Revisão do gênero Lycoperdon Pers. (Lycoperdaceae, Agaricales) mediante análises morfológicas e moleculares

Texto

(1)UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE BIOCIÊNCIAS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM SISTEMÁTICA E EVOLUÇÃO. REVISÃO DO GÊNERO LYCOPERDON PERS. (LYCOPERDACEAE, AGARICALES) MEDIANTE ANÁLISES MORFOLÓGICAS E MOLECULARES. DÔNIS DA SILVA ALFREDO. ________________________________________________. Tese de Doutorado Natal/RN, março de 2017.

(2) DÔNIS DA SILVA ALFREDO. REVISÃO DO GÊNERO LYCOPERDON PERS. (LYCOPERDACEAE, AGARICALES) MEDIANTE ANÁLISES MORFOLÓGICAS E MOLECULARES. Tese de doutorado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Sistemática e Evolução da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, em cumprimento às exigências para a obtenção do título de Doutor em Sistemática e Evolução Área de concentração: taxonomia e sistemática Orientador: Dr. Iuri Goulart Baseia Coorientadora: Dra. María Paz Martín Coorientador: Dr. Paulo Marinho. NATAL – RN 2017 0.

(3) Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN Sistema de Bibliotecas - SISBI Catalogação de Publicação na Fonte. UFRN - Biblioteca Setorial Prof. Leopoldo Nelson - -Centro de Biociências - CB. Alfredo, Dônis da Silva. Revisão do gênero Lycoperdon Pers. (Lycoperdaceae, Agaricales) mediante análises morfológicas e moleculares / Dônis da Silva Alfredo. - Natal, 2017. 298 f.: il. Tese (Doutorado) - Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Centro de Biociências. Programa de Pós-Graduação em Sistemática e Evolução. Orientador: Dr. Iuri Goulart Baseia. Coorientadora: Dra. María Paz Martín. Coorientador: Dr. Paulo Marinho.. 1. Basidiomycota - Tese. 2. Fungos gasteroides - Tese. 3. ITS barcode - Tese. 4. Puffballs - Tese. 5. Taxonomia - Tese. I. Baseia, Iuri Goulart. II. Martín, María Paz. III. Marinho, Paulo. IV. Universidade Federal do Rio Grande do Norte. V. Título. RN/UF/BSE-CB. CDU 582.284.

(4) DÔNIS DA SILVA ALFREDO. REVISÃO DO GÊNERO LYCOPERDON PERS. (LYCOPERDACEAE, AGARICALES) MEDIANTE ANÁLISES MORFOLÓGICAS E MOLECULARES. Tese de doutorado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Sistemática e Evolução da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, em cumprimento às exigências para a obtenção do título de Doutor em Sistemática e Evolução. Aprovado em: 30 de março de 2017. Comissão examinadora. Dr. Luiz Fernando Pascholati Gusmão, UEFS Examinador Externo à instituição. Dra. Tiara Sousa Cabral, INPA Examinadora Externa à Instituição. Dr. Bruno Cavalvanti Bellini, UFRN Examinador Interno. Dra. Raquel Cordeiro Theodoro, UFRN Examinadora Interna. Dr. Iuri Goulart Baseia, UFRN Presidente 2.

(5) Dedico aos meus pais José Benedito Alfredo e Isabel S. Alfredo por sempre acreditarem e me incentivarem a chegar até aqui. 3.

(6) AGRADECIMENTOS Primeiramente gostaria de agradecer à Universidade Federal do Rio Grande do Norte por oferecer o curso de doutorado no Programa de Pósgraduação em Sistemática e Evolução. Também, devo agradecimentos à Coordenação de Aperfeiçoamente de Pessoa de Nível Superior / CAPES, por proporcionar o apoio financeio de bolsa de estudo no Brasil e estágio. sanduíche na Espanha (Programa Ciéncias Sem Fronteiras), que. viabilizou diversos resultados e parcerias; ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Técnológico / CNPq, pelo suporte financeiro do Projeto Pesquisador Visitante Especial (PVE-MEC/MCTI/CNPq/FAPs nº71/2013), sem o qual as análises moleculares e o intercambio com o/a pesquisador(a) do exterior seria muito difícil de se realizar; também agradecer ao Programa de Pesquisa em Biodiversidade do Semiárido (PPBio/Semiárido) por ter custeado parte das análises em microscópio eletrônico de varredura. Acima de tudo, não conseguiria encontrar palavras para agradecer ao meu orientador Prof. Dr. Iuri G. Baseia. Pois, desde que nossa parceria se formou a confiança mútua foi aumentando e o respeito por este excelente pesquisador tomou grandes proporções. Professor Iuri, sempre esteve disposto a ajudar, escutar e guiar em todas a situações; como um pai sempre se preocupou não somente com a situação acadêmica de seus alunos, mas também com a vida pessoal. Tenho uma profunda gratidão a esse parceiro profissional e amigo. Se hoje eu alcancei uma situação profissional melhor foi porque seis anos atrás ele meu deu um voto de confiança, e desde então, tenho me esforçado todos os dias para corresponder a confiança dada por ele. Professor muitíssimo obrigado! Claro, não poderia me esquecer de sua adorável esposa Tereza Cristina O. Galvão, pelos momentos alegres e descontraídos em nossas confraternizações. À ambos, que são meus padrinhos de casamento, Obrigado! Também quero deixar meu profundo agradecimento a minha coorientadora no exterior Dra. Maria P. Martín, que foi fundamental para o sucesso dos estudos moleculares além das preciosas orientações na construção da tese. Profa. MariPaz, saiba que desejo tudo de bom a ti e muito sucesso em sua vida profissional e pessoal. Saiba que tenho por ti um profundo respeito e carinho. Agradeço pelos momentos vividos na Espanha, e por ter acolhido a mim e minha esposa como membros de sua família. Aprendi muito contigo durantes esses anos, ensinamentos que jamais irei me esquecer. Tu és uma 4.

(7) profissional de excelência, uma verdadeira amiga que irei levar no fundo de meu coração. Agradeço também, a Paco, Analí e Eva, todos vocês fizeram a distância e as saudades do Brasil e de nossos familiares ficarem menos perceptíveis. Tenho vocês como parte da família. Ao meu coorientador Prof. Dr. Paulo Marinho, que me confiou o acesso ao seu laboratório de biologia molecular, também por me aceitar como aluno no estágio a docência, meus eternos agradecimentos, foi ótima nossa parceria na ciência e seus ótimos conselhos. Aos Professores Doutores Bruno C. Bellini, Raquel C. Theodoro, Tiara Cabral e Luis Fernando P. Gusmão, fico muito agradecido por aceitarem a participarem da banca avaliadora; aos Professores Doutores Bruno T. Goto e a Vagner G. Cortez, obrigado por se disporem a participarem como suplentes da banca avaliadora. De maneira muito especial, sou eternamente grato aos meus pais José Benedito Alfredo e Isabel da Silva Alfredo, que sempre me incentivaram a continuar meus estudos; por se preocuparem todos os dias pela distância que o desafio de estudar nos impôs; principalmente por terem me ensinado a trabalhar sempre com honestidade e sempre preserverar nos momentos difíceis. Do fundo do meu coração, muito obrigado! Amo vocês! Aproveito para deixar meus agradecimentos aos meus irmãos, pela preocupação e pelo carinho que sempre tivemos um pelo outro. Aos colegas do Laboratório de Biologia de Fungos pela companhia e preciosos momentos de convivência, e em especial a Rafaela Gurgel e Cinta Samara, pelo trabalho em enquipe e aprendizado mútuo. Também, agredeço a T. Accioly por ter cedido gentilmente os espécimes de L. exoelongatum. Aos curadores dos herbários BAFC, CORDC, FH/HUH, LG, VDEMOULIN, MA-Fungi, MCF-Fungi, NY, K. ICN, PACA, UFRN-Fungos, pelos empréstimos das exsicatas. Em especial as pesquisadoras Dra. Laura Domínguez, Dra. María Luciana Hernández-Caffot e Dra. Silvana Longo por me acolherem estupendamente em minha visita ao herbário IMBIV-Museo Botánico (CORD) de Buenos Aires/Argentina.. 5.

(8) Ao pesquisador Dr. Francisco de Diego Calonge (Paco), que durante meu doutorado sanduíche no Real Jardím Botánico, Marid/Espanha, me proporcionou ótimos momentos de trocas de experiência, ensinamentos e boas conversas. Da mesma forma, a todos do Real Jardín Botánico, em especial: M. Dueñas, M. Tereza Tellería, Ricarda Riina, Vlademir Sandoval, Javier Fernández-Lopez, Kina Gracia, Irene Villa Machio, Emilio Cabeza, Yolanda León e Yurena Arjona, muito obrigado por proporcionarem uma maravilhosa companhia durante os nove meses que convivemos. Um especial agradecimento à Fátima Duran, por to paciência e disposição em ajudar me nas atividades do laboratório. Do mesmo modo, deixo meus agradecimentos às pesquisadoras do Iran, Dr. Farideh Moharrek and Tahmineh Shagholi, pelos momentos felizes e divertidos que passamos na Espanha. Também as pesquisadoras Dra. Laura Martinez-Suz e a curadora assistente Dra. Begoña Aguirre-Hudson, que me deram um especial suporte durante minha rápida visita ao herbário do Kew Botanical Gardens. Bem como, a pesquisadora da Macedonia, Dr. Katerina Rusevska, pelo trabalho em equipe realizado, e pela ótima companhia durante as extrações de DNA e alinhamentos das sequências. Deixo também meus sinceros agradecimentos à Dra. Marian Glenn (Seton Hall University, USA), que exaustivamente realizou as correções da versão em inglês de todos os capítulos da presente tese, um muito obrigado pelo seu tempo e dispocição! Agradeço aos meus sogros Joaci Lavor e Onelia Lavor pelo apoio durante esses anos, vocês são exemplos a serem seguidos. Deixo meu agradecimento em especial a minha amada esposa e compamnheira de pesquisa Pâmela Lavor, que esteve comingo em todos os momentos, nas alegrias e nas frustações que às vezes a pesquisa nos proporciona. Também por ser essa maravilhosa pessoa que sempre sabe como me erguer diante das minhas dificuldades não só na pesquisa quanto na vida pessoal. Muito obrigado! Amo você! Obrigado Deus, por me dar forças para sempre continuar diante das intempéries da vida.. 6.

(9) Trabalhe duro e em silêncio. Deixe que seu sucesso faça barulho. (Dale Carnegie).. 7.

(10) RESUMO Em uma estimativa sobre a biodiversidade da terra acredita-se haver entorno de 50 milhões de espécies e para os fungos acredita-se que essa estimativa gira em torno de 5,1 milhões de espécies, o que levaria cerca de 1000 anos para os taxonomistas identificassem todas essas espécies. Os taxonomistas têm empregado muito esforço para identificar essas espécies de fungos, incluindo o gênero representante dos chamados “puffballs” Lycoperdon Pers. Durante um longo período, a taxonomia do gênero Lycoperdon se baseou fundamentalmente em caracteres morfológicos, e muitos conceitos adotados para nomear espécies tem se mostrado divergentes entre os taxonomistas. Até o final da década de 80, diversos trabalhos de taxonomia morfológica foram publicados e ajudaram a ampliar o conhecimento sobre a diversidade de espécies de Lycoperdon em quase todos os continentes, no entanto, em muitos casos a morfologia não é suficiente para segregar espécies crípticas, ou esclarecer problemas de divergência quanto a sinonimização de táxons. No início da década de 90 houve uma revolução na taxonomia de fungos com o uso de ferramentas moleculares na classificação de espécies, relacões filogenéticas e identificação novos táxons. Representantes do gênero Lycoperdon foram estudados por meio dessa nova ferramenta somente no início do século 21, e logo em seguida em 2008, com os trabalhos de Larsoon e Jeppson, sendo que alguns gêneros como Morganella e Vascellum foram reconhecidos como subgêneros de Lycoperdon. Durante esse período outra ferramenta passou a ganhar espaço na identificação de espécies por meio de um código de barras molecular, e essa ferramenta passou a ser usada na identificação de animais, plantas e fungos, usando dentre outra, a região espaçadora transcrita interna (ITS), embora, até o presente momento, nenhum trabalho de DNA “barcoding” havia sido realizado com as espécies do gênero Lycoperdon. O presente trabalho teve o objetivo de revisar as espécies do gênero Lycoperdon para América do Sul, identificando-as com base nos caracteres morfológicos e no uso da região ITS como DNA “barconding” de fungos e, posteriormente, adicionando a região da subunidade maior (LSU) do nrDNA para avaliar se ao adicionar as espécies sul-americanas, Morganella seguiria como subgênero de Lycoperdon. Para isso, foram realizados empréstimos de herbários nacionais e internacionais; usando literatura especializada na taxonomia do gênero Lycoperdon e com ajuda de renomados especialistas do grupo, as espécies de Lycoperdon foram identificadas. Posteriormente, foi extraído o DNA de pequenas porções internas do basidiomas; logo em seguida o produto extraído foi amplificado e sequenciado; as 8.

(11) sequências foram editadas e submetidas à busca por similaridade no GenBank utilizando o programa BLAST para checar se as sequências se assemelhavam as regiões comparadas; uma vez realizado esse processo as sequências foram corridas em análises de Máxima Parcimônia e distância (K2P) utilizando o programa PAUP; a árvore de distância se obteve por Neighbor-Joining. Além disso, foi realizada a análise Bayesiana no programa MrBayes; as árvores geradas foram visualizadas no FigTree e editadas no programa InkScap. Com base somente no ITS como DNA barcoding do gênero Lycoperdon, obteve-se os seguintes resultados: 65% das amostras obtiveram sucesso de amplificação; foram identificadas 19 espécies, excluindo aquelas que estavam sob Morganella, para América do Sul e Central; quatro táxons são primeiros registros para o continente sul-americacano: Lycoperdon calvescens, L. endotephrum, L. ericaeum e L. eximium; e foi erguido um novo subgênero: Lycoperdon subg. Arenicola. Com base nas análises de morfológia e DNA barcoding foi possível identificar 43 espécies do gênero Lycoperdon, sendo que destas, 30 espécies são reportadas para América do Sul e Central; poucas espécies se encontram nos dois hemisférios (aprox. 30 %). Com estes resultados, concluímos que ITS como DNA “barcoding” de Lycoperdon é promissor, embora alguns grupos necessitem incluir mais espécimes e marcadores. A taxonomia morfológica continua sendo crucial na interpretação de dados geradas pela taxonomia molecular. Palavras-chave:. Basidiomycota,. fungos. gasteroides,. ITS. barcode,. puffballs,. Taxonomia.. 9.

(12) ABSTRACT Earth’s biodiversity is estimated to include about 50 million species. For Fungi this estimate is around of 5.1 million species, and to identify them all, it is believed would take the taxonomists about 1000 yrs. The taxonomists have been making the effort to identify these fungal species, including the puffballs genus, Lycoperdon Pers. Traditionally, the taxonomy of Lycoperdon has been based only on morphological characters, and individual taxonomists have adopted their own distinct concepts to separate the species. Through the end of 1980`s many projects based on morphological taxonomy were published to describe the diversity of species of Lycoperdon encompassing almost all continents, to separate cryptic species, and to solve problems of divergence by synonymizing of taxons. In the beginning of the 90`s there was a revolution in the taxonomy of fungi with the introduction of molecular tools in species classification, as well to infer phylogenetic relationships and to identify new taxa. Lycoperdon taxonomy was hit by these new tools in the beginning of the 21th century; with the 2008 Larsson and Jeppson work, some genera, such as Morganella and Vascellum were recognized as being subgenera of Lycoperdon. During this period, identifying species by a molecular bar coding gained acceptance, opening the era of DNA barcoding to identify animals and plants, and for fungi, using the internal transcribed spaced region (ITS) to distinguish among species. The work described here is the first to focuss on extensive DNA barcoding to classify the species in the Lycoperdon genus. The present work aims to review the species of Lycoperdon from South America, based on morphological features and on the use of ITS as barcode. Also, using the large subunit (LSU) of nrDNA, to check wether the South American species, Morganella could be a subgenus of Lycoperdon. For this work, loans were made from nationals and international herbaria; the specialized literature in the taxonomy of Lycoperdon was studied, and renowned experts of Lycoperdon were consulted. Afterward the DNA was extracted from little portions of the inside of basidiomata; next the product extracted was amplified and sequenced. The sequences were edited and submitted to the search by similarity on the GenBank website using the BLAST software to check whether the sequences matched homologous sequences or were contaminants. Sequences were aligned with the aid of free software for download, such as Geneious Pro v4.8.5. After the editing of the sequences, analyses of maximum parsimony and distance (K2P) were carried out with the PAUP software; the distance tree was constructed by Neighbor-Joining. Also, a Bayesian analysis was 10.

(13) done using MrBayes software. The generated trees were viewed with FigTree software and edited on InkScap software. Based on ITS as barcoding of Lycoperdon genus, the following results were obtained: 65% of the samples were successfully amplified; 19 species, excluding those under Morganella, were identified from Central and South America; four are first records to South American continent: Lycoperdon calvescens, L. endotephrum, L. ericaeum and L. eximium. Adding the LSU region, Morganella is confirmed as a subgenus of Lycoperdon; L. demoulinii is a new species for science; and a new subgenus, Arenicola, emerged. Based on morphological analyses and DNA barcoding, it was possible to identify 43 species of Lycoperdon genus around the world; 30 species from Central and South America; few species are distributed in both Hemisphere (around 30%). Finally, we concluded that the ITS is promising as DNA barcode of Lycoperdon; however, some groups need to include more specimens and markers. Morphological data are crucial for interpretation of the data generated by molecular methods of taxonomy. Key-words: Basidiomycota, ITS barcode, gasteroid fungi, puffballs, Taxonomy. 11.

(14) LISTA DE FIGURAS Figura 1. Tipos de formas dos basidiomas em Lycoperdon e Morganella. a. L. mammiforme basidioma piriforme (K s/n coletado por M.C. Cook 1885); b. L. pulcherrimum basidioma subgloboso (K 3933 – holotipo !); c. M. compacta, basidiomas depresso globosos (PDD10140 holotipo!); d. M. fuliginea basidioma globoso (UFRNFungos 1768); e. L. utriforme, basidioma depresso globose a obovoide (K200231); f. L. pratense, basidiomas subglobose a turbinado (VDEMOULIN 7412). Barras = 10 mm.37 Figura 2. Tipos de subgleba em espécies de Lycoperdon. a. Subgleba reduzida e com células compactas, L. fuligineum (UFRN-Fungo 1768); b. Subgleba bem desenvolvida, celular e com diafragma L. marginatum (CORD756); c-d, f. Subgleba desenvolvida e celular: (c) L. perlatum (MA-Fungi 29372), (d) L. pratense (K200229), (f) L. utriforme (K200230) em basidioma parcialmente imaturo; e. subgleba bem desenvolvida e lanosa, (e) L. pyriforme (MA-Fungi 16908). Barras = 10 mm. ................................................... 37 Figura 3 Tipos de ornamentação do exoperídio e superfície do endoperídio. a, d. Espinhos com as pontas alongadas, delgadas e curvadas; b, e, f. Verrugoso; c. Espinhos piramidais; a-c, e-f. Superfície do endoperídio liso; d. Superfície do endoperídio areolada. Todas as ornamentações apresentadas são caducas com o tempo. Barras = 2 mm. ....................... 40 Figura 4 Tipos de esferocistos e células alongadas do exoperídio apical; micoesclereídeos e hifas infladas do endoperídio apical. a. Células alongadas e dextrinoide de L. atrum; b. Esferocistos em cadeias de L. perlatum; c. Esferocistos com formas irregulares de L. pyriforme; d, f. Micoesclereídeos com formas irregulares de L. marginatum e Lycoperdon sp.; e. Hifas com terminações de L. umbrinum. a, c, e. Barras = 20 µm; b. Barra = 100 µm; d, f. Barras = 10 µm. ................................................................................................ 41 Figura 5 Exemplos de basidiosporos quanto a forma e classificação da ornamentação espécies de Lycoperdon. a. basidiosporos lisos [A], L. pyriforme (NY0071979); b-d. Levemente verrugoso [B], L. marginatum (NY00398533), L. eximium (NY0071978), L. umbrinum (MA-Fungi 63394); e-f. Verrugoso [C], L atrum (UFRN-Fungos 832), L. perlatum (NY00793106); g-i. Fortemente verrugoso [D], M. nuda (UFRN-Fungos 1766), M. velutina (NY00839022), L. decipiens (MAF27674); f, g. Basidioporos com o número de ornamentações contadas e diâmetro medido para o cálculo de densidade de ornamentação. Barras = 10 µm........................................................................................ 42 Figura 6 Exemplos de basidiosporos com as classificações de A-D em microscopia eletrônica de varredura (MEV). a, b. Punctados [A], L. pyriforme e L. compactun (= M. 12.

(15) compacta); c, d. Levemente verrucosos [B], L. arenicola (= M. arenicola), L. marginatum; e, f. Verrucoso [C], L. perlatum, L. atrum; g-i. Fortemente verrucoso [D], L. fuligineum (= M. fuliginea), L. atropurpureum e L. mauryanum. Barras = 1 µm. .....43 Figura 7. Materiais e equipamentos usados durante a extração e amplificação do DNA. a. Colunas (lilás e brancas) do kit de extração; b. Tubos eppendorfs contendo em seu interior uma esfera desidratada com todos os reativos para a amplificação por PCR; c. Termociclador; d. Transluminador acoplado com câmera fotográfica para a visualização e confecção de fotografias dos géis em agarose; e-f. Fotografias dos géis em agarose; e. Gel sem as bandas de amplificação da PCR; f. Gel contendo as bandas dos produtos amplificados da PCR. ......................................................................................................52 Figura 8. Esquema do nrDNA no qual se pode observar as regiões dos marcadores e a posição dos iniciadores. Baseado em http://sites.biology.duke.edu/fungi/mycolab/. .....53 Figure 9. Formação das sequências consensos e busca no megablast para verificar se há contaminação das mesmas. a. Visualização das sequências direto e reverso e formação da sequencias consenso; b-g. Submissão da sequencias consenso no megablast disponível na web site NCBI. ................................................................................................................54 Figura 10. Número de amostras analisadas, e porcentagem de falha e sucesso de amplificação da região ITS. ............................................................................................. 58 Figure 11 Agarose gel to verify the PCR products. a. Amplification of ITS5 – ITS4 region: eleven positive PCR products; the eighth sample failed; b. Amplification of ITS3 – ITS4b region: all samples have been successful; c. Amplification of ITS5 – ITS4 have been unsuccessful in all samples; d. Amplification of ITS3 – ITS4b have been unsuccessful in all samples and the control sample is contaminated. M - is the run marker, and N - is the control sample. ................................................................................................................89 Figure 12 Example of search in the UNITE database. a. Set up of run analysis where the query sequences from the user are pasted and blasted; b. Results including the list of homolog sequences to; c. UNITE sequences linked to the SHs with threshold of at least 3% similarity; d. Selected SHs sequence with threshold of 1.5%, name and number access, and statistics on distribution distance. .................................................................91 Figure 13 Neighbor-Joining tree using Kimura 2 Parameter based on sequences of ITS sequences of Lycoperdon species. The support values obtained from parsimony (bs) and Bayesian (pp) analyses are on the branches. ...................................................................93 Figure 14 PCI for each sample from each Lycoperdon species of dataset non-GenBank plus GenBank samples. .................................................................................................100 13.

(16) Figure 15 Average intraspecific and interspecific genetic variability for conspecifics and congeneric of all sequences of dataset excluding Bovista and Morganella. ................. 100 Figure 16 Percent identity of sequences compared with UNITE Species Hypothesis (SHs). ............................................................................................................................. 101 Figure 17 Dry basidiomata of Lycoperdon species. a. Lycoperdon altimontanum (MAFungi 63392); b. L. atropurpureum (MA-Fungi 63389); c. L. decipiens (MA-Fungi 27674); d. L. echinatum (MA-Fungi 39586); e. L. ericaeum (MA-Fungi 63393); f. L. excipuliforme (MC-Fungi 06:6224); g. L. lividum (MA-Fungi 68348); h. L. mammiforme (MA-Fungi 31251); i. L. marginatum (MA-Fungi 31232); all bars = 10 mm. .............108 Figure 18 Dry basidiomata of Lycoperdon species. a. Lycoperdon molle (MA-Fungi 31259); b. L. nigrescens (MA-Fungi 22012); c. L. niveum (MA-Fungi 21618); d. L. perlatum (MA-Fungi 64953); e. L. pratense (MC-Fungi 08: 10114); f. L. pyriforme (MAFungi 16908); g. L. subumbrinum (MA-Fungi 63391); h. L. umbrinoides (MA-Fungi 53530); i. L. umbrinum MA-Fungi 63394 – unsuccessful amplification); all bars = 10 mm. ................................................................................................................................ 116 Figure 19 Scanning microscope electronic of some Lycoperdon species. a. Lycoperdon atropurpureum (MA-Fungi 63389); b. L. ericaeum (MA-Fungi 63393); c. L. lividum (MA-Fungi 74402 – unsuccessful amplification); d. L. mammiforme (MA-Fungi 24103); e. L. marginatum (MA-Fungi 31252); f. L. nigrescens (MA-Fungi 63396 – unsuccessful amplification); g. L. perlatum (MA-Fungi 64953); h. L. subumbrinum (MA-Fungi 63391); i. L. umbrinum (MA-Fungi 73600 – unsuccessful amplification); all bars = 5 µm. .......................................................................................................................................117 Figure 20 Neighbord-Joining tree obtained after calculating the K2P distance of the ITS sequences included in Table 1. Names and vouchers numbers as mentioned in the text and tables. New sequences in bold. Colours to indicate the geographic origin of the specimens and sequences. Yellow, mainly specimens from Central and South America (it can be some specimens from other part from the Southern Hemisphere); Orange, specimens from the Southern Hemisphere, not Central or South America; Red, specimens from both Hemispheres; Blue, only specimens from the Northern Hemisphere...........160 Figure 21 Dry basidiomata of Lycoperdon species. a. L. atrum (UFRN-Fungos 832); b. L. calvescens (CORD 997); c. L. curtisii (VDEMOULIN 4073); d. L. endotephrum (K (M): 200182); e. L. eximium (NY0071978); f. L. hyalinum (DSA 178, UFRN-Fungos 2829); g. L. lividum (NY 0071655); h. L. marginatum (CORD 72); i. L. mauryanum (LG 1570). Bars = 10 mm. ....................................................................................................175 14.

(17) Figure 22 Scaning electronic microscopy of basidisporoes. a. L. atrum (UFRN-Fungos 832; b. L. marginatum (CORD 573); c. L. mauryanum (VD 1570); d. L. nigrescens (PACA 13783); e. L. ovoidisporum (UFRN-Fungos 967); f. L. perlatum (UFRN-Fungos 811); g. L. pratense (ICN 154485); h. L. pyriforme (NY 0071971); i. Lycoperdon sp. 5 (UFRN-Fungos 152). .....................................................................................................186 Figure 23. Dry basidiomata of Lycoperdon species. a. L. nigrescens (NY0071657); b. L. ovoidisporum (13771); c. L. perlatum (VDEMOULIN ex ENCB 1533); d. L. pratense (K(M): 200187); e. L. pyriforme (UFRN-Fungos 2271); f. L. umbrinum (VDEMOULIN 4784); g. L. utriforme (K (M): 2002300); h. Lycoperdon sp. 1 (CORD 167); i. Lycoperdon sp. 4 (UFRN-Fungos 495). Bars = 10 mm. ...................................................................194 Figure 24 Comparative between the species of Lycoperdon sp. 5, L. endotephrum and L. pratense. a-c. Lycoperdon sp. 5 (UFRN-Fungos 152); d-f. L. endotephrum (UFRNFungos 164); g-i. L. pratense (Basidioma – VDEMOULIN ex AGUCH-ET8; spore – ICN 154485); a, d, g. Dry basidiomata; b, e, h. Sphaerocysts; c, f, i. Basidiospores in scanning eletronic microscopy (SEM). Bars a, g = 10 mm; d = 5 mm; b, e, h = 20 µm; c, f, i = 1 µm. .................................................................................................................................195 Figure 25 Phylogenetic tree obtained from parsimony analysis of ITS and LSU combined alignment. Clades and subclades as described in the text. Numbers above branches are parsimony bootstrap (bs) and posterior probability (pp) values. Bovista, Calvatia, Disciseda, Mycenastrum and Tulostoma as outgroups. Vouchers numbers are indicated as in Table 1 and 2. ........................................................................................................234 Figure 26 Lycoperdon albostipitatum (Holotype INPA 239563). a. Dry specimen. b. Detail of apical pore. c. Detail of exoperidium ornamentation. d. Elongated dextrinoid hyphae from exoperidium ornamentation. e. Basidiospores strongly verrucose [D] in LM. f. Scanning electron microscopy of basidiospores. Bars (a) 10 mm; (b) 1 mm; (c) 0.2 mm; (d) 50 µm; (e) 5 µm; (f) 2 µm........................................................................................ 238 Figure 27 Lycoperdon arenicola (Holotype UFRN-Fungos 1006). a. Basidiomata in situ. b. Dry specimen in cross section. c. Sphaerocysts from exoperidium ornamentation. d. Detail of capillitium and paracapillitium mixed. e. Basidiospores punctate [A] in LM. f. Scanning electron microscopy of basidiospores. Bars (a–b) 10 mm; (c) 50 µm; (d) 20 µm; (e) 5 µm; (f) 2 µm. .........................................................................................................240 Figure 28 Lycoperdon demoulinii (Holotype UFRN-Fungos 655). a. Dry specimen; b. Detail of exoperidium ornamentation; c. Detail of endoperidium surface areolate; d. Details of spines from exoperidium; e. sphaerocysts forming the spines; f. Mycosclerids 15.

(18) from apical endoperidium; g. Capillitium and basidiospores punctate in LM. Bars (a) 10 mm; (b) 2 mm; (c) 2 mm; (d) 50 µm; (e–f) 20 µm; (g) 5 µm. ......................................244 Figure 29 Lycoperdon exoelongatum. a. Basidiome in situ; b. Dry specimen; c. Detail of tufts in exoperidium of young basidiome; d. Detail of exoperidial surface in aged basidiome; e. Paracapillitium covered with glebal membrane; f. Basidiospores strongly verrucose [D] in LM; g. Scanning electron microscopy of basidiospores; h. Exoperidial elements. Bars: (a, b, d) bar = 5 mm.; (c) bar = 0.5 mm; (e) bar = 20 µm; (f) bar = 10 µm; (g) bar = 1 µm; (h) bar = 50 µm (Photos: Accioly, T.). ................................................248 Figure 30 Lycoperdon fuligineum. a. Paratype of Morganella mexicana (NY00839022, J.B. Ellis 5013), dried specimens; b. Dry specimens of Morganella mexicana mixed with M. velutina (NY00839023, J.B. Ellis 5013); c. Detail of exoperidium ornamentation; d. Sphaerocysts from exoperidium ornamentation; e. Basidiospores strongly verrucose [D] in LM; f. Scanning electron microscope of basidiospores. Bars: (a–b) 10 mm; (c) 0.2 mm; (d) 50 µm; (e) 5 µm; (f) 2 µm........................................................................................ 251 Figure 31 Lycoperdon nudum (Holotype UFRN-Fungos 1765). a. Dried specimen; b. Detail of exoperidium falls off; c. Detail chain of exoperidium ornamentation; d. Basidiospores strongly verrucose [D] and paracapillitium in LM; e. Scanning electron microscope of basidiospores. Bars (a) 2 mm; (b) 2 mm; (c) 50 µm; (d) 5 µm; (f) 2 µm. .......................................................................................................................................254 Figure 32 Lycoperdon velutinum. a. Dried specimens of type (NY00398807); b. Dried specimens of the mixed basidiomes with L. fuligineum (NY00839022); c. Exoperidium ornamentation; d. Elongated hyphae from exoperidium; e. Basidiospores strongly verrucose [D] in LM (type); f. Scanning electron microscope of basidiospores (type). Bars: (a) 10 mm; (b) 5 mm; (c) 0.2 mm: (d) 50 µm; (e) 5 µm; (f) 2 µm....................... 257. 16.

(19) LISTA DE TABELAS Tabela 1 Iniciadores empregados na amplificação dos fragmentos ITS e LSU nrDNA. Indicação de suas sequências e temperatura de hibridização. .........................................51 Table 2 Sequences used in the molecular analysis. In bold new ITS sequences generated in this work .................................................................................................................... 138 Table 3 Identifications success based on ¨Best Match¨ and ¨Best Close Match¨. .........143 Table 4 Sequence names with incorrect identification based on "Best Match/Best Close Match" within threshold. In bold the values that repeat in the “Best Close Match”. ....143 Table 5 All specimens used in this study with voucher number, country and Genbank Accession Numbers when available. C: Calvatia; L: Lycoperdon; M: Morganella; V: Vascellum. In black, the new sequences generated in this study, from some of them Genbank Accession Numbers (Acc. N.) are not obtained yet. NP: No herbarium permission to molecular studies; NT: Not DNA isolation; C: sequences obtained do not belong to Lycoperdon, different contamination; : not successful amplifications are indicated or not good sequences were not obtained. ..................................................... 212 Table 6 Distance in percent of all specimens of Lycoperdon perlatum terminal branch based on GenBank sample DQ112630. .........................................................................219 Table 7. Distance in percent of all specimens of Lycoperdon pyriforme terminal branch based on GenBank sample DQ112558. .........................................................................220 Table 8 Specimens studied in this work with voucher numbers, country, and the main morphological features considered. Collections which ITS and LSU sequences were obtained are indicated with (+), sequences were not obtained (-), sequences were not attempt (0). .................................................................................................................... 266 Table 9 All the specimens used in the molecular phylogenetic analyses with voucher number and GenBank Accession Numbers. When ITS and LSU have different numbers, the first number corresponds to ITS and the second to LSU. In black are indicated the new sequences generated in this study. .........................................................................270. 17.

(20) LISTA DE ABREVIAÇÕES A seguir serão detalhadas algumas abreviações mais utilizadas ao longo desta tese de doutorado. Não se incluem as abreviaturas dos herbários que estão disponíveis no Index Herbariorum, tão pouco as abreviaturas padronizadas dos diferentes ranques taxonômicos que podem ser consultadas na Recomendação 5ª do Código Internacional de Nomeclatura para Algas, Fungos e Plantas. As abreviaturas dos autores seguem “Author of Fungal Names” que se pode consultar no “Index Fungorum”. ADN/DNA: Ácido desoxirribonucleico/deoxyribonucleic acid. No brasil é muito comum usar DNA. ARN/RNA: Ácido ribonucleico/ ribonucleic acid. CO1: Citocromo c oxidase/cytochrome c oxidose subunit. dNTP: Desoxirribonucleotídeos TriFosfatos/ Deoxynucleotide TriPhosphates. EDTA: Ácido Etilenodiamino Tetra-acético/ Ethylenediamine Tetraacetic Acid. e.g.: Exempli gratia, por exemplo. ITS: Espaçador transcrito interno/ internal transcribed spacer. K2P: Kimura 2 parametros. l: litro, Equivalente a um decímetro cúbico. LSU: Subunidade maior do DNA ribossômico/large subunit ribossomal. min.: Minuto, equivalente a 60 segundos. ml: Milímetro, equivale a um centímetro cúbico. mm: Milítemtro, equivale a um milésimo do metro. nr: Prefix que indica ribossômo nuclear, pode preceder a ADN, LSU, SSU etc./prefix for “nuclear ribosomal”; it may preced DNA, LSU, SSU, et. MP: Máxima parcimonia/Maximum parcimony. MCMC: Métodos de Monte Carlo via cadeias de Markov/Markov chain Monte Carlo. PCI: Porcentagem de identificação correta/Percentage of correct identification.. 18.

(21) PCR: Reação em cadeia da polimerase/Polymerase reaction chain. RPB 1: Gene da RNA polimerase subunidade 1/RNA polymerase II gene subunit 1. RPB2: Gene da RNA polimerase subunidade 1/RNA polymerase II gene subunit 2. SH/plural SHs: Hipóteses de espécies/Species Hypotheis. SSU: Subunidade menor do DNA ribossômico/small ribosomal subunit. TAE: Solução Tampão Tris-Acetato-EDTA. µl: microlitro equivalente a um milímetro cúbico. µm: micrômetro equivale a um milécimo do metro. 19.

(22) SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO GERAL ....................................................................................... 24. 1.1. A identificação de espécies em fungos ..................................................................24. 1.2. Conceito de espécies em fungos ............................................................................26. 1.3. O gênero Lycoperdon Pers. .................................................................................... 28. 1.4. Histórico sobre os principais trabalhos do gênero Lycoperdon abordando. morfologia e divergências na classificação das espécies.................................................29 1.5. Classificação de Lycoperdon com base em análises moleculares de ITS e LSU...33. 1.6. Os subgêneros Morganella e Vascellum e seus históricos como espécies de. Lycoperdon………...…………………………………………………………………...34 1.7. Caracteres macro e micromorfológicos em Lycoperdon, Morganella e Vascellum ……………………………………………………………………………………35 Caracteres macroscópicos........................................................................................ 35 Caracteres microscópicos ........................................................................................ 39. 2. JUSTIFICATIVA, HIPÓTESES E OBJETIVOS ..................................................44. 3. MATERIAL E MÉTODOS ................................................................................... 46. 3.1. Coleções estudadas.................................................................................................46. 3.2. Análises morfológicas ............................................................................................ 46. 3.2.1 Analises dos caracteres macromorfológicos .......................................................... 46 3.2.2 Análise dos caracteres micromorfológicos ............................................................. 47 3.3. Análises moleculares .............................................................................................. 49. 3.3.1 Isolamento do DNA, amplificação e sequenciamento ...........................................49 3.3.2 Identificação molecular das espécies de Lycoperdon .…………………………...55 3.4. Nomenclatura .........................................................................................................56. 4. RESULTADOS ......................................................................................................58. 5. DISCUSSÃO GERAL ........................................................................................... 59. 6. CONCLUSÕES GERAIS ...................................................................................... 62. REFERENCES ................................................................................................................63 20.

(23) CAPÍTULO 1/ CHAPTER 1 ....................................................................................... 78 1. INTRODUCTION .................................................................................................81. 1.1. Animal, algae, plant and oomycota barcode .......................................................... 82. 1.2. Fungi barcode and automatic identification tools ..................................................84. 1.3. The genus Lycoperdon Pers. ..................................................................................86. 2. MATERIAL AND METHODS .............................................................................88. 2.1. Collections studied .................................................................................................88. 2.2. Morphological analysis .......................................................................................... 88. 2.3. Molecular analyses .................................................................................................88. 2.3.1 DNA isolation, amplification and sequencing ....................................................... 88 2.3.2 Molecular identification of Lycoperdon species .................................................... 89 2.3.3 Performance of automatic identification through the unite database ..................... 91 3. RESULTS ..............................................................................................................92. 3.1. Molecular analyses .................................................................................................92. 3.1.1 DNA, amplification and sequencing ......................................................................92 3.1.2 Molecular identification of Lycoperdon species .................................................... 92 3.1.3 Probability correct identification (PCI) of Lycoperdon species ............................ 96 3.1.4 Automatic Identification through UNITE ............................................................ 101 4. DISCUSSION ......................................................................................................118. 5. CONCLUSION ....................................................................................................125. REFERENCES ..............................................................................................................126 CAPÍTULO 2 / CHAPTER 2 .................................................................................... 144 1. 2. INTRODUCTION ............................................................................................... 146 1.1. Problems with the species concept and names in Lycoperdon ....................... 148. 1.2. Current taxonomy of Lycoperdon ...................................................................149. 1.3. DNA Barcode to identify fungi ......................................................................150 MATERIAL AND METHODS ...........................................................................152 21.

(24) 2.1. Collections studied .......................................................................................... 152. 2.2. Morphological analyses .................................................................................. 152. 2.2.1. Analyses of macrostructures ....................................................................152. 2.2.2. Analyses of microstructures ....................................................................153. 2.3. Molecular Analyses ........................................................................................ 154. 2.3.1. DNA isolation, amplification and sequecing ...........................................154. 2.3.2. The molecular identification of Lycoperdon species............................... 154. 3. RESULTS ............................................................................................................157 3.1. Molecular analysis .......................................................................................... 157. 3.1.1. DNA, amplification, and sequencing ...................................................... 157. 3.2. Molecular identification of Lycoperdon species .............................................157. 3.3. Probability Correct Identification (PCI) of Lycoperdon perlatum and L.. pyriforme . …………………………………………………………………………..161 3.4. Taxonomy .......................................................................................................162. 4. DISCUSSION ......................................................................................................196. 5. CONCLUSIONS ..................................................................................................199. REFERENCES ..............................................................................................................200 CAPÍTULO 3 / CHAPTER 3 .................................................................................... 223 1. INTRODUCTION ............................................................................................... 225. 2. MATERIAL AND METHODS ...........................................................................227 2.1. Material studied .............................................................................................. 227. 2.2. Morphological analysis ................................................................................... 227. 2.3. Molecular Analyses ........................................................................................ 228. 2.3.1. DNA isolation, amplification and sequencing .........................................228. 2.3.2. Sequence alignment and phylogenetic analyses ......................................229. 3. RESULTS ............................................................................................................231 3.1. Molecular and morphological analyses .......................................................... 231. 22.

(25) 3.2 4. Taxonomy .......................................................................................................235 DISCUSSION ......................................................................................................260. REFERENCES ..............................................................................................................261 CAPÍTULO 4 / CHAPTER 4 .................................................................................... 273 1. INTRODUCTION ............................................................................................... 275. 2. MATERIAL AND METHODS ...........................................................................276. 3. RESULTS ............................................................................................................277 3.1. List of species .................................................................................................277. 4. DISCUSSION ......................................................................................................285. 5. CONCLUSIONS ..................................................................................................287. REFERENCES ..............................................................................................................288 INDEX TAXONÔMICO .............................................................................................. 292. 23.

(26) 1 INTRODUÇÃO GERAL 1.1. A identificação de espécies em fungos A princípio, o planeta terra em uma subestimada previsão de sua biodiversidade. teria entorno de 5 a 15 milhões de espécies (Stork, 1993), estimativas menos conservadoras consideram que esta diversidade possa ultrapassar os 50 milhões de espécies em todo planeta (Wilson, 2003; Scheffers et al., 2012). Para fungos a estimativa é que se tenha em torno de 3 a 5 milhões de espécies (Blackwell, 2011). Ao longo do tempo, os taxonomistas tem empregado um valioso tempo em descrever e nomear espécies, aumentando a cada ano a quantidade de nomes de espécies registradas em herbários ou museus (Alberch, 1993; Wilson, 2003). Tendo isto em vista, a sistemática e a taxonomia tem um papel crucial em nomear e organizar o posicionamento das espécies quanto a seu reino, filo, classe, ordem, família, gênero e espécie. Obviamente, muitos desses nomes trazem consigo uma certa confusão, isto porque, para cada local adotavam-se nomes diferentes para um mesmo grupo de indivíduos e as descrições eram no mínimo imprecisas (Margulis e Sagan, 2002). Para isso, adotou-se o sistema binominal de Linnaeus (Linnaeus, 1753), teve um importante papel no desenvolvimento da taxonomia e classificação das espécies (Hitchcock, 1926; Cain, 1958a; b). Do mesmo modo, muitos pesquisadores empenharam esforços na taxonomia e classificação de diversos grupos de fungos (Tournefort, 1700; Linnaeus, 1753; Scopoli, 1772; Schaeffer, 1774; Persoon, 1801; Fries, 1829; Vittadini, 1842; Berkeley, 1873). Assim como, outros tantos investiram tempo na taxonomia em grupos específicos, como por exemplo, do gênero Lycoperdon Pers. (Massee, 1887; Lloyd, 1905a; b). Dessa forma, por muito tempo, a classificação e nomenclatura das espécies de Lycoperdon foram baseadas exclusivamente em caracteres macromorfológicos (Bonorden, 1857; Massee, 1887). Com o desenvolvimento da microscopia, os taxonomistas passaram a considerar as características micromorfólogicas, usando microscópio ótico para investigar as estruturas da gleba, como esporos e capilícios (Cunningham, 1926, 1944; Coker e Couch, 1928; Johnson, 1929; Bottomley, 1948). Posteriormente, a melhoria da precisão dos microscópios de luz e o advento da microscopia eletrônica de varredura, proporcionou descrições mais detalhas do grupo (Cunningham, 1944; Bottomley, 1948; Demoulin, 1968a; Eckblad, 1971; Perreau, 1971; 24.

(27) Calonge, 1975), persistindo até o final da década 80 (Demoulin, 1983; Homrich and Wright, 1988; Domínguez de Toledo, 1989; Jeppson and Demoulin, 1989; Calonge, 1990). Ao final da década de 80 e início dos anos 90, houve uma revolução na taxonomia não só em Lycoperdon, mas englobando grande parcela dos grupos de fungos conhecidos, foi então o início da era das ferramentas de genética molecular para classificar, identificar e inferir as suas interrelações evolutivas (Bruns et al., 1989, 1991; White et al., 1990; Baldwin, 1992, 1993). O gênero Lycoperdon foi efetivamente estudado por esta nova abordagem de classificação somente com o trabalho de Hibbett e colaboradores que abordaram aspectos evolutivos entre os fungos lamelados e gasteroides utilizando de DNA ribossomal (Hibbett et al., 1997). A partir de então, muitos taxonomistas tem utilizado das ferramentas moleculares para classificar níveis hierárquicos superiores como famílias ou ordens, (Kurtzman e Robnett, 1998; Martín et al., 2000; Krüger e Kreisel, 2003). Uma nova ferramenta passou a ser usada para elucidação de espécies crípticas, identificação e descrição de novas espécies, o DNA barcode (Hebert et al., 2003), utilizando a mesma ideia de um código de barras usado em supermercados e lojas comercias. O DNA barcode surgiu com a ideia de um sequência universal, de rápida amplificação, curto número de pares de bases (600700 pb) e de fácil edição, para identificar especies (Hogg e Hebert, 2004; Hebert e Gregory, 2005; Summerbell et al., 2005). Consequentemente, o DNA barcode passou a ser usado na taxonomia de vários grupos de fungos (Rehner e Buckley, 2005; Grasso et al., 2006; Schubert et al., 2007; Seifert et al., 2007; Nguyen e Seifert, 2008; Nilsson et al., 2009). Da mesma forma, em fungos gasteroides, como por exêmplo, nos gêneros Astraeus, Pisolithus y Scleroderma, o uso de sequências de barcode tem permitido identificar e descrever novas espécies (Phosri et al., 2014; Rusevska et al., 2014, 2015). Com respeito ao gênero Lycoperdon, somente os trabalhos de Larsson e Jeppson (2008) e Jeppson et al. (2012), utilizaram as sequências barcode, junto com um fragmento da região LSU nrDNA para inferir relações filogenéticas entre Lycoperdon e outros gêneros afins. Até o presente momento nenhum trabalho havia sido idealizado com a proposta de avaliar se a sequência de DNA barcode permitiria identificar as espécies de Lycoperdon.. 25.

(28) Com isso, este trabalho tem como proposta integrar a taxonomia morfológica à taxonomia molecular, utilizando a região espaçadora interna (ITS) como barcoding de Lycoperdon e seus subgêneros Morganella e Vascellum. Assim, após detalhada e extenuante revisão literária do gênero e discussões sobre o tema com especialistas do grupo como o Dr. F.D. Calonge (Real Jardín Botánico de Madrid) e o Dr. Vincent Demoulin (Université de Liège – Bélgica), apresenta-se aqui algumas hipóteses: (i) as espécies de Lycoperdon podem ser identificadas com o uso do ITS como DNA “barcoding” quando integrado aos dados morfológicos; (ii) os nomes de espécies adotados para identificar os espécimes da América Central e Sul-americanos de Lycoperdon refletem os conceitos adotados pelos taxonomistas do velho mundo; (iii) ao adicionar as espécies Sul-americanas ao conjunto de dados de Larsson e Jepsson (2008), Morganella continuará sendo subgênero de Lycoperdon.. 1.2. Conceito de espécies em fungos A grande a necessidade do ser humano para nomear e classificar espécies (Stork,. 1993), traz consigo um grande questão entre pesquisadores e naturalistas que se dedicam para descobrir sobre a diversidades das espécies; o que é uma espécie? Ou, qual o conceito de espécies? O conceito de espécie, então passou a ser discutido entre muitos pesquisadores do passado com intuito de unificá-lo (Mayr, 1969; Ghiselin, 1974; Ridley, 1989; Mayden, 1997). Ghiselin (1974), cita que o problema do conceito de espécies está no entendimento do status ontológico da fundamentação biológica. Para Mishler e Donoghue (1982), o reconhecimento de espécie que é feito pelos taxonomistas é baseado em suas experiências com a sistemática dos grupos de organismos de seus estudos. Mayden (1997) comenta que muitas classificações podem existir para o mesmo grupo de organismos, dependendo de qual critério foi adotado para o conceito de espécie; ainda, se os relacionamentos descendem de um hipotético ancestral comum, então a categoria supra específica (gêneros ou famílias) são mais inclusivas do que a categoria de espécies. Para os taxonomistas o conceito de espécies (Taxonomic Species Concept TSC), consiste de que todos os espécimes que são membros de um único tipo, mostrado por evidência ou suposição, são tão similares quanto sua prole ou parentes hereditários; levando-se em consideração esse critério, pesquisadores que não compartilham desse conceito, por exemplo, os pesquisadores afins do conceito genético de espécies (Genetic. 26.

(29) Species Concept – GSC) podem não assumir as entidades consideradas espécies pelos taxonomistas e vice-versa (Mayden, 1997; de Queiroz, 2005). Paralelamente aos 22 conceitos de espécies abordado por Mayden (1997), um conceito de espécies unificado foi proposto como solução dos problemas conceituais, eliminando rivalidades entres conceitos, onde as espécies não precisam ser feneticamente diferentes, ou diagnosticamente, ou ser monofiléticas, ou ainda estarem isoladas reprodutivamente, mas sim, as espécies tem que estar evoluindo separadamente (de Queiroz, 2005); Este conceito unificado nos leva a dois importantes pontos: o primeiro é que, ele serve como um importante critério operacional ou traços de evidências que são relevantes na separação de espécies, que podem ser fenéticos, grupos monofiléticos isolamento reprodutivo, e que são traços ou atributos adquiridos durante a divergência evolutiva; o segundo é que, estas propriedades permanecem importantes, e podem ser usadas na delimitação de espécies ou subcategorias de espécies (de Queiroz, 2006). Assim como os demais gruposde organismos, para os fungos, os taxonomistas também tem se preocupado em definir o conceito de espécies (Petersen e Hughes, 1999) e, segundo os autores temos três conceitos de espécies mais usados em fungos, a saber: conceito biológico (Biological Species Concept (BSC)) – no qual os indivíduos se reconhecem como parceiros reprodutivos; o conceito morfológico (Morphological Species Concept (MSC)), onde as espécies são separadas por diferênças na morfologia, refletido pelas diferênças genéticas entre dois grupos; e terceiro conceito, o filogenético (Phylogenetic Species Concept (PSC), no qual populações pode ser ranqueadas como espécies, se elas compartilham linhagens evolutivas comuns, que são expressadas em nós terminais em uma árvore filogenética. Os autores acreditam que considerando as peculiaridades dos fungos como a variabilidade nos caracteres morfológicos intraespecíficos, reprodução clonal alternando para reprodução sexuada, etc., tornando difícil a elaboração de um conceito unificado de espécies, embora, eles sugiram que o conceito deva demonstrar uma coesão fenética, de descendência evolutiva comum e, quando possível isolamento reprodutivo. Igualmente, Taylor et al. (2000), considerando que os fungos apresentam características. insatisfatórias. no. reconhecimento. de. espécies,. propuseram. o. reconhecimento de espécies por meio da concordância genealógica, onde as espécies estão em isolamento genético. De fato, este tipo de reconhecimento de espécies somente é possível devido aos avanços nos estudos de filogenia molecular, usando diversos tipos 27.

(30) de regiões como ITS e LSU (Bruns et al., 1989; Vilgalys e Hester, 1990; Gardes e Bruns, 1993; Rehner e Samuels, 1994). Assim o conceito filogenético de espécies passou a ser difundido, onde a definição de espécies remeta à um grupo de indivíduos que compartilham no mínimo um caráter derivado em comum (Wheelwe e Meier, 2000; Agapow et al., 2004). Consequentemente, este atualizado conceito, baseado em análises filogenéticas, pode separar em mais de uma espécie, quando anteriormente estavam sob um único nome específico, passando então a ser definido o conceito de espécies crípticas (Bickford et al., 2007); para os autores em uma explicação mais simplista, as espécies crípticas carecem de caracteres morfológicos suficientes para a separação destas espécies de forma eficaz. E isto mostra a fragilidade do conceito morfológico de espécies (Crespo e Pérez-Ortega, 2009), tendo em vista que os fungos apresentam caracteres morfológicos similares entre espécies (Seifert, 2009). Então, Tan et al. (2010), optou por delimitar espécies crípticas, baseando-se nas diversas ferramentas disponíveis (caracteres morfológicos, moleculares, biológicos e ecológicos) para minimizar os problemas intrínsecos a cada conceito de espécie. Desta maneira, considerando os conceitos mais usados em fungos (conceito biológico, morfológico e filogenético), mesmo com seus tradicionais problemas (Petersen and Hughes, 1999; Taylor et al., 2000), somado aos novos conceitos baseados em ferramentas moleculares (Wheelwe and Meier, 2000; Agapow et al., 2004; Bickford et al., 2007), na presente obra nós optamos pelo conceito da “taxonomia integrativa” (Tan et al., 2010), levando-se em conta todas as ferramentas disponíveis no presente estudo, como dados morfológicos, moleculares e ecológicos, para a delimitação de espécies.. 1.3. O gênero Lycoperdon Pers. O gênero Lycoperdon Pers. é um representante dos fungos chamados de puffballs,. referindo-se aos fungos sem um distinto pedicelo (stem), com um perídio flácido abrindo por uma boca definida, esporos sem pedicelos e mesclado com capilícios (Lloyd, 1905a; Cunningham, 1926). No presente trabalho, será adotado o conceito de definição do gênero conforme propostos nas obras de Demoulin (1970, 1972b, 1973, 1979). Assim para uma geral definição do gênero temos: basidioma com subgleba bem desenvolvida, celular, embora, em alguns casos as células compactas podem ocorrer, apresentando tons esbranquiçada a 28.

(31) acinzentada; deiscência por um poro apical ou ruptura irregular do perídio; gleba composta sempre por capilícios elásticos a subelásticos (em referencias àqueles que podem ocorrer com partes quebradas, mas não por completo), podendo ou não ocorrer poros e septos; paracapilício podendo ocorrer em diferentes proporções; e esporos globosos a subelípticos, sendo punctados a fortemente verrucosos. Tradicionalmente, o gênero pertencia a família Lycoperdaceae (Coker and Couch, 1928). Além de diversos estudos terem sidos realizados para a compreensão da diversidade de espécies e a distribuição do gênero (Johnson, 1929; Rick, 1930; Cunningham, 1944; Bottomley, 1948). Ainda que, em um contexto atual, baseando em analises de filogenia molecular, o gênero está alocado junto aos Agaricales em Agaricaceae, sendo que o nome Lycoperdaceae não reflete sua atual classificação (Hibbett et al., 1997).. 1.4. Histórico sobre os principais trabalhos do gênero Lycoperdon abordando morfologia e divergências na classificação das espécies Linnaeus (1753), tentou nomear várias espécies de fungos, entre elas, as do gênero. Lycoperdon Pers.: L. aurantium L. (= Tubiferaceae), L. carpobulus L. (= Sphaerobulus stellatus Tode), L. epidendrum J.C. Buxb. ex L. (= Lycogala epidendrum Fr.), L. pedunculatum (= Tulostoma brumale Pers.), L. stellatum L. (= Tubiferacea), embora em sua maioria tenham sido transferidas para outros gêneros. O gênero Lycoperdon foi erguido por Tournefort (1700: pag. 563), logo depois no século XVIII, outros autores usaram este nome para reconhecer fungos com o corpo de frutificação globoso a subgloboso e com o conteúdo interno pulverulento (Scopoli, 1772; Schaeffer, 1774). Embora, muitos táxons não pertencessem ao gênero Lycoperdon, a saber: L. pedunculatum Batsch, L. carpobolus Batsch, L. epidendrum (= Lycogala epidendrum (J.C. Buxb. ex L.) Fr.), L. stellatum L. per Rehl. (=Geastrum coronatum Pers.). No século XIX, Persoon (1801) foi quem validamente publicou o gênero Lycoperdon, inserindo-o em Gasteromycetes. Em seu trabalho intitulado Synopsis Methodica Fungorum”, o autor forneceu uma descrição do gênero: “peridium caulescens, apice demum ruptum, verrucis squamulosis, aut spinulosis obsitum (Pulvis seminalis viridis). O autor listou 14 espécies: Lycoperdon bovista Pers., L. candidum Pers., L. echinatum Pers., L. excipuliforme (Scop.) Pers., L. gigateum Batsch, L. gossypinum Bull., 29.

(32) L. mammiforme Pers., L. molle Pers., L. perlatum Pers., L. pratense Pers., L. quercinum Pers., L. umbrinum Pers., L. utriforme Bull. e L. pyriforme Schaeff. Ainda no séc. XIX, Fries (1829), contribuiu com a sistemática do gênero descrevendo nove espécies alocando elas em duas tribos: Bovistoides, composto pelas espécies de L. bovista, L. caelatum e L. pusillum; tribo Proteoides, composto pelas espécies de L. brasiliense (espécie brasileira), L. constellatum, L. gemmatum, L. gossypinum, L. pyriforme e L. saccatum. Ainda que, nenhum outro autor tenha utilizado essas tribos. O autor ainda indica L. album e L. esculentum como espécies duvidosas no gênero. Vittadini (1842), teve uma importante contribuição com a sistemática do gênero com o trabalho “Monographia Lycoperdineorum”. Logo em seguida, Bonorden (1857) em seu trabalho fornece uma lista com 31 espécies, onde muitas delas são hoje consideradas sinônimos: L. laxum Bonorden (= L. mammiforme), L. pistiliforme Bonorden (= L. excipuliforme), L rusticum Bonorden (= L. excipuliforme), etc. Massee (1887), em sua obra “A Monograph of the genus Lycoperdon (Tournef.) Fr.”, fez uma exaustiva revisão dando descrições de 129 espécies, claro que muitos delas, hoje são sinônimos, ou pertencem a outro gênero, como exemplo: Lycoperdon sculptum Harkn. (= Calvatia sculpta Lloyd), L. serotinum Bonord. (=L. pyriforme), L. mundula Kalch. (= Bovista pusilla Batsch), etc). Ainda que, para todos os autores expostos até aqui, o conceito de caracterização das espécies dentro do gênero tenha sido de forma muito ampla, muitas dessas espécies estudas por eles continuam permanecendo em Lycoperdaceae. No século XX, muito autores contribuíram exaustivamente para a compreensão do gênero Lycoperdon, e as descrições das espécies passaram a ser melhor caracterizadas e menos amplas (Lloyd 1905a). Lloyd revisou as exsicatas de Persoon (1801), Vittadini (1842), e Bonorden (1857), que foram reportadas para Europa. Subsequente a este trabalho, Lloyd (1905b) publicou um segundo trabalho em continuação as suas revisões de espécies de Lycoperdon, porém com espécimes norte Americanas. Coker e Couch (1928) contribuíram com um extenso trabalho sobre Gasteromycetes para América do Norte, com descrições de 25 espécies de Lycoperdon, dando chave de identificação e boas figuras com fotos dos basidiomas, ainda que, algumas espécies tratadas por eles hoje são sinônimos em outros gêneros, por exemplo, Lycoperdon polymorphum Vittad. (= Bovista polymorpha Kreisel), L. oblongisporum 30.

(33) Berk. M.A. Curt. (= B. longispora Kreisel) e L. acuminatum Boc. (= B. acuminata Kreisel). Em seguida, Johnson (1929), seguindo os conceitos adotados por Coker e Couch (1928), reportou 25 espécies de Lycoperdon para Ohio, Canada. Como o autor seguiu Coker e Couch, os mesmos sinônimos são encontrados nesse trabalho. Na presente obra consideramos muitas das descrições de espécies como referências para aquelas registradas no Capítulo 1 e Capítulo 2, como por exemplo, L. atropurpureum Vittad., L. eximium Morgan e L. umbrinum. Dentre muitos trabalhos sobre a diversidade de espécies de Lycoperdon em diversas partes do mundo (Cunningham, 1926, 1944; Kobayasi, 1937; Bottomley, 1948; Perdeck, 1950; Smith, 1951; Dennis, 1953; Garner, 1956; Pilát, 1958; Bowerman, 1961; Dissing e Lange, 1962; Dring, 1964; Herrera, 1964), devemos aqui pontuar os trabalhos de Cunningham, para Nova Zelândia e Austrália; o trabalho com as espécies africanas de Bottomley; e as espécies holandesas de Perdeck. Estes trabalhos oferecem um conceito de delimitação de espécies em Lycoperdon que permite o leitor a compreender a classificação adotada, ainda que não concorde com a sinonimização de uma ou outra espécie, a saber: Cunningham e Bottomley, em seus distintos trabalhos, consideram Lycoperdon excipuliforme um sinônimo de L. perlatum, fato esse, apropriadamente desconsiderado por Perdeck, o qual aqui consideramos o conceito de Perdeck. Kreisel (1973), em seu importante trabalho sobre Lycoperdaceae na Alemanha, inseriu os conceitos de tipos de exoperídio e capilício em Lycoperdaceae, além disso, Kreisel forneceu as localidades tipos de diversas espécies de Lycoperdon, ainda que por muitas vezes a localidade tipo era vagamente informada como Europa, como exemplo, em L. perlatum. Demoulin (1968a), em seu trabalho de fungos gasteroides para Bélgica, segue os conceitos adotados por Perdeck (1950), e fornece descrições detalhadas de diversas espécies e sua distribuição. Demoulin (1968b) direciona os critérios para identificação das espécies: L. molle, L. muscorum and L. umbrinum, o qual o autor chama de grupo molle-umbrinum-muscorum. Ainda neste trabalho, o autor fornece uma tabela com todas as coleções estudadas por ele, discutindo os caracteres variáveis e os constantes nessas espécies. Do mesmo modo, o autor seguiu aprofundando seus conhecimentos em Lycoperdon e, em sua principal obra “Le genre Lycoperdon en Europe et en Amérique du Nord Étude taxonomique et phytogéographique”, Demoulin (1972), reporta 30 táxons 31.

(34) para Europa e América do Norte. Além de explanar sobre a distribuição geográfica, elaborou uma chave de identificação levando em consideração não somente os caracteres morfológicos, mas também os tipos de substratos em que as espécies ocorriam. Este trabalho foi utilizado como principal meio de definição do gênero e identificação morfológica das espécies. Posteriormente, Demoulin e Schumacker (1972), forneceram um importante trabalho para o problema do grupo de Lycoperdon molle-umbrinummuscorum, agora baseando-se na técnica de agrupamento, enumerando os caracteres taxonômicos. Nesta obra, por exemplo, os autores relatam que Lycoperdon lambinonii, anteriormente publicado por Demoulin (1972a), é uma espécie intermediário entre L. molle e L. umbrinum. Outro importante pesquisador que contribuiu com os conhecimentos sobre a diversidade de espécies em Lycoperdon foi o Dr. Francisco Diego Calonge, que em várias oportunidades realizou parcerias com Dr. V. Demoulin. Calonge e Demoulin (1975), reportaram 12 espécies para o gênero e mais três espécies, que no presente trabalho trataremos como pertencentes a Lycoperdon, são elas: Calvatia excipuliformis, C. utriformis Bull. per Pers. e Vascellum pratense F. Smarda. A mais recente obra e que também iremos considera-la por diversas vezes em nossos tratamentos taxonômicos é Calonge (1998), que reportou 13 espécies para a flora Ibérica, ainda que, nesta obra o autor trata L. decipiens como sinônimo de L. atropurpureum, porém, veremos no decorrer desta obra que ambas são espécies distintas. Ainda, para a Inglaterra temos o trabalho de Pegler et al. (1995), seguindo principalmente os conceitos de Demoulin (1972b), Kreisel (1973), Calonge e Demoulin (1975). Pegler e colaboradores reportaram 13 espécies para o território inglês. Na América do Sul os registros de Lycoperdon são reportados por Fries (1829), com a espécie L. brasiliense. Na sequência, Massee, (1887) reportou L. gardneri Berk., L. pyriforme, L. velutinum Berk. & M.A. Curt., para Venezuela; L. albinum, L. astrocaryi Berk. & M.A. Cooke, L. brasiliense e L. pusillum Fr. para Brasil e Peru; Spegazzini (1898) teve grande influência no conhecimento para a Argentina, com registros e novas espécies L. argentinum, L. asperum, L. bonariense etc. No século 20 temos o registro de alguns trabalhos esporádicos: Hennings (1904) e Sydow e Sydow (1907); sobre as espécies reportadas para o Brasil, Rick (1930, 1961) teve um grande papel no avanço do conhecimento das espécies de Lycoperdon e de outros gêneros e famílias; embora,. 32.