2.4. Propagação in vitro
2.4.4. Reguladores de crescimento
Na micropropagação, os meios de cultura são suplementados por substâncias reguladoras de crescimento, cuja função é suprir as possíveis deficiências dos teores endógenos de hormônios nos explantes. Simultaneamente, estimulam certas respostas como crescimento, alongamento ou multiplicação da parte aérea. Estas respostas dependem do estado fisiológico dos explantes, que está relacionado com a época do ano e estado geral da planta-matriz (CASTRO et al., 2002).
A composição e a concentração dos reguladores de crescimento no meio de cultura são fatores determinantes para o crescimento e padrão de desenvolvimento da maioria dos sistemas de cultivo in vitro. Entre os principais grupos de hormônios vegetais utilizados na cultura de tecidos estão as auxinas, as citocininas e as giberelinas.
As auxinas têm em comum a capacidade de atuar na divisão e alongamento celular, indução de calo, dominância apical, formação e crescimento das raízes, no desenvolvimento de gemas florais e do fruto (KRIKORIAN, 1991; POZO et al., 2005).
As concentrações de auxinas nos meios variam de 0,01 a 10mg.L-1. As auxinas mais usadas são ANA, AIB, ácido indolácetico (AIA) e 2,4-diclorofenoxiácetico (2,4-D) (TORRES et al., 2001). A auxina possui vários efeitos, os quais diferem de época para
época, de espécie para espécie e, sobretudo, de tecido para tecido. Como muitos outros compostos fisiologicamente ativos, a auxina se mostra tóxica em altas concentrações (RAVEN et al., 1992 ).
As citocininas desempenham um papel importante na regulação da divisão celular, na formação de gemas adventícias, de brotações adventícias e axilares e interagem com as auxinas no controle de muitos aspectos do crescimento e do desenvolvimento das plantas (FRANK & SCHMÜLLING, 1999; POZO et al., 2005).
As citocininas mais usadas na cultura de tecidos são a cinetina, BAP, zeatina, isopenteniladenina (2ip) e thidiazuron (TDZ). As concentrações recomendadas destas substâncias variam de 0,03 a 30mg.L-1 (TORRES et al., 2001).
A disponibilidade e interação dessas duas classes de reguladores de crescimento no meio de cultura levam ao crescimento e morfogênese in vitro, tendo uma importante influência na formação das raízes, parte aérea e calo em cultura de tecidos. O efeito fisiológico depende da concentração de cada regulador no meio, sendo que cada parte da planta tem uma resposta diferente, às alterações das concentrações de auxinas e citocininas (FRANK & SCHMÜLLING, 1999; POZO et al., 2005).
Em meio para multiplicação in vitro, concentrações efetivas de cada regulador de crescimento irá variar e precisará ser ajustado de acordo com o genótipo da planta a ser cultivada, o tipo de tecido ou órgão (PASQUAL et al.; 1997a).
Na micropropagação de Piper longum L. o maior número de brotos foi obtido com 2mg.L-1 de BAP e 1mg.L-1 de cinetina (SONIYA & DAS, 2002). Para Eupatorium triplinerve (MARTIN, 2003/4) e Ceropegia candelabrum L. (BEENA et al., 2003) as concentrações de 2mg.L-1 de BAP e 0,5mg.L-1 de AIB foram eficientes na indução e desenvolvimento das brotações. Já em Sophora flavescens 2mg.L-1 BAP e 0,5mg.L-1 de ANA promoveram uma maior proliferação dos brotos (ZHAO et al., 2003/4), enquanto que para Orthosiphon spiralis (Lour) Murr. 0,5mg.L-1 de BAP foi suficiente para a sua multiplicação (ELANGOMATHAVAN et al., 2003). Para porta-enxertos de Prunus o AIB e o AIA foi superior ao ANA quanto ao número e tamanho dos brotos (SILVEIRA et al., 2001).
O BAP estimulou brotações em explantes do porta-enxerto de macieira ¨Seleção 69¨ (SANTA-CATARINA et al., 2001) e, favoreceu a indução de roseta (multibrotos) em segmentos nodais de marmelinho (BERTOLUCCI et al., 2000), sendo superior a cinetina quanto a percentagem de explantes com brotações em espinheira-santa (Maytenus ilicifolia Mart.) (FLORES et al., 1998). Já em macela (Egletes viscosa (l.) Less.) a concentração de 2mg.L-1 de BAP favoreceu uma maior brotação (DINIZ et al., 2003).
Em insulina vegetal (Cissus sicyoides) a interação entre cinetina e ANA proporcionou maior indução de gemas (ABREU et al. 2003). Para Lippia micromera Schau o meio MS suplementado com 1mg.L-1 ANA e 2mg.L-1 BAP foi eficiente para a sua multiplicação (CAPOTE et al., 1999). Já para micropropagação de Lippia junelliana a interação de BAP + AIB induziu um maior número de brotações (JULIANI JÚNIOR et al., 1999).
As giberelinas, na forma de ácido giberélico (GA3), têm como principal efeito o alongamento das brotações durante a multiplicação in vitro, sendo este fato observado em Rollinia mucosa (FIGUEIREDO et al., 2001) e macela (Egletes viscosa (L.) Less.) (DINIZ et al., 2003).
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3. CAPÍTULO I
ESTABELECIMENTO IN VITRO DE ALECRIM-PIMENTA (Lippia sidoides Cham.)
RESUMO
COSTA, Andréa Santos. Estabelecimento in vitro de alecrim-pimenta ( Lippia sidoides Cham.). In: Sustentabilidade da produção de alecrim-pimenta (Lippia sidoides Cham.):
micropropagação visando a conservação in vitro. 2006. Cap.I. Dissertação de Mestrado em Agroecossistemas – Universidade Federal de Sergipe, São Cristóvão.
O alecrim-pimenta (Lippia sidoides Cham.) é um arbusto nativo da região do semi-árido do nordeste brasileiro e seu óleo essencial possui elevado valor comercial, contém timol e carvacrol como constituintes majoritários, os quais possuem fortíssima propriedade antimicrobiana e anti-séptica. Este trabalho teve como objetivo o estabelecimento in vitro de L. sidoides, a partir da avaliação de concentrações de hipoclorito de sódio e tempos de imersão, de três meios de cultivo, do antibiótico cefotaxima sódica e de antioxidantes. Recomenda-se o uso de 0,8% de hipoclorito de sódio e um tempo de imersão de 16 minutos, 200mg.L-1 de cefotaxima sódica, o meio WPM, MS ou B5 e 3,0g.L-1 de carvão ativado ou 0,5g.L-1 de PVP para o estabelecimento in vitro de L. sidoides.
Palavras-chave: Lippia sidoides, planta medicinal nativa, micropropagação, controle de contaminação, oxidação.
ABSTRACT
COSTA, Andréa Santos. In vitro establishment of Lippia sidoides Cham. In:
Sustainability of the production of Lippia sidoides Cham.: micropropagation for in vitro conservation. 2006. Cap.I. Thesis - Master of Science in Agroecosystems - Universidade Federal de Sergipe, São Cristóvão.
Lippia sidoides Cham. is a native shrub from the semi-arid region of northeast Brazil and its essential oil have high commercial value. Thymol and carvacrol are the major compounds of the essential oil and present antimicrobial and antiseptic properties.
The aim of this work was the in vitro establishment of L. sidoides evaluating concentrations of sodium hipoclorite and immersion time, three culture mediums, the antibiotic cefotaxime sodium and antioxidants. For in vitro establishment of L. sidoides we recommend immersion of explants for 16 minutes in a 0.8% sodium hypochlorite solution, 200mg.L-1 of cefotaxime sodium, WPM, MS or B5 culture medium, and 3.0g.L-1 of active charcoal or 0.5 g.L-1 of PVP.
Key words: Lippia sidoides, native medicinal plant, micropropagation, contamination control, oxidation.
3.1. INTRODUÇÃO
Devido a facilidade com que os recursos genéticos vegetais são perdidos, antes mesmo de haver um estudo de suas propriedades e utilidades, é que se tem desenvolvido técnicas de multiplicação e conservação in vitro de plantas em condições assépticas, proporcionando uma maior proteção contra a ação de microorganismos (fungos, bactérias ou vírus) e sob condições ambientais controladas.
A Lippia sidoides é uma planta nativa da Caatinga, vulgarmente conhecida como alecrim-pimenta, estrepa cavalo, alecrim-do-nordeste e alecrim bravo (INNECCO et al., 2000; MATOS, 2002). Seu óleo essencial possui elevado valor comercial, pois contém timol e carvacrol, dois terpenos fenólicos com fortíssima propriedade antimicrobiana e anti-séptica (MATOS, 2000). Devido a sua importância econômica, esta espécie pode sofrer forte pressão antrópica no seu ambiente natural e ao fato de que ainda não foram encontradas sementes botânicas1 da mesma. A definição de um protocolo de estabelecimento in vitro se torna importante, uma vez que é possível multiplicá-la e conservá-la in vitro mantendo-lhes as mesmas características de uma planta desenvolvida em meio natural.
Espécies nativas e lenhosas encontram certas dificuldades no seu estabelecimento, em decorrência da oxidação e contaminação bacteriana e fúngica presentes na superfície do explante (SATO et al., 2001). Além dessa contaminação superficial, é freqüente deparar-se com aquelas presentes no interior dos tecidos (TEIXEIRA, 2001). A utilização de antibióticos para o controle da contaminação bacteriana é freqüente, podendo os mesmos ser adicionados ao meio de cultura ou submetendo os explantes a banhos sob agitação por alguns minutos ou horas (MONTARROYOS, 2000; GRATTAPAGLIA & MACHADO, 1998).
Com a oxidação fenólica dos explantes, ocorre a liberação de compostos, os quais são oxidados pelas enzimas polifenases, produzindo substâncias tóxicas, inibindo o crescimento dos explantes, além de escurecer o meio de cultura (GRATTAPAGLIA
& MACHADO, 1998). O uso de antioxidantes é uma das alternativas para contornar este problema.
Os objetivos do trabalho foram estabelecer condições de cultivo in vitro de L.
sidoides na fase inicial com a avaliação de diferentes meios de cultura, antioxidantes, concentrações de hipoclorito de sódio e do antibiótico cefotaxima.
3.2. MATERIAL E MÉTODOS 3.2.1. Obtenção de explantes
As mudas de L. sidoides Cham. utilizadas como fonte de explante foram produzidas por estaquia a partir das matrizes plantadas no Horto de Plantas Medicinais da Fazenda Experimental "Campus Rural da UFS”, localizado no município de São Cristóvão-SE, fornecidas pela Universidade Federal do Ceará. Estacas de ramos mais finos foram colocadas em bandeja de poliestireno com 72 alvéolos, utilizando como substrato areia e pó de coco + 12g.L-1 de Bioativo (6-24-12), na proporção de 1:1, e colocadas em ambiente protegido com tela sombrite 50%, com irrigação por aspersão.
Após 70 dias, as mudas foram transplantadas para vasos de 5,5 litros com o substrato acima citado e mantidas em estufa agrícola. Os ensaios in vitro foram realizados no Laboratório de Cultura de Tecidos e Melhoramento Vegetal do Departamento de
1 Informação cedida pelo Profº Dr. Renato Innecco da Universidade Federal do Ceará.