G L I C O L I P O P R O T E I N A D E L E P T O S P I R A I N T E R R O G A N S S O R O G R U P O I C T E R O H A E M O R R H A G I A E : D I S T R I B U I Ç Ã O E M F Í G A D O E R I M D E C O B A I A S
E X P E R I M E N T A L M E N T E I N F E C T A D A S
K . I . M A C E D O S A N T O S (1), E E . S A K A T A (2), P . H . Y A S I D A (3), A . W A K A M A T S U (1), C . T . K A N A M I ' R A (1), I. C A N D E L O R I (1), C . B . P E S T A N A (1) & V . Á . F . A L V E S (1)
R E S U M O
Acredita-se que as lesões teciduais na leptospirose possam decorrer da ação di-reta das leptospiras, de toxinas sintetizadas ou liberadas durante sua lise. O presente estudo visou a extração quimica da glicolipoproteína ( G L P ) da leptospira, a produ-ção de anti-soro anti-GLP e a avaliaprodu-ção de sua distribuiprodu-ção em cortes de fígado e rim de cobaias inoculadas e sacrificadas em estudo seqüencial diário até o 6? dia de
in-fecçâo, correspondente ao pico da doença. Procurou-se também correlacionar a ex-pressão tecidual da G L P com o grau de lesões locais, em busca de novos subsídios para a compreensão da patogenia da leptospirose. A Q L P foi detectada em fígado e rim de 2 dentre 6 cobaias no 5? dia e em todas as 6 no 6? dia de infecção, sob a
for-ma de grânulos no citoplasfor-ma de for-macrófagos, livres no interstício ou acolados à membrana de células endoteliais e parenquimatosas, especialmente nas regiões mais lesadas. A cronologia do aparecimento da G L P e sua distribuição sugerem tratar-se de produto de lise de leptospiras fagocitadas por macrófagos e que esta substância, conquanto não comprovada como iniciadora das lesões, associa-se a seu agravamen-to nas etapas mais avançadas da lepagravamen-tospirose.
I M T E R M O S . Glicolipoproteína; Leptospirose; Imunohistoquímica.
I N T R O D U Ç Ã O
Estudos clínicos e anátomo-patológicos da leptospirose têm sugerido que as lesões ou as dis-funções orgânicas possam ser causadas pela ação direta das leptospiras, por toxinas elabora-das por essas bactérias ou liberaelabora-das durante a sua lise 2,4,5,6,9,10,11,23,29. Diversas tentativas de
iso-lamento e caracterização de possíveis fatores tó-xicos, foram realizadas por S T A L H E I M2 4
, MIL-L E R e cols.* J A C K S O N & Z E Y1 6
, K N I G H T e cols. 1 7 e F A I N E e cols. , 5. A ação citotóxica do
sorotipo pomona sobre cultura âe fibroblastos foi demonstrada por Y A M e cols.2 8
, sem entre-tanto caracterizar a natureza química responsá-vel por essa atividade tóxica. J á , V I N H e cols.2 7 extrairam do sorotipo Copenhagen!, tanto de ce-pas virulentas quanto de cece-pas avirulentas, uma glicolipoproteína ( G L P ) de efeito citotóxico so-bre fibroblastos de camundongos e sugeriram ser o componente lipídico dessa G L P o fator res-ponsável por essa toxicidade.
(1) Divisão de Patologia, Instituto A d o l f o L u t z . S ã o P a u l o , S P , Brasil. (2) Seção de Bacteriologia, Instituto A d o l f o L u t z . São P a u l o , S P , Brasil.
(3)" Instituto de Ciências Bioniédicas da Universidade de S ã o P a u l o . São P a u l o , S P , Brasil.
Tendo em vista novos subsídios à com-preensão da patogenia da leptospirose, o pre-sente estudo teve como objetivo a extração quí-mica da glicolipoproteina ( G L P ) de lepstospira, a produção de anti-soro de coelho anti-GLP e, através de técnicas imunohistoquímicas, a ava-liação de sua presença em tecidos de cobaias inoculadas experimentalmente.
M A T E R I A L E M É T O D O S
Extração da G L P — A amostra utilizada foi a cepa 15/86 isolada de paciente internado no Hospital Emilio Ribas e tipificada como sen-do sen-do sorotipo monymusk sen-do grupo Icterohae-morrhagiae de L . interrogans, pela técnica de absorção cruzada de aglutininas.
Segundo a técnica de V I N H e cols.2 7 , a cul-tura de 7 dias à 30°C em meio E M J H (Difco) foi centrifugada e seu sedimento ressuspenso em solução T r i s / H C l 0,01M p H 7.4, contendo 50 mcg de lisozima (Sigma) e incubado por 18 horas a 34°C. As leptospiras assim tratadas fo-ram submetidas a nova centrifugação a 20.000 x g por 30 minutos e seu sobrenadante foi trata-do com uma mistura de 50 mcg/ml de RNAse e de DNAse (Sigma) por 3 horas a 37°C. A seguir foi realizada diálise com solução tampão T r i s / H C l p H 7.4 por 24 horas a 4°C e o dialisa-do foi acidificadialisa-do até p H 3.7 com solução de ácido acético 1M. Formou-se então um precipi-tado, correspondente à glicolipoproteina ( G L P ) , que foi centrifugado a 37.000 x g por 30 minutos e lavado 2 vezes com ácido acético O . I M .
Obtenção de *»nti-GLP em coelho — 2 mg de G L P (peso úmido) foram ressuspensos em P B S , emulsionados v/v com adjuvante incom-pleto de Freund e injetados intradermicamente em coelhos de 4kg. Após 3 semanas, proce-deu-se à sangria de prova e o teor de anticorpos anti-GLP foi dosado pela reação de soroagluti-nação microscópica, empregando a própria ce-pa 15/86.
Reprodução experimentai da leptospirose em cobaias — Foi realizado um estudo seqüen-cial diário até o 6? dia d*e infecção utilizando 30 cobaias recém-desmamadas, pesando de 170 a 200 gramas e inoculadas com a cepa 15/86. Os grupos foram assim constituídos:
Grupo 1: 2 cobaias sacrificadas no 1? dia após inoculação
Grupo 2: 2 cobaias sacrificadas no 2? dia
após inoculação
Grupo 3: 2 cobaias sacrificadas no 3? dia após inoculação
Grupo 4: 6 cobaias sacrificadas no 4? dia após inoculação
Grupo 5: 6 cobaias sacrificadas no 5? dia após inoculação
Grupo 6: 6 cobaias sacrificadas no 6? dia
após inoculação
Cada cobaia dos grupos teste (1 a 6) foi inoculada por via intraperitoneal com 1 ml de cultura, de 5 a 7 dias a 28-30°C em meio Flet-cher e com densidade aproximada de 10 a 10 leptospiras/ml. Antes de serem sacrificadas, as cobaias foram submetidas à punção intracar-díaca para obtenção de retrocultura como teste-munho da etiologia.
O grupo-controle (grupo O) constituído de 6 cobaias, foi inoculado com 1 ml de meio Flet-cher estéril.
Após o sacrifício, seguiu-se um exame ma-croscópico e a retirada de fragmentos de fígado e rim que, após fixação em solução de Bouin, desidratação em álcoois, diafanização em xilóis e inclusão em parafina, foram seccionados a 4 micrômetros para análises imunohistoquími-cas.
Anti-soro — Soro total de coelho an-ti-GLP de leptospira, absorvido com pó de fí-gado e rim de cobaias normais na proporção de 0,lg/ml de soro diluído 1/2 durante uma noite, foi centrifugado a 3.000 xg por 15 minutos, sen-do o sobrenadante utilizasen-do como anticorpo primário na diluição 1/40. Como anticorpo se-cundário foi empregado soro de cabra anti-IgG de coelho diluído 1/50, obtido comercialmente (Diagnostic Reagents, U S A ) . A amplificação foi feita pelo uso do complexo peroxidase an-ti-peroxidase ( P A P ) obtido em coelho (Dako, U S A ) , diluído 1/2000.
Protocolo Imunohistoquímico — Foi utili-zado o método de anticorpos não-conjugados, descrito por S T E R N B E R G E R e cols.25 modifi-cado às nossas condições laboratoriais, de acor-do com A L V E S e cols.1
Controles negativos:
1 — Casos-controle (grupo O) foram sempre submetidos às mesmas pesquisas de antigenos efetuadas nos demais grupos.
2 — Foi aplicada reação a cortes de tecido sabi-damente positivos para o antígeno, mas omitin-do-se a incubação com anticorpo primário. 3 — Idem, omitindo-se a incubação do anticor-po secundário.
4 — Idem, omitindo-se a incubação do comple-xo de amplificação.
5 — Idem, com incubação do sobrenadante re-sultante da absorção do anticorpo primário com excesso de G L P de leptospira.
Análise imunohistoquímica: A análise dos preparados foi efetuada por um único observa-dor ( V . A . F . A . ) , visando avaliar qualitativa-mente a distribuição da G L P nas estruturas he-páticas e renais das cobaias experimentalmente infectadas.
R E S U L T A D O S
Nenhum dos controles negativos apresen-tou qualquer coloração à pesquisa imunohisto-química, o mesmo sucedendo com as cobaias sacrificadas no 1?, 2?, 3? e 4? dias.
A glicolipoproteina foi encontrada no teci-do hepático e renal apenas a partir teci-do 5? dia de infecção, com padrão granuloso ou de curtos bastões.
No tecido hepático, dentre os casos do gru-po 5, apenas as cobaias 5.1 e 5.6 mostraram-se positivas, notando-se raros grânulos no cito-plasma de macrófagos, livres no interstício ou acolados à membrana de células endoteliais. Por outro lado, no 6? dia de infecção, todos os
casos apresentaram número variável de grânu-los no citoplasma de macrófagos (Fig. 1), livres no interstício ou acolados à membrana de célu-las endoteliais e de hepatócitos (Fig. 2). Raros grânulos foram ainda visualizados no citoplas-ma destes últimos.
D I S C U S S Ã O
Para o estudo das lesões máximas da lep-tospirose ieterohemorrágica, selecionamos den-tre as coleções de cultura de L. interrogans
exuberan-te, incluindo icterícia, insuficiência renal aguda e diátese hemorrágica. A absorção cruzada de aglutininas, foi confirmada sua classificação no sorogrupo Icterohaemorrhagiae, sendo identifi-cado como sorotipo monymusk.
Este estudo, com sacrifício seqüencial diá-rio de animais do 1? ao 6? dia de infecção,
de-monstrou-se suficiente para análise de todo o espectro da doença já que, no último dia do ex-perimento três das cobaias evoluíram para mor-te espontânea, encontrando-se outras duas em fase agônica quando do sacrifício.
A detecção de antígenos específicos das leptospiras mediante imunohistoquímica enzi-mática, foi publicada por E L L I S e cols. (1983)1 4 que exploraram a expressão de antígenos em te-cido de rim de porcos com objetivos de diag-nóstico veterinário. Esses autores valorizaram apenas as estruturas antigênicas com formato de leptospiras íntegras e mostraram a alta sensi-bilidade e especificidade do método quando comparado com o diagnóstico obtido por cultu-ra de leptospicultu-ras. No primeiro estudo referindo detecção imunohistoquímica enzimática de an-tígeno de leptospira em rim de cobaia1
empre-gamos o complexo peroxidase anti-peroxidase. A seguir, constatamos a presença de antígeno de leptospira em tecidos humanos hepáticos e renais, comprovando a utilidade do método pa-ra diagnóstico em autópsias2
. Foi também esta a metodologia que usamos em recente estudo de lesões vasculares e cardíacas na leptospirose12
. Estas experiências prévias levaram-nos a escolher o complexo peroxidase anti-peroxidase para a amplificação das reações com antígenos de leptospira.
Os anticorpos usados foram preparados a partir da própria cepa 15/86, empregada na inoculação de cobaias. Ressalte-se que, no pre-sente estudo, o antígeno utilizado na produção de anti-soro consistiu apenas da glicolipoprotei-na G L P , extraída desta leptospira. Para obten-ção de maior contraste foram efetuadas algu-mas modificações no método que descrevemos originalmente1
, sendo agora introduzida a pré-digestão proteica com tripsina e a incubação com o anticorpo primário por 24 horas.
A imunohistoquímica enzimática com em-prego de peroxidase tem dentre suas principais características favoráveis a aplicabilidade a te-cidos fixados e incluídos rotineiramente, desde que os antígenos não sejam totalmente destruí-dos por estes procedimentos, a manutenção da coloração por tempo indefinido e a
possibilida-de possibilida-de análise à microscopia óptica convencio-nal1 3
<1 8 '2 1
'2 2 '2 6
.
A amplificação pelo complexo peroxidase anti-peroxidase ( P A P )2 5
, acarreta grande sensi-bilidade devido à formação de imunecomplexos mais volumosos, à estrutura cíclica do comple-xo P A P , que lhe confere grande estabilidade, e à ausência de ligações covalentes entre a enzima e os anticorpos envolvidos, não diminuindo a afinidade imunológica dos mesmos7
'8 2 0 . Conquanto a maioria dos estudiosos atri-bua a formação das lesões teciduais na leptospi-rose a efeito tóxico ligado às leptospiras, restam importantes questões sobre a participação dire-ta do microorganismo através de sua movimen-tação ativa, como propuseram S I T P R I J A e cols.2 3
, bem como a de seus componentes. Estes poderiam incluir produtos de síntese bacteriana ou corresponder a substâncias liberadas duran-te sua lise2 2 9
. Recentemente, V I N H e cols.2 7 extraíram uma glicolipoproteina a partir de cul-tura de L . interrogans sorotipo copenhageni e demonstraram sua toxicidade direta em fibro-blasts de camundongos.
A glicolipoproteina extraída da leptospira, segundo método de V I N H e col.2 7
, foi pela pri-meira vez detectada em tecido hepático e renal no presente trabalho, mostrando-se em peque-na quantidade em apepeque-nas 2 casos no 5? dia e em abundância no 6? dia de infecção. Sua localiza-ção no fígado deu-se no citoplasma de células de Kupffer, nas membranas de células endote-liais e de hepatócitos. No rim, foram evidencia-das no citoplasma de macrófagos, livres no in-terstício e no epitélio ou luz tubular.
Em estudo recente3
, observamos que neste modelo experimental, as lesões hepáticas e re-nais iniciam-se no 4? dia, crescendo até um pico no 6? dia de infecção, quando as cobaias
su-cumbem espontaneamente ou encontram-se em fase agônica.
A cronologia do aparecimento da G L P nos tecidos, bem como sua distribuição, sugerem que esta substância seja um dos produtos de lise das leptospiras quando fagocitadas pelos ma-crófagos.
Esta G L P , que foi recentemente extraída e demonstrada como citotóxica2 7
as-sociar a seu intenso agravamento na fase final da doença.
S U M M A R Y
Glycolipoprotein from Leptospira interrogans serogroup icterohaemorrhagiae: immunohistochemical expression in liver and kidney of experimentally infected guinea-pigs.
Tissue damage in leptospirosis has been ascribed to direct effect of the microorganisms and/or their virulence, including products synthetised by leptospires or released during their lysis. This study aimed at chemical extraction of the glycolipoprotein ( G L P ) from virulent leptospires, production of a rabbit anti-GLP and analysis of its distribution in liver and kidney of inoculated guinea-pigs, sacrificed sequentially from the 1st
to 6t h
day of infection, covering the whole, spectrum of ac^te leptospirosis. The comparison of G L P expression to local injuries aimed at new pathogenetic data. G L P was detected in liver and kidney in 2 out of 6 guinea-pigs on the 5t h day and in all 6 animais on the 6t h
day of infection. Granular forms were seen in the cytoplasm of macrophages, free in interstitium or adhered to endothelial and parenchimal cell membranes, especially in the most damaged sites. These findings lead us to the hypothesis of G L P as a toxic factor resulting from leptospiral lysis by macrophages. Although it was not proved as a promoter of initial lesions, it seems to be related to the enhancement of tissue damage late in the course of the disease.
R E F E R Ê N C I A S B I B L I O G R Á F I C A S
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