UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE FACULDADE DE ODONTOLOGIA
AVALIAÇÃO DE CARBOHIDROXIAPATITA NANOESTRUTURADA E
RHBMP-2 EM REGENERAÇÂO ÓSSEA DE ALVÉOLOS
PÓS-EXTRAÇÃO IN ANIMA MOBILE
Niterói
UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE FACULDADE DE ODONTOLOGIA
AVALIAÇÃO DE CARBOHIDROXIAPATITA NANOESTRUTURADA E
RHBMP-2 EM REGENERAÇÂO ÓSSEA DE ALVÉOLOS
PÓS-EXTRAÇÃO IN ANIMA MOBILE
GUILHERME DIAZ DE OLIVEIRA
Dissertação apresentada à Faculdade de Odontologia da Universidade Federal Fluminense, como parte dos requisitos para obtenção do título de Mestre, pelo Programa de Pós-Graduação em Odontologia.
Área de Concentração: Periodontia
Orientador: Profa. Dra. Carolina Miller de Santana
Niterói 2017
O 48 Oliveira, Guilherme Diaz de
Avaliação de carbohidroxiapatita nanoestruturada e RHBMP-Z em regeneração óssea de alvéolos pós-extração em ratos / Guilherme Diaz de Oliveira; orientadora: Profª Carolina Miller de Santana. – Niterói: [s.n.], 2017.
45 f.: il.
Inclui tabelas.
Dissertação (Mestrado em Odontologia) – Universidade Federal Fluminense, 2017.
Bibliografia: f. 40-44.
1. Biocompatibilidade. 2. Hidroxiapatita. 3. Alvéolos dentários. 4. Osteogênese. 5. Ratos. I. Santana, Carolina Miller de [orient.] . II. Título.
Prof(a). Dr(a). Carolina Miller Mattos de Santana
Instituição: Faculdade de Odontologia da Universidade Federal Fluminense
Decisão: ________________Assinatura: _________________________________ Prof. Dr. Ronaldo Barcelos de Santana
Instituição: Faculdade de Odontologia da Universidade Federal Fluminense
Decisão: ________________Assinatura: _________________________________
Prof. Dr. Rodrigo Guerra de Oliveira
Instituição: Faculdade de Odontologia da Universidade Federal de Juiz de Fora Decisão: ________________Assinatura: _________________________________
A Deus, por ser o sentido de todas as coisas;
Aos meus pais, Désio e Laura, pela dedicação, apoio, exemplo e carinho em todos os momentos;
Ao meu avô, “Manolo”, que me ensinou o verdadeiro significado da ternura; Aos meus familiares e amigos, pelo incentivo e confiança;
Aos meus orientadores, Carolina Miller e Ronaldo Barcellos, pela confiança depositada e dedicação;
Aos professores, Mônica Diuana Calasans Maia, Adriana Therezinha Neves Novelino Alves, Rodrigo Resende, Marcelo Uzeda e Gutemberg Gomes Alves e Carlos Alberto Brazil Barboza Junior pelos ensinamentos, atenção e ajuda incalculáveis;
Aos amigos Igor Paulinelli, Nathalia Di Lanaro, Rodrigo Modena e Alessandra Marinho pela generosidade;
A esta Universidade, por ter sido minha segunda casa, e a todos que a tornam especial;
Muito obrigado.
Oliveira GD; Santana CM. Avaliação de hidroxiapatita e BMP em alvéolo pós extração em ratos [dissertação]. Niterói: Universidade Federal Fluminense, Faculdade de Odontologia; 2017.
As alterações que ocorrem no rebordo alveolar pós-extracção são bem conhecidas e muitas vezes apresentam um problema para a reabilitação dos pacientes candidatos à terapia de implante. Biomateriais têm sido utilizados como importantes ajudas na manutenção da arquitetura alveolar. A hidroxiapatita é uma excelente escolha pela sua biocompatibilidade, semelhança com a porção inorgânica do tecido ósseo e resultados consistentes na literatura. As proteínas morfogenéticas ósseas (BMPs) são substâncias biológicas importantes usadas para a regeneração óssea. O uso de carreadores é altamente necessário, uma vez que aumenta a permanência das BMPs no local de aplicação, permitindo tempo suficiente para que ocorram os eventos celulares desejados e sirva de estrutura para a formação do novo tecido. O objetivo deste estudo foi avaliar a resposta biológica do tecido ósseo alveolar de ratos na presença de BMP e um carreador de hidroxiapatita carbonatada após extração. Ratos Wistar (n = 24) foram divididos aleatoriamente em 2 subgrupos de acordo com os períodos experimentais de 1 e 6 semanas. Após a extração do incisivo central superior direito os alvéolos foram preenchidos por esferas de hidroxiapatita carbonatada (n = 12) e hidroxiapatita carbonatada + BMP (n = 12). Os animais foram sacrificados após 1 e 6 semanas e os blocos ósseos contendo o biomaterial foram processados para avaliação histológica. A formação óssea foi limitada 7 dias após o procedimento de extração e aumentou em ambos os grupos entre 7 e 42 dias após a cirurgia, demonstrando um aumento dependente do tempo do volume ósseo durante todo o período experimental (p <0,05). No entanto, este aumento foi significativamente mais robusto para o grupo CHA + rhBMP-2 (p <0,001). Conclui-se que as esferas de CHA nanoestruturados são biocompatíveis, biorreabsorvíveis e osteocondutoras quando enxertadas em cavidades dentárias alveolares. A adição de rhBMP-2 a CHA aumentou significativamente a nova formação óssea após 42 dias sugerindo que CHA pode ser um portador adequado para BMP-2 nesses defeitos.
Palavras-chave: Biocompatibilidade, hidroxiapatita, Alvéolos dentários, Osteogênese, Ratos.
Oliveira GD; Santana CM. Evaluation of hydroxyapatite and BMP in alveoli after extraction in rats [dissertation]. Niterói: Fluminense Federal University, School of Dentistry; 2017.
Changes occurring in the post-discharge alveolar ridge are known and often represent a problem for the rehabilitation of patient candidates for implant therapy or even dento-supported fixed partial dentures. Over the years, a number of strategies have been studied in order to avoid these alterations and biomaterials have been used as important aids in maintaining the alveolar architecture. Among these, bone morphogenetic proteins, also called BMPs, stand out due to the quality of the results described in the literature. The use of carriers is highly necessary since they increase the permanence of the BMPs at the site of application, allowing enough time for the desired cellular events to occur, and serve as a framework for the formation of the new tissue. Among them, hydroxyapatite is an excellent choice for its biocompatibility, similarity to the inorganic portion of the bone tissue and consistent results in the literature. The objective of this work was to evaluate the biological response of the alveolar bone tissue of rats in the presence of BMP and carbonated hydroxyapatite after extraction. This project was submitted to the Animal Use Ethics Committee of the Federal University of Fluminense (CEUA / NAL-UFF) and used Wistar rats (n = 36) to be distributed randomly in 2 subgroups according to the experimental periods of 1 and 6 Weeks. After the procedures of anesthesia, antisepsis and extraction of the right upper central incisor the alveoli were filled by spheres of carbonate-apatite (n = 12), carbonate-apatite + BMP (n = 12) and clot (n = 12) The region was sutured. The animals were euthanized after 1 and 6 weeks for removal of the bone blocks containing the biomaterial and were submitted to histological processing for inclusion in paraffin (n = 5) and resin (n = 1). 5 μm thick sections of the demineralized samples were stained with Hematoxylin and Eosin (HE) for histomorphometric analysis and descriptive histological analysis.
Key words: Biocompatibility Testing, Hydroxyapatite, Bone Repair, Osteogenesis, Rats.
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
HA... Hidroxiapatita cHA... Hidroxiapatita carbonatada HE... Hematoxilina-Eosina CEP... Comitê de Ética em Pesquisa UFF... Universidade Federal Fluminense UPC... Unidade de pesquisa Clínica BMP ………. Bone Morphogenetic Protein rhBMP ... Recombinant Human Bone Morphogenetic Protein
Sumário
RESUMO... 6
ABSTRACT ... 7
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS ... 8
1 - INTRODUÇÃO ... 11
2 – MATERIAIS E MÉTODOS ... 15
2.1.Biomateriais: ... 15
2.1.1 Hidroxiapatita carbonatada ... 15
2.1.2 rhBMP-2 ... 16
2.2.Caracterização dos Animais: ... 16
2.3.Procedimentos cirúrgicos: ... 17
2.4.Procedimentos e cuidados pós-operatórios: ... 17
2.5.Obtenção das amostras: ... 18
2.6.Processamento das amostras: ... 18
2.7.Análise dos resultados: ... 19
2.8.Infra-estrutura disponível para a realização do Projeto:... 20
2.9. Local ... 20
3 - ARTIGOS PRODUZIDOS ... 20
ANEXO 1 – Certificado de aprovação do comitê de ética no uso de animais. ... 39
Índice de Ilustrações
Figura 1. Microscopia eletrônica de varredura (SEM). A: Esferas de hidroxiapatita carbonatada (CHA)(aumento de 100x); B: Superfície das esferas de CHA (aumento de 1000x), ambos sem tratamento térmico...15
Figura 2. Padrão de difração de RX da cHA ... 16 Figura 3. A) Alvéolo pós exodontia do incisivo central superior direito. B) Alvéolo preenchido com biomaterial (cHA + rhBMP-2) ... 17 Figura 4. Amostras prontas para inclusão em parafina ... 19
1 - INTRODUÇÃO
A perda de um elemento dentário afeta diretamente a vida de qualquer indivíduo, tendo efeitos negativos em sua fonética, função mastigatória e convívio social.1
Em sequência a este fato, uma série de eventos biológicos se inicia no alvéolo em cicatrização e algumas modificações ocorrem em sua morfologia, gerando estreitamento do rebordo e migração do topo da crista óssea alveolar para lingual ou palatina .234 Esta redução pode levar a problemas estéticos e até mesmo impossibilitar ou dificultar a instalação de implantes.
Tamanha é a atenção dada a este fato que alguns autores propuseram classificações para descrever os rebordos alveolares pós exodontia. A primeira delas definia os rebordos quanto ao volume ósseo remanescente em grupos A, B, C, D e E, sendo o grupo A, de maior volume e o E, de menor volume. 5
Outro autor dividiu os rebordos cicatrizados em classes I, II e III, significando, respectivamente, rebordos com perda de volume horizontal, rebordos com perda de volume vertical e por último rebordos com perda de volume horizontal e vertical. 6 A esta classificação foi posteriormente proposta uma modificação7 onde os autores dividiram os rebordos em 3 grupos, A, B e C, que representavam, respectivamente, rebordos com perda vertical, perda horizontal e perda combinada, além de classificar as deformidades dos rebordos em relação ao rebordo adjacente como leve (menos de 3mm), moderada (de 3 a 6 mm) e severa (> 6mm).
Os eventos envolvidos na cicatrização de um alvéolo pós exodontia são bem descritos na literatura e nos ajudam a entender como ocorrem as alterações morfológicas desta estrutura.
Imediatamente após a exodontia ocorre o preenchimento do alvéolo com sangue e consequente formação de um coágulo. Este, que possui papel fundamental na cicatrização, podendo sua ausência acarretar problemas pós-operatórios, contem substancias que influenciam células mesenquimais e células inflamatórias. Em 48h, no entanto, este coágulo começa a ser substituído por tecido de granulação, rico em macrófagos, células semelhantes a fibroblastos e posteriormente, vasos neoformados. Ocorre deposição de matriz extracelular e formação de um tecido conjuntivo. Em torno dos vasos recentemente formados se
inicia a transição do tecido conjuntivo para tecido ósseo através da migração de células osteoprogenitoras, formação de matriz osteóide e consequentemente tecido ósseo. Devido à pouca espessura e a ausência de trabeculado ósseo na extremidade mais coronária da crista óssea alveolar, pode ocorrer necrose desta porção tecidual em consequência do rompimento do suprimento sanguíneo fornecido pelos vasos do ligamento periodontal e, em alguns casos, quando o periósteo é descolado, da perda também do suprimento sanguíneo periosteal. 8
Diversos autores demonstraram que esta perda óssea progride por toda a vida, porém, sua etapa mais significante ocorre nos primeiros seis meses. 2
Nesse contexto, uma série de técnicas vem sendo desenvolvidas para preservar a arquitetura alveolar bem como uma gama de materiais de enxerto visando uma melhora no ganho ósseo do local. 9101112
Os enxertos ósseos podem ser classificados quanto a sua origem em autógenos, onde o doador e o receptor são o mesmo indivíduo, em homógenos, onde o doador e o receptor são indivíduos diferentes, porém da mesma espécie, em heterógenos onde doador e receptor são de espécies diferentes e em aloplásticos, quando sua origem é sintética. 13
Além disso, podem ser classificados quanto à forma de atuação em osteoindutores, quando o novo osso é formado a partir de células progenitoras indiferenciadas estimuladas por um ou mais agentes indutores, em osteocondutores, quando o material de enxerto atua como um arcabouço para a proliferação celular e deposição de matriz óssea, e em osteogênicos quando são compostos, dentre outras coisas, por células viáveis à osteogênese.14
Dentre os diversos tipos de enxerto ósseo existentes, os de origem autógena são considerados ainda como o padrão ouro devido aos resultados descritos na literatura, além da inexistência de reações inflamatórias do tipo corpo estranho. Este tipo de enxerto consegue reunir as propriedades osteogênica, osteocondutora e osteoindutora, o que justifica seu bom desempenho. 10,12
Entretanto, este tipo de abordagem apresenta algumas desvantagens que limitam e por vezes impossibilitam seu uso. Dentre elas é possível destacar a morbidade causada por outra área cirúrgica necessária para a coleta do material. Outro fator limitante é a taxa de reabsorção imprevisível à que está sujeito o enxerto.15 16 Além disso, ainda existe a limitação de quantidade estabelecida pela
área doadora disponível. Estes fatores fazem com que outros materiais alternativos sejam testados a fim de aumentar o leque de possibilidades do paciente e do profissional além de contornar as limitações apresentadas pelos enxertos autógenos.
Dentre estes materiais, um grupo deles se destaca fortemente pelas suas propriedades osteoindutoras, as proteínas morfogenéticas ósseas, conhecidas como BMPs (Bone Morphogenetic Protein) ou rhBMPs (Recombinant Human Bone Morphogenetic Protein)
As primeiras investigações neste sentido podem ser observadas em um estudo do início do século onde foi descrita a capacidade auto indutiva do tecido ósseo.17 Primeiramente, o autor tratou espécimes ósseas removendo seu periósteo e a camada mais superficial e as inoculou em tecido muscular e subcutâneo. Foi observada formação de osso sobre os enxertos e com isso começou-se a entender que a presença do periósteo não é obrigatória à formação de tecido ósseo. Posteriormente, o mesmo autor injetou “extratos” alcoólicos de tecido ósseo em tecido muscular e subcutâneo e observou a formação de tecido ósseo e cartilaginoso em um número pequeno de amostras.
Os efeitos das BMPs foram observados pela primeira vez de forma significativa em um trabalho clássico onde foram implantadas amostras de tecido ósseo desmineralizado em tecido muscular de rato, levando a formação de tecido ósseo e cartilaginoso de forma ectópica.18 As BMPs eram inicialmente obtidas em quantidades mínimas através de processos de purificação óssea e, posteriormente, com seu sequenciamento e clonagem,19 passou a ser produzida em larga escala.
Pertencentes à superfamília do TGF-β,20
estão profundamente envolvidas nas etapas iniciais de desenvolvimento do esqueleto durante a embriogênese e posteriormente, regulando a formação, manutenção e reparo do tecido ósseo na fase adulta. Além disso, as BMPs possuem participação fundamental na formação e funcionamento de outros sistemas, sendo sua deficiência um fator de alto risco no desenvolvimento de uma variedade de patologias como câncer, doenças auto-imunes, deformidades ósseas e doença cardiovascular. A nível tecidual, estimulam a quimiotaxia, proliferação21,22, diferenciação, osteogênese, angiogênese e remodelação.23
Devido à forma de apresentação das BMPs normalmente ser líquida, se faz necessário o uso de algum material carreador que possibilite a permanência das BMPs no local de aplicação, permitindo tempo suficiente para que ocorram os eventos celulares desejados, além de servirem de arcabouço para a formação do novo tecido. Dentre eles a hidroxiapatita se mostra como uma excelente opção pela sua biocompatibilidade e semelhança com a porção inorgânica do tecido ósseo, ambos descritos na literatura.
Constituinte principal da porção mineral dos tecidos calcificados dos animais, a hidroxiapatita, sintética ou natural, está entre as melhores opções de biomaterial para substituição óssea. A unidade estrutural de hidroxiapatita apresenta íons Ca2+, PO43- e OH-. Estes grupamentos terminais podem ser substituídos por outros íons
como o Cl-, F-, CO32-, VO43- e de acordo com a substiruição ocorrem alterações no
comportamento biológico da hidroxiapatita. Estudos com Hidroxiapatita carbonatada apresentam resultados biológicos mais interessantes em relação a seu uso como substituto ósseo quando comparados à forma estequiométrica de HA devido a sua maior solubilidade.24,25 Os íons carbonato podem estar localizados nos locais correspondentes aos íons OH-, formando Hidroxiapatita carbonatada do tipo A ou no local correspondente ao PO43-, formando Hidroxiapatita carbonatada do tipo B. 26
Outro fator importante no comportamento biológico da HA e que também influencia diretamente em sua solubilidade é a cristalinidade. O melhor resultado obtido na produção de cristais de HA utiliza temperaturas acima de 800ºc e resfriamento lento de no mínimo 6 horas. Este processo resulta em uma HA de baixo grau de degradação e com isso menor solubilidade nos tecidos. Por outro lado, existe a produção à baixas temperaturas, que além de resultar em um baixo grau de cristalinidade ainda favorece o aumento no teor de carbono da HA, gerando um material de alta solubilidade. 2728 29
O objetivo deste trabalho foi avaliar in vivo o resultado da implantação de hidroxiapatica carbonatada com e sem BMP em alvéolos pós exodontia in anima mobile..
2 – MATERIAIS E MÉTODOS
2.1.Biomateriais:
2.1.1 Hidroxiapatita carbonatada
Neste trabalho foram utilizadas esferas de carboapatita, com tamanhos variando entre 400µm e 500µm, e apresentando partículas menores que 20nm, foram sintetizadas a partir de soluções aquosas de nitrato de cálcio tetra hidratado, di-hidrogênio fosfato de amônio e carbonato de amónio extra puro (Merck). Os reagentes foram misturados e mantidos a 5°C, durante 2 horas e mantida a pH=13 com KOH e estequiometria entre 1,6 <Ca / P <2,0. Esferas de hidroxiapatita, com tamanhos variando entre 400µm e 500µm, foram sintetizadas sob 90°C e estequiometria de 1,67. A seguir, fotos da microestrutura das partículas de cHA e seu padrão de difração de RX.30
Figura 1. Microscopia eletrônica de varredura (SEM). A: Esferas de hidroxiapatita carbonatada (CHA)(aumento de 100x); B: Superfície das esferas de CHA (aumento de 1000x), ambos sem tratamento térmico.
Figura 2: Padrão de difração de RX da cHA
2.1.2 rhBMP-2
Foi utilizada rhBMP-2 na forma liofilizada em pó reconstituída no momento da cirurgia por hidratação com água destilada na proporção de 1,5 mg/ml.
2.2.Caracterização dos Animais:
Este projeto foi aprovado pelo Comitê de Ética em Utilização Animal (CEUA/NAL)(Anéxo 1). Nesta pesquisa serão utilizados ratos Wistar (n=24) machos ou fêmeas, com peso médio de 300 gramas, serão divididos aleatoriamente em caixas contendo 6 animais e distribuídos em 2 sub-grupos de acordo com os períodos experimentais de 1 e 6 semanas após os procedimentos cirúrgicos. Todos os animais serão mantidos em caixas com ração e água sem restrições no Núcleo de Animais de Laboratório (NAL) da Universidade Federal Fluminense (UFF).
2.3.Procedimentos cirúrgicos:
Os animais receberão anestesia geral sob injeção intramuscular de 75mg/kg de Ketamina (cloridrato de cetamina, Veltbrands, Brasil) e 1,5ml/kg de Rompun (xilazina, Veltbrands, Brasil). Após anestesia geral será realizada a sindesmotomia, luxação e extração de um dos incisivos centrais superiores com uma sonda milimetrada nº5, em seguida será realizado o preenchimento dos alvéolos dentários com biomaterial e seguindo-se a sutura com fio de nylon 5.0 (Ethicon®, Johnson & Johnson, Brasil) e anti-sepsia com gaze e solução alcoólica de clorexidina 2% para proteção da ferida cirúrgica e evitar contaminação secundária. O biomaterial foi manipulado apenas no momento da cirurgia e foi feita a hidratação da hidroxiapatita carbonatada com a solução de rhBMP-2 (na proporção de 1,5 mg/ml) em quantidade suficiente para permitir a aglutinação do material.
Figura 3. A) Alvéolo pós exodontia do incisivo central superior direito. B) Alvéolo preenchido com biomaterial (cHA + rhBMP-2).
2.4.Procedimentos e cuidados pós-operatórios:
Todos os procedimentos cirúrgicos serão realizados nas segundas-feiras para permitir a realização do protocolo de analgesia nos dois dias seguintes a cirurgia, de acordo com as orientações do Prof. Fabio O. Ascoli. Será ministrado anti-inflamatório (Meloxicam) 1mg/kg, via subcutânea a cada 24 horas ou Cetoprofeno, 5mg/kg via subcutânea a cada 24 horas, deve ser iniciado no dia da cirurgia e manter por mais 2 dias.
2.5.Obtenção das amostras:
Decorridos os períodos experimentais de 1 e 6 semanas, os animais de cada grupo experimental receberam dose letal de anestésico geral para coleta das amostras e tecidos circunjacentes.
2.6.Processamento das amostras:
As amostras provenientes foram fixadas, descalcificadas e processadas para m foram obtidos e corados com Hematoxilina e Eosina (HE) conforme Tabela 1.
Tabela 1. Sequência de processamento da amostra desmineralizada para inclusão em parafina
Soluções Tempo Banhos
Desidrataçao
Álcool 70% 1 hora 1 banho
Álcool 80% 1 hora 1 banho 1 hora 1 banho
Álcool 90% 1 hora 2 banhos
Álcool 100% 1 hora 3 banhos
Diafanização ou
Clarificação
Xilol 1 hora 3 banhos
Impregnação Parafina 56- 60°C Inclusão e Resfriamento Parafina Microtomia Cortes com 6 μm de espessura Colorações Hematoxilina e Eosina Tricrômico de Masson
Figura 4. Amostras prontas para inclusão em parafina
2.7.Análise dos resultados:
As lâminas foram observadas em um microscópio de luz de campo claro (Olympus Bx 43). As imagens selecionadas foram capturadas por uma câmera digital (Olympus SC 100) utilizando um sistema de captura (CellSens Standard). Foram feitas aleatoriamente entre 8 e 10 imagens por corte histológico correspondente a cada animal sem que houvesse sobreposição das mesmas. Cada imagem foi aberta no software Imagepro plus e marcada com 247 pontos com espaçamento igual entre si. A cada ponto foi atribuída uma definição entre cinco possíveis: osso nativo, tecido conjuntivo, osso neoformado, biomaterial e outros. Os dados foram tratados estatisticamente (ProStat, New York, USA).
A análise descritiva da resposta tecidual aos biomateriais foram avaliados em função da presença de células gigantes, de tecido fibroso, de neoformação vascular e óssea. No decorres do estudo não ocorreram complicações cirúrgicas ou infecção em nenhum animal.
2.8.Infra-estrutura disponível para a realização do Projeto:
A pesquisa será desenvolvida no Núcleo de Animais de Laboratório e no Laboratório de Bioengenharia, Materiais e Mineralização biológica do Instituto de Biologia, ambos da UFF, que possuem infra-estrutura mínima adequada para a execução deste projeto.
2.9. Local
Núcleo de Animais de Laboratório (NAL) e Laboratório de Bioengenharia, Materiais e Mineralização biológica do Instituto de Biologia, ambos da UFF.
3 - ARTIGOS PRODUZIDOS
Regenerative effects of nanostructured carbonated hydroxyapatite spheres and rhBMP-2 in alveolar extraction defects
Guilherme Diaz de Oliveira1 Mônica Diuana Calasans-Maia2
Adriana Therezinha Neves Novelino Alves3 Carolina Miler Mattos de Santana1.
Ronaldo Barcellos de Santana1 *
1. Department of Periodontology. School of Dentistry, Federal Fluminense University, Niterói, Rio de Janeiro, Brazil.
2. Department of Oral Surgery. School of Dentistry, Federal Fluminense University, Niterói, Rio de Janeiro, Brazil.
3. Department of Stomatology. School of Dentistry, Federal Fluminense University, Niterói, Rio de Janeiro, Brazil.
*Corresponding author
Key words: Biocompatibility Testing, Hydroxyapatite, Bone Repair, Osteogenesis, Rats.
ABSTRACT
Changes occurring in the post-extraction alveolar ridge are well-known and often present a problem for the rehabilitation of patient candidates for implant therapy. Biomaterials have been used as important aids in maintaining the alveolar architecture. hydroxyapatite is an excellent choice for its biocompatibility, similarity to the inorganic portion of the bone tissue and consistent results in the literature. Bone morphogenetic proteins (BMPs) are important biological substances used for bone reneration. The use of carriers is highly necessary since they increase the permanence of the BMPs at the site of application, allowing enough time for the desired cellular events to occur, and serve as a framework for the formation of the new tissue. The objective of this study was to evaluate the biological response of the alveolar bone tissue of rats in the presence of BMP and a carbonated hydroxyapatite carrier after extraction. Wistar rats (n = 24) were randomly divided in 2 subgroups according to the experimental periods of 1 and 6 Weeks. After extraction of the right upper central incisor the alveoli were filled by spheres of carbonate-apatite (n = 12), carbonate-apatite + BMP (n = 12). The animals were euthanized after 1 and 6 weeks and bone blocks containing the biomaterial were proccesd for histologic evaluation. Bone formation was limited 7 days after the extraction procedure and increased in both groups between 7 and 42 days from surgery, demonstrating a time dependent increase of bone volume throughtout the experimental period (p<0.05). However, this increase was significantly more robust for the CHA+rhBMP-2 group (p<0.001). It is concluded that spheres of nanostructured CHA are biocompatible, bioresorbable and osteoconductive when grafted in alveolar dental sockets. The addition of rhBMP-2 to CHA significantly increased new bone formation after 42 days suggesting that CHA
may be an adequate carrier for BMP-2 in such defects. INTRODUCTION
The loss of a dental element directly affects the life of any person, having negative effects on their phonetics, masticatory function and social life.1
Following this fact, a series of biological events begins in the healing alveolus and some modifications occur in its morphology, generating a narrowing of the ridge and migration from the top of the alveolar ridge to the lingual or palatine . 234 This reduction can lead to aesthetic problems And even prevent or make difficult the installation of implants.
So much attention is given to this fact that some authors have proposed classifications to describe the alveolar ridges after exodontia. The first one defined the edges of the remaining bone volume in groups A, B, C, D and E, with the highest volume group A and lowest volume group E. 5
Another author divided the healed edges into classes I, II and III, respectively, with horizontal volume loss, vertical volume loss, and finally horizontal and vertical volume loss. 6 This classification was subsequently proposed7, where the authors divided the borders into 3 groups, A, B and C, which represented, respectively, vertical loss, horizontal loss and combined loss, in addition to classifying the deformities of the ridges in relation To the adjacent border as light (less than 3mm), moderate (3 to 6mm) and severe (> 6mm).
The events involved in healing of a post-extraction cavity are well described in the literature and help us understand how morphological changes occur in this structure.
Immediately after the exodontia occurs the filling of the alveolus with blood and consequent formation of a clot. The latter, which plays a fundamental role in healing, may have postoperative problems, and may contain substances that influence mesenchymal cells and inflammatory cells. In about 48h, however, this clot begins to be replaced by granulation tissue, rich in macrophages, fibroblast-like cells, and later, neoformed vessels. It occurs deposition of extracellular matrix and formation of a temporary connective tissue. Around the newly formed vessels, the transition from the temporary connective tissue to the bone tissue is initiated
through the migration of osteoprogenitor cells, formation of osteoid matrix and consequently bone tissue. Because of the thinness and absence of bone trabeculation at the most coronary end of the alveolar bone crest, necrosis of this tissue portion may occur as a result of disruption of the blood supply provided by the vessels of the periodontal ligament and, in some cases, when the periosteum is detached, Loss of the periosteal blood supply. 8
Several authors have shown that this bone loss progresses throughout life, but its most significant stage occurs in the first six months. 2
In this context, a series of techniques have been developed to preserve the alveolar architecture as well as a range of graft materials aiming an improvement in the bone gain of the site. 91011 12
Bone grafts can be classified according to their origin in autogenous, where the donor and the recipient are the same individual, in homogens, where the donor and the recipient are different individuals, but of the same species, in heterogens where donor and recipient are of Different species and in alloplastics, when their origin is synthetic. 13
In addition, they can be classified as to how they act in osteoinductors, when the new bone is formed from undifferentiated progenitor cells stimulated by one or more inducing agents in osteoconductors, when the graft material acts as a framework for cell proliferation And deposition of bone matrix, and in osteogens when they are composed, among other things, via cells that are viable to osteogenesis. 14
Among the various types of bone grafts, those of autogenous origin are still considered the gold standard due to the quality of the results obtained, as well as the non-existence of inflammatory reactions of the foreign body type. This type of graft Osteogenic, osteoconductive and osteoinductive properties, which justifies its good performance. 10,12
However, this type of approach presents some disadvantages that limit and sometimes make it impossible to use. Among them it is possible to highlight the morbidity caused by another surgical area necessary for the collection of the material. Another limiting factor is the rate of unpredictable resorption to which the
graft is subjected. In addition, there is still the quantity limitation established by the available donor area.
These factors cause other alternative materials to be tested in order to increase the possibilities of the patient and the professional, as well as to overcome the limitations presented by the autogenous grafts.
Among these materials, a group of them stands out strongly for their osteoinductive properties, the Bone morphogenetic proteins known as BMPs or rhBMPs (Recombinant Human Bone Morphogenetic Proteins)
The first investigations in this sense can be observed in a study of the beginning of the century where the auto-inductive capacity of the bone tissue was described. 17 First, the author treated bone specimens by removing their periosteum and the superficial layer and inoculated them in muscular and subcutaneous tissue . Bone formation was observed on the grafts and with this it was begun to understand that the presence of the periosteum is not obligatory to the formation of bone tissue. Subsequently, the same author injected alcoholic "extracts" of bone tissue into muscle and subcutaneous tissue and observed the formation of bone and cartilage tissue in a small number of samples.
The effects of BMPs were first observed for a significant time in a classic work where samples of demineralized bone tissue were implanted into rat muscle tissue, leading to the formation of ectopic and cartilaginous tissue. 18 BMPs were initially obtained in amounts Minimal through bone purification processes and, later, with its sequencing and cloning, 19 was now produced on a large scale.
Belonging to the TGF-β superfamily, 20
are deeply involved in the initial stages of skeletal development during embryogenesis and thereafter regulating the formation, maintenance, and repair of bone tissue in adulthood. In addition, BMPs play a key role in the formation and functioning of other systems, and their deficiency is a high risk factor in the development of a variety of pathologies such as cancer, autoimmune diseases, bone deformities and cardiovascular disease. At the tissue level, they stimulate chemotaxis, proliferation21,22, differentiation, osteogenesis, angiogenesis and remodeling. 23
Due to the way in which the BMPs are normally liquid, it is necessary to use some carrier material that allows BMPs to remain in the application site, allowing
enough time for the desired cellular events to occur, as well as providing a framework for the formation Of the new tissue. Among them, hydroxyapatite is an excellent choice for its biocompatibility, similarity to the inorganic portion of the bone tissue and consistent results in the literature.
Principal constituent of the mineral portion of calcified tissues of animals, synthetic or natural hydroxyapatite is among the best biomaterial options for bone replacement. The structural unit of hydroxyapatite presents ions Ca2 +, PO43- and OH-. These terminal groups can be replaced by other ions such as Cl-, F-, CO32-, VO43- and alterations in the biological behavior of hydroxyapatite occur. Studies with carbonated hydroxyapatite present more interesting biological results in relation to their use as a bone substitute when compared to the stoichiometric form of HA due to their greater solubility. 24,25 Carbonate ions may be located at the sites corresponding to the OH- ions, forming carbonapatite of the Type A or at the site corresponding to PO43-, forming type B carbonapatite. 26
Another important factor in the biological behavior of HA and that also directly influences its solubility is crystallinity. The best result obtained in the production of HA crystals uses temperatures above 800 ° C and slow cooling of at least 6 hours. This process results in a low degradation HA and thus less tissue solubility. On the other hand, there is production at low temperatures, which in addition to resulting in a low degree of crystallinity still favors the increase in the carbon content of the HA, generating a material of high solubility. 27 2829
The objective of this study was to evaluate in vivo the result of implantation of carbonated hydroxyapatite with and without BMP in alveoli after rat exodontia.
MATERIALS AND METHODS
Hydroxyapatite preparation
HA was prepared by drop-wise addition of aqueous (NH4)2HPO4 solution to a Ca(NO3)2 solution (Merck KGaA, Darmstadt, Germany) at 90 °C and pH 11. X-ray fluorescence (X-Ray Fluorescence Spectrometer PW 2400, Philips Analytical X-Ray, Almelo, Netherlands), was used to determine the HA Ca/P molar ratio. The structure and crystallinity of the HA were analyzed by Fourier transform infrared spectroscopy
(IR Prestige Series 21, Shimadzu Corp., Tokyo, Japan) in transmission mode from 400 to 4000 cm-1 and by X-ray diffraction with CuKa radiation at 40 kV and 40 mA (X’Pert Pro X-Ray diffractometer, PANanalytical, Almelo, Netherlands).
Hydroxyapatite microspheres preparation
HA powder was gently dispersed in a 10 mg/mL aqueous solution of sodium alginate (Fluka Biochemika, Buchs, Switzerland) to achieve a 1:15 alginate-HA ratio. The alginate/HA mixture was extruded drop-wise at room tem- perature into a 0.15 M CaCl2 solution using a needle with a 0.70 mm diameter (BD Precision Glide, Sao Paulo, SP, Brazil). Spherical particles instantaneously formed and were allowed to mature in the CaCl2 solution for 24 h for complete gelation. The HA-alginate microspheres were dried overnight in an oven at 30 °C and sintered at 1100 °C for 2 h. After sintering, the microsphere diameters were reduced to a range of 425–600 lm. The microspheres were also characterized by X-ray diffraction (X’Pert Pro X-Ray diffractometer) and Fourier transform infrared spec- troscopy (IR Prestige Series 21), respectively. The XRD pattern of the HA microspheres after the thermal treatment at 1100 °C confirmed the presence of a unique crystalline HA phase as shown in Fig. 1. The specific surface area of the microspheres was determined by the BET method using an ASAP 2020 instrument (Micromeritics Instrument Corp., Norcross, USA). The specific surface area of the microspheres was 0.85 m2/g ± 0.17 according to BET analysis.
Animals and surgical procedures
All procedures were carried out in accordance with conventional guidelines in the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (US National Institutes of Health 85-23, revised 1996) and were approved by the local Institutional Animal Care and Use Committee of Federal Fluminense University, Niteroi, Brazil (protocol number 50/2008). Three-month-old male Wistar rats weighing approximately 250 g were maintained under standard conditions with free access to food and water. A total of 24 animals were divided into 2 groups and examined after different experimental periods [33].
SP, Brazil) and xylazine (1 mg/Kg) (FortDodge, São Cristovão, RJ, Brazil). The surgical area was scrubbed with sterile gauze soaked with 4 % alcoholic chlorhexidine, rinsed with sterile water and then draped. Subsequently, syndesmotomy of periodontal tissue was performed using a syndesmotome (Duflex®, Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, Brazil), and the upper-right incisor was extracted with a clinical probe adapted to this tooth (Figure 3A). The dental alveolar sockets were grafted with either nanostructured carbonated hydroxyapatite (CHA group, n=12) or with CHA incorporated with recombinant human bone morphogenetic protein 1 (CHA + rhBMP-2, n=12), and sutured with a 5–0 nylon interrupted suture. (Johnson & Johnson Medical Ltd., Blue Ash, Ohio, United States)
At 7 and 42 days after implantation, the animals were anesthetized and euthanized with an overdose of the anesthetic solution and samples containing the biomaterials were removed and fixed in 4 % buffered formalin at pH 7.0. The specimens were decalcified in fast bone demineralization solution (Allkimia Ltda, Campinas, Brazil) for 48 h, washed for 1 h, dehydrated in ethanol (Vetec Química Fina Ltda., Duque de Caxias, Brazil), clarified in xylol (Vetec Ltda.), and embedded in paraffin (Vetec Ltda.).
Histological analysis
Decalcified paraffin sections (5µm thick) were stained with hematoxylin-eosin (HE) and examined by an experienced pathologist in the field of biomaterials biocompatibility without knowing the tested animal groups (blind analysis). A descriptive analysis comparing the intra and inter-group biological responses was based on the type and intensity of the inflammatory alterations and repair processes (fibrosis, new blood vessels and osteogenesis). Photomicrographs were obtained with a digital camera (Cybershot DsC-W300, Sony, Manaus, Brazil) connected to an optical microscope (FWl-1000, Feldman Wild Leitz, Manaus, Brazil).
Histomorphometric analysis
For histomorphometric analysis, a light microscope (Olympus BX43, Tokyo, Kanto, Japan) with 200x of magnfication was used. The microscope was connected to a computer and each HE-stained histological slice corresponding to the alveolar
region was captured by scanning by Image acquisition software (Cellsens® 1.9 Digital, Tokyo, Kanto, Japan). One expert observer analysed ten non-consecutive images of each section. With the Image-Pro Plus® 6.0 (Media Cybernetics, Silver Spring, Maryland, USA), a grid of 200 points were superimposed on captured field, permitting the determination of newly formed bone and the residual biomaterial. The bone volume density (BV/ TV%) was calculated by bone volume over total volume, indicating the fraction of volume of interest that was occupied by bone. For biomaterial volume density (BiomatV/TV%), the same calculation method was applied. The areas were expressed in percentage.
RESULTS
Histological analyses
Morphological analysis was performed at light microscope after hematoxylin-eosin staining. The Figures 1-12 contain representative photomicrographs of alveolar socket from each implanted biomaterials at magnification of 200X and 400x.
After seven days, both groups exhibited a mild inflammatory response, which mainly consisted of mononuclear cells, blood vessels of different calibers, and loose connective tissue around the particles, with collagen fibers randomly dispersed in the area. Hemorrhagic exudate, inflammatory cells and a few multinucleated inflammatory giant cells were also observed. The CHA group showed few trabeculae of newly formed bone with osteoblasts pavement on periphery, interspersed by connective tissue containing serum hemorrhagic exudate. New bone formation occurred only in contact with the residual bone walls. Both biomaterial groups presented the dental socket filled by connective tissue characterized by granulation reaction permeating a small fraction of biomaterial spheres.
CHA 7 days
Figure 1. 400X magnification. Presence of connective tissue (CT) permeating neoformed bone islands (NB) adjacent to preexisting bone tissue (PB).
cHA
C
T
NB
PB
C
T
Figure 2. 400X magnification. Presence of biomaterial (cHA), surrounded by connective tissue (CT). Inflammatory activity adjacent to the material (black arrows).
Figure 3. 400X magnification. Presence of richly cellularized connective tissue (CT) and biomaterial (cHA).
CHA + rhBMP-2 7 days
cHA
C
T
cHA
PB
C
T
Figure 4. 200X magnification. Presence of preexisting bone tissue (PB), connective tissue (CT) rich in inflammatory cells around biomaterial particles (cHA + rhBMP-2).
Figure 5. 200X magnification. Presence of preexisting bone tissue (PB), connective tissue (CT) rich in inflammatory cells around biomaterial particles (cHA + rhBMP-2).
Figure 6. 200x magnification. Presence of a large area of connective tissue with inflammatory infiltrate (II). It is possible to observe a small area of preexisting bone
PB
cHA
C
T
tissue (black arrow) and early formation of immature bone tissue.
After 42 days, the alveolar socket of both groups was almost filled by newly formed bone interspersed by connective tissue and remnant hemorrhagic exudate. Inflammatory cells and multinucleated giant cells were rare and localized to the periphery of the CHA and CHA/rhBMP-2 particles, and new bone was present around the particles. The CHA group, however, exhibited most of the particles surrounded by connective tissue with reduced bone-to-particle contact, suggesting a less robust bone repair process in comparisson with the CHA/rhBMP-2 group. At high magnification, there was observed the trabeculae periphery surrounded by a large osteoblasts pavement. Both groups of biomaterials presented a reduction of biomaterial amount compared with seven-day period. The HA group showed regions of newly formed bone surrounding the spheres. A reduction of the amount of discernible CHA spheres could be observed between 7 and 42 days. A considerable amount of newly formed bone was observed surrounding the spheres and the biomaterials particles. Moreover, the final amount of CHA, observed after 42 days, was smaller compared to the amount of HA at the same experimental time, and in CHA group the newly formed bone seems to be in higher amount than in HA group.
CHA 42 days
CT
Figure 7. 400X magnification. Presence of biomaterial (cHA), neoformed bone tissue (NB) and black arrow indicating osteoblastic paving.
Figure 8: 400X magnification. Presence of biomaterial (cHA), neoformed bone tissue (NB) and black arrow indicating osteoblastic paving.
NB
NB
CT
Figure 9: 400X magnification. Presence of biomaterial (cHA), neoformed bone tissue (NB) and black arrow indicating osteoblastic paving.
cHA + rhBMP-2 42 dias
Figure 10. 200x magnification. Presence of neoformed bone tissue (NB), connective tissue (CT) and island of bone formation (red arrow).
CT
NB
PB
NB
Figure 11. 200x magnification. Presence of neo-formed bone (NB) tissue and pre-existing bone tissue (PB) with a clear definition line between both (black arrows).
Figure 12. 200x magnification. Area with large volume of neoformed bone tissue (NB) adjacent to the nasal mucosa (NM). Presence of islands of bone formation associated with blood vascularization.
Histomorphometric analysis
BV/TV% (p<0.05)
Bone formation was limited 7 days after the extraction procedure and diferences between CHA and CHA+rhBMP-2 were not significant (P=0.17). Histomorphometric analysis showed an increase of BV/TV% in both groups between 7 and 42 days from surgery (table 1), demonstrating a time dependent increase of BV/TV% throughtout the experimental period. (p<0.05). However, this increase was significantly more robust for the CHA+rhBMP-2 group, which exhibited significantly (p<0.001) more new bone after 42 days in comparison with 7 days after extraction. After 42 days CHA+rhBMP-2 group exhibited significantly more new bone than CHA group (P<0.001). The increased new bone formation in CHA group after 42 days, in comparison with 7 days after extraction, did not reach statistical significance (P=
NB
0.07).
Figure 13. BV/TV%. Bone volume density in groups of CHA and CHA + rhBMP2 after 7 and 42 dys of implantation.
BiomatV/TV%
As expected, both groups exhibited residual particles of grafted material 7 days after surgery and no significant differences were found between them at this time point (P=0.31). A time-dependent biosorption was observed for both groups as documented by a significant decrease in BiomatV/TV% of CHA at 42 days after surgery compared with 7days (P=0.02). Similar results were found for CHA+rhBMP-2 group (P=0.01). No difference was found between the groups for residual BiomatV/TV% after 42 days of healing (P>0.99).
CHA
CHA+rhBMP2
7 D.P.C 42 D.P.C
٭٭
New bone
Figure 14. BiomatV/TV%. Biomaterial volume density in groups of CHA and CHA + rhBMP2 after 7 and 42 dys of implantation.
Table 2 – Histomorphometric evaluation of extraction sites following implantation of carbonates HÁ.
CHA CHA CHA/rhBMP-2 CHA/rhBMP-2
7 days 42 days 7 days 42 days
Native Bone 6.22 ± 4.62 0.0 ± 0.0 4.62 ± 1.49 3.02 ± 4.66 Connective Tissue 62.28 ± 26.87 80.92 ± 38.85 50.89 ± 41.28 24.98 ± 10.24 New Bone 4.83 ± 9.47 17.74 ±1.57 0.61 ± 1.23 63.99 ± 9.00 Residual Particles 21.07 ± 28.35 0.0 ± 0.0 36.10 ± 37.49 0.0 ± 0.0 Other 5.58 ± 12.21 0.28 ± 0.01 7.75 ± 7.09 7.26 ± 6.13
CHA
CHA+rhBMP2
7 D.P.C 42 D.P.CDISCUSSION
The present study demonstrated that carbonated nanostructured hydroxyapatite/sodium alginate spheres may be a promising biomaterial for bone replacement since it exhibited biocompatibility, biosesorbability and osteoconduction. Moreover, data showed that combined to rhBMP-2, a well-known osteoinductive agent, osteogenesis was significantly enhanced.
The present data is in accordance with other studies 31 30 that have previously demonstrated the biocompatibility of this biomaterial. Of particular interest is the finding of complete absence of biomaterial particles 42 days after implantation in both treatment groups (table 2), suggesting that CHA alone or in association with rhBMP-2 may be employed as a biomimmetic composite graft material in bone regenerative therapies. Theses data suggests that the material is completely absorbed and substituted predominantly by new bone during the healing stages of alveolar extraction socket defects in rats. The greater absorption of nanostructured CHA spheres observed during this study corroborates previous studies, showing that CHA exhibits higher solubility and absorption32,33 and greater absorption in vivo 34 possibly due to its lower crystallinity, particle size, surface area, and morphology.32,33
Also interesting was the finding of abscence of residual graft material after 42 days of healing on the CHA + rhBMP-2 group (table 1), which exhibited significantly enhanced bone regeneration in comparison with CHA alone (table 1). This suggests that CHA may potentially serve as a new carrier system for bone morphogenetic protein 2 in alveolar bone regenerative treatments. As previously anticipated,
nanostructured CHA with low crystallinity may present improved characteristics that are desirable in tissue engineering and dental implantology.34 The healing pattern documented in this study with significant bone formation (64 ± 9% new bone) and minimal quantities (0 ± 0%) of residual particles, may present an ideal tissue response in extraction socket defect.
Thus, it is concluded that spheres of nanostructured CHA are biocompatible, bioresorbable and osteoconductive when grafted in alveolar dental sockets. The addition of rhBMP-2 to CHA significantly increased new bone formation after 42 days suggesting that CHA may be an adequate carrier for BMP-2 in such defects.
ANEXO 1
– Certificado de aprovação do comitê de ética no uso de
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