Análises moleculares

3.3.1 Isolamento do DNA, amplificação e sequenciamento

As extrações de DNA e amplificações das reações em cadeias da polimerase (PCR) foram realizadas em dois laboratórios distintos: (a) Laboratório de Biologia Celular e Genética de Plantas no Departamento de Biologia Celular e Genética – UFRN; (b) Laboratório de Biologia Molecular do Real Jardín Botánico de Madrid – RJB/CSIC; as extrações de DNA foram realizadas com basidiomas herborizados de tecidos extraídos das partes internas do basidioma e colocando-as em tubos eppendorf 1,5 ou 2 ml (Fig. 7 a), usando o kit de extração DNeasy Plant Kit (Qiagen 69106), seguindo as instruções do fabricante; excerto em três modificações: para agregar o tampão AP1 e o RNase A, em vez de incubar 10 min a 65ºC, se incubou toda a noite a 60ºC, para favorecer a ruptura das paredes quitinosas dos fungos; para adicionar por uma segunda vez 500 μl do tampão de limpeza AW, seguido, de realizar a centrifugação de 1 min a 8000 rpm e descartar-se a fração líquida, se realizou uma segunda centrifugação a 14.000 rpm durante 2 min, para assegurar que a coluna ficava completamente seca de álcool, já que este poderia interferir nas posteriores reações de amplificação; e para aumentar a concentração de DNA eluído, o tampão AE foi pré-aquecido a 60ºC. Uma vez finalizado o isolamento se quantificou o DNA utilizando o espectrofotómetro ARN/ADN calculator GeneQuant II (Pharmacia Biotech).

As amplificações se realizaram em reações individuais mediante IllustraTM PuReTaqTM Ready-To-GoTM PCR beads (GE Healthcare, UK). Cada tubo contendo em seu interior uma esfera desidratada com todos os reativos para uma amplificação por PCR (Taq polimerasa, dNTPs, cloreto de magnésio e tampão Tris-HCl) (Fig. 7 b), para que se possa adicionar os iniciadores (1 μl a 10 μM), o DNA genômico (1.0-10.0 μl, dependendo da concentração) e água ultrapura estéril (Water 95284 Biochemica, SIGMA), até um volume de 25 μl.

Para o marcador ITS, o fragmento que se tentou amplificar compreende os espaçadores internos ITS1 e ITS2, incluindo a subunidade 5.8S do DNA ribossômico nuclear. Para o marcador LSU, o fragmento selecionado compreende os domínios D1-D2 da subunidade maior do DNA ribossômico nuclear (LSU nrDNA). Os iniciadores utilizados para a amplificação destas regiões se indicam na figura 8, e na Tabela 1 se inclui a sequência dos mesmos.

50 isolamentos de DNA de material de herbário, para conseguir os amplímeros desenhados. Em primeiro lugar, se realizaram amplificações diretas com os iniciadores ITS5 e ITS4 (Fig. 8) (White et al., 1990), no caso de ITS, e com os iniciadores LROR (Rehner e Samuels, 1994) e LR7r (Vilgalys e Hester, 1990), para o de LSU. Para cada série de amplificação foi corrido gel de comprovação para determinar a qualidade e quantidade do produto amplificado. Para isto, se realizou uma electroforese em gel de agarose a 2% (Agarose D-1 low EEO, Conda S.A., Pronadisa) com tampão TAE 1x (tampão TAE 50x: EDTA 0.05M, Tris Acetato 2M). Como agente intercalante de DNA se adicionou 1 μl de SYBR SafeTM por cada 10 ml de agarose. Em cada poço foi preenchido com 5 μl de produto amplificado mesclados com 1 μl de tampão de carga LB diluído 1:10 (LB 6x: azul de bromofenol 0.25 %, xilencianol 0.25 %, glicerol 30 %). Para conhecer a longitude dos possíveis amplímeros foi realizado como padrão de peso molecular o marcador 1 Kb Plus DNA Ladder, diluído 1:19. A eletroforeses foi percorrida a 100V durante 30 min, tendo em vista que os moldes dos géis utilizados são de 10 × 15 cm. A visualização do DNA foi por meio do sistema de documentação de géis G:BOX EF (SynGene) ou Cleaver. Em cada série de amplificações se incluiu sempre um controle negativo. Uma vez preparados os tubos de PCR beads (Fig. 7 b) se procedeu à amplificação utilizando o termociclador MJ Research-PTC-200 (Fig. 7 c). Os programas empregados nas amplificações para cada região correspondem a Martín e Winka (2000) para ITS, e Telleria et al. (2013), para LSU.

Naqueles casos em que não foram visualizadas banda depois da amplificação direta (Fig. 7d), se procedeu a realizar una amplificação por partes. Para o marcador ITS se utilizou os pares de iniciadores ITS1F/ITS2 e ITS3/ITS4 (White et al., 1990), e para o marcador LSU, LROR/LR5 (White et al., 1990) e LR3R /LR7r (Vilgalys e Hester, 1990) (Fig. 8).

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Tabela 1 Iniciadores empregados na amplificação dos fragmentos ITS e LSU nrDNA. Indicação de suas sequências e temperatura de hibridização.

Região Primer Sequências (5’...3’) T hibridização

ITS

ITS1F CTT GGT CAT TTA GAG GAA GTA A 67ºC

ITS2 GCT GCG TTC TTC ATC GAT GC 57ºC

ITS3 GTC TTG AAA CAC GGA CC 57ºC

ITS4 TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC 53ºC

ITS4-B CAG GAG ACT TGT ACA CGG TCC AG 67ºC

ITS5 GGA AGT AAA AGT CGT AAC AAG G 69ºC

LSU

LROR ACC CGC TGA ACT TAA GC 57.9ºC

LR3 CCG TGT TTC AAG ACG GG 56ºC

LR5 TCC TGA GGG AAA CTT CG 58.8ºC

LR7r TAC TAC CAC CAA GAT CT 46.2ºC

Quando tão pouco foi possível visualizar produto das amplificações (Fig. 7 e), se realizaram nested PCR para ITS e seminested PCR para LSU. No caso do ITS se realizou uma primera amplificação com 1 μl de DNA genômico e o par de iniciadores ITS1F/ITS4B (Gardes e Bruns, 1993), e uma segunda amplificação (PCR nested) com os pares de iniciadores ITS5/ITS4, naquela que se incluiu com DNA de 1 μl da primeira amplificação. No caso do LSU, se realizou uma primeira amplificação com os pares de iniciadores LROR/LR7r e 1 μl de DNA genômico, depois se conduziu uma segunda amplificação com 1 μl da amplificação anterior e os pares de iniciadores LROR/LR5 e LR3R/LR7r por separado.

Aquelas amplificações em que se observaram bandas no gel de comprovação se procedeu a purificação. Dependendo da qualidade e concentração do produto amplificado, se utilizou um dos seguintes protocolos:

(1) nas amplificações que se obtiveram bandas duplas ou uma banda muito grossa (Fig. 7 f), se utilizou o kit QIAquick Gel Extraction (QiaGen®). Para esta purificação, em primeiro lugar se realizou uma segunda eletroforese em gel de agarose a 2 %; nos géis adicionou-se os 20 μl restantes de amplificação aos que se adicionou 1 μl de LB. No gel se deixou um poço vazio entre as amostras para evitar arrastrar amostras vizinhas ao cortar. Para assegurar que as bandas se separaram corretamente se deixou correr o gel a 120 V durante 45 min, já que os moldes eram de 10 × 15 cm. Depois se visualizaram as

52 bandas com o transluminador de luz azul SafeImagerTM 2.0 Blue-Light Transilluminator ou Clear View UV Transilluminator Cleaver, e se cortaram utilizando palitos de madeira estéreis. Cada porção de agarosa com sua banda correspondente se introduziu em um tubo eppendorf de microcentrífuga de 1.5 ml, e despois se seguiu o protocolo indicado pelo fabricante.

Figura 7. Materiais e equipamentos usados durante a extração e amplificação do DNA. a. Colunas (lilás e brancas) do kit de extração; b. Tubos eppendorfs contendo em seu interior uma esfera desidratada com todos os reativos para a amplificação por PCR; c. Termociclador; d. Transluminador acoplado com câmera fotográfica para a visualização e confecção de fotografias dos géis em agarose; e-f. Fotografias dos géis em agarose; e. Gel sem as bandas de amplificação da PCR; f. Gel contendo as bandas dos produtos amplificados da PCR.

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Figura 8. Esquema do nrDNA no qual se pode observar as regiões dos marcadores e a posição dos iniciadores. Baseado em http://sites.biology.duke.edu/fungi/mycolab/.

(2) o segundo protocolo de purificação que foi empregado para aquelas amplificações em que os géis de comprovação se visualizou uma única banda bem definida e intensa (mais de 20 ng/μl). A purificação foi realizada com a enzima Exosap, IllustraTM ExoStar-1-Step (GE Healthcare, UK) segundo as instruções do fabricante, com a enzima diluída a 1:10. Depois de adicionar 8 μl de Exosap 1:10 aos tubos que continham as amplificações; estes foram introduzidos no termociclador MJ Research- PTC-200 para a eliminação dos restos de dNTPs, dímeros, etc. Se utilizou o seguinte programa: um ciclo à 37ºC durante 30 min (ativação e atuação da enzima), um ciclo a 80ºC durante 15 min (desativação da enzima) e um ciclo de conservação à 4ºC até que as purificações fossem armazenadas ao freezer (4ºC).

Para cada série de purificação se realizou também um gel de comprovação para assegurar que, sobre tudo nos casos em que haviam cortado as bandas, não se havia perdido o DNA. Estas eletroforeses foram realizadas sob as mesmas condições que as dos géis de comprovação das amplificações.

As purificações foram enviadas para serem sequenciadas a serviço de sequenciamento de DNA da Macrogen (Coreia), com os iniciadores (10 μM) que se haviam utilizado nas amplificações, para obter tanto a sequência direta (forward) quanto a reversa (reverse).

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Figure 9. Formação das sequências consensos e busca no megablast para verificar se há contaminação das mesmas. a. Visualização das sequências direto e reverso e formação da sequencias consenso; b-g.

55 Para obter as sequências consenso das regiões analisadas de cada uma das amostras, editaram-se as sequências direta e reversa utilizando o programa Sequencher 4.1.4 ou no programa Genious Pro v4.8.5 (Fig. 9 a). Uma vez obtidos os consensos, para comprovar que estas sequências correspondiam ao gênero de espécie de estudo e que não provinham de uma contaminação, se analisaram uma por uma com a opção de busca megablast (BLAST®) (Fig. 9 b-g) disponível no NCBI (National Center of Biotechnology Information (Altschul et al., 1997).

3.3.2 Identificação molecular das espécies de Lycoperdon

As sequencias de ITS obtidas (Capítulo 1-3) e a de LSU (Capítulo 3) foram alinhadas usando o programa Seaview versão 4.6 (Galtier et al., 1996; Gouy et al., 2010) para múltiplas sequencias. As sequencias foram comparadas como homólogos de Lycoperdaceae do GenBank principalmente as sequencias publicadas por Larsson e Jeppson (2008), Jeppson et al. (2012), Kumla et al. (2013) e Kim et al. (2016). Foram usadas como grupo externo as sequencias de Bovista (Capítulo 1-2), Mycenastrum e

Tulostoma (Capítulo 3). Onde ocorreram ambiguidades no alinhamento caracteres

informativos foram escolhidos. Onde haviam gaps foram marcados com “–“, nucleotídeos não resolvidos e desconhecidos na sequencia foram indicados com “N”.

Para analisar se a sequência ITS é uma boa região “barcode” para identificar as espécies de Lycoperdon, se realizou um agrupamento das sequências, mediante uma análise de distância com o algoritmo de Kimura-2-Parametros (K2P) sob Neighbor- Joining (NJ) (Meier et al., 2006; Chen et al., 2010; Ramadan and Baeshen, 2012). Se obtiveram os valores de PCI (porcentagem de identificação correta) e a variação intraespecífica e interespecífica utilizando o programa TaxonDNA disponível em http://taxondna.sf.net/.

Para avaliar se os agrupamentos obtidos por NJ eram apoiados, se realizaram análises de Máxima Parcimônia (MP) e de inferência bayesiana. A análise de Máxima Parcimônia (MP) foi conduzida no programa PAUP versão 4.0a152 (Swofford, 2002). Como medida de apoio para a análises MP, utilizou-se o método de bootstrap (bs) (Felsenstein, 1985), com a opção fast-step, retendo 10000 réplicas por árvore, e se calcularam também os índices de consistência (CI; Kluge e Farris, 1969), de retenção (RI; Farris, 1989) e o índice de consistência reescalado (RC; Farris, 1989).

56 foi utilizado o programa MrBayes v. 3.1. A análise se realizou baseada no modelo de tempo reversível (Rodríguez et al., 1990), incluindo a estimação de sítios invariáveis e assumindo uma distribuição gama com seis categorias (GTR+I+G), modelo selecionado com o programa MrModeltest v. 2.3 (Nylander, 2004). Mediante o MrBayes se realizaram as análises independentes e simultâneas, a partir de distintas árvores aleatórias, ao longo de 2.000.000 de gerações correndo quatro cadeias paralelas e guardando-se as árvores e os valores dos modelos de cada 100 gerações. De cada 1.000 árvores geradas em cada uma das duas análises se tomou uma como amostra para mediar a similaridade entre elas e determinar o nível de convergência entre as duas análises. O MrBayes obteve a árvore consenso pela regra da maioria a 50% e os valores de probabilidade dos nós.

No Capítulo 3, para as análises preliminares se realizou um alinhamento combinado das sequências de ITS e LSU, excluindo as sequências de EMBL/GenBank/DDBJ das que não estavam disponíveis as sequências das duas regiões. A visualização dos dendogramas foi realizado com auxílio do TreeView (Page, 1996) e foram editados com auxílio do programa InkScape Wink, versão 0.92.0 r15299 (http://wiki.inkscape.org/wiki/index.php?title=Release_notes/0.91&oldid=98966).

3.4 Nomenclatura

A nomenclatura micológica e de plantas está de acordo com o Código Internacional de Nomenclatura para Algas, Fungos e Plantas (McNeill et al., 2012). Tendo em vista, que a presente obra de tese de doutorado não possui ISSN e ISBN, e tem como o seu propósito a aquisição de título de doutorado em Sistemática e Evolução, o qual é submetida a Universidade Federal do Rio Grande do Norte, cabe ressaltar que nenhuma das novidades nomenclaturais mencionadas pode-se considerar validamente publicada na própria obra de tese de acordo com o Art. 30.8. De fato, nenhuma destas tais novidades nomenclaturais pretende-se ser publicadas de forma efetiva aqui, a não ser aquelas que foram (no caso dos Capítulos 2 e 3) ou serão publicadas de forma efetiva por meio de aceitação e publicação dos diferentes capítulos em revistas científicas correspondentes. Se incluem, todavia, as diagnoses, citações de material tipo e números de MycoBank tal qual como se deveriam aparecer na efetiva publicação. Por esses motivos, pedimos aos possíveis leitores desta obra que não citem as novidades

57 nomenclaturais que aqui aparecem em seus respectivos capítulos, excepcionalmente se estas forem citadas a partir de suas efetivas publicações, uma vez que tenha sido realizada.

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4 RESULTADOS

A partir dos empréstimos realizados dos herbários nacionais e internacionais supracitados, foi possível revisar 334 exsicatas, totalizando 888 espécimes; houve uma média de 2,7 espécimes (ou basidiomas) por exsicata; com isso, obteve-se um sucesso de amplificação da região ITS em 220 exsicatas (65,9 %), em 96 amostras (28%) não se obteve sucesso de amplificação (Fig. 10); sendo que os resultados de sucesso de amplificação obtidos neste estudo são equivalentes aos encontrados por Schoch et al.

(2012).

Figura 10. Número de basidiomas analisados, considerando o número de exsicatas, as amostras com sucesso de amplificação da região ITS, e as amostras sem sucesso de amplificação da região ITS.

Os resultados se apresentam nos seguintes capítulos:

Capítulo/Chapter 1: Is the ITS barcode useful to discriminate Lycoperdon species? Capítulo/Chapter 2: Integrative taxonomy for the identification of species of

Lycoperdon (Basidiomycota) from Central and South America.

Capítulo/Chapter 3: Revision of species previously reported from Brazil under

Morganella.

Capítulo/Chapter 4: Updated check-list to Lycoperdon from South America.

888 334 220 96 0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 Número total de basidiomas analizados Quantidade de exsicatas revisadas

Números de amostras com ITS amplificado

Números de amostras sem amplificação

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