MESTRADO EM AGROECOSSISTEMAS
DISSERTAÇÃO
Sustentabilidade da Produção de Alecrim- pimenta (Lippia sidoides Cham.):
Micropropagação visando a conservação in vitro
Andréa Santos da Costa
2006
PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA
NÙCLEO DE ESTUDOS E PÓS-GRADUAÇÃO EM RECURSOS NATURAIS MESTRADO EM AGROECOSSISTEMAS
SUSTENTABILIDADE DA PRODUÇÃO DE ALECRIM- PIMENTA (Lippia sidoides Cham.): MICROPROPAGAÇÃO
VISANDO A CONSERVAÇÃO IN VITRO
ANDRÉA SANTOS DA COSTA
Sob a Orientação do Professor Arie Fitzgerald Blank
Dissertação apresentada a Universidade Federal de Sergipe, como parte das exigências do Núcleo de Pós-Graduação e Estudos em Recursos Naturais – NEREN, para obtenção do título de Mestre em Agroecossistemas.
São Cristóvão - SE Fevereiro de 2006
FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA BIBLIOTECA CENTRAL UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE
BIBLIOTECÁRIA: NELMA CARVALHO - CRB -5/1351 Costa, Andréa Snatos da
C837s Sustentabilidade da produção de Alecrim-Pimenta (Lippia sidoides Cham.) : micropropagação visando a conservação in vitro / Andréa Santos da Costa. - - São Cristóvão, 2006.
56f. : il.
Dissertação (Mestrado em Agroecossistemas) – Núcleo de Pesquisa e Pós-Graduação e Estudos em Recursos naturais, Universidade Federal de Sergipe.
Orientador: Profº. Dr.º. Arie Fitzgerald Blank .
1. Plantas medicinais – Alecrim-Pimenta – Conservação in vitro. 2.
Lippia sidoides. 3. Desenvolvimento sustentável – Caatinga – Nordeste brasileiro. 4. Biodiversidade. 5. Agroecossistemas. I. Título.
CDU 633.88(1-18+81)
UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE - UFS
PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA – POSGRAP
NÚCLEO DE POS-GRADUAÇÃO E ESTUDOS EM RECURSOS NATURAIS - NEREN
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM AGROECOSSISTEMAS
ANDRÉA SANTOS DA COSTA
Dissertação submetida ao Programa de Pós-Graduação em Agroecossistemas, como requisito parcial para obtenção do título de Mestre em Agroecossistemas
DISSERTAÇÃO APROVADA EM 21/02/2006
e aos meus irmãos, que colaboraram com compreensão, amor e carinho nesta jornada
.
OFEREÇO
Ao meu esposo Helenilson e a minha filha Anne Camile que sempre estiveram comigo.
DEDICO
À Universidade federal de Sergipe (UFS), pela oportunidade de realização do Curso de Mestrado.
Ao CNPq, pelo financiamento do projeto por mim executado.
Á CAPES, pela bolsa a mim concedida.
Ao Prof. Dr. Arie Blank pela confiança em mim depositada, pela amizade e orientação durante esse período.
Aos professores do Curso de Mestrado em Agroecossistemas, pelos ensinamentos e experiências transmitidas.
À Embrapa Tabuleiros Costeiros, na pessoa da Drª. Ana da Silva Lédo, pela sua disponibilidade e apoio.
À Profª. Drª. Maria de Fátima Arrigoni Blank, pelo carinho, amizade e ensinamentos.
A Verônica e Aline, que muito contribuíram para o meu trabalho.
As amigas do laboratório Valéria, Grasiela, Thatiana, Catarina, Aline pela amizade e agradável convivência.
A Fátima Hora, Marinoé e Eliane pela amizade e pelos momentos que compartilhamos juntas.
A Ricardo e Welton, pela ajuda na produção das mudas para os ensaios.
A todos, muito obrigada.
Página
1. INTRODUÇÃO... 1
2. REFERENCIAL TEÓRICO... 2
2.1. Agroecossistemas e biodiversidade... 2
2.2. Botânica e usos de Lippia sidoides ... 4
2.3. Cultura de tecidos de plantas... 5
2.4. Propagação in vitro... 6
2.4.1. Contaminação in vitro ... 7
2.4.2. Oxidação em tecidos cultivados in vitro... 8
2.4.3. Meios de cultura ... 9
2.4.4. Reguladores de crescimento ... 10
2.5.REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 12
3. CAPÍTULO I: ESTABELECIMENTO IN VITRO DE ALECRIM-PIMENTA (Lippia sidoides Cham.) ... 20
RESUMO ... 20
ABSTRACT ... 21
3.1. INTRODUÇÃO... 22
3.2. MATERIAL E MÉTODOS ... 22
3.2.1. Obtenção de explantes ... 22
3.2.2. Influência de concentrações de hipoclorito de sódio e tempos de imersão sob explantes de L. sidoides ... 23
3.2.3. Influência de concentrações de cefotaxima sódica no estabelecimento in vitro de L. sidoides ... 23
3.2.4. Influência de meios de cultura no estabelecimento in vitro de L. sidoides . 23 3.2.5. Influência de antioxidantes no estabelecimento in vitro de L. sidoides ... 24
3.2.6. Condições ambientais ... 24
3.2.7. Análise estatística ... 24
3.3. RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 24
3.3.1. Influência de concentrações de hipoclorito de sódio e tempos de imersão sob explantes de L. sidoides ... 24
3.3.2. Influência de concentrações de cefotaxima sódica no estabelecimento in vitro de L. sidoides ... 25
3.3.3. Influência de meios de cultura no estabelecimento in vitro de L. sidoides 26
3.3.4. Influência de antioxidantes no estabelecimento in vitro de L. sidoides ... 27
3.4. CONCLUSÕES... 29
3.5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 29
4. CAPÍTULO II: INFLUÊNCIA DE REGULADORES DE CRESCIMENTO EM ALECRIM-PIMENTA (Lippia sidoides Cham.) IN VITRO ... 32
RESUMO ... 32
ABSTRACT ... 33
4.1. INTRODUÇÃO ... 34
4.2. MATERIAL E MÉTODOS ... 34
4.2.1. Obtenção de explantes ... 34
4.2.2. Desinfestação e inoculação dos explantes ... 35
4.2.5. Influência de cinetina e ANA na a micropropagação de L. sidoides ... 35
4.2.6. Influência de AIA na a micropropagação de L. sidoides ... 35
4.2.7. Influência do GA3 no alongamento das brotações de L. sidoides ... 36
4.2.8. Análise estatística ... 36
4.3. RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 36
4.3.1. Influência de BAP e AIB na micropropagação de L. sidoides ... 36
4.3.2. Influência de ANA na micropropagação de L. sidoides ... 39
4.3.3. Influência de cinetina e ANA na a micropropagação de L. sidoides ... 40
4.3.4. Influência do AIA na a micropropagação de L. sidoides ... 41
4.3.5. Influência do GA3 no alongamento das brotações de L. sidoides ... 42
4.4. CONCLUSÕES... 43
4.5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 43
5. CONSIDERAÇÕES GERAIS... 47
ANEXOS... 48
Figura Página 1. Alecrim-pimenta (Lippia sidoides) cultivado no horto de Plantas
Medicinais e Aromáticas da Estação Experimental “Campus Rural da UFS”, localizado no município de São Cristóvão-SE ... 4 2. Efeito da cefotaxima no estabelecimento de L. sidoides. (A) com
cefotaxima (200mg.L-1) no meio de cultivo e (B) ausência de cefotaxima... 26 3. Efeito do carvão ativado no estabelecimento de L. sidoides. (A) 3g.L-1 e
(B) 12g.L1... 28 4. Efeito do PVP no estabelecimento de L. sidoides. (A) 0,5g.L-1 e (B) 2,0g.L-
1... 29 5. Formação de calo na base do explante (A), folhas malformadas e
vitrificadas de explantes de alecrim-pimenta (B)... 38 6. Comprimento dos brotos em explantes de alecrim-pimenta (A) e (B)... 41
Tabela Página 1. Valores médios de porcentagem de contaminação fúngica (%), número de
brotos e folhas e número de folhas por broto de explantes de alecrim-pimenta (Lippia sidoides Cham.), em função de
diferentes concentrações de hipoclorito de sódio... 25 2. Valores médios de porcentagem de contaminação fúngica (%), número de
brotos e folhas e número de folhas por broto de explantes de alecrim- pimenta (Lippia sidoides Cham.), em função de diferentes tempos de
imersão ... 25 3. Valores médios de porcentagem de oxidação (%), de contaminação
bacteriana (%) e de sobrevivência (%) de explantes de alecrim-pimenta (Lippia sidoides) in vitro em função de concentrações de cefotaxima sódica no meio de cultura MS modificado ... 26 4. Valores médios de número e comprimento dos brotos (cm), número de
folhas, porcentagem de oxidação (%), de raiz (%) e de sobrevivência (%) de explantes de alecrim-pimenta (Lippia sidoides Cham.) em diferentes meios de cultivo ... 27 5. Valores médios de porcentagem de oxidação (%), comprimento dos brotos
(cm), porcentagem de sobrevivência (%) e de vitrificação (%) de explantes de alecrim-pimenta (Lippia sidoides Cham.), em função de diferentes concentrações de dois antioxidantes ... 28 6. Valores médios de número e comprimento de brotos (cm) e número de
folhas de explantes de alecrim-pimenta (Lippia sidoides) in vitro em função de concentrações de BAP no meio de cultura MS ... 37 7. Valores médios de massa (g) de folha fresca (MFF), massa de folha seca
(MFS) e porcentagem de calo (%) de explantes de alecrim-pimenta (Lippia sidoides) in vitro em função de concentrações de BAP no meio de cultura
MS ... 37 8. Valores médios de número e comprimento de brotos (cm) e número de
folhas de explantes de alecrim-pimenta (Lippia sidoides) in vitro em função de concentrações de AIB no meio de cultura MS ... 38 9. Valores médios de massa (g) de folha fresca (MFF) e massa de folha seca
(MFS) e porcentagem de calo (%) de explantes de alecrim-pimenta (Lippia sidoides) in vitro em função de concentrações de AIB no meio de cultura
MS ... 39
em função de concentrações de ANA no meio de cultura MS... 39 11. Valores médios de porcentagem de raiz (%), massa (g) de folhas fresca
(MFF) e massa de folha seca (MFS) de explantes de alecrim-pimenta (Lippia sidoides) in vitro em função de concentrações de ANA no meio de cultura MS ... 40 12. Valores médios de número de brotos, comprimento de brotos (cm), número
de folhas de explantes de alecrim-pimenta (Lippia sidoides) in vitro em função de concentrações de cinetina no meio de cultura MS... 40 13. Valores médios de massa (g) de folha fresca (MFF) e massa de folha seca
(MFS) de explantes de alecrim-pimenta (Lippia sidoides) in vitro em função de concentrações de cinetina no meio de cultura MS... 41 14. Valores médios de número de brotos, comprimento dos brotos (cm) e
número de folhas de explantes de alecrim-pimenta (Lippia sidoides) in vitro em função de concentrações de AIA no meio de cultura MS ... 41 15. Valores médios de porcentagem de raiz (%), massa (g) de folha fresca
(MFF) e seca (MFS) de explantes de alecrim-pimenta (Lippia sidoides) in vitro em função de concentrações de AIA no meio de cultura MS... 42 16. Valores médios número e comprimento de brotos (cm), número de folhas,
massa (g) de folha fresca (MFF) e seca (MFS) de explantes de alecrim-
pimenta (Lippia sidoides) in vitro em função de concentrações de GA3... 43
AIB Ácido indolbutírico AIA Ácido indol 3-acético ANA Ácido naftaleno-acético BAP 6-benzilaminopurina
GA3 Ácido giberélico
PVP - 40 Polivinilpirrolidona
PADETEC Parque de Desenvolvimento Tecnológico do Ceará MFF Massa de folha fresca
MFS Massa de folha seca PRONAT Produtos Naturais Ltda
MS Meio de cultura formulado por (Murashige &
Skoog, 1962)
WPM Meio de cultura formulado por (Lloyd & Mccown, 1980)
B5 Meio de cultura formulado por (Gamborg et al., 1968)
COSTA, Andréa Santos. Sustentabilidade da produção de alecrim-pimenta (Lippia sidoides Cham.): micropropagação visando a conservação in vitro. São Cristóvão:
UFS, 2006. 70p. (Dissertação - Mestrado em Agroecossistemas).
A utilização de plantas medicinais é uma prática tradicional ainda existente entre os povos de todo o mundo, porém a sua exploração muitas vezes é feita de forma extrativista, o que tem levado às reduções drásticas das populações naturais dessas espécies. A Lippia sidoides é uma planta medicinal nativa da Caatinga, também conhecida como alecrim-pimenta, alecrim bravo e alecrim do nordeste. Possui propriedades antimicrobianas, graças à presença de timol e carvacrol em seu óleo essencial, o que lhe confere uma grande importância econômica. A exploração econômica desta espécie medicinal nativa já iniciou e para garantir a sustentabilidade da produção é necessário que se faça a conservação da variabilidade genética. A conservação in vitro é uma técnica viável de armazenamento de genes, mas é necessário estabelecer técnicas de micropropagação desta espécie. Não existem relatos de trabalhos sobre a micropropagação de L. sidoides. Os objetivos do presente trabalho foram desenvolver técnicas de estabelecimento e multiplicação in vitro da espécie. Nos ensaios de estabelecimento da espécie foram utilizadas diferentes concentrações e tempos de imersão de hipoclorito de sódio, cefotaxima sódica, antioxidantes e meios de cultura (MS, B5, WPM). Para a multiplicação foram testados o BAP, AIB, ANA, AIA, cinetina e GA3 em diferentes concentrações.O segmento nodal é o explante mais eficiente para a micropropagação de L. sidoides e, os meios de cultivo MS, WPM ou B5, sem a presença de reguladores de crescimento. A concentração de 0,8% de hipoclorito de sódio por 16 minutos pode ser usado para assepsia. A cefotaxima sódica na concentração de 200mg.L-1 reduziu a contaminação bacteriana e o carvão ativado a 3g.L-1 controlou a oxidação.
Palavras-chaves: planta medicinal nativa, estabelecimento in vitro, multiplicação in vitro
COSTA, Andréa Santos. Sustainability of the production of Lippia sidoides Cham.:
micropropagation for in vitro conservation. São Cristóvão: UFS, 2006. 70p. (Thesis - Master of Science in Agroecosystems).
The use of medicinal plants is a traditional practice of all the people over the world, but its exploration is mostly predatorious, what have caused high reductions of the native populations. Lippia sidoides is a native medicinal plant from the Caatinga and is also known as "alecrim-pimenta", "alecrim-bravo" and "alecrim do nordeste". It possesses antimicrobial properties because of the presence of thymol and carvacrol in its essential oil, which proportion high economical importance. The economic exploration of L.
sidoides already started. To guarantee a sustainable production it is necessary to conserve the genetic variability. In vitro conservation is a possible manner to store genes, but it is necessary to dominate the technique of micropropagation of L. sidoides.
There is no report of works in the literature about micropropagation of L. sidoides. The aims of this work were to develop techniques for in vitro establishment and multiplication of L. sidoides, testing sodium chlorite concentrations and immersion time, sodium cefotaxima, antioxidants, culture medium and the growth regulators: BAP, AIB, ANA, cinetina and GA3. The nodal segment can be used as a source for micropropagation of L. sidoides, using MS, WPM or B5 medium, without growth regulators. The concentration of 0.8% sodium chlorite for 16 minutes can be used for asepsis. The concentration 200mg.L-1 of sodium cefotaxima reduced bacterial contamination and 3g.L-1 of active charcoal reduced the oxidation.
Key words: native medicinal plant, in vitro establishment, in vitro multiplication.
1. INTRODUÇÃO
A utilização das plantas medicinais é uma das mais antigas práticas empregadas para o tratamento das enfermidades humanas e muito já se conhece a respeito de seu uso por parte da sabedoria popular. Com os avanços científicos, esta prática milenar perdeu
1espaço para os medicamentos sintéticos, entretanto, o alto custo destes fármacos e os efeitos colaterais apresentados contribuíram para o ressurgimento da fitoterapia.
O uso de plantas medicinais pela população mundial tem sido muito significativo nos últimos tempos. De acordo com a Organização Mundial da Saúde (OMS) cerca de 65-80% da população mundial dos países em desenvolvimento, devido a pobreza e a falta de acesso a medicina moderna, dependem essencialmente das plantas para a saúde primária. Porém, poucas destas plantas têm sido cientificamente estudadas para avaliação com segurança de suas qualidades e eficácia (CALIXTO, 2005).
A exploração de plantas de uso medicinal da flora nativa através da extração direta nos ecossistemas tropicais (extrativismo) tem levado a reduções drásticas das populações naturais dessas espécies, seja pelo processo predatório de exploração, seja pelo desconhecimento dos mecanismos de perpetuação das mesmas (SIMÕES et al., 2004). A preocupante taxa de extinção destas espécies vegetais leva à necessidade de se considerar urgente o estabelecimento de políticas e ações de conservação.
Lippia sidoides Cham. (Verbenaceae), um arbusto nativo da Caatinga, região do Nordeste do Brasil, apresenta área de maior ocorrência na faixa compreendida entre os Estados da Bahia e do Ceará. Popularmente conhecida por alecrim-pimenta, alecrim-do- nordeste, alecrim-bravo (INNECCO, 2000) e estrepa-cavalo (INNECCO, 2000;
MATOS, 2002). Do alecrim-pimenta é extraído o óleo essencial, que é rico timol e carvacrol o que lhe confere fortíssima atividade antimicrobiana e anti-séptica (MACAMBIRA et al., 1988). Em virtude da grande importância econômica desta espécie, ela poderá sofrer uma forte ação antrópica no seu ambiente natural. A espécie possui mercado externo, interno e regional, e já está sendo explorada pela empresa de Produtos Naturais Ltda (PRONAT) incubada no Parque de Desenvolvimento Tecnológico do Ceará (PADETEC) da Universidade Federal do Ceará (UFC).
O óleo essencial de L. sidoides é exportado pela PRONAT para os Estados Unidos a US$ 60,00/Kg, onde é utilizado para produção de xampu anti-caspa, creme dental e colutório de boa qualidade e é eficiente no controle da placa bacteriana bucal (NUNES, 1999).
Tendo em vista a grande importância econômico-social desta espécie, ela foi selecionada dentre as sete plantas medicinais e aromáticas de maior prioridade a serem conservadas entre as espécies nativas da Caatinga (EMBRAPA & IBAMA, 2002).
Ainda não foram encontradas suas sementes botânicas1 e sendo assim, faz-se necessário o desenvolvimento de técnicas alternativas de propagação, o que dará suporte para a multiplicação e conservação in vitro de genótipos, contribuindo dessa maneira para o seu manejo sustentável.
Diversas espécies do gênero Lippia já foram micropropagadas: L. integrifolia (Gris.) Hier. (PASSERA & AMBROSETTI, 1999), L. micomera Schau (CAPOTE et al., 1999), L. junelliana (Mold.) Tronc (JULIANI JÚNIOR et al., 1999) e L. Alba (GUPTA et al., 2001), porém não existem trabalhos disponíveis na literatura sobre a propagação in vitro de L. sidoides Cham. O objetivo deste trabalho foi realizar ensaios para o estabelecimento de um protocolo de micropropagação e o conhecimento gerado será usado para desenvolver um protocolo de conservação in vitro de L. sidoides.
1 Informação cedida pelo Profº Dr. Renato Innecco da Universidade Federal do Ceará.
2. REFERENCIAL TEÓRICO
2.1. Agroecossistemas e biodiversidade
O desenvolvimento agrícola mudou a relação entre cultura humana e o ambiente natural. Há pouco tempo atrás, na história da humanidade, toda a agricultura era tradicional e em pequena escala; os agroecossistemas eram distribuídos como pequenas manchas na paisagem natural maior. Os habitats manejados mantinham a integridade dos ecossistemas naturais, ao mesmo tempo em que diversificavam a paisagem. Hoje, em contraste, predominam os usos agrícolas da terra, fazendo dos habitats naturais manchas dispersas (GLIESSMANN, 2001).
O desenvolvimento dos sistemas biológicos e sociais apresenta maior capacidade de sustentabilidade quanto maior for a sua diversidade interna, seja a diversidade de espécies, etnias como a de elementos econômicos, políticos, sociais, culturais e institucionais. A maior diversidade, facilitando a maior complexidade, permite a formação de inúmeras interações, aumentando a capacidade de regeneração ou a sua resiliência. Os sistemas biológicos e sociais, enquanto sistemas abertos, estão permanentemente submetidos a pressões externas (perturbações) as quais tendem a desorganizar/ reorganizar o funcionamento suposto do sistema (CARVALHO, 1994).
A necessidade de conciliar desenvolvimento econômico e preservação ambiental, duas questões antes tratadas separadamente, levou à formação do conceito de desenvolvimento sustentável. A consciência de que é necessário tratar com racionalidade os recursos naturais, uma vez que estes podem se esgotar mobiliza a sociedade no sentido de se organizar para que o desenvolvimento econômico não seja predatório, mas sim, “sustentável”. No entanto, o processo de desenvolvimento sustentável, baseado na manutenção da biodiversidade e no equilíbrio dos ecossistemas, requer mudança completa no comportamento dos processos humanos de produção diante da natureza (SOARES & FERREIRA, 2004).
Em 1998, a FAO realizou em conjunto com a Secretaria Executiva da Convenção sobre Diversidade Biológica (CDB) e o Governo da Holanda um encontro técnico denominado “Sustaining Agricultural Biodiversity and Agro-ecosystem Functions” quando se discutiu sobre oportunidades, incentivos e estratégias para a conservação e o uso sustentável da biodiversidade em agroecossistemas. O documento final apresentou a necessidade de se ampliar a compreensão de que biodiversidade agrícola engloba grande diversidade de animais, plantas e microrganismos, necessários para manutenção de funções vitais dos agroecossistemas, sua estrutura e processos que suportam a produção de alimentos e matérias-primas vitais para a humanidade. Assim, melhorar a integração e a coordenação das atividades e processos que sustentam a diversidade biológica em agroecossistemas, sua produtividade e o provimento das funções e serviços ambientais deles provenientes são fundamentais para que se alcance e se mantenha a sustentabilidade dos agroecossistemas (LOPES et al., 2005).
Biodiversidade, ou diversidade biológica é uma das propriedades fundamentais da natureza, responsável pelo equilíbrio e estabilidade dos ecossistemas, e fonte de imenso potencial de uso econômico, pois serve de base para a estratégica indústria da biotecnologia. Na atualidade nem todas as espécies possuem demanda para uso, porém no futuro poderão ser altamente desejáveis levando-se em conta a utilização de genes e alelos existentes (VALOIS et al., 2001). É preciso conservá-las, uma vez que tal diversidade biológica possui valor incomensurável além de se acreditar que sua deterioração vem ocorrendo pela fragmentação e destruição do habitat. Tendo como os
maiores responsáveis por essa destruição, o crescimento contínuo das cidades, da malha rodoviária e a expansão da fronteira agrícola ( DIAS, 1996; BORÉM, 2005). O binômio biodiversidade e recursos genéticos forma a base sólida da agrobiodiversidade visando o desenvolvimento de uma agricultura sustentável na dimensão do agronegócio, da utilização social e do equilíbrio ambiental (VALOIS et al., 2001).
O Brasil é considerado o país que apresenta a maior diversidade genética vegetal do mundo, com cerca de 55.000 espécies catalogadas de um total estimado entre 350.000 e 550.000 espécies (SANDES & DI BLASI, 2000). Não pode ser feita uma estimativa precisa do número de espécies que estão se extinguindo nas florestas tropicais ou em outros biomas, pela simples razão de não conhecermos os números de espécies originalmente presentes. Contudo, não pode haver dúvida de que a extinção está seguindo em ritmo muito mais rápido do que antes de 1800 (WILSON, 1997). Um país detentor de um mega biodiversidade e em contínuo crescimento populacional, precisa encontrar alternativas, especialmente no campo tecnológico, além da implementação de políticas públicas e mecanismos de gestão que viabilizem estratégias de acesso e uso sustentável dos recursos naturais (LOPES et al., 2005).
Assim, torna-se importante a valorização da diversidade biológica e da agregação de valor econômico aos produtos naturais provenientes dessa diversidade. O desenvolvimento tecnológico recente, especialmente com relação a biotecnologia, abriu inúmeras oportunidades para investimento no aproveitamento sustentável dos recursos genéticos e da diversidade biológica em áreas de interesse químico, farmacêutico, agrícola e industrial. A valorização da diversidade é de grande importância não só para a preservação dos ecossistemas e, conseqüentemente, das espécies presentes, mas também como fonte natural de produtos para exploração sustentada e consumo humano.
Atualmente, as novas técnicas de exploração dessa biodiversidade permeiam o conceito conservacionista, através do manejo sustentado. Objetiva-se não somente o ganho econômico, mas, principalmente, a conservação dos recursos naturais. Deve-se ter em mente que a redução da diversidade de espécies compromete a disponibilidade permanente dos recursos ambientais, bem como a sustentabilidade do próprio meio ambiente (ODALIA-RÍMOLI, et al., 2000).
A preocupação sobre a conservação da biodiversidade aumentou consideravelmente nesta década. Em setembro de 2001, por iniciativa do Instituto Brasileiro de Meio-ambiente e dos Recursos Naturais Renováveis (IBAMA) e da Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia (CENARGEN), foi realizada a 1ª reunião técnica sobre estratégias para a conservação e manejo de recursos genéticos de plantas medicinais e aromáticas, envolvendo pesquisadores de todo o Brasil e apontando espécies medicinais prioritárias para investigação em conservação e manejo, nos diversos biomas brasileiros. Entre as sete plantas medicinais e aromáticas de maior prioridade a serem conservadas entre as espécies nativas da Caatinga encontrava-se a L.
sidoides Cham.. Algumas ações foram prioridade: coleta de germoplasma, estudo sobre sistema reprodutivo, diversidade genética e dinâmica de populações, mercado potencial, caracterização agronômica e farmacológica, conservação a campo, in vitro e in situ, manejo sustentável e melhoramento genético (EMBRAPA & IBAMA, 2002).
Dentro deste contexto a biotecnologia deve ser entendida como mais uma forma de propiciar a conservação da biodiversidade, através de ferramentas biotecnológicas como: a utilização do seres vivos (vegetais, animais e microrganismos) ou dos seus produtos (por exemplo, enzimas) no processamento de materiais para produzir bens de consumo ou serviços, incluindo-se para tal, as aplicações dos atuais métodos científicos e das técnicas de modificação, de melhoramento e de conservação dos sistemas biológicos (ODALIA-RÍMOLI et al., 2000).
2.2. Botânica e usos de Lippia sidoides
O gênero Lippia é composto por, aproximadamente, 200 espécies de ervas, arbustos e pequenas árvores pertencentes à família Verbenaceae. Entre as principais espécies deste gênero estão: L. gracillis H.B.K., L. sidoides Cham., L. alba Mill N.E.
Brown, L. mycrophylla Cham., L. gravelous, L. alnifolia, L. aristata, L. grata, L.
triphylla, L. thymoides, L. citiodora, L. adoensis e L. schimperi (TERBLANCHÉ &
KORNELIUS, 1996).
É um arbusto caducifólio, ereto, muito ramificado e quebradiço, podendo chegar a 2-3 m de altura. Suas folhas são pecioladas e simples, de dois a três centímetros, muito aromáticas e picantes, as flores são pequenas, esbranquiçadas, reunidas em espigas de eixo curto nas axilas das folhas (Figura 1). Até o momento não foram encontradas sementes desta espécie1, a sua propagação é assexuada, através do processo de estaquia, usando os ramos mais finos (LORENZI & MATOS, 2002) ou estacas herbáceas com folhas (MENDONÇA, 1997).
FIGURA 1. Alecrim-pimenta (Lippia sidoides) cultivado no horto de Plantas Medicinais e Aromáticas da Estação Experimental “Campus Rural da UFS”, localizado no município de São Cristóvão-SE, UFS, 2005.
Nas folhas do alecrim-pimenta, que é a parte medicinal, encontram-se até 4,5%
de óleo essencial rico em timol, que é seu princípio ativo majoritário e o responsável pelo seu cheiro característico (MATOS, 2002). Matos et al. (1999), conseguiram extrair das folhas de alecrim pimenta até 73,1% do óleo essencial. O óleo essencial de L.
sidoides de acordo com vários autores apresenta a seguinte composição química:
monoterpernos (carvacrol, p-cimeno, timol, α-felandreno), sesquiterpene (β-cariofileno, α-copaeno, α-humuleno) (MACAMBIRA et al., 1986; LEMOS et al., 1990;
TERBLANCHÉ & KORNELIUS, 1996). Radünz et al. (2001b) constataram um percentual de 2,93% de óleo essencial nas folhas de alecrim-pimenta e a depender da temperatura e do local de secagem este valor é alterado. Em outro trabalho Radünz et al.
1 Informação cedida pelo Profº Dr. Renato Innecco da Universidade Federal do Ceará.
(2001a), observaram que o processo de secagem das folhas desta espécie pode ser otimizado com o aumento da temperatura, sem que o mesmo implique em prejuízo quantitativo no teor do óleo essencial.
O óleo essencial apresenta forte ação antifúngica, antibacteriana, antimicrobiana, contra Staphylococcus aureus que causa infecções na pele e na garganta, Streptococcus mutans responsável pela cárie dentária, Corynebacterium xerosis que causa mal cheiro nas axilas e nos pés, Candida albicans ou Monilia encontrada nas aftas e corrimento vaginal, Trichophytum rubrum e T. interdigitale que causam micoses na pele, ação moluscida contra o caramujo hospedeiro da esquistossomose Biomphalaria glabra, e ação larvicida contra o mosquito transmissor da dengue Aedes aegypti (LEMOS et al., 1990; LACOSTE et al., 1996; MATOS, 2000; LORENZI & MATOS, 2002). Além do óleo essencial, o extrato etanólico de alecrim-pimenta controlou gengivites marginais em cães, e também foi observado uma atividade antiinflamatória (GIRÃO et al., 2001).
Nunes (1999) desenvolveu um creme dental eficiente no controle da placa bacteriana bucal e confirmou que a grande eficiência do produto se deve ao alto teor de timol. Carvalho et al. (2003) e Cavalcanti et al. (2004) comprovaram atividade larvicida do óleo essencial puro de L. sidoides, em pesquisa realizada com as larvas do Aedes aegypti L., onde a mortalidade foi de 100% .
O óleo essencial da L. sidoides Cham. apresentou potencialidades alelopáticas na germinação de plântulas de alface independente do tipo de contato (NAGAO et al., 2002). Resultados semelhantes foram encontrados por Alves et al. (2004), onde os efeitos na germinação e comprimento das raízes variaram de acordo com a concentração do óleo. Sampaio et al. (2004) constataram esse efeito também sobre a germinação de sementes de picão-preto e de soja. A presença do óleo essencial mostrou-se eficaz no controle da planta invasora e influenciou negativamente a germinação da soja. Em sementes de picão-preto a germinação foi afetada pela presença do óleo independente da forma de aplicação (BEZERRA et al., 2004; GUERRA et al., 2004), enquanto que a aplicação do óleo em pós-plantio influenciou negativamente a cultura do feijão (GUERRA et al., 2004).
Trevisan et al. (2003), observaram que o extrato de L. sidoides tem atividade anticolinasterase para o tratamento da doença de Alzheimer, com inibições que variam de 7 a 77%, dependendo do extrato e da parte da planta utilizada na composição do mesmo.
2.3. Cultura de tecidos de plantas
A biotecnologia compõe-se basicamente das seguintes tecnologias: biologia molecular, engenharia genética, transformação genética e cultura de tecidos. A biologia molecular permite identificar, isolar e caracterizar o gene de interesse. A engenharia genética possibilita clivar, por meio de enzimas de restrição, seqüências nucleotídicas específicas de ácidos nucléicos pela geração de extremidades aderentes de fitas simples da molécula de DNA de uma espécie que se associam a fragmentos de DNA de outra espécie clivados por essas enzimas. A transformação genética possibilita inserir um gene selecionado em uma célula vegetal. A cultura de tecidos regenera a planta através de gemas, meristemas apicais, embriões, segmentos de caule, extremidade de raízes e outras, os quais podem ser cultivadas in vitro em meio nutritivo apropriado em ambiente asséptico (AMARAL & SILVA, 2003).
A cultura de tecidos vegetais compreende um conjunto de técnicas nas quais um explante (célula, tecido ou um órgão) é isolado e cultivado sob condições de plena assepsia, em um meio nutritivo artificial (PASQUAL, 1997a). A técnica está baseada na
totipotencialidade da célula vegetal, ou seja, na sua capacidade de, por si só, originar uma nova planta, devido às mesmas encerrarem em seu núcleo, toda a informação genética para isto (PINTO, 2001). Vale salientar que, para cada tipo de célula, há a necessidade de se empregar um meio de cultura específico, que contenha, adequadamente, os nutrientes e agentes indutores necessários ao desenvolvimento das células. Estas, por sua vez, são influenciadas pela luz (intensidade e qualidade), temperatura, estágio fisiológico, e época para colheita do material a ser propagado (BERTOLOTI & GONÇALVES, 1979).
Entre as principais funções da técnica de cultura de tecidos cabe dar ênfase à produção de clones, ou seja, material homogêneo e uniforme, livre de patógenos;
híbridos, por hibridação somática, através da fusão de protoplastos; haplóides; mutantes portadores de caracteres desejáveis, por meio de agentes mutagênicos ou por variação somaclonal; plantas biorreatoras; plantas geradoras de vacinas; bem como conservação de germoplasma por criopreservação ou por manutenção do material vegetal, durante períodos prolongados, sob condições limitantes de crescimento e desenvolvimento e, finalmente, biotransformação de compostos pouco interessantes em compostos muito interessantes sob o aspecto econômico (AMARAL & SILVA, 2003).
2.4. Propagação in vitro
A propagação vegetativa in vitro, também denominada de micropropagação devido ao tamanho dos propágulos utilizados, é a técnica de maior aplicabilidade da cultura de tecidos e aquela de maior impacto, uma vez que proporciona obtenção de um grande número de plantas com elevado nível qualitativo (GRATTAPAGLIA &
MACHADO, 1998). Sendo dessa forma uma ferramenta promissora que pode ser utilizada para propagação e preservação de muitas espécies de plantas medicinais que vêm sendo exploradas de forma indiscriminada e que estão em vias de extinção.
A micropropagação tem sido utilizada para multiplicação de várias espécies com propriedades medicinais. Passera & Ambrosetti. (1999), desenvolveram um método rápido para a propagação de Lippia integrifolia, usando segmentos nodais em meio MS (MURASHIGE & SKOOG, 1962) completo e diluído pela metade. Em Lippia junelliana, Juliani Júnior et al. (1999), estudando diferentes métodos de propagação, obtiveram os melhores resultados com gemas apicais e segmentos nodais em meio de cultura MS suplementado com 4,4µM de 6-benzilaminopurina (BAP) ou 0,04µM ácido indolbutírico (IBA) + 4,4µM de BAP. Com a Lippia alba cultivar Kavach, a regeneração de plantas foi obtida usando gemas apicais e meio de cultura MS contendo 2,0µg/mL de BAP (GUPTA et al., 2001). Já para Lippia micromera var. helleri, observou-se que os melhores resultados de multiplicação ocorreram quando usou-se o meio de cultura de MS acrescentado de 0,1mg.L-1 de ácido naftaleno - acético (ANA) + 2,0mg.L-1 de BAP (CAPOTE et al., 1999).
Plantas de aroeira (Myracrodruon urundeuva Fr. All) são de interesse farmacológico por possuírem urundeuveína A e B, que possuem propriedade antiinflamatória. A multiplicação in vitro foi desenvolvida através de segmentos nodal e apical, os quais obtiveram 90% de regeneração (ANDRADE et al., 2000). Zhao et al.
(2003/4), desenvolveram um método rápido para regeneração de plantas em Sophora flavescens a partir de segmentos nodais.
Plantas de Hypericum perforatum L. são de interesse comercial por apresentarem uma naftodiantrona, a hipericina, usada como cicatrizante e antidepressivo. Um método rápido para otimizar a sua micropropagação foi
desenvolvido através de segmentos nodais em meio MS suplementado com BAP e ANA (SANTARÉM & ASTARICA, 2003).
Lu (2005) desenvolveu um protocolo, onde o mesmo favoreceu uma rápida propagação em larga escala de Vitis thunbergii Sieb. et Zucc., uma planta medicinal usada na medicina chinesa contra inflamações nos olhos, hepatites e no alívio de artrites.
2.4.1. Contaminação in vitro
Na micropropagação todas as etapas são importantes, porém a desinfestação requer toda atenção, uma vez que esta deve permitir a eliminação dos microorganismos com o menor dano possível para os explantes. Na desinfestação deve-se levar em conta o tipo de explante e a espécie vegetal para o uso das soluções desinfestantes (MROGINKI & ROCA, 1991).
Os microorganismos contaminantes competem com os explantes pelos nutrientes do meio de cultura e provocam danos diretos e indiretos pela colonização de seus tecidos, podendo eliminar, no meio, metabólitos tóxicos às plantas (MONTARROYOS, 2000). Nadesinfestação do explante a maior dificuldade é obtê-lo descontaminado sem conduzi-lo à morte quando isolado. Para isso várias substâncias com ação germicida têm sido utilizadas, sendo os mais comuns o etanol (70%) e os compostos a base de cloro, tais como o hipoclorito de sódio (NaOCl) e o de cálcio (CaOCl2) (GRATTAPAGLIA & MACHADO, 1998). As concentrações das soluções desinfestantes assim como as combinações dos princípios ativos desinfestantes e os tempos de exposição podem variar muito (MONTARROYOS, 2000), sendo necessário à adequação de acordo com a espécie e a sensibilidade do tecido a ser desinfestado (MROGINKI & ROCA, 1991).
No estabelecimento in vitro de explantes de insulina vegetal (Cissus sicyoides), os segmentos nodais não apresentaram problemas de oxidação e contaminação quando foi realizada a assepsia de 30 minutos em água corrente, 30 segundos em álcool 70% e 20 minutos em 0,75% de hipoclorito de sódio e seis vezes em água estéril (ABREU et al., 2003).
O hipoclorito de sódio foi mais eficiente na desinfestação de explantes de macieira (Malus domestica Borkh), possibilitando uma maior porcentagem de sobrevivência, em relação ao de cálcio (ERIG & SCHUCH, 2003).
Espécies como Lippia integrifolia (PASSERA & AMBROSETTI, 1999), Lippia micromera schau in Dc. var. helleri (Britt) (CAPOTE et al., 1999), Eucalyptus globulus Labill (BENNETT et al., 1994), aroeira (Myracrodruon urundeuva Fr. All) (ANDRADE et al., 2000), caixeta (Didymopanax morototoni (Aubl.) Dene. et Planch) (MANTOVANI et al., 1999) e abacate “ouro verde” (BIASI et al., 1994), utilizaram NaOCl e álcool etílico (70%) na assepsia dos explantes.
A contaminação por microorganismos é conhecida como um dos problemas mais sérios na micropropagação. Na maioria das vezes, essa contaminação é proveniente de bactérias, sendo consideradas os contaminantes mais comuns em cultura de tecidos e os que ocasionam os maiores danos, depois dos vírus, porque podem ser sistêmicas e sua detecção muitas vezes é mais difícil (MONTARROYOS, 2000).
Embora alguns gêneros de bactérias possam ser patogênicos, muitos são encontrados no solo como saprófitas, ou nas plantas. No entanto, estas espécies após estabelecerem in vitro podem interferir no crescimento e conduzir a cultura de plantas à morte (CORRÊA, 2004). Alguns gêneros de bactérias já foram isolados em diferentes trabalhos e espécies de plantas entre eles: Acinetobacter, Agrobacterium, Bacillus,
Corynebacterium, Enterobacter, Erwinia, Ravobacterium, Micrococcus, Pseudomonas, Staphylococcus e Xanthomonas (PASQUAL et al., 1997a).
Para o controle das contaminações bacterianas, normalmente são utilizadas substâncias antibióticas que são incorporadas ao meio de cultura ou usadas diretamente sobre os explantes contaminados (MONTARROYOS, 2000; GRATTAPAGLIA &
MACHADO, 1998).
Trabalhos nos quais foi avaliado o nível de toxidez de vários antibióticos demonstraram que os do grupo dos betalactamos: ampicilina, cefotaxima, carbenicilina e, particularmente, as cefolosporinas possuem amplo espectro de ação e sua toxidez é mínima nas concentrações que controlam bactérias (MONTARROYOS, 2000).
Mesmo que se utilizem antibióticos de amplo espectro, o controle bacteriano na cultura de tecidos é problemático. Na maioria dos trabalhos in vitro, a freqüência de descontaminação não é total, pois, os tecidos vegetais podem interferir no controle, por meio da destoxificação destas substâncias ou servindo como habitat para os contaminantes que se translocam por seus tecidos. É comum que as concentrações de antibióticos devam ser elevadas quando estes são adicionados ao meio nutritivo juntamente com o explante, no entanto a fitotoxicidade dessas substâncias é fator limitante dessas concentrações (PEREIRA & FORTES, 2003).
Uma das alternativas para se evitar o efeito tóxico dos antibióticos sobre os explantes é reduzir ao máximo o tempo do tratamento (contato) dos explantes com o agente antimicrobiano. No entanto, esta técnica muitas vezes causa efeitos apenas bacteriostáticos, constituindo uma ação paliativa frente ao principal objetivo que é a eliminação por completo do organismo contaminante (PEREIRA et al., 2003). Num estudo com bactérias endofíticas contaminantes na cultura da batata in vitro, Pereira et al. (2003) verificaram que entre doze antibióticos testados, seis apresentaram algum tipo de controle e, destes, os que proporcionaram os melhores resultados para a inibição do crescimento bacteriano foram a ampicilina, o cloranfenicol, a estreptomicina e a tetraciclina em concentrações que variaram de 32 a 256 mg L-1.
As contaminações fúngicas podem ser facilmente visualizadas devido à intensa proliferação dos fungos (PASQUAL et al., 1997a). O benomyl, o primeiro fungicida sistêmico desenvolvido, possui atividades preventivas, curativas e sistêmicas contra numerosos grupos de fungos. Apresenta, ainda, baixa toxicidade, de modo geral, e não provoca fitoxicidades (SATO et al., 2001). O benomyl tem sido utilizado em diversos trabalhos no controle de contaminações fúngicas, através de pulverizações na planta matriz em várias concentrações, 200mg.L-1 (SATO et al., 2001), 1mg.L-1 (RODRIGUES et al., 2003; DANTAS et al., 2002), 2g.L-1 (MANTOVANI et al., 1999) e 4g.L-1 (WILLADINO et al., 2002).
2.4.2. Oxidação em tecidos cultivados in vitro
As plantas perenes lenhosas são consideradas ricas em substâncias derivadas do metabolismo secundário como os polifenóis, os quais exercem importante papel no metabolismo destas espécies, bem como na defesa contra predadores e microorganismos. In vitro, a oxidação fenólica constitui um dos principais problemas enfrentados no início do estabelecimento e durante o cultivo de explantes destas espécies. A oxidação fenólica é altamente dependente do genótipo, do tipo de explante e da época do ano. Alguns gêneros de plantas são mais suscetíveis à oxidação que outros, em relação ao explante, em geral os mais jovens oxidam menos que os velhos (TEIXEIRA, 2001).
A liberação de compostos fenólicos ocorre devido ao dano causado nas células durante a excisão dos explantes, inibindo o crescimento da plântula, levando-a à morte.
Os compostos fenólicos são oxidados pela enzima polifenol oxidase, a qual produz substâncias amareladas de composição complexa, do tipo quinonas. Essas substâncias podem se ligar a proteínas das membranas ou enzimas, acarretando toxidez e morte da célula (TEIXEIRA, 2001).
Algumas medidas são recomendadas para controlar a oxidação como: lavagem do material antes da desinfestação em água corrente, auxiliando na lixiviação dos compostos fenólicos; utilização de antioxidantes e incubação inicial dos explantes no escuro (CALDAS et al., 1998, GRATTAPAGLIA & MACHADO, 1998). Os antioxidantes a serem incorporados ao meio de cultura, podem ser o ácido cítrico, ácido ascórbico, polivinilpirrolidona (PVP), carvão ativado, glutation, cisteína, ditiotreitol e rosmanol ou utilizados como solução para enxaguar explantes isolados retardando o processo de escurecimento (PASQUAL et al., 1997b).
O carvão ativado evita o acúmulo de inibidores fenólicos, contudo, o seu uso pode adsorver outras substâncias do meio nutritivo, como os reguladores de crescimento, bem como pode ser tóxico a alguns tecidos e induzir o processo de rizogênese. A adição de 100mg.L-1 de carvão ativado no meio evitou a oxidação fenólica e aumentou a produção de brotos sadios e normais em Gymnema sylvestre. Acima dessa concentração os brotos ficaram vitrificados (RAO & KOMALAVALLI, 2000).
O PVP é um antioxidante, que tem sido bastante empregado, pois também impede uma maior oxidação dos explantes pelas enzimas fenolases, adsorvendo os produtos da oxidação fenólica, ou quinonas (PASQUAL et al., 1997b). Augusto (2002), controlou a oxidação de amoreira-preta (Rubus sp.) com a adição de 1g.L-1 PVP em meio sólido.
2.4.3. Meios de cultura
Os meios de cultura utilizados para a cultura de células, tecidos e órgãos de plantas fornecem as substâncias essenciais para o crescimento dos tecidos e controlam, em grande parte, o padrão de desenvolvimento in vitro (CALDAS et al., 1998).
O meio de cultura é constituído de componentes essenciais e opcionais. Os essenciais compreendem água, sais inorgânicos, fonte de carbono e energia, vitaminas e reguladores de crescimento. Outros componentes orgânicos, tais como aminoácidos, amidas, ácidos orgânicos e substâncias naturais complexas, podem ser adicionados ao meio para otimizar determinada resposta no padrão de crescimento (TORRES et al., 2001).
Os macronutrientes N, P, K, Ca, Mg, e S são requeridos em todos os tipos de culturas de planta, mas a concentração de cada um pode variar de acordo com espécie.
Embora as células em cultivo possam crescer apenas na presença de em nitrato, o pH do meio (5.0-6.0) é geralmente melhor quando o meio contem íons de nitrato e de amônio.
Os micronutrientes são requeridos pela planta em quantidades de traço, sendo os mais utilizados em cultura de teciods o Fe, Mn, Zn, B, Cu, Cl, Mo, e o Ni, no entanto o Co, I, e o Na são incluídos também em alguns meios embora sua exigência e papel na fisiologia não estejam bem definidos (ROUT et al., 2000).
A exigência de carboidratos é suprida com a incorporação da sacarose 2-3%, ou com menos freqüência de glicose. Outros carboidratos como a lactose, a maltose, o galactose são usados raramente. Além do seu papel como uma fonte do carbono, os carboidratos ajudam a manter o potencial osmótico no meio de cultura. As plantas inteiras sintetizam todas as vitaminas requeridas para o crescimento e o desenvolvimento normal. No meio de cultura são adicionadas vitaminas específicas,
incluindo a tiamina (B1), o ácido nicotínico (B3), o piridoxina (B6), e o mio-inositol as quais são requeridas pelo explante em cultivo. Embora, as células cultivadas sejam normalmente capazes de sintetizar todos seus aminoácidos exigidos, a adição de glutamina, cisteína, prolina, e tirosina ou uma mistura do aminoácido como a caseína hidrolisada ao meio pode aumentar o crescimento celular. O ágar é o agente solidificante mais usado para preparar meios de cultura sólido ou semi-sólido, porém outros agentes geleificantes como: gelatina, amido, e o gelrite também são utilizados (ROUT et al., 2000).
O meio MS (MURASHIGE & SKOOG, 1962) e o B5 (GAMBORG et al., 1968) são os mais usados na cultura de tecidos da grande maioria das espécies, porém para espécies lenhosas o mais indicado é o WPM (LLOYD & MCCOWN, 1980) (CALDAS et al., 1998).
Louro-pardo (Cordia trichotoma (Vellozo) Arrabida ex Steudel) (MANTOVANI et al., 2001), caixeta (MANTOVANI et al., 1999), Ficus carica L.
(FRÁGUAS et al., 2004), Vitis thunbergii Sieb. et Zucc. (LU, 2005), marmelinho (Tournefortia cf paniculata Cham.) (BERTOLUCCI et al., 2000) são exemplos de espécies micropropagadas através do meio WPM. Entretando, algumas espécies lenhosas são propagadas em meio MS como: Lippia micromera (CAPOTE et al., 1999), Lippia junelliana (mold.) Tronc. (JULIANI JUNIOR et al., 1999), aroeira (Myracrodruon urundeuva Fr. All) (ANDRADE et al., 2000) e insulina vegetal (Cissus sicyoides L.) (ABREU et al., 2003).
As modificações e diluições feitas no meio MS têm apresentado bons resultados para diversas espécies lenhosas. Em espinheira-santa com a redução em 50% da concentração dos sais do meio MS, minimizou-se a oxidação fenólica (FLORES et al., 1998), enquanto que para as plantas do gênero Prunus, o meio MS reduzido a ¾ foi eficiente no crescimento dos explante, na taxa de multiplicação e no número de brotações (RODRIGUES et al., 2003).
Na micropropagação de Aloysia polystachia Sansberro em meio MS semi-sólido diluído quatro vezes obteve-se uma maior sobrevivência dos explantes (MROGINSKI, 1995). Já para aroeira (Myracrodruon urundeuva Fr. All) o meio MS modificado com a metade dos seus sais foi eficiente na multiplicação da espécie (ANDRADE et al., 2000).
2.4.4. Reguladores de crescimento
Na micropropagação, os meios de cultura são suplementados por substâncias reguladoras de crescimento, cuja função é suprir as possíveis deficiências dos teores endógenos de hormônios nos explantes. Simultaneamente, estimulam certas respostas como crescimento, alongamento ou multiplicação da parte aérea. Estas respostas dependem do estado fisiológico dos explantes, que está relacionado com a época do ano e estado geral da planta-matriz (CASTRO et al., 2002).
A composição e a concentração dos reguladores de crescimento no meio de cultura são fatores determinantes para o crescimento e padrão de desenvolvimento da maioria dos sistemas de cultivo in vitro. Entre os principais grupos de hormônios vegetais utilizados na cultura de tecidos estão as auxinas, as citocininas e as giberelinas.
As auxinas têm em comum a capacidade de atuar na divisão e alongamento celular, indução de calo, dominância apical, formação e crescimento das raízes, no desenvolvimento de gemas florais e do fruto (KRIKORIAN, 1991; POZO et al., 2005).
As concentrações de auxinas nos meios variam de 0,01 a 10mg.L-1. As auxinas mais usadas são ANA, AIB, ácido indolácetico (AIA) e 2,4-diclorofenoxiácetico (2,4-D) (TORRES et al., 2001). A auxina possui vários efeitos, os quais diferem de época para
época, de espécie para espécie e, sobretudo, de tecido para tecido. Como muitos outros compostos fisiologicamente ativos, a auxina se mostra tóxica em altas concentrações (RAVEN et al., 1992 ).
As citocininas desempenham um papel importante na regulação da divisão celular, na formação de gemas adventícias, de brotações adventícias e axilares e interagem com as auxinas no controle de muitos aspectos do crescimento e do desenvolvimento das plantas (FRANK & SCHMÜLLING, 1999; POZO et al., 2005).
As citocininas mais usadas na cultura de tecidos são a cinetina, BAP, zeatina, isopenteniladenina (2ip) e thidiazuron (TDZ). As concentrações recomendadas destas substâncias variam de 0,03 a 30mg.L-1 (TORRES et al., 2001).
A disponibilidade e interação dessas duas classes de reguladores de crescimento no meio de cultura levam ao crescimento e morfogênese in vitro, tendo uma importante influência na formação das raízes, parte aérea e calo em cultura de tecidos. O efeito fisiológico depende da concentração de cada regulador no meio, sendo que cada parte da planta tem uma resposta diferente, às alterações das concentrações de auxinas e citocininas (FRANK & SCHMÜLLING, 1999; POZO et al., 2005).
Em meio para multiplicação in vitro, concentrações efetivas de cada regulador de crescimento irá variar e precisará ser ajustado de acordo com o genótipo da planta a ser cultivada, o tipo de tecido ou órgão (PASQUAL et al.; 1997a).
Na micropropagação de Piper longum L. o maior número de brotos foi obtido com 2mg.L-1 de BAP e 1mg.L-1 de cinetina (SONIYA & DAS, 2002). Para Eupatorium triplinerve (MARTIN, 2003/4) e Ceropegia candelabrum L. (BEENA et al., 2003) as concentrações de 2mg.L-1 de BAP e 0,5mg.L-1 de AIB foram eficientes na indução e desenvolvimento das brotações. Já em Sophora flavescens 2mg.L-1 BAP e 0,5mg.L-1 de ANA promoveram uma maior proliferação dos brotos (ZHAO et al., 2003/4), enquanto que para Orthosiphon spiralis (Lour) Murr. 0,5mg.L-1 de BAP foi suficiente para a sua multiplicação (ELANGOMATHAVAN et al., 2003). Para porta-enxertos de Prunus o AIB e o AIA foi superior ao ANA quanto ao número e tamanho dos brotos (SILVEIRA et al., 2001).
O BAP estimulou brotações em explantes do porta-enxerto de macieira ¨Seleção 69¨ (SANTA-CATARINA et al., 2001) e, favoreceu a indução de roseta (multibrotos) em segmentos nodais de marmelinho (BERTOLUCCI et al., 2000), sendo superior a cinetina quanto a percentagem de explantes com brotações em espinheira-santa (Maytenus ilicifolia Mart.) (FLORES et al., 1998). Já em macela (Egletes viscosa (l.) Less.) a concentração de 2mg.L-1 de BAP favoreceu uma maior brotação (DINIZ et al., 2003).
Em insulina vegetal (Cissus sicyoides) a interação entre cinetina e ANA proporcionou maior indução de gemas (ABREU et al. 2003). Para Lippia micromera Schau o meio MS suplementado com 1mg.L-1 ANA e 2mg.L-1 BAP foi eficiente para a sua multiplicação (CAPOTE et al., 1999). Já para micropropagação de Lippia junelliana a interação de BAP + AIB induziu um maior número de brotações (JULIANI JÚNIOR et al., 1999).
As giberelinas, na forma de ácido giberélico (GA3), têm como principal efeito o alongamento das brotações durante a multiplicação in vitro, sendo este fato observado em Rollinia mucosa (FIGUEIREDO et al., 2001) e macela (Egletes viscosa (L.) Less.) (DINIZ et al., 2003).
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