4. CAPÍTULO II: INFLUÊNCIA DE REGULADORES DE CRESCIMENTO
4.3.2. Influência de ANA na micropropagação de L. sidoides
O número de brotos não sofreu influência pelas concentrações estudadas de ANA. Já o número de folhas apresentou um efeito linear negativo, à medida que tais concentrações aumentaram (Tabela 10). Em relação ao comprimento dos brotos, observou que o aumento na concentração de ANA promoveu uma diminuição do comprimento dos mesmos proporcionando uma curva de regressão cúbica (Tabela 10).
Isso mostra que concentrações mais elevadas dessa auxina podem inibir o tamanho e o número de folhas dos brotos. Não foram observadas diferenças significativas para MFF e MFS (Tabela 11).
TABELA 10. Valores médios de número de brotos, comprimento de brotos (cm) e número de folhas de explantes de alecrim-pimenta (Lippia sidoides) in vitro em função de concentrações de ANA no meio de cultura MS. São Cristóvão-SE, UFS, 2005.
ANA (mg.L-1) Número de brotos1/ Comprimento dos brotos (cm) Número de folhas1/
Para a variável porcentagem de explantes com raiz não houve diferenças significativas entre as concentrações de ANA testadas (Tabela 11). Resultados semelhantes foram encontrados para Deco, genótipo de aspargo (Asparagus officinalis L.), onde as concentrações de ANA não influenciaram o enraizamento, enquanto que para o outro genótipo M-7 a concentração de 0,9mg.L-1 de ANA proporcionou um aumento no número de raízes (AMARANTE et al., 2001). Assim como em Vitis thunbergii Sieb. et Zucc. 0,5mg.L-1 de ANA (LU, 2005) e em Phyllanthus caroliniensis 0,2mg.L-1 de ANA (CATAPAN et al., 2000).
TABELA 11. Valores médios de porcentagem de raiz (%), massa (g) de folhas fresca (MFF) e massa de folha seca (MFS) de explantes de alecrim-pimenta (Lippia sidoides) in vitro em função de concentrações de ANA no meio de cultura MS. São Cristóvão-SE, UFS, 2005.
1/ Dados transformados para arco seno da raiz de (x/100);
2/ Dados transformados para raiz de (x + 0,1);
3/ Dados transformados para raiz de (x + 0,01).
4.3.3. Influência da cinetina e ANA na a micropropagação de L. sidoides
Não houve interação significativa entre cinetina e ANA. Para as variáveis número de brotações e número de folhas não houve efeito significativo da cinetina (Tabela 12). Resultados diferentes foram obtidos no estabelecimento e multiplicação in vitro de Cissus sicyoides, onde os melhores índices para número e altura de brotos foram alcançados na presença de 0,99mg.L-1de cinetina e 0,58mg.L-1 de ANA (ABREU et al., 2003). Também foram observados efeitos positivos na multiplicação de Salix humboldtiana (PEREIRA et al., 2000b) e Ficus carica L. (FRÁGUAS et al., 2004).
TABELA 12. Valores médios de número de brotos, comprimento de brotos (cm), número de folhas de explantes de alecrim-pimenta (Lippia sidoides) in vitro em função de concentrações de cinetina no meio de cultura MS. São Cristóvão-SE, UFS, 2005.
Cinetina (mg.L-1) Número de brotos1/ Comprimento dos brotos (cm) Número de folhas1/
As variáveis comprimento de brotos (Tabela 12), MFF e MFS (Tabela 13) podem ser representadas por uma regressão cúbica. A concentração de 1,0mg.L-1 de cinetina promoveu um maior comprimento dos brotos (Figura 6). Porém, na concentração de 2mg.L-1 de cinetina houve inibição do crescimento, originando brotações com tamanhos menores do que aquelas formadas nos segmentos nodais da testemunha. A ausência de cinetina favoreceu o acúmulo de MFF e MFS (Tabela 13).
FIGURA 6. Comprimento dos brotos em explantes de alecrim-pimenta (A) e (B).
TABELA 13. Valores médios de massa (g) de folha fresca (MFF) e massa de folha seca (MFS) de explantes de alecrim-pimenta (Lippia sidoides) in vitro em função de concentrações de cinetina no meio de cultura MS. São Cristóvão-SE, UFS, 2005.
Cinetina (mg.L-1) MFF (g) MFS (g)
0,00 250,79 23,81
0,25 178,72 18,36
0,50 160,17 16,54
1,00 218,37 22,13
2,00 236,86 23,11
Equação (Y=) -181,021x3 + 568,58x2 -420,08x + 250,85 R2 = 1,000**
-15,55x3 + 48,10x2 - 34,38x + 23,90
R2 = 0,9959**
CV (%) 18,67 17,72
4.3.4. Influência do AIA na micropropagação de L. sidoides
As variáveis, número e comprimento dos brotos, número de folhas, MFS não apresentaram diferenças significativas com a utilização de AIA (Tabelas 14 e 15). Em relação a variável MFF houve diferença significativa entre os tratamentos sendo esta variável representada pela regressão linear.
TABELA 14. Valores médios de número de brotos, comprimento dos brotos (cm) e número de folhas de explantes de alecrim-pimenta (Lippia sidoides) in vitro em função de concentrações de AIA no meio de cultura MS. São Cristóvão-SE, UFS, 2005.
AIA (mg.L-1) Número de brotos1/ Comprimento dos
brotos (cm) Número de folhas1/
0,00 2,50 0,82 14,20
0,50 2,78 0,71 15,24
1,00 2,88 0,71 16,56
1,50 2,96 0,69 16,16
2,00 3,11 0,66 12,60
Equação (Y=) ns ns ns
CV (%) 14,87 17,44 11,58
1/ Dados transformados para raiz de (x + 0,5)
A B
A variável porcentagem de explantes com raiz apresentou uma regressão cúbica, sendo, em média, a concentração de 1,50mg.L-1 de AIA a que proporcionou os maiores percentuais de enraizamento (Tabela 15), a partir desta concentração detectou-se a inibição na formação de raízes. Este resultado reforça a afirmativa de Grattapaglia &
Machado (1998), de que quando a concentração de auxina no meio é excessiva, ocorre o comprometimento da rizogênese. Para marmeleiro (Cydonia oblonga Mill.) a maior porcentagem de enraizamento foi obtida com 1,75mg.L-1 de AIA (ERIG & SCHUCH, 2004). Já em mrytle (Myrtus communis L.) a concentração de 1mg.L-1 de AIA induziu 61% de enraizamento (SCARPA et al., 2001).
TABELA 15. Valores médios de porcentagem de raiz (%), massa (g) de folha fresca (MFF) e seca (MFS) de explantes de alecrim-pimenta (Lippia sidoides) in vitro em função de concentrações de AIA no meio de cultura MS. São Cristóvão-SE, UFS, 2005.
AIA (mg.L-1) Porcentagem de raiz1/ MFF (g) MFS (g)
1/Dados transformados para arco seno da raiz de (x/100)
4.3.5. Influência do GA3 no alongamento de brotações de L. sidoides
O GA3 não induziu o alongamento desejado nas brotações do alecrim-pimenta, não havendo diferenças significativas entre os tratamentos para todas as variáveis, exceto para a MFF que a adição do GA3 no meio de cultivo proporcionou um efeito linear negativo (Tabela 16). Apesar do efeito sobre a elongação das plantas, o GA3
adicionado ao meio de cultura não proporcionou aumento na altura das brotações de bacurizeiro (Platonia insignis Mart.) (SILVA et al., 2002) de abacate “ouro verde”
(BIASI et al., 1994) de macieira “Marubakaido” (MACHADO et al., 2004) e “Seleção 69” (SANTA-CATARINA et al., 2001) além das cultivares “Golden delicious” e
“Gala” (RIBAS & ZANETTE, 1992). Entretanto a utilização de 1,0 mg.L-1 de GA3 na micropropagação de jenipapo (Genipa americana), mostrou-se efetiva, promovendo o alongamento das brotações (COSTA et al., 2002). E para macela (Egletes viscosa (L.) Less.), a melhor concentração foi 0,5 mg.L-1 (DINIZ et al., 2003).
Neste estudo, observou-se uma alta percentagem das plantas vitrificadas (dados não apresentados) à medida que elevou a concentração de GA3. Resultados semelhantes foram obtidos em segmentos nodais de Tournifortia paniculata (BERTOLUCCI et al., 2000) e em macela (DINIZ et al., 2003), onde a presença do GA3 induziu a hiperhidratação e alteração na forma das folhas.
TABELA 16. Valores médios número e comprimento de brotos (cm), número de folhas, massa (g) de folha fresca (MFF) e seca (MFS) de explantes de alecrim-pimenta (Lippia sidoides) in vitro em função de concentrações de GA3. São Cristóvão-SE, UFS, 2005.
- A presença de 2mg.L-1 de BAP induz um maior percentual de explantes com calo na base;
- A concentração de 0,1 mg.L-1 BAP promove maior acúmulo de matéria fresca nas folhas;
- O AIB não apresenta efeito no crescimento in vitro de L. sidoides;
- A adição de ANA no meio de cultura não proporciona efeitos positivos no crescimento in vitro de L. sidoides;
- A concentração de 1,0mg.L-1 de cinetina promove um maior comprimento dos brotos;
- A concentração de 1,5mg.L-1 de AIA promove o desenvolvimento das raízes em explantes de L. sidoides;
- O GA3 não promove alongamento em brotações de alecrim-pimenta sob condições de cultivo in vitro.
4.5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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5. CONSIDERAÇÕES GERAIS
A Lippia sidoides é uma planta nativa da Caatinga que foi domesticada pela Universidade Federal do Ceará e hoje é explorada comercialmente pela empresa PRONAT, instituição nacional incubada no Parque de Desenvolvimento Tecnológico do Ceará da Universidade Federal do Ceará. A PRONAT possui 10 ha de alecrim-pimenta e já exporta o seu óleo essencial para os EUA, onde o quilo custa US$ 60,00. Com o aumento do interesse econômico, por esta espécie, pelas indústrias farmacêuticas e de cosméticos, e uma vez que não possui sementes botânicas, nota-se uma grande necessidade de se conservar, o máximo, a sua variabilidade genética, visto que a L.
sidoides pode vir a sofrer uma forte pressão antrópica no seu habitat natural, a Caatinga.
E quanto mais permitirmos que as perdas se acumulem, maiores serão os prejuízos das futuras gerações, tanto os já conhecidos quanto daqueles que serão certamente descobertos mais tardes.
Diante disso, precisa-se conservar tais recursos fora do local de ocorrência, ou seja, ex situ. Nesse caso, o importante é que esta espécie seja conservada por métodos convencionais e biotecnológicos. A conservação de germoplasma in vitro constitui um método valioso para a conservação dos recursos genéticos vegetais, uma vez que facilita o intercâmbio de germoplasma, auxilia no melhoramento genético, reduz a erosão genética e promove a produção de matrizes livres de patógenos.
Porém antes de se realizar a conservação in vitro é necessário dominar as técnicas de micropropagação da espécie. O presente trabalho permitiu definir as condições para o estabelecimento e multiplicação in vitro de L. sidoides. O desenvolvimento dos melhores métodos de conservação in vitro de L. sidoides associados de outras estratégias para apoiar a área de recursos genéticos de plantas medicinais, contribuirá sobre maneira para a sustentabilidade do ecossistema Caatinga.
ANEXOS
TABELA 1A. Composição do meio MS (MURASHIGE & SKOOG, 1962).
Componentes Concentração (mg.L-1) Macronutrientes
CaCl2.2H2O 440
KH2PO4 170
KNO3 1.900
NH4NO3 1.650
MgSO4.7H2O 370
Micronutrientes
CoCl2.6H2O 0,025
CuSO4.5H2O 0,025
H3BO3 6,20
KI 0,83
MnSO4.4H2O 22,3
Na2MoO4.2H2O 0,25
ZnSO4.7H2O 8,6
FE-EDTA
FeSO4.7H2O 27,85
Na2 EDTA.2H2O 37,25
Vitaminas e Aminoácidos
Ácido Nicotínico 0,50
Glicina 2,00
Piridoxina – HCl 0,50
Tiamina – HCl 0, 10
Mio-inositol 100
Sacarose (g.L-1) 30
Fonte: Caldas et al. (1998)
TABELA 2A. Composição do meio B5 (GAMBORG et al., 1968).
Componentes Concentração (mg.L-1) Macronutrientes
CaCl2.2H2O 150
KNO3 2.500
MgSO4.7H2O 250
NaH2PO4.H2O 150
(NH4)2SO4 134
Micronutrientes
CoCl2.6H2O 0,025
CuSO4.5H2O 0,025
H3BO3 3
KI 0,75
MnSO4. H2O 10
Na2MoO4.2H2O 0,25
ZnSO4.7H2O 2
FE-EDTA
FeSO4.7H2O 27,8
Na2 EDTA.2H2O 37,2
Vitaminas e Aminoácidos
Ácido Nicotínico 1,0
Glicina 2,00
Piridoxina – HCl 1,0
Tiamina – HCl 10
Mio-inositol 100
Sacarose (g.L-1) 20
Fonte: Pasqual et al. (1997b)
TABELA 3A. Composição do meio WPM (LLOYD & MCCOWN, 1980).
Componentes Concentração (mg.L-1) Macronutrientes
CaCl2.2H2O 96
Ca(NO3)2.4H2O 556
KH2PO4 170
K2SO4 990
MgSO4.7H2O 370
NH4NO3 400
Micronutrientes
CuSO4.5H2O 0, 25
H3BO3 6,2
KI 0,75
MnSO4. 4H2O 22,3
Na2MoO4.2H2O 0,25
ZnSO4.7H2O 8,6
FE-EDTA
FeSO4.7H2O 27,8
Na2 EDTA.2H2O 37,2
Vitaminas e Aminoácidos
Ácido Nicotínico 0,5
Piridoxina – HCl 0,5
Tiamina – HCl 1,0
Mio-inositol 100
Sacarose (g.L-1) 20
Fonte: Pasqual et al. (1997b)
TABELA 4A. Resumo da análise de variância das variáveis porcentagem de contaminação fúngica (%), número de brotos e folhas, número de folhas por brotos de explantes de alecrim-pimenta (Lippia sidoides) in vitro, em função de concentrações de hipoclorito de sódio e tempo de imersão. São Cristóvão-SE, UFS, 2005.
1/ Dados transformados para arco seno da raiz de (x/100);
2/ Dados transformados para raiz de (x + 0,5);
** Significativo a 1% de probabilidade pelo teste de F.
TABELA 5A. Resumo da análise de variância das variáveis porcentagem de oxidação (%), de contaminação bacteriana (%) e de sobrevivência (%) de explantes de alecrim-pimenta (Lippia sidoides) in vitro, em função de concentrações de cefotaxima no meio de cultura MS modificado. São Cristóvão-SE, UFS, 2005.
Fonte de variação GL QM
Oxidação1/ Contaminação bacteriana 1/ Sobrevivência 1/
Cefotaxima 4 490,172* 728,207* 1256,413**
Resíduo 20 182,829 267,271 79,81
CV(%) 29,11 53,93 90,51
1/ Dados transformados para arco seno da raiz de (x/100)
* Significativo a 5% de probabilidade pelo teste de F; ** Significativo a 1% de probabilidade pelo teste de F.
Fonte de GL QM
variação Contaminação fúngica1/ Número de
brotos2/ Número de
folhas 2/ Número de folhas por brotos2/
Hipoclorito de sódio (H) 3 865,662ns 0,692 ns 4,992 ns 1,229*
Tempo (T) 3 1064,556 0,428 3,026 0,801
HxT 9 1627,056 0,381 1,858 0,506
Resíduo 48 1265,344 0,353 1,995 0,448
CV(%) 82,06 43,74 62,15 43,25
TABELA 6A. Resumo da análise de variância das variáveis número e comprimento dos brotos (cm), número de folhas, porcentagem de oxidação (%), de raiz (%) e de sobrevivência (%) de explantes de alecrim-pimenta (Lippia sidoides) in vitro, nos meios MS, WPM e B5. São Cristóvão-SE, UFS, 2005.
Fonte de GL QM
Variação Número de brotos2/
Comprimento
dos brotos Número de folhas2/
Oxidação1/ Porcentagem
de raiz1/ Sobrevivência1/
Meios 2 2,349ns 0,123ns 54,94ns 322,917ns 281,250* 666,667ns Resíduo 12 1,025 0,058 31,28 484,375 78,125 250,00 CV(%) 46,54 47,77 46,95 105,64 117,85 51,28
1/ Dados transformados para arco seno da raiz de (x/100);
2/ Dados transformados para raiz de (x + 0,5);
*Significativo a 5% de probabilidade pelo teste de F.
TABELA 7A. Resumo da análise de variância das variáveis porcentagem de oxidação (%), comprimento dos brotos (cm), porcentagem de sobrevivência (%) e de vitrificação (%) de explantes de alecrim-pimenta (Lippia sidoides Cham.) in vitro, em função de diferentes concentrações de dois antioxidantes. São Cristóvão-SE, UFS, 2005.
Fonte de GL QM
variação Oxidação1/ Comprimento
dos brotos Sobrevivência 1/ Porcentagem vitrificação1/
Tratamentos 4 1202,021*
*
2,571** 1543,857** 1879,253**
Resíduo 15 152,114 0,457 266,766 284,571
CV(%) 77,28 34,44 41,77 77,93
1/ Dados transformados para arco seno da raiz de (x/100);
** Significativo a 1% de probabilidade pelo teste de F.
TABELA 8A. Resumo da análise de variância das variáveis número e comprimento de brotos (cm), número de folhas, massa (g) de folha fresca (MMF) e seca (MFS) e porcentagem de calo (%) de explantes de alecrim-pimenta (Lippia sidoides) in vitro, em função de concentrações de BAP e AIB no meio de cultura MS. São Cristóvão-SE, UFS, 2005.
1/ Dados transformados para arco seno da raiz de (x/100);
* Significativo a 5% de probabilidade pelo teste de F; ** Significativo a 1% de probabilidade pelo teste de F.
TABELA 9A. Resumo da análise de variância das variáveis número e comprimento dos brotos (cm), número de folhas, porcentagem de raiz (%), massa (g) de folha fresca (MFF) e seca (MFS) de explantes de alecrim-pimenta (Lippia sidoides) in vitro, em função de concentrações de ANA no meio de cultura MS. São Cristóvão-SE, UFS, 2005.
4/ Dados transformados para raiz de (x + 0,01);
** Significativo a 1% de probabilidade pelo teste de F.
TABELA 10A. Resumo da análise de variância das variáveis número e comprimento dos brotos (cm), número de folhas, massa (g) de folha fresca (MFF) e seca (MFS) deexplantes de alecrim-pimenta (Lippia sidoides) in vitro, em função de concentrações de cinetina e ANA no meio de cultura MS. São Cristóvão-SE, UFS, 2005.
Fonte de GL QM
*Significativo a 5% de probabilidade pelo teste de F; ** Significativo a 1% de probabilidade pelo teste de F.
TABELA 11A. Resumo da análise de variância das variáveis número e comprimento dos brotos (cm), número de folhas, porcentagem de raiz (%), massa (g) de folha fresca (MFF) e seca (MFS) de explantes de alecrim-pimenta (Lippia sidoides) in vitro, em função de concentrações AIA no meio de cultura MS. São Cristóvão-SE, UFS, 2005.
Fonte de GL QM
2/Dados transformados para arco seno da raiz de (x/100);
* Significativo a 5% de probabilidade pelo teste de F.
TABELA 12A. Resumo da análise de variância das variáveis número e comprimento dos brotos (cm), número de folhas, massa (g) de folha fresca (MFF) e seca (MFS) deexplantes de alecrim-pimenta (Lippia sidoides) in vitro, em função de concentrações GA3 no meio de cultura MS. São Cristóvão-SE, UFS, 2005.
Fonte de GL QM
variação Número de brotos1/
Comprimento dos brotos
Número de folhas1/
MFF MFS GA3 4 0,021 ns 0,023 ns 0,105 ns 0,006 ns 0,00003 ns Resíduo 20 0,022 0,017 0,149 0,003 0,00002 CV (%) 8,94 29,90 11,02 25,92 18,51
1/ Dados transformados para raiz de (x + 0,5);
* Significativo a 5% de probabilidade pelo teste de F.