Universidade de Lisboa
Faculdade de Ciências
Departamento de Biologia Vegetal
Estudo de dois membros da família das
proteínas da membrana externa de
Helicobacter pylori, hopM e hopN
Andrea Sofia Rebelo Santos
Mestrado em Biologia Molecular e Genética
Universidade de Lisboa
Faculdade de Ciências
Departamento de Biologia Vegetal
Estudo de dois membros da família das
proteínas da membrana externa de
Helicobacter pylori, hopM e hopN
Andrea Sofia Rebelo Santos
Mestrado em Biologia Molecular e Genética
Dissertação orientada pela Doutora Mónica Oleastro do Instituto
Nacional de Saúde Dr. Ricardo Jorge e pelo Professor Doutor Pedro
Silva da Faculdade de Ciências da Universidade de Lisboa.
A presente dissertação não foi redigida segundo o novo Acordo
Ortográfico da Língua Portuguesa por opção do autor.
Índice
ÍNDICE: Agradecimentos………....i Lista de Abreviaturas……….…ii Lista de Figuras………..………iii Lista de Tabelas………..iv Resumo………..………v Abstract……….viCapítulo 1: Introdução
………11. Helicobacter pylori- considerações gerais………..……….……….…..1
2. Características da infecção por Helicobacter pylori…..……….……….….1
3. Diversidade Genética de Helicobacter pylori……….……..…2
4. Diversidade Geográfica de Helicobacter pylori……….…..…3
5. Factores de virulência de Helicobacter pylori………..……...4
5.1. Citotoxina vacuolizanteVacA……….4
5.2. Ilhéu de patogenicidade cag………..5
5.3. Proteínas da membrana externa………..5
5.3.1 Mecanismos de regulação da expressão das proteínas de membrana externa…7
Capítulo 2: Objectivos
………9Capítulo3: Materiais e Métodos
………10Índice
2. Avaliação da diversidade genómica dos genes hopM e hopN………...10
3. Avaliação da variabilidade genética, análise filogenética e parâmetros evolutivos dos genes hopM e hopN……….………12
4. Análise Estatística……….12
Capítulo 4: Resultados
……….131. Avaliação da diversidade genómica dos genes hopM e hopN………...……..13
1.1. Distribuição dos genes hopM e hopN por região geográfica………..….14
1.2. Distribuição dos genes hopM e hopN por patologia………..14
1.3. Associação de hopM e hopN com o genótipo de virulência……… 16
2. Análise filogenétiva, avaliação da variabilidade e parâmetros evolutivos dos genes hopM e hopN………....16
3. Variação Alélica……….20
3.1 Distribuição dos alelos por gene e origem geográfica………22
3.2 Distribuição dos alelos dos genes hopM e hopN de acordo com a patologia e perfil de virulência………23
3.2.1 Distribuição dos alelos por patologia………..23
3.2.2 Distribuição dos alelos por perfil de virulência………..24
Capítulo 5: Discussão e Conclusão
……….…..26Bibliografia
………...……….30Agradecimentos
Andrea Santos i
Em primeiro lugar, não poderia deixar de agrader à Mónica Oleastro pela oportunidade dada para a realização deste trabalho, pela orientação desta tese e pelo apoio científico proporcionado ao longo destes 7 anos de trabalho.
Ao Professor Pedro Silva pela sua disponibilidade e ajuda nos momentos difíceis. A sua orientação e a luz que trouxe à minha mente foram sem dúvida essenciais para a elaboração desta tese.
Ao meu amigo e colega de trabalho João Benoliel, pela amizade, ajuda e apoio oferecidos ao longo destes 7 anos de convivência. Sem ti, todo este trabalho seria bem mais difícil e certamente ainda não teria terminado. Obrigada pela paciência para ouvires os meus desabafos, pelas inúmeras palavras de incentivo e por assegurares o laboratório por mim, libertando-me para a dedicação “quase” exclusiva à minha tese.
À Rita Cordeiro pela sua amizade, dedicação, orientação e pela imensa paciência demonstradas durante a elaboração deste trabalho. Obrigada pela tua disponibilidade e conhecimentos transmitidos durante todo o processo de desenvolvimento desta tese. Sem ti nada disto seria possível, MUITO OBRIGADA!!
À Alexandra Nunes pela sua disponibilidade e ajuda na interpretação de alguns resultados.
À Ana Pelerito, pela amizade, pelos sorrisos e momentos de descontracção proporcionados nos momentos de trabalho.
A todos os meus amigos pela compreensão, apoio e amizade. Obrigada por fazerem parte da minha vida!
Por fim, mas seguramente com maior importância…
Ao Nuno, por todo o amor, carinho e compreensão mas principalmente pelo seu grande apoio e força nos momentos mais difíceis. És o meu porto de abrigo, quem me apazigua e acalma…Obrigada meu querido!
À minha querida maninha, pelo seu carinho e incentivo ao longo de toda a nossa vida. Aos meus queridos Pais, que ao longo de toda a minha caminhada têm estado ao meu lado, incentivando e apoiando cada passo que tenho dado. Sem vocês nada disto seria possível e agradeço todos os sacrifícos que fizeram para que chegasse até aqui…. Vocês são o exemplo que pretendo seguir na minha vida… Este trabalho é dedicado a vocês!
Lista de Abreviaturas
Andrea Santos ii
Lista de Abreviaturas:
ADN Ácido Desoxirribonucleico
Ba bA Blood group antigen binding adhesin
cagA cytotoxin associated gene A
cag PAI ilhéu de patogenicidade cag
CG Cancro gástrico
CT Citosina/Timina
DDI Departamento de doenças infecciosas
EUA Estados Unidos da América
G Gastrite
G+C Guanina+Citosina
H.pylori Helicobacter pylori
IL-8 Interleucina-8
INSA Instituto Nacional de Saúde Dr. Ricardo Jorge
Ka Substituições não sinónimas
Kb kilobases
kDA Kilodaltons
Ks Substituições sinónimas
Leb Lewis B Blood Group
MALT Mucosa associated lymphoid tissue MLST Multilocus sequence typing
min. Minuto
N.D. Não definido
OipA Outer inflammatory protein A
OMPs Outer membrane protein ORF Open reading frame
pb Pares de bases
PCR Polimerase chain reaction
s Segundo
SabA Sialic acid binding adhesin SST4 Sistema de secreção do tipo IV
UP Úlcera péptica
Lista de Figuras
Andrea Santos iii
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Análise filogenética das cinco famílias de parólogos da estirpe de referência da estirpe de referência J99.---6
Figura 2: Distribuição do número de cópias e localização genómica de hopM e hopN, por região geográfica.---14
Figura 3: Frequência dos genes hopM e hopN nas estirpes de Helicobacter pylori de origem ocidental e asiática de acordo com a patologia.---15
Figura 4: Análise filogenética de 379 sequências de Helicobacter pylori, 147 do gene hopM e 232 do gene hopN.---17
Figura 5: Representação gráfica da similaridade entre as 379 sequências de nucleótidos dos genes hopM e hopN de estirpes de Helicobacter pylori.---18
Figura 6: Representação gráfica da similaridade entre 147 sequências de nucleótidos do gene hopM, identificando os 4 alelos.---21
Figura 7: Alelos hopM e hopN. (A) Alinhamento representativo das variações ao nível das sequências de aminoácidos do segmento 4 de hopM e hopN. (B) Esquema representativo dos 4 alelos demonstrando que as variantes AIII e AIV são putativos recombinantes das variantes AI e AII. ---21
Figura 8: Gráficos de similaridade entre sequências de nucleótidos do gene hopM por variante alélica. ---21
Figura 9: Distribuição dos alelos por gene, na população geral. ---22
Figura 10: Distribuição dos alelos de cada gene de acordo com a origem geográfica das estirpes de Helicobacter pylori em estudo. ---22
Lista de Figuras
Andrea Santos iii
Figura 11: Frequência das quatro variantes alélicas de acordo com a patologia, na população geral (A) e por origem geografia (B e C). ---23
Figura 12: Frequência dos alelos hopM+hopN de acordo com genótipo de virulência da estirpe na população geral. ---24
Figura 13: Distribuição das quatro variantes alélicas na população ocidental, considerando os genes em conjunto (A) e separados (B e C) de acordo com o genótipo de virulência das estirpes de Helicobacter pylori. ---25
Lista de Tabelas
Andrea Santos iV
LISTA DE TABELAS:
Tabela 1: Primers utilizados na amplificação e sequenciação dos loci hopM e hopN. ---11
Tabela 2: Análise das distâncias moleculares, substituições sinónimas e não sinónimas para as sequências correspondentes ao gene completo e segmentos 1,2,3 e 4 dos genes hopM e
hopN. ---19
Tabela 3: Análise das percentagens de identidade obtidas entre as sequências do segmento 4 de cada um das variantes alélicas de hopM e hopN. ---20
Resumo
Andrea Santos V
RESUMO
Neste trabalho pretendeu-se estudar a diversidade genética e evolução dos genes hopM e hopN, que codificam proteínas de membrana externa de H. pylori, bem como contribuir para o esclarecimento do seu papel na virulência desta bactéria, através da identificação de possíveis associações a patologias específicas e a marcadores moleculares de virulência (cagA e vacAs1).
Foi utilizado um painel de 234 estirpes clínicas e sequências de 23 estirpes de referência, isoladas de doentes de origem geográfica diferente e com diversas patologias gástricas.
A reconstrução filogenética destes dois genes sugere evolução divergente entre eles. Em cada um dos genes, foram identificados dois clusters predominantes, sendo a segregação entre eles motivada pela origem geográfica das estirpes, havendo uma diferenciação clara entre as estirpes de origem ocidental e as de origem asiática.
Foi observada diversidade relativamente ao número de cópias de cada gene e à sua localização genómica, sendo esta diferença notória entre grupos geográficos diferentes. Na população ocidental ambos os genótipos, de cópia única e dupla cópia (mesmo gene ou genes diferentes), foram observados. Contrariamente, na população asiática apenas foram observados os genótipos de cópia única, enquanto no grupo africano apenas os genótipos de dupla cópia foram apresentados.
Apesar de nenhum destes genótipos ser marcador da doença gastroduodenal, observou-se uma associação estatisticamente significativa, na população ocidental, entre a dupla cópia hopN e o genótipo mais virulento, e entre a dupla cópia hopM e o genótipo menos virulento. No grupo de origem oriental, não se observou nenhuma associação estatisticamente significativa com o perfil de virulência da estirpe.
A análise das sequências dos dois genes sugere a sua regulação por variação de fase e ainda a possibilidade da ocorrência de fenómenos de recombinação intragenómica ou intergenómica, podendo os mecanismos de duplicação ou conversão génica estar implicados na regulação da sua expressão.
Os genes hopM e hopN revelaram um elevado grau de similaridade entre si, com uma distância molecular de 0,146±0,006 ao nível da sequência de nucleótidos e de 0,161±0,011 ao nível da sequência de aminoácidos. Dentro de cada gene, verificou-se um grau de conservação ainda superior, com distâncias moleculares e taxas de substituições de nucleótidos muito similares, quando comparados os valores obtidos para cada gene. Verificou-se ainda uma taxa superior de substituições sinónimas (Ks) do que não sinónimas (Ka), sendo a razão Ka/Ks inferior a um, o que aponta para a existência de uma pressão
Resumo
Andrea Santos V
evolutiva para a conservação destes genes, através da acção da selecção negativa ou purificadora.
Foram identificadas quatro variantes alélicas, comuns a ambos os genes, designadas por AI, AII, AIII e AIV. No geral, foram observados dois alelos predominantes, os alelos AI (39,2%) e o AII (42%,), enquanto os alelos AIII e AIV, putativos recombinantes dos alelos AI e AII, foram observados com menor frequência nas estirpes estudadas (12,9% e 5,8%, respectivamente). Na população ocidental e africana todos os alelos foram observados, sendo o mais prevalente o alelo AI (49,8% e 69,6%, respectivamente). Nestas populações não se verificou nenhuma associação entre as variantes alélicas e a patologia. No entanto, na população ocidental, os alelos AII e AIII foram significativamente associados com o genótipo de virulência da estirpe, mais concretamente o alelo AII com o genótipo menos virulento e o AIII com o genótipo mais virulento. Na população asiática, o alelo AII foi o mais prevalente (85,2%) e o alelo AIV não foi observado. Nesta população, não se verificou nenhuma associação com suporte estatístico, entre as variantes alélicas e a patologia gástrica ou o grau de virulência da estirpe.
Globalmente estes resultados sugerem que hopM e hopN fazem parte do grupo de genes que codificam OMPs de H. pylori implicadas tanto na interacção da bactéria com o seu hospedeiro humano, como na variação antigénica, contribuindo para a persistência e sucesso da infecção. Mais, as variantes alélicas podem constituir biomarcadores de virulência da estirpe em determinadas populações.
Abstract
Andrea Santos vi
ABSTRACT
This work aimed to study the genetic diversity and evolution of hopM and hopN genes, which encode outer membrane proteins of H. pylori, as well as contribute to the clarification of its role in the virulence of this bacterium, by identifying possible associations to specific diseases and virulence markers (cagA and vacAs1).
We used a panel of 234 clinical strains and of 23 reference strains sequences isolated from patients from different geographical origins and presenting different gastroduodenal pathologies. The phylogenetic reconstruction of these two genes suggests a divergent evolution between them. It also revealed a geographic segregation in each gene, with two dominant clusters, with a clear differentiation among strains of Western and East Asian origin.
Diversity was observed regarding the number of copies and their genomic localization, with East Asian and Western strains presenting different genotypes. In the Western strains both, the single and double copy genotypes were observed. In contrast, in the East Asian group, only the single copy was presented, while in the African group only the double copy genotype was observed.
While no association was found between these genotypes and gastroduodenal disease, statistically significant associations between the hopN double copy genotype and the more virulent profile, and between the hopM double copy genotype and the less virulent profile, were observed in the Western group. In the East Asian group, there was no association between hopM/hopN genotypes and the virulence profile of the strain.
The sequence analysis of these genes suggests regulation by phase variation. It also indicates possible recombination events, leading to gene duplication or hopM/hopN conversion which may be implicated in the regulation of these genes as well.
The hopM and hopN genes revealed a high degree of similarity between them, with a moelcular distance of 0,146±0,006 at nucleotide level and of 0,161±0,011 at the aminoacid level. Within each gene, there was an even higher degree of conservation, with very close molecular distances and rates of nucleotide substitutions, when comparing the values obtained for each gene. It was observed a higher level of synonymous substitutions (Ks) than non-synonymous (Ka), and the ratio Ka/Ks<1, suggests an evolutionary pressure to maintain the two genes by negative or purifying selection.
Four allelic variantes were identified in both genes and in all strains studied although with different frequencies. In general, two dominant alleles were observed, alleles AI (39,3%) and AII (42%), and two less predominant, putative recombinants of the dominant variants, alleles
Abstract
Andrea Santos vi
AIII (12,9%) e AIV (5,8%). In Western and in African strains all the alleles were observed, althoug the AI allele was the most frequently found (49,8% and 69,6%, respectively). In these populations, there were no correlation between any allele and disease. However in the Western group, AII and AIII alleles were statiscally associated with the virulence genotype of the strain, more specifically, the AII allele with the less virulent genotype and AIII with the most virulent genotype. In East Asian strains, the allele AII was the most prevalent (85,2%) and the allele AIV was not observed. In this group, despite the apparent associations between some allelic variants and certain diseases, no statistical association was observed, nor between hopM/hopN alleles and the virulence genotype of the strain.
Overall, the results of this study suggest that hopM and hopN are good candidates to be part of the pool of H. pylori OMPs implicated in host-bacteria interface and also contributing to the generation of antigenic variability, and thus involved in persistence and success of H.
pylori infection. Moreover, some allelic variants may constitute biomarkers of the virulence of
the strain in some populations.
Introdução
Andrea Santos
1
Capítulo1: Introdução
1. Helicobacter pylori- Considerações gerais
Helicobacter pylori (H. pylori) é uma bactéria Gram negativa espiralada que coloniza o
estômago humano [1,2]
.
Possui cinco a sete flagelos unipolares com bainha e extremidades bulbares [3,4],
essenciais para a motilidade e sobrevivência no estômago.A primeira referência a esta bactéria, remonta a 1893 por Bizzozero, o qual descreve a presença de “espiroquetas” no estômago de gatos e cães [5,6]
.
Desde essa data e até aos anos oitenta, vários relatos foram feitos relativamente à presença deste microrganismo em tecido gástrico, nomeadamente de doentes com úlcera péptica e cancro gástrico ou de amostras colhidas post-mortem [4,5,7]. Só em 1983, o gastrenterologista Barry Marshall e o patologista Robert Warren conseguem a primeira cultura bacteriana a partir de uma amostra gástrica. Em 1989, é então criado o género Helicobacter [3,8].Este género é actualmente composto por mais de 27 espécies [9,10] todas microaerófilas [9]. A maioria das espécies são catalase e oxidase positivas e algumas, como H. pylori, são também urease positiva [9]. A colonização do estômago e do tracto intestinal pelo género
Helicobacter é ubiquitária no reino animal, sendo as espécies intestinais incapazes de
colonizar o estômago e vice-versa. Há assim uma divisão em dois grupos dentro do género, definidos de acordo com o seu tropismo para determinados órgãos [11].
H.pylori tem como nicho o epitélio gástrico humano e de outros primatas [11]. Apesar de
conseguir sobreviver em condições de pH bastante ácidas (pH<5), normalmente coloniza o antro gástrico (parte inferior) onde a produção de ácido é menor. A sobrevivência deste microrganismo nesta gama de pH deve-se à presença da enzima urease, que hidrolisa a ureia em amoníaco e dióxido de carbono, levando à tamponização do microambiente que rodeia a bactéria [2]. Mais concretamente, H.pylori localiza-se abaixo da camada de muco, à superfície das células epiteliais, podendo encontrar-se aderente ou móvel e utiliza o pH do muco como orientação quimiotática [2,12]. Dados mais recentes sugerem que pode também invadir as células da mucosa gástrica, alternando entre o espaço intra e extracelular, aptidão que pode estar implicada na persistência e patogenicidade de H.pylori [13].
2.Características da Infecção por Helicobacter pylori
O conhecimento actual sugere que a aquisição de H. pylori ocorre predominantemente na infância, sendo o contágio intrafamiliar a forma mais comum de transmissão [14-16]. Uma vez estabelecida no estômago, a infecção irá persistir durante toda a vida do hospedeiro se não for tratada, levando ao aparecimento de doença gástrica severa, com as manifestações clínicas a sobrevir sobretudo na idade adulta [17].
Introdução
Andrea Santos
2
Os principais factores de risco relacionados com a aquisição da infecção incluem práticas sanitárias inadequadas, classe social mais baixa, elevada densidade populacional, entre outros [14,17-19]. A prevalência mundial da infecção tem por isso uma variação bastante acentuada entre países desenvolvidos e em desenvolvimento. Nos países em desenvolvimento a taxa de infecção ronda os 50% nas crianças e mais de 90% dos adultos, enquanto nos países desenvolvidos tem vindo a diminuir, atingindo cerca de 20-50% dos adultos e 10% das crianças [20,21]. Em Portugal, a prevalência desta infecção atinge valores muito próximos dos observados nos países em desenvolvimento, atingindo cerca de 80% da população adulta e variando entre aproximadamente 20% nas crianças até aos 5 anos e 50% nas crianças com idades compreendida entre 10 e 15 anos [22-24].
Vários estudos sugerem que a transmissão directa, pessoa a pessoa, é a via mais provável de aquisição da infecção, quer seja por via oral-oral, gástrica-oral ou fecal-oral, tendo sido detectado ADN de H. pylori no vómito, saliva, placa dentária, suco gástrico e fezes [9,14,15,17,21,25,26
]
. Foram também sugeridas outras vias de transmissão, como através da água, de animais e de endoscópios esterilizados incorrectamente [9,14,17,21,27-31].Clinicamente esta infecção é caracterizada pela presença de dores abdominais persistentes, dores epigástricas pós-prandiais, vómitos e indigestão. A análise histológica da biopsia gástrica destes doentes revela sempre a presença de gastrite crónica, que pode evoluir para doença severa (15-20% dos indivíduos infectados), como úlcera duodenal ou úlcera gástrica [17,32,33]. Menos frequentemente (cerca de 0,1- 4% dos casos) [17], a infecção por H.pylori pode também progredir para carcinoma gástrico ou para o linfoma de MALT (Mucosa Associated Lymphoid Tissue). No desenvolvimento destas patologias, para além da infecção por H. pylori, os factores genéticos do hospedeiro e os factores ambientais, desempenham um papel preponderante [17,34,35].
3. Diversidade Genética de Helicobacter pylori
Durante a longa convivência com os seres humanos, H. pylori tem desenvolvido estratégias complexas de adaptação, no sentido de manter a inflamação do epitélio gástrico num limiar que impeça a sua própria eliminação [17,32]. Esta adaptação constante a um hospedeiro específico, traduz-se na grande diversidade encontrada nas estirpes de H. pylori e são o reflexo das inúmeras alterações genómicas sofridas pela bactéria, essencialmente por mecanismos de recombinação e mutação, durante o longo período de infecção [36,37]. Vários métodos moleculares permitiram demonstrar que é quase impossível encontrar dois isolados independentes de H. pylori com perfis genómicos idênticos, o que sugere uma das maiores variabilidades genómicas conhecidas entre as bactérias [36,37,38].
Introdução
Andrea Santos
3
Actualmente existem 31 genomas de H.pylori totalmente sequenciados e anotados, obtidos de isolados clínicos independentes. A sua comparação permitiu verificar que cerca de 10% dos genes presentes no genoma de H.pylori são específicos de estirpe [39-48] e estão localizados em duas regiões genómicas denominadas de zonas de plasticidade 1 e 2 [44,49]. Estas regiões têm um conteúdo em G+C diferente do restante genoma (35%G+C, em vez de 39%-percentagem média de G+C do restante genoma), o que sugere que a sua aquisição possa ter resultado de transferência horizontal. As zonas de plasticidade contêm várias sequências de inserção, bem como genes responsáveis pela transcrição de proteínas com elevada homologia com algumas recombinases, integrases e topoisomerases. A presença destas sequências sugere que estas regiões genómicas estariam implicadas em eventos de recombinação, incluindo a transposição, levando a rearranjos genómicos entre as estirpes [39,44,47,49].
A recombinação genética parece ser o mecanismo mais envolvido na adaptação desta bactéria ao seu hospedeiro, resultando da troca de genes entre estirpes em colonização mista [50-53]. Este mecanismo é possível porque H. pylori é naturalmente competente, permitindo a entrada de ADN exógeno, cromossomal ou plasmídico, de outras estirpes de H.
pylori, normalmente sob a forma de pequenos fragmentos (417 pares de bases(pb)), que
são integrados no cromossoma [52,53]. A ocorrência de recombinação intragenómica, também já foi descrita em H. pylori, especialmente em genes da família das proteínas de membrana externa (OMPs, Outer membrane protein), levando a variações genómicas na ausência de colonização mista [54,55].
As mutações pontuais são outro mecanismo que promove a elevada diversidade genética de H. pylori, estando envolvido, por exemplo, no desenvolvimento de resistências aos antibióticos [51,56]. Muitos genes identificados neste microrganismo contêm sequências repetidas, homopoliméricas ou dinucleótidicas, que podem constituir locais preferenciais para a ocorrência de mutações (hotspots), geradas pelo mecanismo de slipped strand
misparing, durante a replicação do ADN [39-48,57,58]. Este evento constitui um mecanismo
de regulação da expressão genética, alterando a funcionalidade dos genes ou afectando a actividade do promotor, através da alteração da grelha de leitura desses genes [59,60]. Alguns autores sugerem que a elevada taxa de mutação desta bactéria, poderá dever-se também à aparente ausência dos sistemas de reparação do ADN [36,61].
4. Diversidade geográfica de Helicobacter pylori
A comparação de sequências de várias categorias de genes de H. pylori, de diferentes regiões geográficas, tem vindo a permitir identificar alelos distintos em determinados genes, específicos ou mais expressos numa determinada região geográfica [36,38,53,62,63]. Assumindo que a infecção por H. pylori ocorre no seio familiar e que cada estirpe se adapta
Introdução
Andrea Santos
4
a um hospedeiro específico, é provável que a evolução desta bactéria tenha vindo a ocorrer de forma particular em diferentes regiões geográficas [36,38,53]. Alguns autores sugerem que os diferentes isolados analisados, reflectem tanto, as características iniciais da população bacteriana que foi introduzida numa determinada região, como as pressões antigénicas ou variações funcionais a que esteve sujeita, para persistir numa dada população hospedeira [45,53,64]. Vários autores têm por isso utilizado as subdivisões geográficas das estirpes de H. pylori, para traçar as migrações modernas e ancestrais do Homem [53,65]. De uma forma geral, apesar da elevada taxa de recombinação observada, as espécies de H. pylori podem ser divididas em seis populações e várias subpopulações com distribuição geográfica distinta, baseadas nas diferenças de perfis de MLST (Multilocus
sequence typing) considerando sete genes housekeeping. Estas populações são
designadas por:hpEuropa (Europa e Países colonizados por Europeus); hpAfrica1 composta
pelas subpopulações hspWAfrica (África Oriental, África do Sul e América) e hspSAfrica (África do Sul); hpEastAsian que é constituída pela subpopulação hspMaori (Polinésia, Malásia e Tailândia), hspAmerind (Índios Americanos) e hspEAsia (Ásia Oriental);
hpNEAfrica (África do Norte); hpAfrica2 (população muito específica da África do Sul); hpAsia2 (Ásia do Sul e Central) [53,65,66]. Recentemente foi identificada mais uma população, a hpSahul que é constituída por estirpes isoladas de Aborígenes da Austrália e de algumas tribos da Nova Zelândia [67,68].
Estas populações modernas são o resultado de dezenas de milhares de anos de evolução conjunta com o Homem, reflectindo tanto as migrações, como o isolamento geográfico de algumas populações humanas e as recombinações inter-estirpes [2,53,66,69].
5. Factores de virulência de Helicobacter pylori
São vários os factores de virulência já identificados em H. pylori, estando implicados tanto na colonização e lesão do epitélio gástrico como na adaptação e sobrevivência do microrganismo no estômago humano [9]. De entre eles destacam-se os flagelos, a enzima urease e algumas adesinas (BabA, SabA, etc), assim como a presença da forma activa da citotoxina vacuolizante VacA e do ilhéu de patogenicidade cag [9].
5.1 Citotoxina Vacuolizante VacA
A proteína VacA (vacuolating cytotoxin A) é uma toxina secretada por algumas estirpes de H.pylori tendo sido inicialmente identificada devido à sua actividade vacuolizante das células epiteliais gástricas [17,70]. A citotoxina é constituída por dois domínios, p33 e p55 que são clivados após secreção da toxina pela bactéria. O domínio p55 medeia a ligação às células do hospedeiro, enquanto o p33, em conjunto com o N-terminal do domínio p55, é responsável pela vacuolização celular [69,71,72]. Dependendo do pH do meio, a toxina pode
Introdução
Andrea Santos
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apresentar-se sob a forma de oligómeros ou monómeros que são introduzidos na camada lipídica da membrana das células epiteliais, formando canais iónicos [73,74]. Vários efeitos celulares têm sido descritos para a proteína VacA, quer nas células epiteliais, interferindo com a sua permeabilidade ou levando à formação de vacúolos ou à apoptose, quer em células do sistema imunitário, interferindo com a proliferação das células T ou com a apresentação do antigénio pelas células B [69,74-76]. Embora o gene vacA esteja presente em 100% dos isolados de H. pylori, exibe um polimorfismo significativo que lhe confere diferentes níveis de expressão e toxicidade [17,69,77]. Apresenta uma estrutura em mosaico, resultante da diversidade alélica observada em três regiões distintas do gene: a região 5’(s) que codifica o péptido sinal e para a região N-terminal da proteína madura (alelos s1 ou s2), a região média (m) que codifica parte do domínio p55 (alelos m1 ou m2) e a região intermédia (i) responsável pelo domínio p33 (alelos i1 ou i2) [12,69,78]. Todas as combinações entre os alelos são possíveis, no entanto a combinação mais tóxica é a s1m1i1 que corresponde a uma forma completamente activa da toxina, encontrada frequentemente em estirpes isoladas de doentes com úlcera péptica e carcinoma gástrico [17,69], sendo a combinação s2m2i2 a forma inactiva devido à presença de uma extensão hidrofílica no N-terminal da proteína, que bloqueia as actividades de vacuolização e formação de poros [69,79].
5.2 Ilhéu de patogenicidade cag
O ilhéu de patogenicidade cag (cag PAI) é uma região de aproximadamente 40 kb que contém cerca de 31 genes implicados na virulência das estirpes de H.pylori [5]. Este ilhéu pode estar ausente, presente ou não funcional, devido à interrupção do cag PAI pela inserção de uma sequência IS605 ou por um grande fragmento de ADN cromossomal [5,69,73].
Um cluster específico destes genes codifica componentes do sistema de secreção do tipo IV (SST4), está envolvido no desencadear da resposta inflamatória e é responsável pela injecção de moléculas bacterianas no interior das células do hospedeiro, como a proteína CagA e o peptidoglicano [17,60,80-82]. O gene cagA, presente em cerca de 50-70% das estirpes isoladas em países Ocidentais e em 90% das estirpes da Ásia Oriental, tem uma associação epidemiológica forte com a úlcera duodenal e o carcinoma gástrico [83-87]. Ao ser translocada para o interior das células epiteliais gástricas, a proteína CagA é fosforilada em determinadas sequências repetidas (motivos EPIYA), por cinases do hospedeiro [88,89], interferindo nas vias de sinalização das células epiteliais gástricas e alterando os seus padrões morfológicos e de proliferação [90-92]. A interacção entre o SST4 e as células hospedeiras resulta na indução de citocinas pró-inflamatórias in vivo [94,95], entre as quais a interleucina-8 (IL-8) que é o principal mediador da inflamação na mucosa gástrica [69,96].
Introdução
Andrea Santos
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5.3 Proteínas da membrana externa
As proteínas da membrana externa bacterianas (OMPs) estão envolvidas na interacção entre a bactéria e o meio envolvente, desempenhando um papel essencial quer na sua sobrevivência, quer na sua patogenicidade. Dependendo das espécies, estas proteínas podem estar envolvidas no transporte de moléculas, funcionando como porinas, na aderência e colonização do hospedeiro ou na evasão à resposta imunitária [97]. A análise das sequências do genoma das estirpes de referência J99 e 26695 revelou a presença de uma grande família de genes que codificam proteínas da membrana externa em H. pylori, correspondendo a cerca de 4% do total de regiões codificantes de cada estirpe [39,58]. Foram identificadas cinco famílias de genes parálogos, contendo entre 3 e 33 membros que variam em tamanho entre 27 e 135 kDA [97] (Figura 1).
h o rD 0.05 h o rD 0.05 fecA hom frpB hof hef hop e hor
Figura 1: Análise filogenética das cinco famílias de parólogos da estirpe de referência J99 [Adaptado
de 98]. O tracejado identifica os 5 pares de genes duplicados.
A família 1 é constituída pelas proteínas Hop que contêm as regiões N e C terminais altamente conservados e pelas proteínas Hor que não têm o motivo Hop no N-terminal [97]. Nesta família, as regiões conservadas podem ter estruturas e funções semelhantes, tais como a integração da proteína na membrana externa ou a interacção proteína-proteína com
Introdução
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outros membros da família, enquanto as regiões variáveis parecem estar envolvidas em funções específicas, como por exemplo, a capacidade de agir como adesina ou porina [97]. Sabe-se actualmente que as proteínas HopA e HopE funcionam como porinas [99], enquanto as proteínas HopB (AlpB), HopC (AlpA), HopS (BabA), HopP (SabA), HopZ e HopH (OipA), funcionam como adesinas [96,100,101,102].
A família 2 é constituída por oito membros sem função conhecida e que exibem um elevado nível de similaridade ao nível das proteínas (>95%) [97].
A terceira família é constituída por 4 membros (HomA, HomB, HomC e HomD) que apresentam os terminais C e N conservados e domínio central variável, estando envolvidos tanto na adaptação a hospedeiros específicos como na virulência de H. pylori. Até à data, os membros melhor caracterizados desta família, são as proteínas HomA e HomB. O gene
homB é 90% homólogo com o homA [63,96,97]. Estudos recentes sugerem que o gene homB constitui um novo factor de virulência dado a sua associação com a doença ulcerosa
péptica, enquanto o gene homA, foi correlacionado com a dispepsia não ulcerosa [96,102,103]. O genótipo homB parece ainda constituir um marcador molecular na distinção entre o cancro gástrico e a úlcera péptica [104]. Foi também demonstrado que a proteína HomB é antigénica e é capaz de activar a secreção da IL-8 in vitro, através do seu papel como adesina [96,103].
A família 4 (FecA e FrpB) tem homologia com OMPs de outras bactérias, envolvidas na regulação do ferro, enquanto a família Hef (família 5) é constituída por três membros (HefA, HefD e HefG) altamente conservados, homólogos a genes que codificam sistemas de efluxo [97].
Dada a importância destas proteínas na relação entre bactéria e hospedeiro, H. pylori dispõe de vários mecanismos implicados na regulação e diversidade ao nível da expressão das OMPs, que fazem variar a composição proteica da membrana externa, bem como a antigenicidade dos seus constituintes. De entre esses mecanismos destacam-se a duplicação, delecção ou conversão génica, a regulação por variação de fase, a diversidade alélica e a presença de genes específicos de estirpe.
5.3.1 Mecanismos de regulação da expressão das proteínas da membrana externa
A análise das sequências de diversas OMPs revelou que alguns genes hop apresentam duas cópias no mesmo genoma. Ambas as estirpes de referências 26695 e J99 contêm 5 pares de genes duplicados: hopJ/hopK, hopM/hopN, hopS(babA)/hopT(babB), hopP(sabA)/hopO(sabB) e homA/homB que também estão presentes na maioria das
estirpes clínicas [96,97](Figura 1). A presença destes genes duplicados pode dever-se a processos evolutivos em curso onde os genes duplicam, por recombinação intragenómica, acumulando posteriormente mutações para divergirem gradualmente em genes que
Introdução
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codificam novas proteínas, funcionalmente distintas. Este processo é provavelmente similar ao que gerou a família Hop inteira [97]. Foi também sugerido que a duplicação destes genes representaria uma forma de regulação da expressão de proteínas para a adaptação às mudanças na inflamação e na resposta imunitária do hospedeiro [55,97], bem como na evolução da doença gástrica. Por exemplo, o genótipo de dupla cópia homB foi associado à úlcera péptica, o que sugere que a duplicação não é um fenómeno aleatório e pode constituir uma vantagem biológica facilitando a adaptação a um hospedeiro específico [96].
Para além da duplicação, alguns genes hop contêm repetições de dinucleótidos CT na região 5’ e são regulados por variação de fase [97,101,102,105]. Durante a replicação do ADN, na zona de repetições pode ocorrer um desemparelhamento entre as bases complementares (misparing), o que leva ao “deslize” da polimerase na grelha de leitura, resultando na adição ou delecção de unidades CT. Estas alterações no número de repetições podem originar a adição ou remoção de codões STOP, alterando a expressão da proteína devido à mudança de fase on/off [60]. Os genes já identificados regulados por este mecanismo em H. pylori são: babB, sabA e sabB, hopZ, oipA e homB. A variação de fase como mecanismo de diversidade é utilizado por várias espécies bacterianas e tem mostrado contribuir para a variação antigénica e virulência durante a infecção [58,96].
A variação alélica é também um mecanismo de diversidade em vários genes de H. pylori, como babA, hopQ, hopZ, homA e homB [63,96,102,106,107]. Em todos estes genes é observado um perfil conservado de segmentação, com a região variável localizada na região média do gene e com a existência de pelo menos duas variantes alélicas conservadas. Estas variantes podem associar-se em alguns casos, a determinadas apresentações clínicas da infecção e podem também contribuir para a diversidade antigénica [106]. Por exemplo no gene hopQ, a família alélica do tipo I é mais frequente em estirpes isoladas de doentes com úlcera, estando associada ao genótipo virulento, cagPAI+/vacAs1 [106]. No entanto, nos genes babA e babB, foram descritas 3 e 5 variantes alélicas respectivamente, não estando nenhuma delas relacionadas com o genótipo de virulência ou com a capacidade de adesão da estirpe [107]. O mesmo acontece com os genes homA e homB [63]. Assim, nestes casos a variação alélica parece ser um mecanismo utilizado por H. pylori para originar estirpes com diferentes perfis antigénicos que vão permitir evadir-se à resposta imunitária [63,107].
Para além de todos estes mecanismos, algumas estirpes contêm ainda genes específicos que codificam OMPs, tais como, hopU e homB, fenómeno que pode representar uma vantagem adaptativa a hospedeiros específicos [97].
Objectivos
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Capítulo 2: Objectivos
As OMPs estão envolvidas na relação entre H. pylori e a mucosa gástrica humana, contribuindo para a colonização e persistência da infecção [108].
Aproximadamente 4% do genoma de H. pylori contém informação para a codificação de pelo menos 32 OMPs [97,109], sendo que as principais proteínas associadas com a patogenicidade e adesão de H. pylori são: BabA, SabA, OipA, AlpA, AlpB e HomB [59,96,103,109,110]. A adesina BabA interage com as células epiteliais gástricas, através da ligação ao antigénio do grupo sanguíneo Lewis b (Leb), que também é produzido ao nível destas células [108,110]. A interacção BabA-Leb levou a que esta OMP tenha sido considerada, até à data, a principal adesina de H. pylori [108-110]. O gene babA tem um gene parólogo, babB, cuja função é ainda desconhecida [110]. Foi demonstrado no entanto que a recombinação entre os dois loci contribui para a dinâmica de adesão da bactéria às células gástricas, aumentando a sua fitness [113].
Um estudo do “complexoma” de H. pylori mostrou que BabA e BabB formam complexos com outras OMPs, nomeadamente HopM e HopN [109]. Estudos recentes sugerem que nenhuma das proteínas BabA ou BabB é capaz de induzir resposta imunitária em macacos, nem são os antigénios imunodominantes em humanos [109,111,112]. Uma hipótese que poderia explicar este facto seria a de que as proteínas de membrana que interagem com BabA ou BabB, por exemplo, HopM e HopN, poderiam mascarar os epítopos daquelas proteínas e consequentemente serem elas próprias expostas e assim antigénicas [109]. Esta hipótese é ainda corroborada pelo facto de HopN/HopM terem demonstrado reactividade contra soros de pacientes positivos para H. pylori [109,113]. Estes dados sugerem que estas proteínas poderão desempenhar um papel importante na relação entre a bactéria/hospedeiro, nomeadamente, constituindo prováveis antigénios e consequentemente importantes alvos vacinais; por outro lado, o facto de formarem complexos com BabA poderá indiciar o seu papel na adesão de H. pylori à célula epitelial gástrica [109,110].
Este trabalho tem como objectivo o estudo dos genes hopM e hopN, nomeadamente a sua diversidade genética, a análise filogenética e evolutiva. Pretende-se também contribuir para o esclarecimento do seu papel na virulência de H. pylori, através da identificação de possíveis associações destes genes a patologias específicas e a marcadores moleculares de virulência. Para tal, foi estudada uma amostra de estirpes clínicas de H. pylori, isoladas de biopsias gástricas de doentes de diferentes regiões geográficas, apresentando diversas patologias gástricas, nomeadamente, úlcera péptica, gastrite e cancro gástrico. Foram também utilizadas as sequências nucleotídicas de 23 estirpes de referência de H. pylori, cujos genomas já se encontram sequenciados e anotados.
Materiais e Métodos
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Capítulo 3: Materiais e Métodos
1.Estirpes de Helicobacter pylori e material genómico
Foram estudadas 234 estirpes clínicas de H. pylori isoladas de biopsias gástricas de doentes de diversas origens geográficas, apresentando diferentes patologias gastroduodenais, nomeadamente dispepsia não ulcerosa com gastrite (G), doença ulcerosa péptica (UP) gástrica ou duodenal, e cancro gástrico (CG) (Anexo I). As estirpes de H. pylori estudadas pertencem à colecção de estirpes bacterianas da Unidade de
Campylobacter/Helicobacter do Departamento de Doenças Infecciosas (DDI) do Instituto
Nacional de Saúde Dr. Ricardo Jorge (INSA); o material genómico de algumas estirpes de
H. pylori não pertencentes à colecção do INSA, foi gentilmente cedido pelo Doutor Yoshio
Yamaoka, Department of Medicine, Michael E. DeBakey Veterans Affairs Medical Center and Baylor College of Medicine, Houston, Texas, EUA.
Foram ainda utilizadas três estirpes de referência de H. pylori, as estirpes 26695 (ATCC 700392), J99 (ATCC 700824) e HPAG1, cujos genomas já se encontram sequenciados, como controlos das reacções de amplificação e de sequenciação [39,46,58].
Cultura das estirpes de Helicobacter pylori
As estirpes de H. pylori conservadas a -80ºC em meio TSB com glicerol, foram cultivadas em meio HP selectivo e não selectivo (Biogerm, Maia, Portugal), e incubadas a 37ºC numa atmosfera de microaerófilia (5% de O2; 10% de CO2; 85% de N2), durante 48 horas. Uma
placa de cultura foi utilizada para extracção de ADN e a outra para congelar a estirpe de modo a repor a colecção de bactérias (Anexo II).
Extracção de ADN genómico
A extracção de ADN genómico foi realizada utilizando o kit comercial QIAamp® DNA Mini (Qiagen GmbH, Hilden, Alemanha), de acordo com as instruções do fabricante [114].
2. Avaliação da diversidade genómica dos genes hopM e hopN
Para o estudo da diversidade genómica dos genes hopM e hopN, na amostra de estirpes em estudo, foram identificados os loci de cada gene alvo, por análise dos genomas de estirpes sequenciadas (Anexo III), e desenhados oligonucleótidos iniciadores (doravante designados por primers) nas respectivas regiões genómicas flaqueantes e no interior dos genes (Tabela 1). Todos os primers descritos neste trabalho foram desenhados com recurso ao software Web Primer3 (http://www.broad.mit.edu/cgi-bin/primer/primer3_www.cgi). Procedeu-se depois à amplificação e sequenciação de cada locus, pelas técnicas de PCR e sequenciação.
A reacção de amplificação foi realizada num volume final de 25μl contendo: 1μl de ADN, Tampão 1X (Bioline Ltd, Londres, Reino Unido), 2,8mM de MgCl2, 200μM de cada dNTP
Materiais e Métodos
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(Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemanha), 0,5μM de cada primer, 1U de
Bio-X-ActTM Long DNA Polimerase e água destilada estéril. Em cada ensaio usou-se um controlo
negativo constituído por água destilada estéril, e como controlos positivos o ADN das três estirpes de referência. A reacção de amplificação consistiu num ciclo inicial de 5min a 95ºC e 1min a 57ºC, seguido de 35 ciclos constituídos por extensão de 3min a 68ºC, desnaturação a 95ºC durante 30s e hibridação dos primers a 57ºC durante 30s, com um ciclo de extensão final de 10min a 68ºC, realizada num Termociclador GeneAmp® PCR
System 9700 (Applied Biosystems Inc., Foster City, EUA).
Tabela 1: Primers utilizados na amplificação e sequenciação dos loci hopM e hopN. Os primers
internos utilizados são os mesmos nas duas regiões genómicas estudadas.
Região Genómica Primer Sequência (5’ 3´) TM (ºC)
hopM (primers externos) hopMF2 GCCATTCTTTTTGTATCTTTT 50,1
hopMR2EXT CTGTTGATTCTTCCATAAAAAACTC 50,6
hopN (primers externos) hopNF2 TCCCTATCGCTTATAGCTTGA 55,9
hopNR1 TATGCGGGTATTGGTTTTGC 45
hopMR4 CGCTAAAGCCACAGCTTGATA 47
hopMR3 GCGTTTTCATTAGCCTTAAG 43
hopM/hopN hopMR5 CCTTAACCCGCACCTTCT 56
(primers internos) hopMR6 AGGCCCTTGAATGCTGTG 56
hopMR7 TAGGGCCAGGGCCACAGC 52
hopMR8 GGTTTAAAGCGGTTTGGAT 42
Os produtos de amplificação foram detectados por electroforese em gel de agarose 1% e corado com GelRedTM (1:10000) (Biotium Inc., Hayward, EUA), em tampão de corrida TBE 0,5X (Anexo IV). Foi utilizado como marcador de peso molecular o 1Kb DNA Ladder com fragmentos de ADN de 500 pb a 12 Kb (Invitrogen S.A, Barcelona, Espanha).
Os produtos de amplificação foram purificados com o kit QIAquick® PCR Purification Spin
(Qiagen GmbH, Hilden, Alemanha), segundo instruções do fabricante [115] e seguidamente sujeitos a sequenciação enzimática utilizando o Big Dye® Terminator (Applied Biosystems
Inc.) e o Sequenciador automático Genetic Analyser Abi-Prism 3130 xl (Applied Biosystems Inc.). A reacção de sequenciação foi realizada num volume final de 10μl contendo: 2μl de
Big Dye® V1.1 (Applied Biosystems Inc.), 0,5μM de primer, 0,5 a 7,5μl de ADN purificado e
água destilada estéril. O programa de sequenciação consistiu num ciclo inicial de desnaturação de 30s a 96ºC, seguido de 25 ciclos constituídos por uma desnaturação de 10s a 96ºC, uma hibridação de 5s a 45ºC e uma extensão de 4min a 60ºC. Estas reacções foram realizadas num Termociclador GeneAmp® PCR System 9700 (Applied Biosystems
Inc.). Após a reacção cíclica os produtos foram entregues na Unidade de Tecnologia e Inovação do INSA para sequenciar. As sequências de nucleótidos obtidas foram visualizadas no programa Chromas LITE (Version 2.01) e comparadas recorrendo ao programa MultAlin (http://multalin.toulouse.inra.fr/multalin/). Em seguida, foram traduzidas
Materiais e Métodos
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em sequências de aminoácidos correspondentes recorrendo ao programa EMBOSS transeq (www.ebi.ac.uk/emboss/transeq/).
3. Avaliação da variabilidade genética, análise filogenética e dos parâmetros evolutivos dos genes hopM e hopN
De modo a avaliar a variabilidade genética e os parâmetros filogenéticos e evolutivos, foi realizada uma análise bioinformática das sequências nucleotídicas e respectivas sequências de aminoácidos previstas. Foram também utilizadas as sequências nucleotídicas das 23 estirpes de referência de H. pylori (Anexo III).
A variabilidade genética foi determinada a partir de gráficos de similaridade, utilizando alinhamentos gerados pelo programa BioEdit Sequence Alignment Editor 7.0.9 (http://www.mbio.ncsu.edu/BioEdit/bioedit.html), com recurso à aplicação do programa
SimPlot 3.5.1 (http://sray.med.som.jhmi.edu/SCRoftware/simplot/).
A análise da filogenia foi realizada através de árvores filogenéticas criadas pelo programa
MEGASoftware 4.0.2 (Molecular Evolutionary Genetics Analysis)
(http://www.megasoftware.net/), a partir de alinhamentos múltiplos das sequências de nucleótidos e respectivas sequências de aminoácidos previstas, obtidos no BioEdit
Sequence Alignment Editor 7.0.9 pela aplicação ClustalW. Foi utilizado o teste de filogenia Bootstrap Neighbor Joining Tree com 1000 réplicas e o modelo de Kimura 2-parameter
[63,116,117].
Os parâmetros evolutivos foram determinados recorrendo ao programa MEGASoftware 4.0.2, utilizando alinhamentos também gerados no BioEdit Sequence Alignment Editor 7.0.9, calculando-se: distância molecular pelo método p-distance, frequência de substituições sinónimas (Ks), frequência de substituições não-sinónimas (Ka) e razão entre substituições não-sinónimas e substituições sinónimas (Ka/Ks), pelo método de Nei Gojobori [63,116].
4. Análise Estatística
Para testar associações entre duas variáveis qualitativas, foram utilizadas tabelas de contingência de 2x2, recorrendo-se ao teste Exacto de Fisher com recurso à aplicação do programa EpiInfoTM 3.5.3. (http://www.cdc.gov/epiinfo). Todos os testes utilizados foram bilaterais. Foi estabelecido em 5% o nível de significância dos testes, tendo-se rejeitado a hipótese nula quando a probabilidade de significância do teste (p value) foi inferior a este valor. Os valores p apresentados referem-se à comparação entre ter ou não o gene ou um determinado alelo por patologia ou por genótipo de virulência (genótipo de virulência ou genótipo não virulento).
Resultados
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Capítulo 4: Resultados
1.Avaliação da diversidade genómica dos genes hopM e hopN
Considerando a classificação da estirpe de referência HPAG1, os genes hopM e hopN, estão localizados no locus HPAG1_0230 (locusM) e no locus HPAG1_1289 (locusN), respectivamente. Nas estirpes clínicas foram obtidos produtos de amplificação que variaram entre 2604-2616 pb para o locusM e 2559-2589 pb para o locusN. Neste último, verificou-se ainda para algumas estirpes (24,6%), a amplificação de produtos de menor peso molecular, variando entre 200 e 1500 pb. Todos estes produtos de amplificação foram posteriormente sequenciados e as respectivas sequências de nucleótidos foram analisadas recorrendo ao programa MultAlin, sendo posteriormente traduzidas para as sequências de aminoácidos correspondentes, recorrendo ao programa EMBOSS transeq.
Verificou-se em todas as estirpes estudadas (clínicas e de referência), que os genes
hopM e hopN ocupavam ambos os loci (M/N) indiferentemente. Os produtos de menor
tamanho localizados no locusN correspondiam a uma região intergénica (estirpes asiáticas), a uma ORF (Open Reading Frame) mais curta com homologia com a região 3’ dos genes
hopM e hopN (estirpes ocidentais) ou ainda a uma ORF que correspondia à fusão entre a
região codificante do péptido sinal de HopM e HopN e a região 3’ de uma DNA-metiltransferase de H. pylori (dnpA) (estirpes asiáticas).
Foram obtidas 468 sequências a partir de 234 estirpes clínicas, 132 correspondendo ao gene hopM, 206 ao gene hopN, 115 Loci “vazios” e 15 sequências que não pertenciam a nenhuma destas três categorias e que serão descritas seguidamente. Os dois genes foram identificados com recurso à aplicação BLAST, Basic Local Alignment Search Tool (http://blast.ncbi.nml.nih.gov/Blast.cgi). Apesar do elevado grau de similaridade entre hopM e
hopN (94% similaridade, calculado para as sequências da estirpe de referência HPAG1), os
genes diferenciam-se ao nível da extremidade 5’ na região compreendidade entre os 396 e 900 pb (Anexo V e Figura 5).Foram identificadas três estirpes ocidentais que apresentavam uma sequência que correspondia a uma fusão entre os dois genes (quimeras hopM/N) (Anexo V). Nestas três estirpes, duas apresentavam a quimera apenas no locusM, enquanto a outra apresentava este putativo gene recombinante em ambos os loci.
Ambos os genes possuem na extremidade 5’ repetições de dinucleótidos CT. Verificou-se em cinco estirpes clínicas e numa estirpe de referência (6/234, 2,6%) a existência de proteínas putativas truncadas em ambos os loci, devido a alterações no número de repetições.
Resultados
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1.1 Distribuição dos genes hopM e hopN por região geográfica
Foram incluídas neste trabalho as sequências hopM/hopN de 226 estirpes clínicas e 23 estirpes de referência (n=249 estirpes) (Anexos I e III). Pelo menos uma cópia de hopM ou
hopN foi detectada em todas as estirpes analisadas. Foi observada diversidade
relativamente ao número de cópias de cada gene e à sua localização genómica (Figura 2). A distribuição dos genes hopM e hopN relativamente ao número de cópias e loci que ocupam, por origem geográfica, encontram-se representados na figura 2. Nas estirpes ocidentais os genótipos de cópia única e dupla cópia (mesmo gene e genes diferentes) foram observados, sendo o genótipo de dupla cópia mais prevalente. Contrariamente, nas estirpes de origem asiática, apenas o genótipo de cópia única foi observado, enquanto na população africana todas as estirpes estudadas possuíam o genótipo de dupla cópia. Verificou-se ainda que no caso de cópia única, o gene ocupava sempre o locusM enquanto no caso de dupla cópia os dois genes ocupavam indiferentemente os dois loci.
A) ESTIRPES OCIDENTAIS (n=167) Genótipo cópia única
Locus M Locus N
Genótipo dupla cópia
Locus M Locus N hopM hopN hopN hopM 17% 11,3% hopM hopM hopN hopN 46,5% hopN hopM x x 18,9% 6,3% x x B) ESTIRPES ASIÁTICAS (n=71) Locus M Locus N hopN hopM 31,2% 68,8% C) ESTIRPES AFRICANAS (n=11) Locus M Locus N hopM hopN hopN hopM 50% 16,7% hopM hopN hopN hopM 33,3% Genótipo cópia única
Genótipo dupla cópia
Figura 2: Distribuição do número de cópias e localização genómica de hopM e hopN, por região geográfica. As
percentagens indicam a frequência de cada genótipo nas populações Ocidental, Asiática e Africana. O X representa ausência do gene hopM ou hopN completo.
1.2 Distribuição dos genes hopM e hopN por patologia
Para realizar esta análise foram incluídas apenas as estirpes para as quais havia informação sobre a situação clínica do doente de onde tinha sido isolada (n= 224), com a seguinte distribuição: 127 (56,7%) casos de úlcera péptica (UP), 82 (36,6%) de gastrite (G) e 15 (6,7%) de cancro gástrico (CG). Todas as estirpes com uma cópia de cada gene no seu genoma (71/224, 31,7%) foram numa primeira abordagem eliminadas.
Verificou-se que o gene hopN foi o mais prevalente em todas as patologias, estando presente em 73,3% das estirpes de UP (63/86), em 62,5% das G (35/56) e em 90,9% das estirpes de CG (10/11).
Resultados
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Com o objectivo de perceber se, para além da presença dos genes, a forma como eles se distribuem no genoma (número de cópias e loci que ocupam), estaria associada com patologias específicas, foi efectuada a análise da distribuição dos diferentes genótipos por patologia. Considerando todas as estirpes, verificou-se que o genótipo mais frequentemente encontrado na UP foi a cópia única hopN (35,4%), seguido da dupla cópia MN (31,5%). Na gastrite, os genótipos mais frequentes foram a dupla cópia MN (31,7%) e a cópia única
hopN (26,8%) e no CG, o genótipo mais frequentemente encontrado foi o de cópia única hopN (76,9%).
Posteriormente efectuou-se o mesmo tipo de análise por origem geográfica (Figura 3). Na população ocidental o gene hopM foi mais frequentemente encontrado na G do que na UP, enquanto o hopN foi mais frequente na UP. Na população asiática, o gene hopM foi mais frequentemente identificado na G enquanto o gene hopN foi mais prevalente na UP e CG. Na população africana todas as estirpes foram isoladas de UP sendo o gene hopN o mais frequente (n=10, 85,7% hopN). Apesar de existir uma associação aparente entre a presença do gene e a patologia, nenhuma associação é suportada estatisticamente, uma vez que o
hopN é o gene mais prevalente em todas as populações.
População Ocidental (n=83) A) 0 10 20 30 40 50 60 70 80 hopM hopN 26,1% 73,9% 37,8% 62,2% UP G % d e e s ti rp e s p o s iti v a s (n=46) (n=37) 0 10 20 30 40 50 60 70 80 hopM hopN 29,7% 70,3% 35% 65% 23,1% 76,9% UP G CG População Asiática (n=70) B) (n=37) (n=20) (n=13) % d e e s ti rp e s p o s iti v a s
Figura 3: Frequência dos genes hopM e hopN nas estirpes de H. pylori de origem ocidental (A) e asiática (B) de
acordo com a patologia (úlcera péptica (UP), gastrite (G) e cancro gástrico (CG)). As percentagens foram calculadas para cada patologia.
Relativamente ao genótipo hopM/hopN, na população ocidental o mais prevalente foi a dupla cópia MN tanto nas estirpes isoladas de UP (47,5%, 38/80) como nas de G (42,6%, 26/61). Na população asiática, o genótipo mais prevalente nas estirpes isoladas de UP foi a cópia única hopN (70,3%, 26/37 UP), assim como em 65% (17/20) das G e em 76,9% (10/13) dos CG. Na população africana, as estirpes foram todas isoladas de doentes com UP, sendo o genótipo mais frequente a dupla cópia hopN (6/10, 60%). Assim, apesar de se verificarem diferenças relativamente à prevalência dos diferentes genótipos por origem geográfica, esse genótipo é também o mais encontrado em todas as patologias nessa população.
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1.3 Associação dos genes hopM e hopN com o genótipo de virulência Foram estudadas 222 estirpes com o objectivo de verificar a associação entre a presença de hopM e hopN com outros genes de H.pylori associados à virulência, nomeadamente a presença do gene cagA, marcador da presença do ilhéu de patogenicidade cag e do alelo s do gene vacA. Definiram-se como estirpes virulentas as estirpes positivas para o gene cagA e para o alelo citotóxico vacAs1, e estirpes não virulentas as estirpes negativas para o gene cagA e com o alelo vacAs2 (alelo não citotóxico) [79,83]. De uma forma geral, verificou-se a associação entre a presença de dupla cópia M e da dupla cópia MN e o genótipo não virulento (57,9% MM vs 26,6%; 47,2% MN vs 20,7% outros genótipos, respectivamente) e a associação entre a cópia única N e genótipo virulento (88,7% cópia única hopN vs 62,3%), sendo estas associações suportadas estatisticamente (p=0,01, p<0,001 e p<0,001, respectivamente). Por origem geográfica, na população ocidental observou-se que 80,8% das estirpes com dupla cópia N eram virulentas, contra 56,5% de outros genótipos (p=0,03) e que 64,7% das estirpes com dupla cópia M eram não virulentas, contra 37,5% de outros genótipos (p=0,05). Na população asiática, não foi possível observar qualquer tipo de associação com o genótipo de virulência, uma vez que todas as estirpes são cagA e vacAs1 positivas. Na população africana, 60% das estirpes virulentas apresentam a dupla cópia N no seu genoma, não tendo no entanto esta associação suporte estatístico, provavelmente devido ao pequeno número de estirpes estudadas.
2.Análise filogenética, avaliação da variabilidade genética e parâmetros evolutivos dos genes hopM e hopN
Para todas as estirpes em estudo (n=249), foi obtida uma sequência codificante em pelo menos um dos loci analisados. Todas as sequências obtidas foram identificadas por homologia com o respectivo gene, hopM ou hopN, recorrendo à aplicação BLAST. As sequências correspondentes ao gene hopM variaram entre os 2082 e 2097 pb, enquanto para o gene hopN variaram entre 2075 e 2100 pb.
A reconstrução filogenética das 379 sequências obtidas em ambos os loci (147 hopM e 232 hopN) mostra dois ramos independentes para cada um dos genes o que sugere evolução divergente (Figura 4). Dois clusters predominantes foram identificados em ambos os genes, sendo a segregação entre eles motivada pela origem geográfica das estirpes (bootstrap=86). O cluster I foi identificado como grupo Ocidental e é composto por estirpes isoladas de Portugal, França, Alemanha, Suécia, Brasil, Colômbia e EUA, enquanto o cluster II foi identificado como grupo Oriental/Ameríndio e é composto por estirpes originárias da Ásia Oriental (Japão, Singapura e Coreia do Sul) e da América do Sul (Peru e Venezuela) (Figura 4). As estirpes africanas (Burquina-Faso, Gâmbia e África do Sul) encontram-se
