Avaliação da composição corporal e de marcadores da inflamação de pacientes com doença de Crohn

UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS

FACULDADE DE CIÊNCIAS MÉDICAS

JÚLIA FIGUEIREDO MACHADO

AVALIAÇÃO DA COMPOSIÇÃO CORPORAL E DE MARCADORES

DA INFLAMAÇÃO DE PACIENTES COM DOENÇA DE CROHN

Campinas

2017

AVALIAÇÃO DA COMPOSIÇÃO CORPORAL E DE MARCADORES

DA INFLAMAÇÃO DE PACIENTES COM DOENÇA DE CROHN

Tese apresentada à Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para obtenção do título de Doutora em Ciências, na área de Saúde da Criança e do Adolescente.

Orientadora: Profa. Dra. Maria Marluce dos Santos Vilela

ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA TESE DEFENDIDA PELA ALUNA JÚLIA FIGUEIREDO MACHADO,

E ORIENTADA PELA PROFA. DRA. MARIA MARLUCE DOS SANTOS VILELA.

Campinas

2017

DEDICATÓRIA

À FAPESP pelo apoio financeiro (Processo: 2008/53902-3).

À minha orientadora, Profa. Dra. Marluce, pela oportunidade, confiança e por compartilhar seus conhecimentos.

Ao Dr. Claudio Coy, pela oportunidade de trabalhar com pacientes com Doença de Crohn.

Ao Ambulatório de Doenças Inflamatórias Intestinais e a todos os seus profissionais. Aos pacientes pela disponibilidade em contribuir com este estudo.

Ao programa de pós-graduação em Saúde da Criança e do Adolescente. Aos amigos do Laboratório de Imunologia Pediátrica.

Ao Laboratório Central de Tecnologias de Alto Desempenho em Ciências da Vida (LaCTAD).

Aos funcionários e amigos do CIPED, em especial à Silvana. À Lia por toda a ajuda.

Aos professores, Dra. Elizete Lomazi e Dr. Gabriel Hessel, pelas importantes contribuições no exame de qualificação.

Ao meu pai Rubens, pelo incentivo e contribuições.

À minha mãe, pelo incentivo, amor, carinho, compreensão... À minha família por todo o apoio.

A avaliação da atividade inflamatória durante o acompanhamento clínico da doença de Crohn (DC) representa um desafio na prática clínica, pois é baseada em uma combinação de sinais e sintomas clínicos, marcadores bioquímicos, ressonância magnética, endoscopia com biópsia e histopatologia. A monitorização da doença clinicamente silenciosa é fundamental para diferenciar os pacientes que permanecerão em remissão daqueles em risco de ativação da doença. O objetivo do estudo foi analisar a atividade inflamatória de pacientes com DC utilizando marcadores séricos. A análise incluiu marcadores de soro, tais como: TNF-α, leptina, adiponectina, resistina, IL-8, CCL2, proteína C reativa (PCR) e contagens de leucócitos e plaquetas. Um grupo de 31 adultos com DC e 29 controles saudáveis (HC) foram incluídos no estudo. Para o escore de atividade da doença, utilizou-se o Índice de Atividade da Doença de Crohn (IADC). Os pacientes foram separados em dois grupos: grupo de pacientes em remissão da doença (RDC), com IADC < 150, e grupo em atividade da doença (ADC), com IADC ≥ 150. Para a análise das citocinas e quimiocinas foram utilizados os kits Multiplex da Millipore. A Absorciometria com Raios-X de Dupla Energia (DEXA) foi realizada em todos os participantes para fornecer dados sobre a composição corporal. A maioria dos pacientes estava em remissão clínica da doença e compuseram o grupo RDC (n=25). Mesmo em remissão da doença, o grupo RDC, quando comparado ao grupo HC, mostrou níveis aumentados de leucócitos, neutrófilos, plaquetas e PCR. No entanto, a CCL2 apresentou-se reduzida neste grupo, quando comparado aos grupos HC e ADC. Os monócitos foram significativamente elevados no grupo ADC quando comparados aos grupos RDC e HC. Quando os grupos RDC e ADC foram combinados e comparados ao grupo HC, observamos aumento na gordura visceral e nos níveis de resistina e adiponectina. Os pacientes com DC considerados em remissão pelo IADC, mostram uma redução acentuada de CCL2 e consequente contagem de monócitos normais, indicando que esta quimiocina é um biomarcador promissor de controle da doença de Crohn.

The evaluation of inflammatory activity during clinical follow-up of Crohn's Disease (CD) represents a challenge in clinical practice because it is based on a combination of clinical signs and symptoms, biochemical markers, magnetic resonance imaging, endoscopy with biopsy and histopathology. Monitoring of clinically silent disease is critical to differentiate those patients who will remain quiescent of those at risk of disease activation. The aim of the study was to analyze the inflammatory activity of the CD patients using serum markers. The analysis included serum markers, such as TNF-α, leptin, adiponectin, resistin, IL-8, CCL2, C-reactive protein (CRP) and leukocyte and platelet counts. A group of 31 adults with CD and 29 health controls (HC) were enrolled to the study. For disease activity scoring, the Crohn’s Disease Activity Index (CDAI) was used. The patients were separated into two groups: remission group (RCD), with CDAI<150 and in disease activity group (ACD), with IADC≥150. Millipore Multiplex kits were used for cytokine and chemokine analysis. Dual Energy X-ray Absorptiometry (DEXA) was performed in all participants to provide data on body composition. Most of the patients were in disease clinical remission (n = 25). Even in remission, the RCD group, when compared to the HC group, showed increased levels of neutrophils, platelets and CRP. However, CCL2 was reduced in this group when compared to HC and ACD groups. Monocytes were significantly elevated in the ACD group when compared to the RCD and HC groups. When the RCD and ACD groups were combined and compared to the HC group, we observed increases in visceral fat and resistin and adiponectin levels. CD patients considered in remission by the CDAI show marked reduction of CCL2 and consequent normal monocytes counts, indicating that this chemokine is a promising biomarker for control of Crohn's disease.

Figura 1.1 Estrutura conceitual para a patogênese da DII ... 16 Figura 1.2 Modelo proposto de enriquecimento de monócitos CD16 + durante a inflamação intestinal ... 18 Figura 1.3 Um modelo de inflamação crônica causada por erros inatos de macrófagos de pacientes com DC ... 19 Figura 1.4. Citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC) e dependente do complemento (CDC) ... ... 21 Figura 1.5 Dois dos principais mecanismos alternativos de ação do anti-TNF. ... 22 Figura 1.6 Características da gordura mesentérica na doença de Crohn. ... 26 Figura 1.7 Conceito hipotético de quatro passos da patogênese da gordura mesentérica na doença de Crohn. ... 27 Figura 4.1 Distribuição de leucócitos, linfócitos, neutrófilos, monócitos, proteína C reativa (PCR) e CCL2. ... 35 Figura 4.2 Distribuição de leptina, adiponectina e resistina ... 35

Tabela 4.1 Características clínicas dos pacientes com doença de Crohn ... 32 Tabela 4.2 Características demográficas e nutricionais dos participantes do estudo .... 32 Tabela 4.3 Exames laboratoriais ... 34

ADA adalimumabe

AINEs fármacos anti-inflamatórios não esteroides Anti-TNF anti-fator de necrose tumoral

AZA azatioprina CC circunferência da cintura CCL2 CC‑chemokine ligand 2 CCL13 CC‑chemokine ligand 13 CCR2 CC‑chemokine receptor 2 CCR6 CC‑chemokine receptor 6 CD14 cluster of differentiation 14 CD16 cluster of differentiation 16 CF calprotectina fecal

CIPED Centro de Investigação em Pediatria DC Doença de Crohn

DEXA absorciometria de raios-x de dupla energia DII Doença Inflamatória Intestinal

IADC Índice de Atividade da Doença de Crohn IFX infliximabe IL‑1 Interleucina 1 IL‑2 Interleucina 2 IL‑10 Interleucina 10 IL‑12 Interleucina 12 IL‑21 Interleucina 21 IL‑27 Interleucina 27

IL‑12R receptor de Interleucina 12 IL‑23R receptor de Interleucina 23 IFNγ Interferon gama

IMC Índice de Massa Corporal HC controles saudáveis HDL High Density Lipoprotein JAK2 Janus kinase 2

LaCTAD Laboratório Central de Tecnologias de Alto Desempenho LDL Low Density Lipoprotein

MCP-1 proteína quimioatraente de monócitos-1 M-CSF fator estimulador de colônias de macrófagos MIP-1α proteína inflamatória do macrófago-1 alfa NK natural killer cell

NOD2 nucleotide oligomerization domain 2 PCR proteína C reativa

PPARγ peroxisome proliferator-activated receptor gamma STAT1 signal transducer and activator of transcription 1 STAT3 signal transducer and activator of transcription 3 STAT4 signal transducer and activator of transcription 4 sTNF fator de necrose tumoral solúvel

Th 1 type 1 helper T cells TLR1 toll-like receptor 1

tmTNF fator de necrose tumoral transmembrana TNF-α fator de necrose tumoral alfa

TNFR1 receptor 1 do fator de necrose tumoral TNFR2 receptor 2 do fator de necrose tumoral TReg célula T reguladora

VAT tecido adiposo visceral

VLDL Very Low Density Lipoprotein VPN valor preditivo negativo VPP valor preditivo positivo

1- INTRODUÇÃO ... ..14 2- OBJETIVOS... ...28 2.1 Geral...28 2.2 Específicos ... ..28 3- MATERIAL E MÉTODOS ... ..29 3.1 Sujeitos do Estudo ... ..29

3.2 Classificação e avaliação da atividade da doença de Crohn ... ..29

3.3 Avaliação da composição corporal ... 30

3.4 Avaliação de marcadores inflamatórios ... 30

3.5 Análise dos dados ... 30

4- RESULTADOS ... 31

4.1 Características clínicas dos pacientes ... 31

4.2 Composição Corporal dos participantes do estudo ... 32

4.3 Exames laboratoriais... 33

5- DISCUSSÃO ... 36

6- CONCLUSÃO ... 39

7- REFERÊNCIAS ... 41

8- APÊNDICES ... 49

8.1 Termo de Consentimento Livre e Esclarecido para Adultos ... 49

8.2 Ficha de coleta dos dados ... 52

8.3 Artigo submetido à revista Inflammatory Bowel Disease ... 54

9- ANEXOS ... 74

9.1 Carta de Aprovação do Comitê de Ética da Faculdade de Ciências Médicas da Unicamp ... 74

1- INTRODUÇÃO

A doença de Crohn (DC) é uma doença inflamatória intestinal crônica (DII), de natureza recidivante e transmural, que afeta de forma segmentar qualquer área do trato gastrointestinal, principalmente o íleo e o cólon (1-3). As manifestações clínicas gastrointestinais e extra intestinais associadas à doença são: diarreia, cólicas abdominais, febre, anemia, perda de peso, osteoporose, artropatias, pioderma gangrenoso e eritema nodoso. Em pelo menos 25% dos pacientes ocorrem manifestações extra intestinais (4). A formação de estenoses, fístulas e abscessos são complicações comuns da doença, as quais podem necessitar de intervenções cirúrgicas (3). A natureza prolongada da DC gera um grande impacto sobre a qualidade de vida dos pacientes, marcada por uma sobrecarga de terapias, hospitalizações e cirurgias (3, 5).

A prevalência da DC aumentou rapidamente na Europa e na América do Norte na segunda metade do século XX e está se tornando comum no resto do mundo, principalmente em países que adotam um estilo de vida ocidental (6). A incidência anual da DC varia entre 0-20,2 por 100.000 habitantes na América do Norte e 0,3-12,7 por 100.000 habitantes na Europa (5). Países em desenvolvimento estão apresentando um aumento na incidência da doença, à medida que se tornam industrializados. Entretanto, nesses países os dados epidemiológicos de base populacional são escassos (7). Um estudo realizado no estado de São Paulo encontrou no período entre 2001 e 2005, uma taxa de incidência de 3,5 por 100.000 habitantes e prevalência de 5,65 por 100.000 habitantes (8). A maioria dos estudos epidemiológicos apontam para um pico de incidência na segunda a quarta década de vida, sendo que parte destes estudos sugerem uma taxa de incidência bimodal, com um modesto segundo pico na sexta e sétima décadas de vida (7).

A etiologia da DC não é totalmente conhecida, sabe-se que o seu aparecimento é influenciado por fatores relacionados à predisposição genética, disbiose da microbiota intestinal e influências ambientais. Os fatores genéticos levam a alterações imunológicas, que agem em sinergia com o ambiente externo e com a composição da microbiota intestinal, o que dificulta o entendimento da patogênese desta doença (5, 7; Figura 1.1). Sabe-se que os hábitos de vida têm grande importância na etiologia da doença. Alimentação, uso de antibióticos, ausência de aleitamento materno causam alterações na microbiota intestinal, contribuindo com o aparecimento da doença. Outros fatores ambientais parecem estar relacionados com a doença, como tabagismo, apendicectomia, uso de contraceptivos e exposição a infecções. Estudos estão

mostrando que modificações viáveis no ambiente externo podem contribuir com o tratamento da DC, ajudando a manter a remissão da doença por longos períodos (5).

A natureza genética da DC foi inicialmente reconhecida em 2001, com a descoberta do primeiro gene associado a esta doença (9). Posteriormente, um estudo internacional de mapeamento genético identificou 163 loci de risco para DC (10). Os efeitos genéticos sobre o sistema imunitário são variados, podem ocorrer alterações na resposta imune inata, adaptativa e na integridade da barreira epitelial (5). Variantes genéticas do domínio de ligação da oligomerização de nucleotídeo 2 (NOD2), por exemplo, podem interferir na resposta de monócitos a compostos bacterianos (9). Já foram identificados loci de susceptibilidade à DC com genes que codificam citocinas e proteínas envolvidas na sinalização de receptores de citocinas e quimiocinas, por exemplo: interleucina-2 (IL-2), IL-21, IL-10, IL-27, interferon-y (IFNγ), transdutor de sinal e ativador de transcrição 1 (STAT1), STAT3, STAT4, receptor 6 de quimiocina CC (CCR6), ligante 2 de quimiocina CC (CCL2), CCL13, receptor de interleucina12 (IL-12R), IL-23R e Janus quinase 2 (JAK2). Estas alterações imunológicas promovem um desequilíbrio nas quantidades e proporções de fatores anti-inflamatórios, pró-inflamatórios e imunomoduladores, contribuindo, então, com o aparecimento da doença (3).

Figura 1.1 Estrutura conceitual para a patogênese da DII.

Fatores genéticos e ambientais induzem a alterações na barreira intestinal. A função de barreira alterada subsequentemente induz a translocação de bactérias comensais e de produtos microbianos do lúmen intestinal para a parede intestinal, o que leva à ativação das células imunitárias e à produção de citocinas. Se a inflamação aguda na mucosa não puder ser resolvida por mecanismos anti-inflamatórios e pela supressão de respostas imunológicas pró-inflamatórias, desenvolve-se uma inflamação intestinal crônica. Por sua vez, a inflamação crônica pode causar complicações da doença e destruição de tecidos. DII, doença inflamatória intestinal; AINEs, fármacos anti-inflamatórios não esteroides; TReg, célula T regulatória (3).

Evidências sugerem que a DC é conduzida pelo avanço de lesões imunológicas no trato gastrointestinal, caracterizadas por um infiltrado de células inflamatórias, incluindo linfócitos T, macrófagos e neutrófilos (11-13). As quimiocinas têm a capacidade de atrair células inflamatórias para as lesões intestinais, desta forma estas proteínas e seus receptores orquestram a chegada e a retenção de células imunes no local da inflamação (13). Células inflamatórias presentes em lesões intestinais, fibroblastos, células endoteliais e epiteliais são capazes de produzir quimiocinas (12). A CCL2 tem sua expressão aumentada na mucosa inflamada (14-16) e está elevada no soro de pacientes com DC em atividade (13, 17). Esta quimiocina atrai monócitos periféricos, que são fontes de macrófagos na mucosa intestinal inflamada (18). O subtipo de monócitos clássicos CD14+CD16− apresenta uma alta capacidade de migrar para o intestino, devido a sua alta expressão de receptores de quimiocina CC-2 (CCR2) (19). Por outro lado, os monócitos não clássicos CD14+ CD16+ apresentam baixa expressão de CCR2 (20) e estão aumentados no sangue periférico de pacientes com DC em atividade, podendo ser utilizado como um marcador sérico de inflamação intestinal (21, 22). Os papéis biológicos destes monócitos continuam a ser esclarecidos, principalmente em relação a sua capacidade de migrar para os tecidos e sua função no sangue (20). A figura 1.2 mostra um modelo de migração transendotelial de monócitos proposto por Koch et al. (20).

A infiltração da mucosa intestinal por neutrófilos está bem documentada na DC ativa, sendo que a migração destas células para o local inflamado envolve uma resposta ao gradiente positivo de substâncias quimiotáticas. A IL-8 é uma quimiocina produzida principalmente por monócitos e macrófagos, e é altamente seletiva para neutrófilos (23). Um aumento da expressão de IL-8 foi verificado em biópsias intestinais inflamadas de pacientes com DC (24, 25) e sua expressão foi correlacionada positivamente com a infiltração de neutrófilos (25). O acúmulo de neutrófilos dentro das criptas epiteliais e no lúmen intestinal se correlaciona diretamente com a atividade da doença clínica e lesão epitelial (26). Os neutrófilos são fagócitos que montam a resposta inflamatória aguda atuando como primeira linha de defesa contra patógenos invasores. O papel destas células na DC ainda é obscuro, sua função prejudicada pode resultar em depuração bacteriana limitada, levando a uma cronicidade da resposta inflamatória (27).

Defeitos funcionais em células imunológicas, como monócitos e neutrófilos, foram relatados na DC, e fez levantar a questão de se considerar a DC como uma imunodeficiência (28). Existe um modelo, proposto por Casanova e Abel (29), de que a inflamação intestinal crônica é causada por erros inatos de macrófagos (Figura 1.3). Esta proposta considera que

defeitos inatos em macrófagos ocasionam uma atração prejudicada de granulócitos para a mucosa intestinal, comprometendo a depuração de bactérias, o que gera a inflamação crônica, com formações de granulomas (29). Estes erros inatos, também, podem afetar outras funções não inflamatórias dos macrófagos, como suas ações no reparo e remodelamento da mucosa intestinal, agravando ainda mais as lesões intestinais (30).

Figura 1.2 Modelo proposto de enriquecimento de monócitos CD16 + durante a inflamação intestinal. (A) CD14+ CD16– atravessam a mucosa em resposta a estímulos inflamatórios. (B) Na lâmina própria, os monócitos inflamatórios sofrem uma mudança de fenótipo para expressar CD16+. (C) Alguns monócitos CD16 + voltam para a corrente sanguínea. (D) Os monócitos CD16– e CD16+ perpetuam a inflamação intestinal através da secreção de citocinas inflamatórias. (E) A eficácia dos glicocorticóides pode ser transmitida em parte pela sua capacidade de esgotar células CD16 + na corrente sanguínea e na lâmina própria. (F) Em contraste, a aférese de leucócitos apenas remove células imunes do sangue periférico, reduzindo assim o reservatório de leucócitos infiltrantes (20).

Figura 1.3 Um modelo de inflamação intestinal crônica causada por erros inatos de macrófagos em pacientes com DC. Os macrófagos dos pacientes são intrinsecamente defeituosos, com insuficiência de secreção de citocinas, que normalmente são traduzidas, mas internamente degradadas. Devido à produção insuficiente de citocinas e quimiocinas, há uma atração prejudicada de granulócitos. A inflamação aguda e granulocítica prejudicada resulta em comprometimento da depuração de bactérias e detritos da parede intestinal, resultando em inflamação crônica e granulomatosa (29).

Na DC, o manejo terapêutico tem como objetivo induzir e manter uma remissão duradoura e evitar a progressão da doença, prevenindo o aparecimento de complicações (31). Com base na importância das citocinas na patogênese da DC, foram testadas as ações de citocinas anti-inflamatórias recombinantes e anticorpos específicos para citocinas pró-inflamatórias no controle da doença. O uso de um anticorpo neutralizante específico para TNF-α (anti-TNF-TNF-α) resultou em cicatrização da mucosa inflamada e melhorias clínicas. Vários anticorpos quiméricos, humanizados ou totalmente humanos, tais como adalimumab, certolizumab, golimumab e infliximab, estão sendo utilizados no tratamento da doença (2, 3). Entretanto, o mecanismo exato destes novos agentes no controle da doença não é totalmente compreendido (32).

Os efeitos do anti-TNF-α vão além da simples neutralização do TNF-α. Existem duas formas principais de TNF-α; a forma solúvel (sTNF) e a forma transmembrana (tmTNF). Tanto o infliximab (IFX) quanto o adalimumab (ADA) podem se ligar a estas duas formas. Estas ligações desencadeiam um bloqueio na estimulação do receptor 1 e 2 do fator de necrose tumoral (TNFR1 e TNFR2), o que resulta na inibição de vias pro-inflamatórias, reduzindo a liberação de citocinas e infiltração de células inflamatórias. Além disso, a ligação no tmTNF pode desencadear uma citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC) ou dependente do complemento (CDC). O anticorpo anti-TNF-α liga-se ao tmTNF na célula alvo e ao mesmo tempo se liga às células natural killer (NK) ou ao sistema do complemento, ocasionando a destruição da célula alvo (32, 33; Figura 1.4). A cicatrização da mucosa também foi associada às outras ações alternativas dos anti-TNFs, que foram sugeridas nos últimos anos, tais como: a indução da apoptose das células T na lâmina própria e a indução de macrófagos do tipo 2, que estão associados à cicatrização (32; Figura 1.5).

Outros medicamentos utilizados no controle da DC são os derivados de tiopurinas, como a azatioprina (AZA) e a 6-mercaptopurina, conhecidos como antimetabolitos purínicos, que inibem a replicação de DNA e RNA, impedindo a proliferação celular, principalmente de células T. Além disso, eles inibem genes que codificam proteínas relacionadas com a inflamação intestinal e com o tráfico de leucócitos, tais como: ligante indutor de apoptose relacionado ao TNF, membro 7 da superfamília do receptor TNF e integrina-alfa-4 (34). Estes fármacos são menos eficazes do que as drogas anti-TNF-alfa para a indução de remissão isenta de esteroides. Por outro lado, a indução de remissão pela terapia combinada com AZA e IFX é superior ao IFX sozinho (34).

Estudos com aférese adsortiva de granulócitos e monócitos (GMA), uma terapia extracorpórea que reduz seletivamente granulócitos e monócitos, têm apresentado resultados promissores no controle da DC (21), e demonstraram ter poucos efeitos adversos (35, 36). A terapia combinada com GMA intensiva e tiopurinas foi eficaz e bem tolerada na indução e manutenção de remissão clínica em pacientes com DC (37). Diferente dos medicamentos que podem induzir a apoptose de células inflamatórias na lâmina própria, na aférese, estas células são esgotadas apenas do sangue periférico (Figura 1.2). Isto pode reduzir o grupo de monócitos que reabastece o infiltrado de células inflamatórias na mucosa intestinal e, assim, melhorar a inflamação crônica (20).

Figura 1.4 Citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC) e dependente do complemento (CDC). Infliximabe e adalimumabe possuem uma porção Fc, cujos domínios CH1 e CH2 ativam os componentes C1 e C3 do sistema complemento, respectivamente, ocorrendo a formação de um complexo de ataque de membrana (C5b-C9) e lise das células alvo. Infliximabe, adalimumabe e etanercept expressam domínios CH2 e CH3 que se ligam aos receptores para Fc de IgG de células NK, que culminam na libertação de granzima B e perforina, que lisam as células alvo (33).

Figura 1.5 Dois dos principais mecanismos alternativos de ação do TNF. (A) Existe um sinal anti-apoptótico por mTNF expresso em monócitos para o TNFRII expresso em células T CD4 +. Este mecanismo é inibido por anti-TNFs, resultando em apoptose de células CD4 +. (B) Anti-TNFs se ligam ao mTNF em células T ativadas; A parte Fc do anticorpo é reconhecida pelos receptores Fc expressos pelos monócitos, desencadeando a sua diferenciação para o tipo M2, um subtipo de macrófagos que promove cicatrização. Este mecanismo depende da presença da região Fc do anticorpo, que está ausente no caso do certolizumab (32).

O acompanhamento dos efeitos das terapias empregadas na DC, assim como o diagnóstico da doença, requer uma combinação de exames clínicos, testes laboratoriais, exames de imagem e endoscopia com histologia. A ressonância magnética (RM) pode ser utilizada no diagnóstico e no acompanhamento de pacientes com DC. A enterografia por RM é capaz de identificar pacientes com doença ativa e com complicações, por meio de diferentes imagens identificadas antes e após a injeção de contraste. No entanto, a medida da intensidade da inflamação intestinal possui limitações relacionadas a uma variabilidade interobservador significativa (38). A ileocolonoscopia é considerada padrão-ouro para o diagnóstico e avaliação da atividade inflamatória (39), este exame possibilita a análise da mucosa intestinal, porém é extremamente invasivo e incomodo para os pacientes. A RM e a ileocolonoscopia são exames dispendiosos, não sendo apropriados para uma avaliação periódica da atividade da doença (38, 40, 41).

O Índice de Atividade da Doença de Crohn (IADC) e sua versão simplificada, o Índice Harvey-Bradshaw, são amplamente utilizados para avaliar a atividade clínica da doença. No IADC são analisados sintomas subjetivos, sinais objetivos e dosagem de hematócrito. No entanto, a correlação entre estes índices clínicos e a gravidade da doença endoscópica é fraca. A medida da atividade clínica é importante no acompanhamento do paciente, mas não é suficiente para medir a inflamação na mucosa intestinal (39). Recentemente, há uma preocupação em avaliar não só os sintomas clínicos da doença, mas também a saúde da mucosa intestinal, pois um grau de inflamação subclínica pode persistir silenciosamente na mucosa, contribuindo para um risco de recidiva "sintomática" (31). A manutenção de uma mucosa saudável gera benefícios em relação à durabilidade da remissão e à prevenção de lesões intestinais. A avaliação não invasiva utilizando marcadores bioquímicos capazes de revelar a presença ou ausência de inflamação subclínica, pode representar um avanço importante no monitoramento rotineiro da doença (31, 42).

Muitos marcadores inflamatórios séricos têm sido estudados como indicadores de atividade inflamatória na DC, por exemplo: proteína C reativa (PCR), taxa de sedimentação de eritrócitos e contagem de leucócitos e plaquetas (39). Além disso, proteínas fecais, como a calprotectina fecal (CF) e a lactoferrina fecal (LF), têm sido estudadas como promissores biomarcadores inflamatórios não-invasivos (41, 43). Os resultados dos estudos que exploram estes marcadores são bem diversificados, além disso poucos avaliam marcadores de remissão da doença e uma minoria inclui a endoscopia na avaliação dos pacientes sintomáticos. Existe também, uma dificuldade na interpretação dos resultados destes estudos, devido à falta de uma

análise da sensibilidade, especificidade, valor preditivo positivo e/ou negativo (VPP e/ou VPN) dos marcadores (41, 44).

A PCR é uma proteína de fase aguda produzida por hepatócitos, que pode estar elevada por várias razões, como infecções, inflamação intestinal e extra intestinal. Apesar desta proteína não ser um marcador específico de inflamação intestinal, ela tem sido bastante utilizada na prática clínica associada a outros biomarcadores (42). A PCR já foi correlacionada com a atividade clínica da DC (45, 46), mas nem sempre pacientes com a doença ativa apresentam níveis elevados deste marcador (42). Estudos mostram que uma concentração sérica de PCR ≥ 5 mg/L tem uma especificidade relativamente alta (92%) e uma sensibilidade fraca (49%) na detecção da atividade da doença endoscópica. Desta forma, um teste negativo não exclui de forma confiável a presença de uma inflamação ativa. É fundamental lembrar que aproximadamente 25% dos pacientes em atividade não conseguem produzir PCR, devido a polimorfismos no gene desta proteína (42).

A CF e a LF são proteínas inflamatórias encontradas no citosol de neutrófilos, que quando presentes nas fezes, indicam que houve migração de neutrófilos para o intestino durante um processo inflamatório (42). Diferente dos marcadores séricos que podem estar aumentados em várias condições inflamatórias extra intestinal, os marcadores fecais apresentam maior especificidade na detecção da inflamação no intestino (47). A CF e a LF, quando comparadas à PCR, apresentaram melhores resultados na avaliação da atividade inflamatória de pacientes com DC, com maior sensibilidade (88% e 82%, respectivamente). A precisão na análise de atividade da doença da CF e da LF são bastante semelhantes, porém a menor estabilidade da LF à temperatura ambiente limita o seu uso na prática clínica (44).

Um marcador ideal deve revelar inflamação em um estágio pré-sintomático e, ao mesmo tempo, deve ser fácil e rápido de se realizar, barato, minimamente invasivo e reprodutível. Porém, dos marcadores sorológicos e fecais estudados, nenhum deles demonstrou um alto poder preditivo quando usado sozinho. Desta forma, os dados obtidos a partir da endoscopia e da histologia são de grande valor, mas sua utilização como preditores de recaída clínica está fortemente limitada pela invasividade (31).

O estado nutricional dos pacientes com DC já foi muito associado ao baixo peso corporal, porém estudos recentes documentaram uma prevalência crescente de obesidade nestes pacientes. Considerando que a obesidade é um estado pró-inflamatório, existe a preocupação em se investigar o impacto do aumento da gordura corporal no prognóstico da DC (48, 49). O curso da doença demonstrou ser mais grave em pacientes obesos em comparação com pacientes

eutróficos (50, 51). Além disso, uma proporção elevada de gordura visceral é um marcador de doença agressiva (52).

O tecido adiposo é um órgão produtor de adipocinas, que podem contribuir para a atividade de doenças imunomediada. Pacientes com DC têm uma hipertrofia do tecido adiposo visceral (VAT) que envolve a área intestinal inflamada (“creeping fat”; Figura 1.6) e infiltrações intramurais de lipídios na parede intestinal podem ser visualizadas em tomografia computadorizada (53). Alterações na produção de citocinas e quimiocinas ocorrem na “creeping fat”, o que pode influenciar o sistema imunológico do trato gastrointestinal e em alguns casos agravando a doença (54; Figura 1.7).

As adipocinas podem ter efeitos pró ou anti-inflamatórios. A adiponectina tem efeitos anti-inflamatórios (55, 56) e está correlacionada inversamente com a concentração sérica de PCR (57). O VAT de pacientes com DC apresenta um aumento na produção de adiponectina (58, 59), entretanto, as concentrações plasmáticas desta proteína têm sido divergentes entre os estudos. Enquanto Valentini et al. (60) relataram redução na concentração sérica de adiponectina em pacientes com DC, comparado a controles saudáveis, Karmiris et al. (61) identificaram um aumento.

Secretada em quantidades proporcionais à massa de gordura corporal, a leptina é uma adipocina com efeitos pró-saciedade. Esta proteína possui um papel pró-inflamatório, pois induz a ativação de linfócitos, a produção de citocinas e a expressão de moléculas de adesão (56). Na DC há um aumento da secreção de leptina na gordura mesentérica hipertrófica (51). Por outro lado, os níveis séricos de leptina apresentaram-se mais baixos em pacientes com DC em comparação com controles saudáveis (55, 61, 62).

A resistina é outra adipocina com efeitos pró-inflamatórios, podendo estimular a síntese e secreção de TNF-α, IL-12 e moléculas de adesão (63). O tecido adiposo não é uma fonte exclusiva desta citocina, células sanguíneas mononucleares e macrófagos também a produzem (55), com um aumento desta produção na presença de lipopolissacarídeos, TNF-α, IL-1 e IL-6 (64). A expressão de resistina no tecido adiposo mesentérico e os seus níveis sanguíneos estão aumentados em pacientes com DC (59, 60).

O papel das adipocinas na fisiopatologia da DC ainda não foi esclarecido. Acredita-se que Acredita-seus níveis séricos podem Acredita-ser utilizados como marcadores inflamatórios e que a inibição de adipocinas pró-inflamatórias pode expandir o espectro de intervenções terapêuticas para esta doença (55).

Figura 1.6 Características da gordura mesentérica na doença de Crohn.

(A) intestino grosso não afetado e intestino desgado afetado visto durante a laparotomia de um paciente que sofre de doença de Crohn. (B) e (C) intestino delgado ressecado afetado pela doença de Crohn com inflamação transmural e “creeping fat”. A linha de fixação do tecido adiposo na superfície intestinal não é nítida e parece desfocada (a). A superfície do intestino parece granular em comparação com o intestino normal (b). O tecido adiposo se estende sobre a camada serosa do intestino (“creeping fat”) (54).

Figura 1.7 Conceito hipotético de quatro passos da patogênese da gordura mesentérica na doença de Crohn. (A) O processo primário de inflamação intestinal leva a uma liberação sustentada de citocinas, que aumentam a expressão dos receptores ativados por proliferadores de peroxissoma gama (PPAR-γ) no tecido adiposo visceral (VAT). (B) O aumento da expressão de PPAR-γ interfere diretamente na hiperplasia do tecido adiposo e aumenta a expressão de TNF-α. (C) A PPAR- γ exerce efeitos profundos na expressão de adipocinas, com elevação da expressão de adiponectina e redução de leptina. As quimiocinas, como a proteína quimioatraente de monócitos-1 (MCP-1) e a proteína inflamatória do macrófago-1alfa (MIP-1α) são secretadas em quantidades mais elevadas e direcionam a diapedese de monócitos sanguíneos para o tecido adiposo. Sob este microambiente, os macrófagos podem desenvolver tanto a partir de monócitos de sangue transmigrados, quanto de pré-adipócitos ativados. O aumento da infiltração de macrófagos no tecido adiposo visceral conduz a uma transformação inflamatória do tecido adiposo visceral. O aumento da produção de fator estimulador de colônias de macrófagos (M-CSF) a partir de macrófagos potencializa o crescimento do tecido adiposo, levando ao aparecimento de “creeping fat”. (D) Uma "tempestade" de adipocinas e mediadores de macrófagos secretados na “creeping fat" perpetuam o processo inflamatório intestinal, levando a ulcerações mucosas ao longo da borda mesentérica, característica típica da doença de Crohn. Os linfonodos mesentéricos ativados interagem ainda mais com os adipócitos mesentéricos (54).

2-

OBJETIVOS

2.1 Geral

O objetivo do estudo foi analisar a atividade inflamatória de pacientes com doença de Crohn utilizando marcadores séricos.

2.2 Específicos

Classificar os pacientes de acordo com o Índice de Atividade da Doença de Crohn (IADC);

Avaliar a composição corporal dos participantes;

Dosar no soro dos participantes os seguintes marcadores séricos:  Citocina: TNF-α;

 Adipocinas: leptina, adiponectina e resistina;  Quimiocinas: IL-8 e CCL2;

 Leucócitos: contagens de neutrófilos, linfócitos e monócitos;  Plaquetas.

Comparar os dados de composição corporal e de marcadores séricos de pacientes com doença de Crohn com indivíduos saudáveis.

3- MATERIAL E MÉTODOS

Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Faculdade de Ciências Médicas da Unicamp (número de referência 32192614.0.0000.5404), conforme recomendações para pesquisas biomédicas envolvendo seres humanos propostas pela Resolução nº 196 de 10 de outubro de 1996 do Conselho Nacional de Saúde (Anexo).

3.1 Sujeitos do estudo

Pacientes com diagnóstico de doença de Crohn (DC) e indivíduos saudáveis, controles saudáveis (HC), foram recrutados de fevereiro a dezembro de 2015 no Ambulatório de Doença Inflamatórias Intestinais (DII), do Gastrocentro, e no Centro de Investigação em Pediatria (CIPED), da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP). O grupo de HC foi composto por funcionários e alunos do CIPED, e acompanhantes de pacientes atendidos no ambulatório de DII.

Foram incluídos no estudo pacientes com DC em acompanhamento médico no ambulatório DII e indivíduos saudáveis, sem qualquer doença aguda ou crônica.

Os critérios de exclusão para o grupo de pacientes com DC foram: presença de outras doenças, uso de corticoides e gestação. Os critérios de exclusão para o grupo HC foram: uso de medicamentos e gestação.

3.2 Classificação e avaliação da atividade da doença de Crohn

Para a avaliação da atividade da doença, foi utilizado o Índice de Atividade da Doença de Crohn (IADC) (65). Os pacientes foram separados em dois grupos: o primeiro incluiu pacientes com IADC < 150, nomeado de RDC (doença de Crohn em remissão); o segundo incluiu pacientes com IADC ≥ 150, nomeado de ADC (doença de Crohn em atividade). As características e comportamento da DC foram avaliadas de acordo com a classificação de Montreal (66), que considera a idade de início da doença (A), localização da doença (L) e comportamento da doença (B).

3.3 Avaliação da composição corporal

O estado nutricional foi avaliado por meio de medidas de peso corporal, altura e circunferência da cintura (CC). O índice de massa corporal (IMC) foi calculado a partir do peso e da altura (quilogramas por metro quadrado). A absorciometria de raios-x de dupla energia (DEXA) foi realizada para fornecer dados sobre a porcentagem de gordura corporal e a quantidade de gordura visceral.

3.4 Avaliação de marcadores inflamatórios

As amostras de sangue foram coletadas no período da manhã, após um jejum de 12 horas. Parte do sangue foi enviado para a Divisão de Patologia Clínica, do Hospital de Clínicas da UNICAMP, para as dosagens e contagens de: proteína C reativa (PCR), glicose, triglicerídeos, colesterol total, LDL (Low Density Lipoprotein), HDL (High Density Lipoprotein), VLDL (Very Low Density Lipoprotein), leucócitos, neutrófilos, linfócitos, monócitos e plaquetas. Outra parte do sangue foi enviada para o Laboratório de Imunologia do CIPED, na UNICAMP. O sangue foi centrifugado por 10 minutos a 1000g. O soro foi separado e congelado a -80 °C.

Após a coleta de todas as amostras de sangue, os soros de todos os participantes foram encaminhados para o Laboratório Central de Tecnologias de Alto Desempenho (LaCTAD), na UNICAMP. Os níveis de TNF-α, IL-8, CCL2, leptina, adiponectina e resistina foram dosados nos soros utilizando os kits MILLIPLEX MAP Adipokine Human Bead Panel 1 e 2, da Millipore. Estes kits utilizam a tecnologia Luminex xMAP®, que permite a análise de múltiplas proteínas simultaneamente em uma pequena quantidade de amostra. As amostras foram analisadas pelo sistema de Imunoensaio Multiplex da marca Bio-Rad, modelo Bio-plex 200. Todos os testes foram realizados de acordo com as instruções fornecidas pelos fabricantes.

3.5 Análise dos dados

As análises estatísticas foram realizadas usando o pacote de software SPSS 16.0. As variáveis quantitativas foram apresentadas como médias e desvios-padrão. As variáveis qualitativas foram apresentadas como frequências. A comparação dos dados categóricos entre os grupos foi realizada utilizando o método χ² ou o teste exato de Fisher. As comparações entre dois grupos (DC e HC) foram realizadas utilizando o teste T de Student ou Mann Whitney. As comparações entre três grupos (RDC, ADC e HC) foram realizadas por meio do teste de

ANOVA ou Wilcoxon. As análises de comparações múltiplas, post hoc, foram realizadas pelo teste de Bonferroni. A transformação log foi utilizada em algumas variáveis. Foi estabelecido um nível de significância de 5%.

4- RESULTADOS

4.1 Características clínicas dos pacientes

A Tabela 4.1 mostra as características clínicas dos pacientes em remissão (RDC) e em atividade (ADC). A maioria dos pacientes (n=25) estava em remissão clínica da doença. 60% dos pacientes do grupo RDC tinham exames de colonoscopia ou ressonância magnética, sendo que a maioria não apresentou atividade inflamatória, apenas um paciente apresentou atividade inflamatória endoscópica leve. Os medicamentos mais utilizados foram o anti-TNF-α e a AZA. O anti-TNF-anti-TNF-α mais utilizado foi o infliximabe, apenas dois pacientes aplicavam o adalimumabe.

A média da duração da doença foi menor no grupo ADC do que no grupo RDC (p = 0,032). Além disso, a maioria desses pacientes ativos não passou por cirurgias prévias, ao contrário dos pacientes em remissão (p = 0,013). Três pacientes não estavam no momento da avaliação sob tratamento medicamentoso, dois deles estavam com a doença ativa e não tinham sido submetidos a cirurgias prévias.

Tabela 4.1 Características clínicas dos pacientes com doença de Crohn

RDC1 _{(n=25) ADC}2 _{(n=6) p*}

Duração em anos da doença (média ± DP) 13,9 ± 6 7,7 ± 6,3 0,032 Evacuações por dia (média ± DP) 2,6 ± 1,8 3,5 ± 3,3 0,364 Tratamentos

Cirurgia intestinal (sim / não) 19/6 1/5 0,013 Número de cirurgias (média ± DP) 1,2 ± 1 0,5 ± 1.2 0,150

Anti-TNF 7 3 Anti-TNF + Azatioprina 9 1 Azatioprina 6 0 Sem imunossupressor 2 0 Sem medicação 1 2 Classificação de Montreal3

Idade ao diagnóstico (A1/A2/A3) 5/16/4 1/4/1 Localização (L1/L2/L3/L4) 5/11/9/0 1/3/2/0 Comportamento

B1/B2/B3/P 5/7/2/3 1/1/0/3

B1+P/ B2+P/B3+P 4/1/3 0/0/1

*p:Teste T de Student; 1_{RDC: doença de Crohn em remissão;} 2_{ADC: doença de Crohn em atividade} 3_{Classificação de Montreal: (A1) 16 anos ou menos / (A2) 17 a 40 anos / (A3) mais de 40 anos}

(L1) íleo / (L2) cólon / (L3) ileocolônica / (L4) trato gastrointestinal superior

(B1) não estenosante e não penetrante / (B2) estenosante / (B3) penetrante / (P) perianal

4.2 Composição corporal dos participantes do estudo

Enquanto o IMC e o percentual de gordura corporal foram semelhantes entre os grupos DC e HC, a circunferência da cintura e a gordura visceral foram significativamente maiores no grupo DC (Tabela 4.2). A classificação do estado nutricional, de acordo com o IMC, mostrou que o sobrepeso estava presente em 22,5% dos pacientes com DC e 27,5% dos indivíduos saudáveis. A obesidade grau I atingiu 22,5% dos pacientes com DC e 7% dos indivíduos saudáveis. Em ambos os grupos apenas um indivíduo apresentou desnutrição leve.

Tabela 4.2 Características demográficas e nutricionais dos participantes do estudo

DC1 _{(n=31) HC}2 _{(n=29) p}

Masculino (n) 15 11 0,446

Idade (anos) 40,5 ± 11,4 35,3 ± 9,9 0,059

Hábito de fumar (ativo/ex fumantes/nunca) 0/8/23 0/3/26 0,112 Atividade física (sedentária/ativo) 20/11 15/14 0,159 Composição corporal

IMC3 _{(Kg/m²) 25,2 ± 4,9 23.9 ± 3,3 0,222}

CC4 _{(cm) 82,4 ± 11,7 76 ± 9,5 0,025}

Gordura visceral (g) 870,3 ± 765,1 498.3 ± 446,2 0,027 Porcentagem de gordura corporal 33,7 ± 10,9 32.6 ±7,8 0,659

*p:Teste T de Student; 1_{DC: doença de Crohn;} 2_{HC: controle saudável;} 3_{IMC: índice de massa corporal;} 4_{CC: circunferência da cintura}

4.3 Exames laboratoriais

A Tabela 4.3 mostra os dados dos marcadores inflamatórios nos grupos RDC, ADC, HC. Os leucócitos estavam aumentados nos grupos RDC e ADC quando comparados ao grupo HC (p=0,045 e p=0,012, respectivamente), sendo que os neutrófilos estavam aumentados no grupo RDC quando comparado ao grupo HC (p = 0,034) e os monócitos estavam aumentados no grupo ADC quando comparado aos grupos RDC (p=0,033) e HC (p=0,004). As plaquetas estavam mais elevadas no grupo RDC quando comparado ao grupo HC (p=0,028).

Quando a quimiocina IL-8 e a citocina TNF-α foram dosadas no soro, muitos pacientes tinham valores abaixo do limite de detecção do ensaio. Considerando apenas os participantes que tiveram estas proteínas detectadas, não houve diferenças entre os grupos. Por outro lado, a quimiocina CCL2 foi detectada em todos os participantes e apresentou-se muito baixa no grupo RDC quando comparado aos grupos ADC (p=0,049) e HC (p <0,001). A PCR foi maior nos grupos RDC e ADC quando comparados ao grupo HC (p<0,001 e p<0,001, respectivamente). A Figura 4.1 mostra a distribuição dos leucócitos, PCR e CCL2 nos grupos RDC, ADC e HC.

As adipocinas não foram diferentes entre os três grupos, mas ao analisar o grupo de pacientes (DC) versus o grupo HC, algumas diferenças foram encontradas. Os níveis médios de adiponectina no soro foram de 65,4 ± 110,2 μg/mL no grupo DC (n = 31) e 22,4 ± 22,7 μg/mL no grupo HC (n=29), sendo significativamente maiores no grupo DC (Student Test, p=0,046). O mesmo ocorreu com a resistina, que foi significativamente mais elevada no grupo DC (Teste de Mann-Whitney, p = 0,046), sendo que os níveis médios de resistina encontrados foram 60,4 ± 30,8 ng/mL no grupo DC e 46,8 ± 24,1 ng/mL no grupo HC. A Figura 4.2 mostra a distribuição das adipocinas nos grupos DC e HC.

Tabela 4.3 Exames laboratoriais RDC (n=25) ADC (n=6) HC (n=29) p Hemoglobina (g/dL) (n=22) 14,2 ± 1,8 (n=6) 13,7 ± 1,2 (n=26) 14 ± 1,2 0,784 Hematócrito (%) 42,7 ± 4,6 42,2 ± 3,1 41,4 ± 3,3 0,487 Plaquetas (x10³/mm³) 279,3 ± 72,61 _{282,0 ± 58,9 233 ± 44,6 0,015*} Leucócito (x10³/mm³) 6,334 ± 1,5061 _{7,21 ± 1,127}2 _{5,41 ± 1,278 0,005*} Linfócitos (x10³/ mm³) 1,877 ± 0.629 2,518 ± 0,619 1,928 ± 0,531 0,058 Neutrófilos (x10³/mm³) 3,954 ± 1,3181 _{3,96 ± 1,029 3,513 ± 1,137 0,027*} Monócitos (x10³/mm³) 0,504 ± 0,223 0,738 ± 0,2342,3 _{0,443 ± 0,134 0,005*} (n=21) (n=6) (n=28) Colesterol total (ml/dL) 157,8 ± 39,5 192,3 ± 39,92 _{188 ± 32,6 0,012*} HDL (mg/dL) 48,6 ± 10,6 60,8 ± 19,2 56,5 ± 14,9 0,093 LDL (mg/dL) 98,3 ± 43 109 ± 44 112 ± 29,4 0,430 VLDL (mg/dL) 19,3 ± 8,7 23,8 ± 7,2 18,7 ± 10,5 0,326 Triglicerídeos (mg/dL) 93,8 ± 43 114,3 ± 33,8 94,9 ± 52,9 0,424 Glucose (mg/dL) 82,9 ± 9,2 75,8 ± 13,2 76,6 ± 9,7 0,066 (n=25) (n=6) (n=29) CCL2 (pg/dL) 180,78 ± 81,661,3 _{305,99 ± 136,72 370,52 ± 156,93 <0,001*} (n=6) (n=2) (n=21) TNF-α (pg/mL) 3,9 ± 2,4 3 ± 2,1 3,1 ± 2 0,767 (n=15) (n=5) (n=20) IL-8 (pg/mL) 7,54 ± 9,1 5,27 ± 3,61 4,68 ± 2,63 0,826 (n=25) (n=6) (n=27) PCR (mg/L) 17,7 ± 23,71 _{43,4 ± 46,3}2 _{1,44 ± 1,7 <0,001*} (n=25) (n=6) (n=29) Leptina (ng/dL) 15,95 ± 18.89 13,17 ± 8,04 11,93 ± 11,70 0,777 Adiponectina (μg/dL) 62,68 ± 115,9 61,33 ± 67,58 22,39 ± 22,72 0,130 Resistin (ng/dL) 63,56 ± 31,45 48 ± 19,9 46,1 ± 23,2 0,089

TNF-α: fator de necrose tumoral alfa; IL-8: Interleucina-8; CRP: proteína C-reativa; CCL2: C-C Motif Chemokine Ligand 2 *p<0,05, diferença entre os grupos RDC, ADC e HC pelo teste de ANOVA ou Wilcoxon;

1 _{p<0,05, diferença entre os grupos RDC e HC pelo teste de Bonferroni (pos hoc);} 2 _{p<0,05, diferença entre os grupos ADC e HC pelo teste de Bonferroni (pos hoc);} 3 _{p<0,05, diferença entre os grupos RDC e ADC pelo teste de Bonferroni (pos hoc);}

Figura 4.2 Distribuição de leptina, resistina e adiponectina nos grupos DC e HC. Os gráficos de

caixa mostram os quartis e a mediana.

Figura 4.1 Distribuição de leucócitos, linfócitos, neutrófilos, monócitos, proteína C reativa (PCR) e

5- DISCUSSÃO

O objetivo do presente estudo foi avaliar os níveis de diferentes marcadores inflamatórios em pacientes com DC. A maioria dos pacientes estava em remissão clínica da doença e compuseram o grupo RDC (n=25). Neste grupo, 15 pacientes fizeram exames de colonoscopia ou RM, que detectaram ausência de atividade inflamatória intestinal em 14 indivíduos. Mesmo em remissão da doença, este grupo mostrou contagens elevadas de leucócitos, neutrófilos e plaquetas. No entanto, a CCL2 apresentou-se reduzida, o que indica que esta quimiocina poderia ser utilizada como marcador de remissão da doença.

A CCL2 é um potente fator quimiotático para monócitos, e o seu aumento na mucosa intestinal está associado a um maior grau de inflamação endoscópica, e a uma maior gravidade da DC (12, 14, 15). Considerando que os monócitos periféricos são fontes exclusivas de macrófagos no intestino (18), um número normal de monócitos associado a uma redução significativa de CCL2 pode levar a reduções de macrófagos na mucosa intestinal, controlando a atividade inflamatória.

A maioria dos pacientes deste estudo estava em terapia com anti-TNF e/ou AZA, indicando que estes medicamentos podem ter influenciado nos níveis de CCL2, monócitos e linfócitos. Magnusson et al. (67) mostrou reduções de CCL2 após o uso de infliximabe por pacientes com Colite Ulcerativa. Esses autores acreditam que o infliximabe age reduzindo a tenascina C (TNC), uma glicoproteína pró-inflamatória da matriz extracelular, que está ausente em tecidos saudáveis. Nas DIIs e na artrite reumatoide a TNC é um indicador de inflamação (68, 69), pois esta glicoproteína além de induzir a expressão de CCL2, ativa a sinalização dos receptores Toll-like 4 (TLR4), aumentando a síntese de citocinas pró-inflamatórias (67). O controle das contagens de monócitos e linfócitos podem ser explicados pelos efeitos da AZA, que inibe a proliferação destas células, e do anti-TNF que pode levar à apoptose ou destruição destas células (32, 34).

Os pacientes do grupo RDC apesar de não apresentarem sintomas da doença, mostraram elevado número de neutrófilos e plaquetas, em comparação ao grupo HC. Embora haja um aumento dos neutrófilos, a quimiocina que atrai estas células, a IL8, não mostrou um aumento correspondente. Provavelmente os neutrófilos aumentados podem estar relacionados às plaquetas elevadas, pois os trombócitos também podem regular o tráfego de muitos tipos de leucócitos, incluindo os neutrófilos (70). Na DC, a contagem de leucócitos demonstrou uma

baixa precisão (de 54%) na detecção de doença endoscopicamente ativa, com sensibilidade de 55% e especificidade de 50% (71). As plaquetas têm uma boa correlação com a atividade inflamatória, mas o seu aumento não pode ser atribuído apenas à inflamação, portanto sua contagem não é utilizada na prática clínica como indicador de atividade inflamatória (72).

Na DC, a produção de PCR por hepatócitos tem sido associada à atividade inflamatória observada por endoscopia, e à gravidade da doença (45, 73, 74). O ponto de corte de 5 mg/L para PCR apresentou uma acurácia de 66% na detecção de inflamação endoscópica, com uma sensibilidade de 68% e especificidade de 58% (71). A baixa sensibilidade indica que valores de PCR menores que 5 mg/L não excluem de forma confiável a presença de inflamação ativa. Sabe-se que alguns indivíduos apresentam polimorfismos no gene desta proteína, fazendo com que eles produzam menos PCR (42). Neste estudo muitos pacientes (n=14) do grupo RDC apresentaram PCR acima de 5 mg/L, o que poderia indicar atividade da doença. Porém, 50% destes pacientes tinham exames de colonoscopia ou RM, que indicaram remissão da doença em todos estes indivíduos, o que mostra uma limitação na especificidade da PCR.

Os resultados no grupo ADC devem ser interpretados com cautela, devido ao pequeno tamanho amostral. Os monócitos estavam aumentados neste grupo, quando comparado aos grupos RDC e HC, e apenas um paciente tinha PCR menor que 5 mg/dL. Principalmente, o subtipo CD14+ CD16+ de monócito está aumentado no sangue periférico de pacientes com DC em atividade e foi sugerido que estas células poderiam ser utilizadas como um marcador sérico de inflamação intestinal (21,22). Curiosamente, o aumento de monócitos não foi acompanhado por um aumento correspondente de CCL2. Considerando que a maioria desses pacientes estava na terapia com infliximabe, os valores normais de CCL2 neste grupo podem ser atribuídos ao uso de infliximabe, conforme relatado por Magnusson et al (67). Um aumento no número de pacientes neste grupo e exames de colonoscopia para comprovar a atividade inflamatória intestinal são necessários para uma melhor interpretação desses resultados.

Quando os grupos RDC e ADC foram combinados (grupo DC) e comparados ao grupo HC, observamos algumas diferenças estatísticas nas quantidades de gordura visceral, avaliadas por meio da DEXA e medida da CC. O grupo DC apresentou maiores quantidades de gordura visceral, o que pode ser justificado pela hipertrofia do VAT apresentada por pacientes com DC (54). O aumento do VAT já foi relatado em outros estudos e está relacionado com um pior prognóstico da DC (52, 53). Principalmente ao redor da área intestinal inflamada, ocorre um aumento no número de adipócitos (“creeping fat”) e alterações na produção de citocinas, e isto pode influenciar a atividade inflamatória intestinal (54). Além desse excesso de gordura

abdominal, 45% dos pacientes com DC deste estudo também apresentaram sobrepeso ou obesidade. A porcentagem de pacientes com excesso de peso corporal parece estar aumentando, pois o nosso estudo de 2013, também feito no ambulatório de DII do Gastrocentro, mostrou que de 68 pacientes com DC, 36% tinham sobrepeso ou obesidade (75). O aumento na prevalência de sobrepeso e obesidade em pacientes com DC tem sido relatado em outros estudos (48, 76), pacientes portugueses com DC (n=78) apresentaram uma taxa de 32% de sobrepeso e 8% de obesidade (77) e outro estudo feito na Escócia mostrou que de 489 indivíduos com DII, 38% tinham sobrepeso e 18% obesidade (78). O excesso de peso, também, vem atingindo a população pediátrica, um estudo multicêntrico nos Estados Unidos, encontrou um percentual de 23,6% de sobrepeso ou obesidade em 1598 crianças com DII (79). O tecido adiposo representa um órgão metabolicamente ativo, que produz adipocinas com efeitos proinflamatórios, as quais podem contribuir com a atividade inflamatória da DC (48). O aumento do IMC e das quantidades de gordura mesentérica foram associados a maiores níveis de PCR e a uma maior taxa de doença estenosante ou penetrante (52, 80). Pesquisas futuras são necessárias para permitir uma melhor compreensão dessa interação complexa entre a doença de Crohn e a obesidade.

A adiponectina é uma adipocina anti-inflamatória e parece ter um papel na DC (59). Um aumento de adiponectina no grupo DC foi verificado, o mesmo foi observado por Karmiris et al. (61), confirmando os dados de que o VAT na DC produz mais adiponectina (58, 59). Entretanto, outros estudos apresentaram resultados diferentes: Valentini et al. (60) encontraram reduções de adiponectina sérica em pacientes com DC e Waluga et al. (55) não encontraram diferenças entre pacientes com DC e controles. Estes estudos incluíram indivíduos que usavam medicamentos anti-inflamatórios esteroides ou não esteroides e imunossupressores, o que dificulta a análise desses resultados. Sabe-se que o tratamento com esteroides pode suprimir a secreção de adiponectina (59), com isso os efeitos dos medicamentos nos níveis desta proteína, podem ter levado a estes resultados controversos.

A resistina possui efeitos pró-inflamatórios e já foi correlacionada com o escore da atividade da doença, contagem de leucócitos e PCR (60, 81). Nós e outros autores encontramos um aumento nos níveis de resistina no soro de pacientes com DC (55, 60, 61). Além disso, Karmiris et al. (82) determinaram níveis de leptina, adiponectina e resistina no soro de 17 pacientes com DC antes e após o tratamento com infliximabe. Apenas a resistina foi significativamente reduzida após a terapia. Eles sugeriram que na DC a resistina poderia ser usada como marcador de terapia bem-sucedida. Um ponto vulnerável desse trabalho é que não

havia grupo de controle. Em nosso estudo não é possível interpretar o papel do anti-TNF-α no controle da resistina, uma vez que os pacientes não realizaram a dosagem desta proteína antes da terapia.

Com relação a leptina, assim como Valentini et al. (60), nós verificamos que as quantidades séricas desta adipocina em pacientes com DC eram semelhantes ao grupo controle, diferente de dois outros estudos que mostraram reduções (55, 61). Apesar da leptina não apresentar correlação com a atividade da doença (60, 61), estudos indicam que o TNF-α pode diminuir a síntese de leptina durante a inflamação crônica (83, 84). Franchimont et al. (85) e Waluga et al. (55) demonstraram que o tratamento com infliximabe ou AZA aumentam os níveis de leptina. Desta forma, acreditamos que neste estudo os níveis similares de leptina circulante entre os grupos DC e HC, podem ser justificados pelo uso de infliximabe e AZA pelo grupo DC. Os valores controlados de TNF-α encontrados no grupo DC, indicam que não houve a inibição na produção de leptina.

A principal limitação deste estudo é ter uma amostra pequena de pacientes do grupo ADC. Embora o IADC falhe algumas vezes na identificação de inflamação intestinal ativa, nós constatamos que 15 pacientes do grupo RDC apresentavam imagens de colonoscopia e ou de RM, que indicaram ausência de inflamação em 14 deles. Como a CCL2 está fortemente reduzida no grupo RDC, acreditamos que esta quimiocina pode ser utilizada como preditor de mucosa saudável, reconhecendo, no entanto, a necessidade de ampliar a amostra de pacientes para a confirmação desta hipótese.

6- CONCLUSÃO

Os pacientes com doença de Crohn deste estudo estavam em sua maioria em remissão clínica da doença, mostrando a eficácia das terapias com anti-TNF-α e azatioprina. Foi identificado nestes pacientes um aumento na gordura intra-abdominal, que pode estar relacionada a hipertrofia do tecido adiposo mesentérico, a qual pode ter levado às alterações das adipocinas séricas, com aumento da resistina e adiponectina.

Mesmo em remissão, os pacientes apresentaram elevações nas contagens de neutrófilos e plaquetas, e nos níveis de proteína C reativa. Por outro lado, estes pacientes mostraram reduções acentuadas de CCL2 e consequente controle de monócitos, indicando que

apenas a CCL2 poderia ser utilizada como um biomarcador sérico de controle da doença de Crohn.

7- REFERÊNCIAS

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