Universidade Federal do Rio Grande do Norte Centro de Ciências da Saúde
Programa de Pós-Graduação em Desenvolvimento e Inovação Tecnológica de Medicamentos
Delineamento de biocompósitos baseados em paligorsquita e quitosana como carreadores de etambutol
Doutoranda: Lyghia Maria Araújo Meirelles Orientadora: Fernanda Nervo Raffin Co-orientador: Túlio Flávio Accioly de Lima e Moura
Natal-RN Março/2019
LYGHIA MARIA ARAÚJO MEIRELLES
Delineamento de biocompósitos baseados em paligorsquita e quitosana como carreadores de etambutol
Tese submetida ao Programa de Pós-Graduação em Desenvolvimento e Inovação Tecnológica em Medicamentos da Universidade Federal do Rio Grande do Norte (PGDITM/UFRN), como requisito parcial à obtenção do grau de Doutora em Desenvolvimento e Inovação Tecnológica em Medicamentos.
Orientadora: Dra. Fernanda Nervo Raffin Co-orientador: Dr. Túlio Flávio Accioly de Lima e Moura
Natal-RN Março/2019
Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN Sistema de Bibliotecas - SISBI
Catalogação de Publicação na Fonte. UFRN - Biblioteca Central Zila Mamede
Elaborado por FERNANDA DE MEDEIROS FERREIRA AQUINO - CRB-15/301 Meirelles, Lyghia Maria Araújo.
Delineamento de biocompósitos baseados em paligorsquita e quitosana como carreadores de etambutol / Lyghia Maria Araújo Meirelles. - Natal, 2019.
168 f.: il.
Tese (doutorado) - Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Centro de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Desenvolvimento e Inovação Tecnológica de Medicamentos. Natal, RN, 2019.
Orientadora: Profa. Dra. Fernanda Nervo Raffin.
Coorientador: Prof. Dr. Túlio Flávio Accioly de Lima e Moura. 1. Tuberculose - Tese. 2. Etambutol - Tese. 3. Paligorsquita - Tese. 4. Quitosana - Tese. I. Raffin, Fernanda Nervo. II. Moura, Túlio Flávio Accioly de Lima e. III. Título.
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
REITORA
Profa. Dra. Ângela Maria Paiva Cruz
VICE-REITOR
Prof. Dr. José Daniel Diniz Melo
PRÓ-REITOR DE PÓS-GRADUAÇÃO Prof. Dr. Rubens Maribondo do Nascimento
DIRETOR DO CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE Profa. Dr. Hênio Ferreira de Miranda
VICE-DIRETOR DO CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE Prof. Antônio de Lisboa Lopes Costa
COORDENADOR DO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM DESENVOLVIMENTO E INOVAÇÃO TECNOLÓGICA DE MEDICAMENTOS
Profa. Dra. Silvana Maria Zucolotto Langassner
VICE-COORDENADOR DO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM DESENVOLVIMENTO E INOVAÇÃO TECNOLÓGICA DE MEDICAMENTOS
AGRADECIMENTOS
Aos meus pais, Dolores e Miguel, pelo cuidado e amor e por serem meu porto seguro. Eles sempre se esforçaram para proporcionar a melhor educação possível para mim e meu irmão e, seguramente, são os nossos maiores incentivadores. Muito obrigada! Amo vocês!
Ao meu irmão Marcus pela companhia desde os primeiros anos, tornando meus dias mais alegres. Hoje ele é um grande amigo e fonte de admiração.
A Wilbur, meu esposo, pelo amor, convívio e paciência ao longo dessa trajetória. Ele me acompanhou e me incentivou desde a decisão de iniciar o doutorado. Sem você esse caminho certamente teria sido mais difícil. Te amo!
À minha orientadora, Fernanda Raffin, por aceitar me guiar ao longo destes quatro anos sem ao menos me conhecer. Sou grata por toda a confiança em mim depositada, por toda a colaboração dada para o desenvolvimento desta tese, bem como as oportunidades a mim concedidas enquanto parte do grupo. Para mim, ela se tornou um exemplo de firmeza e dedicação profissional.
Ao professor Túlio Moura, por viabilizar sempre o andamento dos trabalhos, esforçando-se por solucionar os problemas que eventualmente surgiam. Agradeço por toda a contribuição dedicada a esta tese.
Aos professores César Viseras, Carola Aguzzi e Pilar Cerezo por todo o suporte e acolhida durante o intercâmbio. Agradeço por disponibilizarem toda a infraestrutura que dispunham para que eu desenvolvesse o trabalho durante o período que estive em Granada. Suas colaborações para a tese foram de grande valia.
Às amizades construídas ao longo do doutorado, em especial àqueles que compõem o LDM e LEFI. Foram vocês que me incentivaram a cada insucesso, me indicaram novas alternativas e tornaram meu dia-a-dia menos complicado. Judite, uma mãezona que encontrei onde menos esperava. Não havia nenhum material que ela não conseguisse ou ajuda que ela negasse. Ednaldo, por sempre se dispor a ajudar nos experimentos e análises que necessitei, e pelas conversas que aliviavam o peso dos problemas.
À Raquel, uma das poucas, mas mais valorosas amizades com que me Natal nos agraciou. O seu otimismo e a sua paixão pela pesquisa são contagiantes. Ela e sua família nos receberam e nos fizeram sentir mais perto de casa.
À Silvana, companheira de doutorado, de quartos de hotel, de apartamento e de vida. Durante toda essa trajetória partilhamos alegrias e tristezas e nos fizemos família quando a nossa estava distante. Obrigada por tudo!
À Dóris, Fernanda, Maria, Mayra, Rodrigo e Sofía, nova família que construí em Granada durante o ano em que lá vivi. A adaptação e a estadia foram mais leves com elas. Também agradeço aos membros da comunidade Shalom, que por diversas vezes me acolheram e me permitiram sentir de forma mais intensa a intervenção de Deus em minha vida. Los echo mucho de menos!
Ao grupo de pesquisa espanhol que me recebeu tão bem ao longo do período que estive em Granada, Rita, Ana, Esperanza e Fátima, bem como as amigas italianas que ali conheci Piera, Cláudia, Sílvia, Francesca e Illênia. Vocês foram um grato presente e nosso convívio me permitiu crescer pessoal e cientificamente.
Aos laboratórios que abriram suas portas viabilizando alguns dos ensaios realizados: Laboratório de Sistemas Dispersos (LASID); Laboratório de Tecnologia e Biotecnologia (TECBIOFAR); Laboratório de Imunologia; Laboratório de Polímeros; Laboratório de Peneiras Moleculares (LABPEMOL), Laboratório de Petróleo (LAPET), Laboratório de Cromatografia do Instituto de Química, Laboratório de Difração de Raios X e Microscopia do Departamento de Ciências de Materiais. Aos amigos e familiares pela compreensão por todos os momentos em que não pude me fazer presente. As palavras de apoio e a admiração por aquilo que eu pretendia me impulsionaram até aqui, estejam certos disto.
Às instituições de ensino das quais fiz e faço parte, bem como os colegas com os quais partilho os desafios diários da docência. Obrigada por permitirem e viabilizarem minha ausência quando necessitei cursar disciplinas em outros estados ou me afastar totalmente para desenvolver a pesquisa em Natal.
Aos meus alunos, que me incentivam a buscar sempre o melhor. Este esforço não teria sentido sem a presença de vocês na minha rotina.
“Jamais há de ter ela a cor saudável Para que a carne do seu corpo goze, Que o que tinha esse corpo de inefável Cristalizou-se na tuberculose.” (Cruz e Sousa, "Tuberculosa ")
RESUMO
A tuberculose, uma doença transmissível que afeta os pulmões devido à infecção causada pelo Mycobacterium tuberculosis, ainda constitui um grave problema de saúde pública, ocupando o nono lugar em causa mundial de mortes, com milhões de novos casos a cada ano. Um dos problemas associados ao tratamento da tuberculose refere-se ao requisito de administração dos quatro fármacos de escolha (etambutol, rifampicina, isoniazida e pirazinamida) em uma única forma farmacêutica, o que acarreta problemas de interação e estabilidade. Tendo em vista a dificuldade encontrada neste tratamento, este trabalho propôs a obtenção de compósitos baseados em paligorsquita, um argilomineral fibroso, com elevada área específica e carga moderadamente negativa e, no biopolímero catiônico quitosana para carrear o tuberculostático etambutol. Neste sentido pretendeu-se melhorar a estabilidade da formulação, empregando insumos amplamente disponíveis na região Nordeste do Brasil. Após a caracterização inicial dos insumos quitosana e paligorsquita, determinando suas composições, procedeu-se o estudo de adsorção do fármaco ao filossilicato. De modo a prever a possibilidade de interação e determinar os potenciais sítios envolvidos na adsorção do fármaco ao filossilicato, procedeu-se a modelagem molecular. Em seguida, foi caracterizado o produto desta interação (ETB/Paly) empregando-se técnicas espectroscópicas (FTIR, DRX, EDS) e termoanalíticas (DSC e TG), microscopia, higroscopicidade, estabilidade e ensaios de liberação in vitro. A interação da paligorsquita com o polímero quitosana foi realizada pelo método da intercalação em solução, obtendo-se um compósito, cuja caracterização compreendeu avaliação da carga superficial, área específica, análise térmica, FTIR e DRX. Os compósitos carregados com etambutol foram obtidos através da técnica de secagem por aspersão, realizando-se a determinação das principais propriedades físico-químicas das micropartículas preparadas e sua biocompatibilidade. A análise in silico indicou a espontaneidade da adsorção do fármaco ao argilomineral, bem como indicou os principais grupos envolvidos em sua formação (Si-OH da paligorsquita e grupos –OH e -NH2 do etambutol). Os resultados obtidos corroboram a
análise computacional, demonstrando uma elevada capacidade de adsorção do tuberculostático ao carreador inorgânico, predominantemente na superfície, distribuído homogeneamente e promovendo uma redução da higroscopicidade do fármaco sob a forma híbrida (ETB/Paly), em relação ao fármaco livre. A análise dos biocompósitos quitosana-paligorsquita evidenciou o envolvimento de interações eletrostáticas e de hidrogênio entre os insumos, com adsorção superficial do polímero ao filossilicato. Ademais, os compósitos quitosana-paligorsquita carregados com etambutol apresentaram-se como micropartículas esféricas, biocompatíveis e com um perfil de liberação controlado, influenciado pela proporção dos insumos na formulação. Portanto, através dos resultados obtidos, é possível verificar a efetividade do sistema em modular a liberação do fármaco etambutol de modo pH-dependente, reforçando o envolvimento de interações eletrostáticas entre os componentes. Além disso, o uso de insumos biocompatíveis resultou na obtenção de compósitos com reduzida citotoxicidade na linhagem celular 3T3, principalmente nos sistemas constituídos por paligorsquita. Este conjunto de dados permite vislumbrar a possibilidade de aplicar esses biocompósitos no tratamento da tuberculose como uma alternativa simples e de baixo custo para dificuldades tecnológicas relacionadas ao esquema terapêutico em vigor.
ABSTRACT
Tuberculosis, a transmissible disease that affects the lungs for infection by Mycobacterium
tuberculosis, is still a serious public health problem, ranking ninth in the global cause of
death, with millions of new cases each year. One problem associated with the treatment of tuberculosis refers to the requirement of administration of four drugs (ethambutol, rifampicin, isoniazid, and pyrazinamide) as a fixed dose combination product, which leads to interaction and stability problems. Considering the difficulty found in this treatment, this work proposed to develop composites to carry the tuberculostatic ethambutol based on palygorskite, a fibrous clay mineral, with a high specific area and moderately negative charge, and on the cationic biopolymer chitosan. In this sense it was intended to improve the stability of the formulation, using raw materials widely available in the Northeast region of Brazil. Initially composition and purity of chitosan and palygorskite were determined and the adsorption study of the drug to the phyllosilicate was carried out. Molecular modeling was performed in order to predict the possibility of interaction and to determine the potential sites involved in the adsorption of the drug to the phyllosilicate. Then, the product of this interaction (ETB / Paly) was characterized using spectroscopic (FTIR, XRD, EDS) and thermoanalytical (DSC and TG) techniques, microscopy, hygroscopicity, stability and in vitro release assays. The interaction between palygorskite and chitosan was performed by the solution intercalation method, obtaining a composite that was characterized by the evaluation of the surface charge, specific area, thermal analysis, FTIR and XRD. The biocomposites loaded with ethambutol were obtained by the spray drying technique and the main physicochemical properties of the microparticles were determined as well as their biocompatibility. In silico analysis indicated that drug adsorption to the clay mineral occurred spontaneously, the main groups involved were palygorskite Si-OH and ethambutol -OH and -NH2 groups. The results obtained corroborate with the computational analysis, demonstrating a high adsorption capacity of the tuberculostatic onto the inorganic carrier, predominantly on the surface, homogeneously distributed and promoting a reduction of drug hygroscopicity in the hybrid form (ETB / Paly), in relation to the free drug. Analysis of the biocomposites based on chitosan-palygorskite evidenced the involvement of electrostatic and hydrogen interactions between the raw materials, with superficial adsorption of the polymer to the phyllosilicate. In addition, the composites loaded with ethambutol presented as spherical microparticles, biocompatible and with a controlled release profile, influenced by the polymer: phyllosilicate rate. Therefore, the results obtained indicated the effectiveness of the system in modulating the pH-dependent release of ethambutol, reinforcing the involvement of electrostatic interactions between the components. Also, the use of biocompatible materials led to composites with reduced cytotoxicity in the 3T3 cell line, mainly in the systems based on palygorskite. This dataset allows us to envisage the possibility of applying these biocomposites in the treatment of tuberculosis as a simple and low-cost alternative for technological difficulties related to the current therapeutic regimen.
SUMÁRIO RESUMO ... vi ABSTRACT ... vii 1. INTRODUÇÃO ... 18 2. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA ... 22 2.1. ARGILOMINERAIS ... 22 2.1.1. Conceitos e propriedades ... 22 2.1.2. Paligorsquita ... 27 2.2. QUITOSANA ... 29 2.2.1. Estrutura e propriedades ... 29
2.2.2. Aplicações em tecnologia farmacêutica ... 31
2.3. COMPÓSITOS BASEADOS EM ARGILOMINERAIS E BIOPOLÍMEROS ... 34
2.3.1. Conceito e benefícios ... 34
2.3.2. Métodos de obtenção ... 35
2.3.3. Sistemas híbridos carreadores de fármacos ... 37
2.4. TUBERCULOSE ... 39
2.4.1. Etiologia e epidemiologia ... 39
2.4.2. Esquema terapêutico para o tratamento da tuberculose ... 40
2.4.3. Compósitos baseados em filossilicatos aplicados ao tratamento da tuberculose ... 44 3. OBJETIVOS ... 47 3.1. OBJETIVO GERAL ... 47 3.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS ... 47 4. MATERIAIS E MÉTODOS ... 48 4.1. MATERIAIS ... 48 4.1.1. Matérias-primas ... 48
4.1.2. Reagentes, materiais e meio de cultura ... 48
4.2. METODOLOGIA ... 49
4.2.1. Tratamento e caracterização dos excipientes ... 49
4.2.1.1. Purificação e caracterização da quitosana... 49
4.2.1.2. Caracterização da Paligorsquita ... 50
4.2.3. Estudo de adsorção de etambutol em paligorsquita e caracterização do
híbrido ... 53
4.2.3.1. Quantificação de etambutol por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) ... 53
4.2.3.2. Estudos de adsorção do fármaco à paligorsquita ... 54
4.2.3.3. Preparo do híbrido Etambutol-Paligorsquita (ETB/Paly) ... 56
4.2.3.4. Caracterização do híbrido ETB/Paly no estado sólido ... 56
4.2.3.5. Higroscopicidade ... 57
4.2.3.6. Estabilidade ... 57
4.2.3.7. Estudo de liberação in vitro ... 58
4.2.3.8. Análise estatística ... 58
4.2.4. Interação quitosana-paligorsquita ... 59
4.2.4.1. Isoterma de adsorção quitosana-paligorsquita ... 59
4.2.4.2. Preparo do compósito quitosana-paligorsquita ... 59
4.2.4.3. Caracterização do compósito quitosana-paligorsquita ... 60
4.2.4.4. Adsorção do fármaco etambutol ao compósito ... 61
4.2.4.5. Análise estatística ... 61
4.2.5. Preparo e caracterização dos biocompósitos baseados em paligorsquita-quitosana ... 61
4.2.5.1. Preparo dos biocompósitos... 61
4.2.5.2. Caracterização físico-química dos biocompósitos ... 62
4.2.5.3. Ensaio de liberação in vitro ... 63
4.2.5.4. Cinética de liberação ... 64
4.2.5.5. Ensaio de citotoxicidade in vitro ... 66
4.2.5.6. Análise estatística ... 67
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 68
5.1. Tratamento e caracterização dos excipientes ... 68
5.1.1. Caracterização da quitosana ... 68
5.1.2. Caracterização da paligorsquita... 70
5.2. Estudo de adsorção de etambutol em paligorsquita e caracterização do híbrido ... 81
5.2.2. Quantificação de etambutol por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência
(CLAE) ... 84
5.2.3. Estudos de adsorção do fármaco à paligorsquita ... 86
5.2.4. Caracterização do híbrido ETB/Paly no estado sólido ... 88
5.2.5. Higroscopicidade ... 95
5.2.6. Estabilidade ... 98
5.2.7. Ensaio de liberação in vitro ... 100
5.3. Interação quitosana-paligorsquita ... 102
5.3.1. Isoterma de adsorção quitosana-paligorsquita ... 102
5.3.2. Caracterização do compósito paligorsquita-quitosana ... 104
5.3.3. Adsorção do fármaco etambutol ao compósito ... 109
5.4. Preparo e caracterização dos biocompósitos baseados em paligorsquita-quitosana ... 111
5.4.1. Caracterização físico-química dos biocompósitos ... 111
5.4.2. Ensaio de liberação in vitro ... 122
5.4.3. Cinética de liberação ... 125 5.4.4. Toxicidade in vitro ... 128 6. CONCLUSÃO ... 132 7. PERSPECTIVAS ... 135 REFERÊNCIAS ... 136 APÊNDICES ... 153 ANEXOS ... 159
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Representação esquemática das unidades tetraédrica e octaédrica dos filossilicatos e suas respectivas camadas. ... 22 Figura 2. Representação esquemática de unidades estruturais dos filossilicatos. .... 23 Figura 3. Classificação dos filossilicatos. ... 24 Figura 4. Sítios de interação mais comuns entre moléculas orgânicas e filossilicatos. ... 26 Figura 5. Representação esquemática da paligorsquita. ... 27 Figura 6. Representação esquemática da conversão de quitina em quitosana. ... 29 Figura 7. Versatilidade das aplicações biomédicas do polissacarídeo quitosana. .... 31 Figura 8. Tipos de compósitos baseados em polímero e argila. ... 35 Figura 9. Esquema de purificação da quitosana. ... 49 Figura 10. Curva de titulação potenciométrica da quitosana e a curva
correspondente à sua primeira derivada. ... 68 Figura 11 Viscosidade inerente (ƞinh) e reduzida (ƞred) em função da concentração de
quitosana. ... 70 Figura 12. Análise difratométrica de Paly e Pharmasorb Colloidal. ... 73 Figura 13. Espectros na região do infravermelho de Paly e Pharmasorb Colloidal. .. 77 Figura 14. Análise termogravimétrica das amostras de paligorsquita. ... 78 Figura 15. Curvas DTA das amostras de paligorsquita. ... 79 Figura 16. Fotomicrografia obtida por microscopia de transmissão (A) e espectro de energia dispersiva (B) de Paly. ... 81 Figura 17. Célula unitária do cristal de paligorsquita otimizada com DMol3... 82 Figura 18 Estrutura de dicloridrato de etambutol otimizada com DMol3. ... 82 Figura 19. Complexo de adsorção formado por dicloridrato de etambutol e a
supercélula de paligorsquita 1x1x4, visto do plano (100) (A) e do plano (001) (B). .. 83 Figura 20. Esquema ilustrativo da complexação do metal cobre com etambutol. ... 85 Figura 21. Cromatograma do padrão de cloridrato de etambutol 0,45 mg.mL-1 em
solução aquosa. ... 85 Figura 22. Isoterma de adsorção de etambutol à paligorsquita (média ± DP, n=3) e as curvas linearizadas de Langmuir e Freündlich. ... 87
Figura 23. Difratogramas dos insumos etambutol (a) e paligorsquita (b), e do híbrido ETB/Paly (c). ... 88 Figura 24 Espectros na região do infravermelho de etambutol (a), de paligorsquita (b), do híbrido ETB/Paly (c). ... 91 Figura 25 Curvas TG (A) e DSC (B) dos insumos Paly, ETB e do híbrido ETB/Paly.93 Figura 26. Microfotografias (MEV) e microanálise (EDX) de Paly (A1-D1) e ETB/Paly (A2-D2). ... 95 Figura 27. Ganho de massa diário de ETB-DFC e Híbrido-DFC submetidos a
condição de umidade 85%. ... 96 Figura 28. Aspecto das misturas físicas de ETB (A) e ETB/Paly (B), ambos na
presença de isoniazida, pirazinamida e rifampicina, no início (dia 1) e no final (dia 7) do estudo. ... 98 Figura 29. Teor relativo dos fármacos anti-TB ao final do ensaio de higroscopicidade para ETB-DFC e Híbrido-DFC. ... 99 Figura 30. Porcentagem cumulativa de ETB liberado a partir de ETB/Paly em
comparação ao fármaco livre em fluidos gástrico simulado (A) e fluido intestinal simulado (B), ambos sem adição de enzimas (média ± DP, n = 6). ... 101 Figura 31. Isoterma de adsorção de quitosana sobre paligorsquita obtida a 30°C, durante 48 horas. ... 102 Figura 32. Representação esquemática da interação paligorsquita-quitosana. ... 104 Figura 33. Difratograma de raios-X de quitosana (CTS), paligorsquita (Paly) e do compósito (CP). ... 105 Figura 34. Curvas TG de paligorsquita (Paly), quitosana (CTS) e do compósito (CP). ... 107 Figura 35. Espectros FTIR do compósito CP e seus respectivos componentes, Paly e CTS. ... 108 Figura 36. Capacidade de retenção de ETB em paligorsquita, quitosana e no
compósito CP. ... 110 Figura 37. Eletromicrografia dos compósitos quitosana-etambutol CE (a) e
quitosana-paligorsquita-etambutol C2P1E (b) e C1P1E (c). ... 115 Figura 38. Difratogramas de raios-X de paligorsquita, quitosana e etambutol:
Figura 39. Espectros na região do infravermelho de paligorsquita, quitosana e
etambutol: insumos (a) e micropartículas (b). ... 118 Figura 40. Curvas termogravimétricas dos insumos etambutol ETB, paligorsquita Paly, quitosana CTS e das micropartículas. ... 120 Figura 41. Curvas DSC de etambutol, quitosana e paligorsquita: insumos (a) e
micropartículas (b). ... 121 Figura 42. Perfil de liberação do fármaco ETB a partir das micropartículas de
quitosana e quitosana-paligorsquita em pH 2,2 (a) e pH 6,8 (b) (n = 3; média ± DP). ... 123 Figura 43. Citotoxicidade da linhagem 3T3 após exposição durante 72 horas a
diferentes concentrações de ETB, e das micropartículas livres e carregadas com o fármaco (n = 5). ... 129
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Sistemas de liberação baseados em quitosana e seus derivados. ... 32 Tabela 2. Descrição dos fármacos que compõem o tratamento de primeira linha da tuberculose. ... 41 Tabela 3. Esquema básico de tratamento dos casos novos de tuberculose. ... 42 Tabela 4. Sistemas híbridos de fármacos anti-TB baseados em filossilicatos. ... 44 Tabela 5. Condições cromatográficas adotadas para a quantificação de etambutol. 54 Tabela 6. Condições cromatográficas para a quantificação dos anti-TB isoniazida, pirazinamida e etambutol contidos nas amostras submetidos ao teste de
higroscopicidade. ... 58 Tabela 7. Identificação das micropartículas, sua composição e o respectivo
rendimento. ... 62 Tabela 8. Modelos cinéticos aplicados para avaliação dos dados obtidos. ... 66 Tabela 9. Composição química de Paly e Pharmasorb Colloidal determinada através de fluorescência e difração de raios X... 71 Tabela 10. Área específica, tamanho de partícula e potencial zeta de Paly e
Pharmasorb Colloidal. ... 74 Tabela 11. Eventos térmicos relacionados aos filossilicatos obtidos a partir de TG e DTA. ... 78 Tabela 12. Parâmetros de linearidade do método para quantificação de etambutol por cromatografia líquida de alta eficiência nos diferentes meios empregados no preparo da amostra. ... 86 Tabela 13. Parâmetros da isoterma obtidos através do ajuste dos dados
experimentais de equilíbrio aos modelos de Langmuir e Freündlich. ... 87 Tabela 14. Potencial zeta da paligorsquita e do híbrido ETB/Paly (média ± DP, n = 3). ... 89 Tabela 15. Parâmetros de linearidade do método farmacopeico empregado na
quantificação dos fármacos anti-TB. ... 98 Tabela 16. Propriedades de superfície de Paly e do compósito
Tabela 17 Propriedades físico-químicas dos compósitos baseados em paligorsquita e quitosana (média ± DP, n = 3). ... 113 Tabela 18. Parâmetros cinéticos obtidos a partir das curvas de liberação de ETB a partir das micropartículas em pH 2,2. ... 125 Tabela 19. Parâmetros cinéticos obtidos a partir das curvas de liberação de ETB a partir das micropartículas em pH 6,8. ... 127
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
AIPEA Associação Internacional para Estudo das Argilas ANVISA Agência Nacional de Vigilância Sanitária
ANOVA Análise de Variância
BET Teoria de adsorção originária dos nomes de seus autores Brunauer, Emmett e Teller
BSA Bovine Serum Albumin
CLAE Cromatografia Líquida de Alta Eficiência
CTS Quitosana
CP Produto da adsorção de quitosana à paligorsquita na proporção mássica 1:1
CE Micropartícula baseada em quitosana, carregada com o fármaco etambutol
C1P1E Micropartícula baseada em quitosana e paligorsquita na proporção mássica 1:1, carregada com o fármaco etambutol
C2P1E Micropartícula baseada em quitosana e paligorsquita na proporção mássica 2:1, carregada com o fármaco etambutol
DFC Dose fixa combinada DFT Density Functional Theory
DMEM Dulbecco's Modified Eagle's Medium DNP Double-Numerical Plus
DP Desvio Padrão
DPR Desvio Padrão Relativo DRX Difração de Raio X
DSC Calorimetria exploratória diferencial DSPP Semi-core pseudopotentials
EDX Energia Dispersiva de Raio-X
ETB Etambutol
FTIR Espectroscopia no Infravermelho com Transformada de Fourier
GD Grau de Desacetilação
HIV Vírus da Imunodeficência Humana ICDD International Centre for Diffraction Data
INH Isoniazida
mb Milibar (unidade de pressão)
O Camada octaédrica
OMS Organização Mundial de Saúde Paly Paligorsquita PBE Perdew–Burke–Ernzerhof T Camada tetraédrica TB Tuberculose TG Análise termogravimétrica UV ultravioleta
1. INTRODUÇÃO
A tuberculose (TB) é uma doença crônica, infecciosa e transmissível cujo agente etiológico é o Mycobacterium tuberculosis. Este bacilo pode infectar várias espécies animais, embora o homem seja o principal hospedeiro. M. tuberculosis é um bacilo ácido-resistente, não encapsulado e aeróbico, o que justifica a predominância dos casos de infecção pulmonar. No entanto, a micobactéria pode alcançar outros tecidos e órgãos através do sistema circulatório e/ou linfático, ocasionando a tuberculose extrapulmonar (LAWN; ZUMLA, 2011). O principal modo de transmissão na TB pulmonar ocorre a partir da inalação de aerossóis emitidos por pessoas com a doença respiratória ativa, seja através da fala, espirro ou tosse. Esses aerossóis contêm o bacilo, que devido à taxa de replicação lenta e à capacidade de permanecer latente, demanda um tratamento prolongado (BRASIL, 2011; CAPONE et al., 2006).
Embora a TB seja uma patologia milenar, cujo agente etiológico foi descoberto em 1882 por Robert Koch, os primeiros fármacos desenvolvidos para a contenção e cura da infecção surgiram apenas na segunda metade do século XX, nos anos 50 e 60, não evoluindo significativamente deste então (COSTA et al., 2013; NGUYEN, 2016). O tratamento da TB apresenta inúmeras limitações, principalmente no que se refere à adesão. Herrero e colaboradores (2015) pontuam que os componentes social e econômico são determinantes para a adesão dos pacientes, seguidos pela duração do tratamento e as reações adversas atreladas aos antibióticos de escolha (FERREIRA et al., 2013).
O esquema terapêutico básico para novos casos de TB pulmonar ou extrapulmonar consiste numa fase de ataque para eliminação rápida dos bacilos e que utiliza rifampicina, isoniazida, pirazinamida e etambutol em dose fixa combinada durante dois meses; seguida de quatro meses da fase de manutenção, na qual se utiliza isoniazida e rifampicina, também em dose fixa combinada, para evitar recidivas (BRASIL, 2011).
Este tratamento foi proposto em 2009 com três mudanças importantes, a inserção do fármaco etambutol (ETB), a redução das doses de isoniazida e rifampicina e a apresentação em dose fixa combinada. O principal motivo para este ajuste foi o aumento no número de casos de resistência primária à isoniazida e
rifampicina. Com estas mudanças também seria possível minimizar os efeitos colaterais destes fármacos pela redução das doses administradas e simplificar o tratamento através da ingestão de um único comprimido contendo os quatro fármacos (ARAKAWA et al., 2015).
Entretanto, a especialidade farmacêutica empregada no tratamento vigente apresenta dificuldades tecnológicas e biofarmacêuticas. Etambutol e pirazinamida catalisam a reação entre rifampicina e isoniazida, resultando na degradação de isoniazida a seu metabólito isonicotil hidrazona, o qual se liga à rifampicina para formar um complexo insolúvel. Além disso, etambutol é um fármaco higroscópico, que pode causar instabilidade física (BHUTANI; MARIAPPAN; SINGH, 2004; BHUTANI; SINGH; JINDAL, 2005; LAVOR et al., 2012). Junto a estes problemas tecnológicos, a biodisponibilidade de rifampicina (ligeiramente solúvel em água) é reduzida pela sua combinação com os demais fármacos anti-TB (muito solúveis em água e com altas taxas de absorção) (AGRAWAL et al., 2004). Estes problemas requerem o desenvolvimento de formulações alternativas que minimizem as interações entre os fármacos anti-TB que compõem a associação em dose fixa combinada.
Em estudos anteriores, diferentes argilominerais têm sido usados como carreadores de agentes tuberculostáticos de primeira linha, incluindo isoniazida (AKYUZ; AKYUZ, 2008; CARAZO et al., 2017a, 2017b; SAIFULLAH et al., 2014), pirazinamida (AKYUZ; AKYUZ, 2004) e rifampicina (VIÇOSA et al., 2009). Estes insumos inorgânicos possuem propriedades atrativas para aplicação farmacêutica, como caráter hidrofílico, elevada capacidade de adsorção, baixo custo, ampla disponibilidade, alta estabilidade térmica e grupos reativos (CARRETERO; POZO, 2009; MEIRELLES; RAFFIN, 2017; RODRIGUES et al., 2013). Estes nanomateriais têm sido empregados para diversos fins, como aumento de solubilidade, melhoria de estabilidade ou na modificação da liberação de fármacos (MURA et al., 2016; TENCI et al., 2017; VISERAS et al., 2010; VISERAS; AGUZZI; CEREZO, 2015).
Sua estrutura geral é baseada em camadas tetraédricas (T) e octaédricas (O) de cátions coordenados a oxigênios em arranjos T:O ou T:O:T, que podem ser eletricamente neutros ou negativamente carregados (BRIGATTI; GALAN; THENG, 2006). Em alguns argilominerais, como as esmectitas e micas, a carga negativa, devido às substituições isomórficas de cátions nas camadas T ou O, é balanceada por cátions presentes no espaço interlamelar (BRIGATTI; GALAN; THENG, 2006).
Esta estrutura torna as esmectitas trocadores de cátions bastante versáteis para diversas moléculas orgânicas, incluindo fármacos básicos (AGUZZI et al., 2007a).
Paligorsquita, também conhecida como atapulgita, pertence a um grupo dos filossilicatos fibrosos, junto à sepiolita, cuja morfologia diferenciada é atribuída a uma descontinuidade na sua camada octaédrica. A estrutura deste filossilicato é formada por fitas de arranjo T:O:T, e cada fita é ligada à próxima pela inversão da camada tetraédrica, resultando em canais zeolíticos que se projetam paralelos ao comprimento da fibra e que contêm quantidades variáveis de água (BRADLEY, 1940). Como a camada octaédrica torna-se descontínua a cada inversão da camada tetraédrica, os átomos de oxigênio da camada octaédrica têm as cargas balanceadas através de coordenação a cátions da fita adjacente, enquanto nos canais este balanço ocorre por prótons, água coordenada e cátions trocáveis (GALAN, 1996).
Diversos trabalhos na literatura abordam o preparo de compósitos polímero-argila, visando aperfeiçoar os insumos de partida através da obtenção de um novo material que reúna as suas melhores propriedades (AMBROGI et al., 2008; MA et al., 2016; ORDIKHANI; DEHGHANI; SIMCHI, 2015; RUSMIN et al., 2015). O produto desta interação adquire propriedades diferentes dos componentes orgânico e inorgânico originários, as quais consistem em mudanças no comportamento térmico, na resistência mecânica, na capacidade de intumescimento, dentre outras (RUIZ-HITZKY et al., 2013a).
Neste trabalho, investigou-se a interação do biopolímero quitosana com paligorsquita, para compreender o mecanismo de interação entre ambos, a fim de preparar posteriormente um compósito com aplicação farmacêutica. A escolha do polímero está relacionada à sua origem natural e ao caráter catiônico, o que propiciaria não somente ligações de hidrogênio com o filossilicato, mas também interações do tipo eletrostáticas, devido à carga superficial moderadamente negativa deste.
O efeito da argila sobre o biopolímero deve-se principalmente à sua elevada área específica, porosidade, capacidade de troca iônica e presença de grupos silanóis na superfície externa (ANNABI-BERGAYA, 2008; RUIZ-HITZKY et al., 2013b). A versatilidade destes compósitos é observada pela amplitude de aplicações relatadas na literatura, dentre as quais em sistemas de liberação de fármacos (AGUZZI et al., 2010; LIU et al., 2013; RUSMIN et al., 2015; SALCEDO et al., 2012).
Alcântara et al. (2014) prepararam compósitos baseados em paligorsquita e quitosana com propriedades mecânicas e de barreira melhoradas, além de maior estabilidade térmica e resistência à água. Trabalhos anteriores propuseram o uso de compósitos baseados em paligorsquita e quitosana como carreadores de fármacos, alcançando perfis de liberação controlados, com menor efeito “burst”, seja pelo recobrimento da fibra inorgânica com o polímero ou pelo efeito reticulante dos argilominerais sobre a matriz polimérica (SANTANA et al., 2017a; WANG et al., 2011). Desta forma é possível oferecer uma barreira capaz de dificultar a difusão do fármaco a partir do sistema.
Neste estudo pretendeu-se desenvolver um sistema de liberação baseado em paligorsquita e quitosana aplicado ao fármaco etambutol. Foram selecionados dois insumos naturais amplamente disponíveis na região nordeste do país e acessíveis sob um baixo custo para compor o híbrido destinado a uma doença negligenciada, cujo tratamento é provido essencialmente por entidades governamentais. Portanto, o propósito deste sistema é alterar a rápida liberação inicial do etambutol visando minimizar as interações decorrentes da sua associação em dose fixa combinada com os demais fármacos anti-TB de escolha. Ademais, este trabalho contribuiu para o conhecimento da interação de etambutol com paligorsquita, pois, diferentemente dos demais tuberculostáticos de primeira linha, este fármaco ainda não havia sido avaliado na presença de argilominerais.
Para tanto, esta tese foi organizada em uma sequência de experimentos que visou a caracterização dos insumos empregados no preparo dos compósitos, seguida pela avaliação da interação entre o filossilicato e o fármaco, além da interação paligorsquita-quitosana. Por fim, preparou-se o compósito por secagem por aspersão da mistura de paligorsquita, quitosana e etambutol e procedeu-se sua caracterização e avaliação in vitro da citotoxicidade do sistema.
2. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA
2.1. ARGILOMINERAIS
2.1.1. Conceitos e propriedades
De acordo com a Associação Internacional para Estudo das Argilas (AIPEA), argilas são materiais de ocorrência natural, compostos principalmente por minerais finamente divididos, os quais possuem comportamento plástico na presença de água e enrijecem quando secos (BERGAYA; LAGALY, 2006). Os argilominerais que compõem as argilas são filossilicatos, sejam eles naturais ou sintéticos, e minerais que conferem plasticidade a estas, tornando-as rígidas ao secar (GUGGENHEIM et al., 2007). Dada a ocorrência em grandes depósitos distribuídos por todo o mundo, as argilas e seus constituintes são materiais abundantes e acessíveis a um baixo custo.
A estrutura dos filossilicatos resulta da combinação de camadas tetraédricas (T) e octaédricas (O) (Figura 1).
Figura 1. Representação esquemática das unidades tetraédrica e octaédrica dos filossilicatos e suas respectivas camadas.
Fonte: Imagem adaptada da página do Soil System Sciences, Divisão da União Europeia de Geociência1.
1 Disponível em: https://blogs.egu.eu/divisions/sss/2014/09/page/3/. Acesso em: 08
Cada tetraedro é formado principalmente pelo cátion Si4+ coordenado a quatro
átomos de oxigênio, ligando-se aos tetraedros adjacentes pelo compartilhamento dos oxigênios basais para a formação da camada tetraédrica. A camada octaédrica, por sua vez, geralmente é composta pelos cátions Al3+ e Mg2+, e sua formação
decorre da união das faces dos octaedros adjacentes (BRIGATTI; GALAN; THENG, 2006).
As camadas T e O se ligam através dos oxigênios apicais da camada tetraédrica, os quais se posicionam no mesmo plano da camada octaédrica, sendo compartilhados entre ambas as camadas. A disposição das camadas pode ocorrer na proporção 1:1 (T:O) ou 2:1 (T:O:T), gerando uma variedade de classes (GHADIRI; CHRZANOWSKI; ROHANIZADEH, 2015). A Figura 2 ilustra dois tipos de unidade estrutural dos filossilicatos, T:O e T:O:T. O primeiro exemplo consiste do alinhamento de uma camada tetraédrica e uma camada octaédrica, enquanto o segundo é composto por uma camada octaédrica entre duas camadas tetraédricas orientadas em sentidos opostos.
Figura 2. Representação esquemática de unidades estruturais dos filossilicatos.
Fonte: Autoria própria.
A Figura 3 representa um esquema com os principais grupos de filossilicatos, classificados conforme seu arranjo e estrutura. Ademais, a morfologia assumida por estas unidades estruturais pode resultar em filossilicatos lamelares, tubulares ou fibrosos.
Além da estrutura, a composição das camadas também pode ser variável, influenciando fortemente as propriedades dos filossilicatos (MURRAY, 2006). A carga superficial de alguns filossilicatos, por exemplo, é atribuída a substituições isomórficas, como a substituição do Si4+ por Al3+ na camada tetraédrica, ou de Al3+
por Mg2+, Fe2+ ou outros cátions na camada octaédrica (SCHOONHEYDT;
JOHNSTON, 2011). Estas trocas geram uma carga predominantemente negativa na superfície dos filossilicatos, salvo algumas exceções, como o talco, que é desprovido de carga.
Figura 3. Classificação dos filossilicatos.
Fonte: Autoria própria.
A fim de balancear a carga negativa superficial, cátions presentes no meio, como K+, Na+, Mg2+ e Ca2+, interagem através de ligações eletrostáticas com os
argilominerais, sendo denominados cátions trocáveis (KHURANA et al., 2015). Comumente estes cátions ocupam o espaço interlamelar ou canais dos filossilicatos junto a moléculas de água (BRIGATTI et al., 2011). Dentre os argilominerais, o grupo das esmectitas é o que possui maior capacidade de permuta, razão pela qual há um maior número de estudos envolvendo estas argilas (MEIRELLES; RAFFIN, 2017).
Ao longo dos anos alguns tratamentos foram desenvolvidos para ampliar a gama de adsorvatos compatíveis com a superfície dos argilominerais, dentre os quais se destacam os tratamentos térmico e químico (GONZÁLEZ et al., 1990; FRINI-SRASRA; SRASRA, 2008; KOMADEL, 2016). Através destes tratamentos é possível modificar a superfície do substrato inorgânico, aperfeiçoando a afinidade entre estas entidades químicas através do aumento da área específica, da
porosidade, do caráter hidrofóbico ou por alteração do tipo de cátion trocável do filossilicato (AGUZZI et al., 2007b).
Outros fatores que influenciam a capacidade adsortiva de alguns argilominerais são a área específica, a hidrofilicidade e a presença de grupos silanóis e aluminóis reativos na superfície. O tamanho nanométrico das unidades estruturais, associado à presença de mesoporos (2 – 50 nm) e microporos (< 2 nm), resulta em uma elevada superfície de contato na maioria dos filossilicatos, principalmente aqueles classificados como fibrosos (MICHOT; VILLIE, 2006). A hidrofilicidade dos filossilicatos está relacionada à presença de oxigênios doadores de elétrons e cátions hidratados, principalmente nos grupos que possuem déficit de carga nas camadas octaédrica e tetraédrica (CHESWORTH, 2008).
As potencialidades destes materiais se refletem na gama de aplicações aos quais se destinam, como em fluidos de perfuração, fertilizantes, agentes catalizadores, purificadores de efluentes, como material de reforço em matrizes poliméricas, na indústria cerâmica, na produção de cosméticos e medicamentos, entre outras funções (MURRAY, 2000; BALTAR et al., 2009; NI et al., 2011; RODRIGUES et al., 2013; LI et al., 2016; MORAES et al., 2017;).
Na área farmacêutica são empregados tanto como adjuvantes farmacotécnicos em formas farmacêuticas sólidas (diluentes, lubrificantes, desintegrantes, aglutinantes), líquidas (emulsificantes, agentes suspensores e isotônicos) e semi-sólidas (agentes tixotrópicos e intumescentes, corantes, flavorizantes, alcalinizantes), quanto como princípios ativos, para patologias tópicas ou relacionadas ao trato gastrintestinal (LÓPEZ-GALINDO et al., 2011; KHURANA et al., 2015). Dentre a grande variedade de argilominerais conhecidos, apenas alguns têm aplicação farmacêutica reconhecida e estão descritos em farmacopeias e compêndios oficiais, como caulim, talco, montmorilonita, bentonita, paligorsquita e sepiolita (LÓPEZ-GALINDO; VISERAS; CEREZO, 2007).
Embora o uso dos filossilicatos no delineamento de formas farmacêuticas não seja uma prática recente, apenas a partir da década de 60 observou-se que a interação fármaco-argila seria capaz de influenciar o medicamento sob o aspecto biofarmacêutico, tecnológico, químico e/ou farmacológico (AGUZZI et al., 2007b). A elevada capacidade adsortiva dos filossilicatos e sua biocompatibilidade favoreceram seu emprego como carreadores de fármacos, os quais podem ser preparados por intercalação em solução ou fusão do fármaco na presença do
carreador inorgânico (CHOY et al., 2007; HAMILTON et al., 2014; YANG et al., 2016b; CARAZO et al., 2017b). A interação fármaco-argilomineral pode ocorrer em diferentes sítios do carreador inorgânico, conforme o esquema elaborado a seguir (Figura 4).
Figura 4. Sítios de interação mais comuns entre moléculas orgânicas e filossilicatos.
Fonte: Autoria própria.
As interações fármaco-filosslicato dependem das propriedades físico-químicas das biomoléculas, bem como da natureza dos sítios reativos do filossilicato enumerados na Figura 4, os quais variam dentre os distintos grupos. Embora a troca iônica seja o mecanismo de interação mais explorado na literatura, outros tipos de interação podem ocorrer entre argilominerais e moléculas orgânicas, como interações hidrofóbicas, ligações de hidrogênio e interações eletrostáticas com sítios carregados de modo pH dependente (AGUZZI et al., 2007a; MANGONI; DIAS; CONSTANTINO, 2015). Assim, os híbridos obtidos a partir destas interações apresentam uma variedade de aplicações como estabilizantes, modificadores do perfil de liberação, agentes solubilizantes, ou promotores da mucoadesão de moléculas bioativas (ITO et al., 2001; RIVERA et al., 2016; BORREGO-SÁNCHEZ et al., 2018; REBITSKI et al., 2018).
2.1.2. Paligorsquita
Paligorsquita é um silicato de alumínio e magnésio, também conhecido como atapulgita, que possui estrutura 2:1 e morfologia fibrosa, resultante da inversão periódica da camada tetraédrica em 180° (BRIGATTI; GALAN; THENG, 2006). A descontinuidade da camada octaédrica a cada inversão causa a formação de túneis e canais retangulares, cuja dimensão restrita somente permite a inserção de pequenas moléculas e cátions (GALAN, 1996; MURRAY, 2000). Esta peculiaridade na morfologia dos filossilicatos fibrosos expõe oxigênios tetraédricos reativos na superfície e cátions octaédricos no interior do túnel (SINGER, 2002). A Figura 5 corresponde a uma representação estrutural deste filossilicato.
Figura 5. Representação esquemática da paligorsquita.
Fonte: Adaptado de Zhuang e colaboradores (2017).
A alta adsortividade da paligorsquita é devida à sua carga superficial moderadamente negativa, capacidade de troca catiônica intermediária e elevada área específica (relacionada à presença dos canais e túneis) (MURRAY, 2000). O caráter hidrofílico da paligorsquita é atribuído aos grupos silanóis presentes na superfície, o que pode ser modulado por modificações químicas, em um processo denominado organofilização (RUIZ-HITZKY et al., 2013b). Esta modificação também impede a reagregação das partículas por estabilização estérica, pois fortes ligações
de hidrogênio e forças de Van der Waals promovem a formação de agregados (WANG; WANG, 2016).
Paligorsquita é comumente encontrada no Ocidente, porém apenas nos últimos anos há registro de jazidas comercialmente exploradas no Brasil, como a bentonita branca obtida em Boa Vista (PB), que contém atapulgita associada à montmorilonita, e a paligorsquita extraída em Guadalupe (PI), que possui maior grau de pureza (COELHO; SANTOS; SANTOS, 2007). Nosso grupo analisou uma amostra deste filossilicato, extraída no Piauí, e propôs seu emprego como excipiente em formas farmacêuticas sólidas destinadas ao tratamento da TB após estudos preliminares de compatibilidade (SOARES et al., 2013). A ampla disponibilidade de paligorsquita na região Nordeste do país, seu baixo custo e a comprovada compatibilidade biológica estimulam o desenvolvimento de novas alternativas farmacêuticas baseadas neste suporte inorgânico.
As propriedades físico-químicas e a estrutura fibrosa incomum tornam este argilomineral um material de vasta aplicação industrial. No segmento farmacêutico pode ser empregado como adsorvente em formas farmacêuticas sólidas; a paligorsquita coloidal é capaz de formar géis e estabilizar emulsões, além de auxiliar no tratamento da diarreia (ROWE; SHESKEY; QUINN, 2009).
A partir da década de 60, observou-se o efeito negativo da interação de filossilicatos sobre a absorção de fármacos, quando coadministrados pela via oral, uma vez que os argilominerais podem ser empregados ora como excipiente, ora como princípio ativo (principalmente para desordens do trato gastrintestinal) em formulações farmacêuticas. Com base nesta informação, vislumbrou-se a possibilidade de encontrar interações benéficas, do ponto de vista tecnológico e biofarmacêutico, destes insumos inorgânicos com moléculas bioativas (AGUZZI et al., 2007a). Nos últimos anos este argilomineral também vem sendo empregado como carreador de fármacos, promovendo estabilidade térmica ou como material de reforço adicionado a matrizes poliméricas (AKYUZ; AKYUZ; AKALIN, 2010; PENG et al., 2013; KONG et al., 2014; CHANG et al., 2016; CARAZO et al., 2017a).
2.2. QUITOSANA
2.2.1. Estrutura e propriedades
Quitina, ou poli-(β-(1→4)-N-acetil-D-glucosamina), é um polissacarídeo natural que compõe o exoesqueleto de crustáceos e insetos e a parede celular de fungos e leveduras, conferindo-lhes resistência mecânica (RINAUDO, 2006). Este polímero é o segundo mais abundante no mundo, após a celulose, sendo principalmente extraído das cascas de caranguejos e camarões (JAYAKUMAR et al., 2010). Apesar da grande disponibilidade da quitina, sua insolubilidade em água restringe o seu uso biológico.
A quitosana (CTS) é o principal derivado de quitina, produzido a partir de sua N-desacetilação parcial em meio alcalino, conforme representação da Figura 6. Este copolímero é formado por unidades de D-glucosamina e N-acetil-D-glucosamina unidas por ligações β-(1→4)-glicosídicas. A proporção das unidades na cadeia é variável, pois a estrutura semicristalina da quitina resulta em uma distribuição heterogênea dos grupos acetila na cadeia de quitosana e, consequentemente, em uma desacetilação não homogênea (RINAUDO, 2006).
Figura 6. Representação esquemática da conversão de quitina em quitosana.
Parâmetros relativos ao método de obtenção adotado, como os reagentes, as suas concentrações, o tempo e a temperatura em que ocorre a reação, influenciam as características do produto obtido, principalmente no que tange ao grau de desacetilação (GD) e à massa molecular (PUVVADA; VANKAYALAPATI; SUKHAVASI, 2012). Estes dois fatores são bastante importantes para a determinação das propriedades do polímero, o qual é comercialmente disponível em uma ampla faixa de especificações.
Quitina com GD superior a 50% torna-se solúvel em solução aquosa ácida, passando a denominar-se quitosana (DOMARD; RINAUDO, 1983). Diferentemente da quitina, a quitosana apresenta solubilidade em meio aquoso, devido aos grupos amina primária e hidroxilas primária e secundária em sua cadeia. Por isso as aplicações biológicas da quitosana são mais extensas, quando comparadas às da quitina (PILLAI; PAUL; SHARMA, 2009). O grupo amina é protonado em meio ácido, favorecendo a solubilidade deste polissacarídeo catiônico em soluções ácidas diluídas com pH menor que seu pKa = 6,3. O GD também influencia a viscosidade da solução de quitosana, a qual torna-se mais viscosa em amostras mais desacetiladas do polímero, devido à conformação estendida e flexível das cadeias altamente protonadas em meio ácido (ERRINGTON et al., 1993).
A massa molar influencia diretamente a viscosidade das soluções de quitosana, a mobilidade das cadeias e a sua solubilidade (BERGER et al., 2004). Ademais, a viscosidade do sistema obtido exerce um papel importante sobre as propriedades biológicas do polímero, como o efeito cicatrizante, a osteogênese e a biodegradabilidade enzimática (DASH et al., 2011). Segundo Xu e Du (2003), cadeias mais extensas permitem uma maior eficiência de encapsulação da proteína albumina (BSA) em nanopartículas de quitosana. Ademais, este parâmetro também influenciou a taxa de liberação da biomolécula, com uma liberação mais lenta nas amostras preparadas a partir de quitosana de maior massa molecular.
A funcionalidade deste biopolímero é observada pela sua gama de aplicações, principalmente na área biomédica (Figura 7). Muitas das suas propriedades o tornam um material interessante para uso em sistemas propostos para o uso biológico, dentre as quais biocompatibilidade, biodegradabilidade, baixa imunogenicidade, promoção de permeabilidade e mucoadesividade (ILLUM, 1998; KUMAR, 2000).
Figura 7. Versatilidade das aplicações biomédicas do polissacarídeo quitosana.
Fonte: Autoria própria.
2.2.2. Aplicações em tecnologia farmacêutica
A quitosana tem sido bastante estudada em formulações farmacêuticas nas últimas décadas, com uma variedade de funções farmacotécnicas (matriz de liberação controlada, aglutinante, molhante, película de revestimento, agente gelificante ou emulsificante) em diferentes sistemas (NUNTHANID et al., 2004; DESAI; PARK, 2005; BHATTARAI; GUNN; ZHANG, 2010; ZHOU, JIE et al., 2010; KLINKESORN, 2013; CHENG, YUNG HSIN et al., 2016; KATSAROV et al., 2017).
Embora a quitosana tenha o uso liberado como suplemento alimentar, diversos países ainda não têm posições concretas sobre o seu emprego como um excipiente farmacêutico, a despeito de um vasto número de sistemas de liberação que vêm sendo desenvolvidos a partir deste polímero a fim de aperfeiçoar aspectos tecnológicos, de estabilidade ou biofarmacêuticos (BALDRICK, 2010). Uma provável justificativa para esta reserva refere-se ao receio de que esse insumo possa acarretar resposta alergênica nos usuários que possuem hipersensibilidade à quitina e/ou seus derivados.
Os sistemas desenvolvidos a partir de quitosana para a liberação de fármacos, vacinas, proteínas e DNA assumem diferentes formas, sendo algumas delas resumidas na Tabela 1.
Tabela 1. Sistemas de liberação baseados em quitosana e seus derivados.
VIA DE
ADMINISTRAÇÃO SISTEMA VANTAGEM REFERÊNCIAS
Oral
Hidrogel
Liberação cólon-retal, com maior mucoadesão e internalização celular
FENG et al. (2015)
Micropartículas /
Microesferas Liberação controlada
HARRIS; LECUMBERRI; HERAS (2010) Nanopartículas / Nanoesferas Aumento da estabilidade, mucoadesão e permeabilidade intestinal Liberação sustentada e vetorizada de quimioterápico MAKHLOF et al. (2011) DHANARAJ et al. (2014) Tópica Hidrogel
Liberação bucal sustentada Liberação ocular sustentada a partir de um hidrogel termossensível e biocompatível
XU et al. (2015) CHENG et al. (2016)
Filme Liberação prolongada e biodisponibilidade superior
KOLAND et al. (2011)
Fibra Biocompatível e biodegradável, para uso em curativos
TUZLAKOGLU et al. (2004)
Esponja Dispositivo para liberação local
de antibióticos NOEL et al. (2010)
Parenteral Hidrogel
Transição sol-gel termossensível para administração subcutânea Liberação prolongada e vetorizada
HAN et al. (2008) REN et al. (2017)
Fonte: Elaborada pela autora com base nos artigos citados.
Apesar de todas as aplicações elencadas, a quitosana torna-se mais versátil pela capacidade de sofrer modificações químicas no grupo amino, de modo a alcançar propriedades e funções biológicas específicas, inclusive ampliar a faixa pH no qual o polímero é solúvel (PILLAI; PAUL; SHARMA, 2009). Um exemplo é a
modificação da cadeia de quitosana através da ligação covalente do grupo funcional catecol, promovendo a reticulação do polímero e aumento da mucoadesão do hidrogel (XU, JINKE et al., 2015). Dado que o meio biológico oferece a condição propícia para pequenas mudanças físicas ou químicas, polímeros responsivos a estímulos são uma plataforma interessante para a liberação de substâncias ativas em razão controlada, de modo estável e eficiente. As principais forças que orientam estas mudanças são a temperatura e o pH.
As maiores vantagens de polímeros termossensíveis devem-se ao fato de dispensar o uso de solventes orgânicos tóxicos; à versatilidade de carrear fármacos hidrofílicos e hidrofóbicos; além de promover a liberação sustentada de fármacos através de implantes em géis formados in situ (JAMES et al., 2014). A adição de glicerol fosfato à quitosana promove uma neutralização do polímero pelos grupos aniônicos do sal, resultando em uma solução neutra a temperatura ambiente. O poliol não exerce apenas efeito reticulante sobre a quitosana, mas também influencia a hidratação das cadeias poliméricas mediante interações hidrofóbicas (CHENITE et al., 2000). Para tanto, demonstrou-se que apenas polímeros com elevado peso molecular (950 kDa) apresentaram solubilidade adequada em pH neutro, com conversão a gel sob temperatura corporal (WANG et al., 2008).
O pH do meio também influencia o comportamento da quitosana, por tratar-se de um polímero catiônico. Ou seja, a presença de grupos -NH2, diretamente
relacionados ao seu grau de desacetilação, determina a hidrofilicidade da cadeia. Pois, em pH neutro ou alcalino os grupos amino estão na forma não ionizada, retendo o fármaco no interior da sua estrutura e, ao atingir um pH inferior ao pKa do polímero, estes grupos serão protonados e a rede polimérica sofrerá repulsão eletrostática, desencadeando a liberação do fármaco (KAROLEWICZ, 2015).
O caráter catiônico da quitosana também exerce influência sobre a membrana biológica, pois ao neutralizar resíduos negativos na superfície celular, provoca a sua deformação e promove a permeação de substâncias através da mucosa intestinal (KAROLEWICZ, 2015). Além da permeabilidade, a fixação à mucosa está principalmente relacionada às interações eletrostáticas entre o ácido siálico da glicoproteína mucina e os resíduos amino protonados da cadeia do polímero, ou seja, também são moduladas pelo grau de desacetilação da quitosana (SOGIAS; WILLIAMS; KHUTORYANSKIY, 2008). Outro fator que determina a mucoadesão do polímero refere-se ao seu peso molecular, o qual deve ser reduzido para evitar o
impedimento estérico e facilitar o acesso à mucosa (KRISANTI; ARYANI; MULIA, 2017).
2.3. COMPÓSITOS BASEADOS EM ARGILOMINERAIS E BIOPOLÍMEROS
2.3.1. Conceito e benefícios
Polímeros e argilas são bastante explorados individualmente, e por vezes não alcançam todos os requisitos para a aplicação desejada. Assim, de modo a suprir as lacunas de cada componente, é cada vez mais comum o preparo de compósitos. Por definição, compósitos são materiais resultantes da junção de dois ou mais componentes, visando a melhoria de propriedades apresentadas individualmente pelos componentes (GAO, 2004). Outros termos vêm sendo adotados para cada situação específica, isto é, quando o compósito é constituído de pelo menos um material em escala nanométrica, ele é considerado um nanocompósito; ou é dito biocompósito aquele que é produzido a partir de insumos de origem natural.
Polímeros são insumos reconhecidamente versáteis empregados na área farmacêutica, uma vez que proporcionam capacidade de intumescimento e de formação de filmes, são bioadesivos e aumentam a internalização celular. No entanto apresentam algumas propriedades que podem ser otimizadas através da obtenção de compósitos, como a resistência mecânica, a capacidade de intumescimento, a estabilidade química e térmica, além do comportamento reológico (HERNÁNDEZ-HERNÁNDEZ et al., 2016).
Frequentemente, filossilicatos têm sido empregados como material de reforço para matrizes poliméricas, compondo uma fase dispersa homogeneamente distribuída na fase contínua, capaz de melhorar as características mecânicas e reológicas dos polímeros (ALCÂNTARA et al., 2014; BERTOLINO et al., 2017). Além do aspecto dimensional, outras características que atraem a atenção para o uso destas nanopartículas inorgânicas referem-se à sua elevada superfície específica, alta capacidade adsortiva, hidrofilicidade, mucoadesividade e biocompatibilidade (VISERAS et al., 2008).
Os compósitos podem apresentar distintos tipos de organização entre os seus constituintes, os quais estão brevemente representados na Figura 8. Os compósitos
cuja fase inorgânica não é capaz de interagir com polímero através da inserção das cadeias entre suas unidades estruturais são denominados microcompósitos. Porém, se o filossilicato tem suas lamelas intercaladas pelas cadeias poliméricas, o compósito é denominado intercalado. E, caso haja a delaminação da argila, com máxima interação na interface orgânica-inorgânica, produziu-se um compósito esfoliado. Vale ressaltar que os dois últimos tipos são considerados nanocompósitos, devido à elevada superfície específica alcançada com a dispersão do filossilicato. Ademais é comum a coexistência dos nanocompósitos intercalados e esfoliados em um mesmo sistema (KOTAL; BHOWMICK, 2015).
Figura 8. Tipos de compósitos baseados em polímero e argila.
Fonte: Autoria própria.
2.3.2. Métodos de obtenção
As interações que ocorrem na interface orgânica-inorgânica têm um papel crucial para obtenção de carreadores com propriedades funcionais. Neste sentido, a carga, a extensão e a afinidade das cadeias poliméricas, além dos tipos de interações envolvidas na adsorção do polímero à superfície do silicato influenciam a escolha do processo de obtenção. Uma variedade de métodos pode ser empregada para a obtenção de sistemas baseados em argila e polímero, e a escolha será determinada pelas características dos insumos de partida e da aplicação desejada.
Existem basicamente três métodos principais para o preparo destes compósitos: intercalação em solução/adsorção; intercalação por fusão; e polimerização in situ.
Nos casos em que o polímero e o argilomineral são hidrofílicos, o compósito pode ser obtido por uma simples dispersão do filossilicato na solução polimérica. Durante o preparo de nanopartículas inorgânicas, o sistema alcança um grau aumentado de entropia no qual as cadeias das macromoléculas estarão inseridas entre as unidades do argilomineral, deslocando moléculas de água previamente adsorvidas (THENG, 1982). Ademais, a simplicidade do método justifica o seu uso na maioria dos casos. Iliescu et al. (2014) prepararam esferas de irinotecano através da dispersão do híbrido fármaco-montmorilonita em solução aquosa de alginato, seguida de gelificação ionotrópica. Este nanocompósito demonstrou um efeito sinérgico do biopolímero e da esmectita em controlar a liberação do citostático, com redução do efeito burst inicial.
A polimerização in situ compreende uma vertente do método anterior, cujo destaque está relacionado à maior capacidade de gerar nanocompósitos uniformemente dispersos. Esta característica é justificada pela viscosidade reduzida da solução monomérica, reduzindo assim a formação de agregados (TASDELEN; KREUTZER; YAGCI, 2010). As unidades poliméricas são adsorvidas na superfície do silicato na presença catalizadores/iniciadores e, posteriormente, a reação de polimerização é iniciada por um estímulo externo, seja ele térmico, químico ou por radiação. KONG e colaboradores (2014) modificaram a superfície de paligorsquita por eletropolimerização in situ do monômero pirrol. O nanocompósito obtido apresentou liberação responsiva a estímulo elétrico e maior capacidade de ligação do fármaco ácido acetilsalicílico, benefícios estes atribuídos à fase orgânica e inorgânica, respectivamente.
Outra maneira de obter nanocompósitos predominantemente esfoliados consiste na mistura direta do polímero no estado fundido com a argila, empregando força de cisalhamento de equipamentos industriais, como misturadores e extrusoras (HERNÁNDEZ-HERNÁNDEZ et al., 2016). Este método é denominado intercalação por fusão, seu principal benefício refere-se à ausência de solventes orgânicos no preparo do híbrido e é considerado mais adequado para o preparo de nanocompósitos a partir de polímeros apolares termoplásticos e argilas organofilizadas (DI et al., 2003; LAI et al., 2014). Após o resfriamento, a cadeia polimérica estará confinada entre as lamelas e canais dos filossilicatos.
Ao preparar compósitos mediante fusão da fase polimérica é necessário considerar o risco de formação de microcompósitos, pela aglomeração dos silicatos, e verificar a estabilidade térmica do fármaco na faixa de fusão do polímero. Campbell e colaboradores (2010) prepararam um nanocompósito de poli(Ɛ-caprolactona) e diferentes argilas organofilizadas, processando as amostras por fusão. A caracterização do material evidenciou uma morfologia intercalada e esfoliada, com aumento da temperatura de transição vítrea da poli(Ɛ-caprolactona) após a adição do material de reforço, além de promover uma liberação mais retardada do fármaco modelo em relação ao carreador polimérico.
2.3.3. Sistemas híbridos carreadores de fármacos
A crescente aplicação da nanotecnologia em sistemas de liberação de fármacos alavancou a pesquisa por novos materiais nos últimos anos, os quais vêm sendo desenvolvidos para atender necessidades cada vez mais específicas em um mercado extremamente competitivo e dinâmico. Desta lacuna surgem os sistemas híbridos, capazes de contornar limitações específicas que os excipientes convencionais não puderam solucionar. Relatos da literatura demonstram diversos exemplos de híbridos fármaco-argila e fármaco-argila-polímero que levaram à liberação controlada, ao mascaramento do sabor e odor desagradáveis de fármacos, melhorando a estabilidade, ou ainda funcionaram como sistemas responsivos a estímulos, direcionando a liberação do fármaco ao sítio alvo e minimizando os seus efeitos tóxicos (YANG et al., 2016a).
Filmes baseados em quitosana e laponita, uma argila sintética, foram desenvolvidos para promover a liberação controlada do antibiótico vancomicina a partir de implantes de titânio, com finalidade profilática (ORDIKHANI; DEHGHANI; SIMCHI, 2015). O filme híbrido promoveu uma maior retenção do fármaco, com a liberação sustentada por um tempo superior ao filme de quitosana isoladamente. Este resultado pode ser explicado pela interação eletrostática entre o polímero e o filossilicato, formando uma cadeia densa com uma razão de intumescimento controlada, restringindo a liberação de vancomicina.
Lal e Datta (2015) avaliaram a capacidade de retenção do anti-hipertensivo atenolol em um nanocompósito preparado a partir de montmorilonita-PLGA, visando
