exemplo, os ratos são predominantemente noturnos, mas também apresentam atividade durante a fase de claro, mesmo quando estão sob T24. O degus apesar de ser considerado diurno, apresenta grande variação de cronotipo em laboratório, podendo inclusive alternar entre diurnalidade e noturnalidade dependendo apenas da disponibilidade de roda de atividade na gaiola (Otalora et al. 2010; Vivanco et al. 2010). Ou seja, para essas espécies o claro não é tão aversivo quanto o escuro é para os saguis, espécie estritamente diurna em habitat natural ou em laboratório sob T24 (Erkert 1989; Menezes et al.1993; Moreira et al. 1991). Dessa forma, a expressão do CSL e do CNSL deve ter sido fortemente influenciada pelo mascaramento negativo do escuro inibindo a expressão tanto da atividade quanto das vocalizações, principalmente quando havia coincidência entre o dia biológico do animal com a noite do ciclo CE.
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animais exibindo os dois componentes, passando a exibir apenas o CSL. Isso ocorreu para uma sagui sob T21.5 e quatro sob T22, que passaram a exibir a atividade motora ou em um padrão típico de coordenação relativa ou de sincronização por arrastamento, mas com uma relação de fase diferente da apresentada quando estão sob T24. Esse dado é interessante porque difere de um estudo anterior com saguis sob ciclos CE diferentes de 24 h, segundo o qual nenhum sagui sincronizou ao T22, apresentando sincronização estável apenas quando submetidos a T23 (Harter & Erkert 1993). Uma possível explicação para essa diferença é que os pós-efeitos devido à exposição aos
T21 e T21.5 anteriormente ao T22 tenham facilitado a sincronização estável ao T22.
Outra possível explicação é que essa diferença seja devido à variação interindividual dos períodos endógenos, o que possibilita que animais com períodos endógenos mais curtos sincronizem a ciclos CE tão curtos como os de 21.5 e de 22 h. De fato, essas fêmeas geralmente apresentavam o período do CNSL mais curto do que as outras presentes no mesmo experimento. Essa variação interindividual na periodicidade endógena pode ser devido à variação geográfica, ou seja, devido a diferenças nas frequências alélicas das bases genéticas de populações distanciadas geograficamente (Futuyma 1992). Dois fatos interessantes reforçam essa ideia: 1) dos animais submetidos aos ciclos CE menores que 24 h, Safira era a única de origem selvagem, enquanto todas as outras nasceram na mesma colônia. Ela foi a única sagui que apresentou a potência espectral do CSL maior que a do CNSL durante o T21 e que já passou a exibir a atividade motora com apenas um componente circadiano quando estava sob T21.5. Somado a isso, o período do seu CNSL era bem menor que o das outras fêmeas; 2) o estudo de Harter & Erkert (1993) foi realizado com animais de uma colônia na Alemanha, os quais podemos presumir que há pelo menos 15 anos não tiveram contato algum com saguis do Nordeste do Brasil, se é que algum dia tiveram, e muito menos com animais da colônia do Núcleo de Primatologia da UFRN, de onde vieram nossos animais. Ou seja, a base genética dessas populações pode ser diferente o bastante, de modo que os animais utilizados no estudo na Alemanha tenham períodos endógenos um pouco maiores que os animais daqui, no Nordeste do Brasil.
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do T, semelhante ao descrito para a atividade motora de ratos (Campuzano et al. 1998). Contudo, para os ratos observou-se uma complementaridade da potência espectral dos dois componentes visto que, conforme a potência espectral do CSL aumentava com o aumento do T, diminuía a potência espectral do CNSL. No presente estudo, os saguis não apresentaram complementaridade da potência espectral dos dois componentes, pois apesar de se observar uma tendência à diminuição do CNSL, a mesma não foi estatisticamente significativa. Além disso, observou-se a ocorrência de atividade e vocalizações na fase de escuro sob os ciclos CE menores que 24 h, de modo que quanto mais curto era o T maior era a ocorrência dessas variáveis na fase de escuro. Esse dado é particularmente interessante, pois a ocorrência de vocalizações e atividade na fase de escuro indica que os animais estavam ativos e alerta apesar da condição ambiental ser propícia ao repouso para essa espécie estritamente diurna (Erkert 1989; Menezes et al.1993; Moreira et al. 1991). Isso é semelhante ao que ocorre com trabalhadores em turnos ou noturnos, que por imposição dos horários de trabalho se expõem a diferentes fotoperíodos em curtos intervalos de tempo, o que leva à dessincronização entre os osciladores endógenos (Waterhouse, Reilly, Atkinson, Edwards 2007). Essa dessincronização interna provoca distúrbios na ritmicidade circadiana, de modo que esses trabalhadores podem estar bem alerta na fase de escuro, condição ambiental propícia ao repouso, ou estar sonolentos na fase de claro, condição ambiental propícia à atividade para os humanos. Ainda mais importante que isso, esses distúrbios na ritmicidade circadiana podem dificultar a recuperação e gerar muitas doenças, sendo inclusive considerada como fator provavelmente carcinogênico pela Agência Internacional de Pesquisa em Câncer (Filipski & Levi 2009). Essa proposta é reforçada por estudos que observaram aceleração no crescimento de tumores, devido a distúrbios na ritmicidade circadiana promovidos por modificações nos sincronizadores alimentares, administração de agentes farmacológicos (Filipski & Levi 2009), destruição do NSQ ou por um modelo crônico de jet lag (Filipski et al. 2006; Filipski & Levi 2009).
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sincronização, pois propicia um aprofundamento no conhecimento do mecanismo de acoplamento entre as células do NSQ e no entendimento da plasticidade na vida real, podendo levar ao desenvolvimento de novos tratamentos para todos esses distúrbios da ritmicidade circadiana (Campuzano et al. 1998, Neto et al. 2008). Schwartz e colaboradores (2009) sugerem que a dessincronização forçada das subdivisões ventrolateral e dorsomedial do NSQ promovida por esse modelo oferece uma oportunidade de acessar a habilidade dessas duas subdivisões de sustentar saídas circadianas independentes, de forma não invasiva, como ressaltado por Schwartz (2009).
Embora nossos dados sejam apenas comportamentais, os ritmos de atividade motora e vocalizações são saídas rítmicas que representam o funcionamento do sistema circadiano, podendo ser então considerados como evidências para nossa hipótese de que o sistema circadiano de primatas é semelhante ao de roedores, sendo composto por pelo menos dois grupos de osciladores que atuam acoplados entre si, e que esse acoplamento pode ser quebrado pela exposição desses animais a ciclos CE próximos ao limite de sincronização. Dessa forma, sugerimos que o T21 promove dessincronização interna nos ritmos circadianos dos saguis, da mesma forma que o
T22 promove nos ritmos circadianos dos ratos (Cambras et al. 2007; Campuzano et al.
1998; Neto et al. 2008; Schwartz et al. 2009) ou que o T21 e o T28 promovem nos ritmos circadianos do degus (Vivanco et al. 2010). O T21 foi assim considerado por ter sido o único capaz de promover dissociação dos ritmos circadianos em todos os saguis, sempre que os mesmos foram submetidos a ele, e exibindo ambos os componentes com potências espectrais bem próximas.
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estrutura do sistema circadiano dos ratos sejam as responsáveis por essas diferenças entre machos e fêmeas.
Em estudo com macacos da espécie Macaca mulatta, também conhecidos como macacos rhesus, foi observado para as variáveis fisiológicas de temperatura corporal, batimentos cardíacos, atividade física e alimentação que os ritmos circadianos das fêmeas eram atrasados em comparação aos ritmos dos machos, embora não houvessem diferenças na média ou amplitude entre os gêneros (Barger et al. 2010). Todos esses resultados fortalecem a hipótese proposta por Barger et al. (2010) de que o sistema circadiano deve apresentar diferenças fundamentais entre machos e fêmeas. Além disso, propomos que essas diferenças variam dependendo da espécie, pois enquanto nos saguis, que são primatas diurnos, foram os machos que apresentaram o CNSL com maior potência espectral, nos ratos, que são roedores noturnos, foram as fêmeas que apresentaram. Dessa forma, sugerimos que os estudos cronobiológicos envolvam, sempre que possível, animais de ambos os gêneros para que essas diferenças sejam mais investigadas.
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Conclusões
Ciclos claro-escuro simétricos de 21, 21.5 e 22 h, períodos próximos ao limite inferior de sincronização, levam à ocorrência de dois componentes circadianos simultâneos devido a uma sincronização parcial do sistema circadiano, sendo um componente sincronizado pela luz, resultado de sincronização de pelo menos um grupo de osciladores pelos processos de mascaramento e coordenação relativa, enquanto o componente não sincronizado pela luz é resultado da ritmicidade endógena do marcapasso circadiano sob influência de mascaramento pelo ciclo CE. Como o ciclo CE simétrico de 21 h foi o único a promover o surgimento dos dois componentes circadianos nos ritmos circadianos de todos os Callithrix jacchus, este foi então considerado o período de ciclo CE promotor de dissociação na ritmicidade circadiana dessa espécie, sendo então sugerido como modelo de dessincronização forçada em primatas não-humanos diurnos.
