INSTITUTO DE PESQUISAS MÉDICAS
MARIA MADALENA MACEDO PIRES FERREIRA
ESTUDO COMPARATIVO DA AÇÃO DE DOIS AGENTES HEMOSTÁTICOS EM HEPATECTOMIA: PESQUISA EXPERIMENTAL EM RATOS
CURITIBA 2013
MARIA MADALENA MACEDO PIRES FERREIRA
ESTUDO COMPARATIVO DA AÇÃO DE DOIS AGENTES HEMOSTÁTICOS EM HEPATECTOMIA: PESQUISA EXPERIMENTAL EM RATOS
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Princípios da Cirurgia da Faculdade Evangélica do Paraná (FEPAR) / Hospital Universitário Evangélico de Curitiba (HUEC) Instituto de Pesquisas Médicas (IPEM), como requisito parcial para obtenção do título de Mestre em Princípios da Cirurgia.
Orientador: Prof. Dr. Osvaldo Malafaia
Co-orientador: Prof.Dr.Orlando Jorge Martins Torres
CURITIBA 2013
Ferreira, Maria Madalena Macedo Pires
Estudo comparativo da ação de dois agentes hemostáticos em hepatectomia: pesquisa experimental em ratos / Maria Madalena Macedo Pires. – Curitiba, 2013.
69 f.: il. (algumas color); 29 cm Orientador: Osvaldo Malafaia
Dissertação (Mestrado em Princípios da Cirurgia) – Instituto de Pesquisas Médicas. Faculdade Evangélica do Paraná.
1. Gelfoam®. TachoSil®. Hepatectomia. Hemostasia. I. Título
TERMO DE APROVAÇÃO
MARIA MADALENA MACEDO PIRES FERREIRA
ESTUDO COMPARATIVO DA AÇÃO DE DOIS AGENTES HEMOSTÁTICOS EM HEPATECTOMIA: PESQUISA EXPERIMENTAL EM RATOS
Dissertação aprovada como requisito parcial para obtenção de grau de mestre no Curso de Pós-Graduação em Princípios da Cirurgia pela Faculdade Evangélica do Paraná, pela seguinte banca examinadora.
Orientador: Prof. Dr. Osvaldo Malafaia Departamento de
Prof. ____________________________________________ Prof. ____________________________________________ Prof. ____________________________________________
A Deus, senhor da minha existência, a quem devo tudo que sou,
tudo que tenho e que mantém em mim acesa a chama da esperança de realização dos meus sonhos.
AGRADECIMENTOS
À minha família, em especial a minha mãe, minhas filhas Gabi e Rafaela e tia Nilde que me incentivaram e não me permitiram desanimar.
Ao meu pai Antonio Pires (in memmoriam) que de onde estiver, continua torcendo pelo meu sucesso.
Aos amigos, que carinhosamente me dispensaram atenção nas horas difíceis, especialmente minha querida amiga Rita de Cassia.
Ao Hospital São Domingos, onde me sinto honrada por trabalhar há 21 anos recebendo apoio, confiança e por fim a contribuição para alcançar esse objetivo.
Ao Prof. Dr. Osvaldo Malafaia que com muita paciência e tolerância acompanhou e orientou cada passo deste trabalho.
Ao ilustre cirurgião Dr. Orlando Jorge Martins Torres que generosamente dedicou seu precioso tempo na operação dos animais, garantindo a realização desse trabalho.
À Dr.ª Rosane Macau que disponibilizou seu precioso tempo na análise histológica das peças.
Aos colegas do mestrado, especialmente Joenville, Cardinely, Tâmara Rubia, Rosilda Mendes, Wildlane Montenegro e Cibelle Magalhães companheiras de todas as horas.
Às secretárias do Centro de Estudos, Sidiany Guterres e Adriana Mendonça sempre disponíveis e pacientes.
Aos acadêmicos membros da LACEMA Marcos Vinícius Silva Costa, Francisco Guilherme de Castro Marques e Jéssica Caroline Freire Carvalho que contribuíram de forma incansável ao longo dos meses de pesquisa.
Deus nos fez perfeitos e não escolhe os capacitados, capacita os escolhidos. Fazer ou não fazer algo só depende da nossa vontade e esperança. Einstein
RESUMO
Introdução: O êxito das ressecções hepáticas está diretamente relacionado ao controle do sangramento, à prevenção de complicações intraperitoneais associadas ao sangramento e à redução dos índices de morbimortalidade. Objetivo: Comparar a hemostasia em ratos submetidos à hepatectomia utilizando dois agentes hemostáticos, Gelfoam® eTachoSil®, avaliando através de estudo macroscópico, bioquímico e histológico do fígado pós hepatectomia. Método: Foram submetidos ao estudo 24 ratos (Rattus norvegicus – Wistar) distribuídos aleatoriamente em dois grupos com 12 animais, denominados grupo Gelfoam® e grupo TachoSil®. Cada grupo de 12 animais foi subdividido em dois grupos de seis, segundo o período de avaliação (três e quatorze dias). Os animais foram anestesiados e submetidos à laparotomia para hepatectomia do lobo mediano , utilizando o hemostático preconizado para cada grupo. Em ambos os grupos o hemostático foi colocado na área cruenta do fígado, pressionando-o por dois minutos. A seguir procedeu-se à sintese da parede abdominal. No 3º e 14º dia pós operatorio, seis animais de cada grupo foram submetidos a reoperação. Avaliou-se a cavidade à procura de hematomas, coleções, abscessos, aderências e fístula. Coletou-se o sangue através de punção da veia cava caudal para dosagem de leucócitos, hemoglobina e hematócrito, Aspartato aminotransferase (AST), Alanina aminotransferase (ALT) e Fosfatase alcalina (ALP). Realizou-se hepatectomia total e os segmentos do fígado retirados foram fixados em formol a 10% e encaminhados para análise histológica. Resultado: A hemostasia foi alcançada igualmente nos dois grupos. 100% dos ratos do grupo Gelfoam® apresentaram aderências e no grupo TachoSi®l somente 41,6%; apenas um animal do grupo Gelfoam® apresentou abscesso intra-abdominal. O edema no grupo TachoSil® foi maior no segundo período de observação com diferença estatística significante (p<0,05). AST e ALT foram mais elevadas enquanto hematócrito e hemoglobina mostraram-se inferiores no grupo TachoSil®, com diferença estatística significante (p<0,05) comparado ao grupo Gelfoam®. Conclusão: A hemostasia não diferiu entre os grupos. No grupo Gelfoan® houve maior reação inflamatória e infecciosa; no grupo Tachosil® a lesão hepatocelular foi mais intensa.
ABSTRACT
Introduction: The success of liver resections is directly related to the control of bleeding, prevention of complications associated with intraperitoneal bleeding and reducing the morbidity and mortality rates. Objective: The objective of this study was to compare the hemostasis in two groups of rats which underwent hepatectomy using two hemostatic agents, TachoSil ® and Gelfoan ®, evaluating mortality between the groups, blood biochemistry, the macro and microscopic liver aspects after hepatectomy. Method: 24 rats (Rattusnorvegicus - Wistar) were submitted to this study and were randomly divided into two groups of 12 animals each called Gelfoam® and TachoSil® group. Each group of 12 was divided into two groups of six. The animals were anesthetized and underwent laparotomy for hepatectomy of the right lobe using the hemostatic determined for each group. In both groups, TachoSil ® and Gelfoam®, the hemostatic was placed on the liver open area pressing it for two minutes. Then we proceeded to the synthesis of the abdominal wall. On the third and on the fourteenth day of post operatory 6 animals, in each group, underwent reoperation to review the cavity seeking evidence of bruising, collections, abscesses, fistulas and adhesions. Blood was collected by puncture of the caudal vein cava for measurement of leukocytes, hemoglobin and hematocrit, AST, ALT and ALP. Liver segments that were removed were fixed in 10% formalin and sent for histological analysis. Result: Hemostasis was achieved equally in both groups. One hundred of the rats in Gelfoam® group had adhesion and in TachoSil® group only 41.6%; only one animal from Gelfoam® group had intra-abdominal abscess. Edema in TachoSil ® group was higher in the second observation period with statistically significant difference (p<0,05). In the same group AST and ALT were higher while hematocrit and hemoglobin levels were lower with statistic significant difference (p<0.05) when compared to the Gelfoam ® group. Conclusion: Hemostasis was not different between the groups; Geolfoan ® group had greater inflammatory and infectious reaction; In Tachosil® group hepatocellular injury was more severe.
LISTA DE FIGURAS
FIGURA1 - DISTRIBUIÇÃO DA AMOSTRA NOS GRUPOS ESTUDADOS ... 29
FIGURA 2 - GELFOAM® ... 30
FIGURA 3 - TACHOSIL® ... 30
FIGURA 4 - POSICIONAMENTO PARA CIRURGIA ... 31
FIGURA 5 - DELIMITAÇÃO DA INCISÃO PARA ACESSO À CAVIDADE ABDOMINAL ... 31
FIGURA 6 - INCISÃO PARA LAPAROTOMIA ... 31
FIGURA 7 - RESSECÇÃO DO LOBO MEDIANO DO FÍGADO ... 32
FIGURA 8 - PORÇÃO DE GELFOAM® NAS DIMENSÕES DE 2 X 2 CM ... 33
FIGURA 9 - APLICAÇÃO DO HEMOSTÁTICO NA ÁREA CRUENTA DO FÍGADO ... 33
FIGURA 10 - AVALIAÇÃO MACROSCÓPICA DA CAVIDADE: PRESENÇA DE ADERÊNCIAS ... 35
FIGURA 11 - PESAGEM DO FÍGADO NA REOPERAÇÃO ... 35
FIGURA 12 - FIXAÇÃO DO FÍGADO EM FORMALDEÍDO A 10% ... 35
FIGURA 13 - ACESSO VENOSO PARA COLETA SANGUÍNEA ... 36
FIGURA 14 - FOTOMICROGRAFIA MOSTRANDO EDEMA E POLIMORFONUCLEARES NO PARÊNQUIMA HEPÁTICO DE ANIMAL DO GRUPO GELFOAM D3. HE, 100X ... 41
FIGURA 15 - FOTOMICROGRAFIA MOSTRANDO REAÇÃO GIGANTOCELULAR DO TIPO CORPO ESTRANHO NO PARÊNQUIMA HEPÁTICO DE ANIMAL DO GRUPO GELFOAN® D3. HE, 100x ... 42
LISTA DE TABELAS
TABELA 1 - PESO MÉDIO DOS ANIMAIS NO PRÉ-OPERATÓRIO ... 38 TABELA 2 - ACHADOS NA REOPERAÇÃO DOS RATOS DO GRUPO
GELFOAM® NOS PERÍODOS D3 E D 14 QUANTO AS ADERÊNCIAS ... 39 TABELA 3 - ACHADOS MACROSCÓPICOS NA REOPERAÇÃO DOS
RATOS DO GRUPO GELFOAM® NOS PERÍODOS D3 E D14 ... 39 TABELA 4 - ACHADOS NA REOPERAÇÃO DOS RATOS DO GRUPO
TACHOSIL® NO PERÍODO D3 E D14 QUANTO AS
ADERÊNCIAS ... 40 TABELA 5 - DESCRIÇÃO DAS VARIÁVEIS HISTOLÓGICAS NOS
SUBGRUPOS GELFOAM® E TACHOSIL® NO PERÍODO D3 ... 41 TABELA 6 - TESTE DE MANN WHITNEY DAS VARIÁVEIS
HISTOLÓGICAS EM RELAÇÃO AOS GRUPOS NO PERÍODO D3 ... 42 TABELA 7 - DESCRIÇÃO DAS VARIÁVEIS HISTOLÓGICAS NOS
GRUPOS GELFOAM® E TACHOSIL® NO PERÍODO D14 ... 43 TABELA 8 - TESTE DE MANN WHITNEY DAS VARIÁVEIS
HISTOLÓGICAS EM RELAÇÃO AOS GRUPOS NO PERÍODO D14 ... 43 TABELA 9 - PARÂMETROS HEMATOLÓGICOS DOS ANIMAIS DOS
SUBGRUPOS GELFOAM® NOS PERÍDO D3 E D14 ... 44 TABELA 10 - PARÂMETROS HEMATOLÓGICOS DOS ANIMAIS DOS
SUBGRUPOS TACHOSIL® NOS PERÍODOS D3 E D14 ... 44 TABELA 11 - PARÂMETROS HEMATOLÓGICOS DOS ANIMAIS DO
SUBGRUPO GELFOAM® E TACHOSIL® NO PERÍODO D3 ... 45 TABELA 12 - PARÂMETROS HEMATOLÓGICOS DOS SUBGRUPOS
GELFOAM® E TACHOSIL® NO PERÍODO D14 ... 46 TABELA 13 - MÉDIA GERAL DOS PARÂMETROS HEMATOLÓGICOS DOS
ANIMAIS NOS GRUPOS GELFOAM® E TACHOSIL® ... 46 TABELA 14 - PARÂMETROS BIOQUÍMICOS DOS ANIMAIS DO
SUBGRUPO GELFOAM® NOS PERÍODOS D3 E D14 ... 47 TABELA 15 - PARÂMETROS BIOQUÍMICOS DOS ANIMAIS DO
TABELA 16 - MÉDIA GERAL DOS PARÂMETROS BIOQUÍMICOS DOS GRUPOS GELFOAM® E TACHOSIL® ... 48
LISTA DE SIGLAS
ABNT - Associação Brasileira de Normas Técnicas ALP - Fosfatase Alcalina
ALT - Alanina aminotransferase AST - Aspartato aminotransferase BIREME - Biblioteca Virtual em Saúde
CEEA - Comitê de Ética e Experimentação Animal DNA - Ácido Desoxirribonucleico
EDTA - Ácido Etilenodiaminotetracético HE - Hematoxilina e Eosina
LAbCEMA - Laboratório de Cirurgia Experimental do Maranhão LILACS - Caribe em Ciências da Saúde
MANOVA - Análise de Variância Multivariada PVPI - Povinilpirrolidona-iodo
SBCAL - Sociedade Brasileira de Ciência em Animais de Laboratório UDT-MED - Serviço de Patologia
SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO ... 15 1.1 OBJETIVO ... 18 2 REVISÃO DE LITERATURA ... 19 2.1 HISTÓRICO ... 19 2.2 HEPATECTOMIA ... 20 2.3 HEMOSTASIA ... 22 3 METODOLOGIA ... 28 3.1 PRINCÍPIOS ÉTICOS ... 28
3.2 CUIDADOS COM OS ANIMAIS ... 28
3.3 DISTRIBUIÇÃO DA AMOSTRA ... 29
3.4 HEMOSTÁTICOS UTILIZADOS ... 30
3.5 ANESTESIA ... 30
3.6 ATO OPERATÓRIO ... 31
3.7 PÓS-OPERATÓRIO ... 34
3.8 REOPERAÇÃO E EUTANÁSIA DOS ANIMAIS ... 34
3.9 COLETA SANGUÍNEA ... 36
3.10 ANÁLISE HISTOLÓGICA ... 36
3.11 ANÁLISE ESTATÍSTICA ... 37
4 RESULTADOS ... 38
4.1 CARACTERIZAÇÃO DOS ANIMAIS QUANTO AO PESO ... 38
4.2 AVALIAÇÃO MACROSCÓPICA ... 38 4.2.1 Grupo Gelfoam® ... 38 4.2.2 Grupo Tachosil® ... 39 4.3 ANÁLISE HISTOLÓGICA ... 40 4.4 PARÂMETROS HEMATOLÓGICOS ... 44 4.5 PARÂMETROS BIOQUÍMICOS ... 47 5 DISCUSSÃO ... 49 5.1 MATERIAL ... 50
5.2 ATO ANESTÉSICO E OPERATÓRIO ... 51
5.3 ANÁLISE MACROSCÓPICA ... 52
5.5 ANÁLISE HEMATOLÓGICA E BIOQUÍMICA ... 54
6 CONCLUSÃO ... 57
REFERÊNCIAS ... 58
APÊNDICES ... 64
1 INTRODUÇÃO
O fígado possui estrutura de elevada complexidade com inúmeras funções vitais do organismo que o tornam um dos órgãos mais importantes. Destacam-se entre as funções hepáticas: a regulação do metabolismo de diversos nutrientes, o papel imunológico, a síntese proteica, o armazenamento de vitaminas e ferro, a degradação hormonal e a inativação e excreção de drogas e toxinas (SCHINONI, 2006). Ele é o maior órgão do corpo humano representando 2,5 a 4,5 % da massa corporal total com um peso médio de 1,5 kg (LIAU; BLUMGART; DEMATEO, 2004). Apresenta dois grandes atributos: uma extraordinária capacidade de regeneração tecidual mesmo após grande perda de substância e a habilidade, em alguns casos, de absorver grandes traumas (TORRES et al., 2004; SKANDALAKIS et al., 2004).
A regeneração hepática frente a qualquer tipo de lesão seja ela química, viral, traumática acidental ou cirúrgica, é regulada com precisão por esse órgão atingindo seu peso original, variando de 5 a 10% quer seja em humanos ou em animais (JESUS; WAITZBERG; CAMPOS, 2000).
A intervenção cirúrgica é o método para tratamento das lesões de órgãos intra-abdominais eleito desde os primórdios da cirurgia hepática. Os relatos das primeiras intervenções cirúrgicas relacionadas ao fígado consistem de avulsões parciais ou totais de porções deste, após lesões traumáticas do abdômen. Somente em meados do século XX, em 1952 é que ocorreu por Lotart-Jacob e Robert a primeira ressecção hepática anatômica, seguida de elucidação da complexa anatomia do fígado, dando início à era moderna da cirurgia hepática. Nas últimas décadas, a segurança nos procedimentos cirúrgicos aumentou consideravelmente, graças a novas técnicas, modernos equipamentos e materiais, reduzindo a morbidade e mortalidade dos pacientes submetidos à hepatectomia (COUINAUD, 1954; HOLT et al., 2000).
As ressecções hepáticas clássicas e as ressecções segmentares têm sido o procedimento terapêutico de escolha para o tratamento de doenças benignas e malignas do fígado, caracterizadas por lesões focais. A realização destas ressecções exige conhecimento detalhado da anatomia do fígado e particularmente dos elementos vasculares (DEMATTEO et al., 2000; TORRES et al., 2004).
As dificuldades desse tipo de procedimento estão relacionadas à localização do fígado, que torna inacessível nos casos de incidência de tumores de grande volume, a impossibilidade de ressecções muito extensas pela insuficiência hepática e principalmente pela predisposição desse órgão para hemorragia difusa, que está associada à sua vascularização e estrutura sinusoidal sem musculatura lisa capaz de promover vasoconstricção (LIN T-Y, 1973; LIAU; BLUMGART; DEMATTEO, 2004; FAUSTO; RIEHLE, 2005).
A hemostasia do parênquima hepático é um dos principais pontos de controle, uma vez que sua dissecção com sangramento mínimo raramente é alcançada. É mais grave em pacientes cirróticos devido ao risco maior de sangramento, por possuírem reserva hepática limitada, carência de propriedades regenerativas do parênquima e predisposição para sepse. Pacientes cirróticos sangram mais por causa de hipertensão porta, associada à coagulopatias (GARRISON et al., 1984; LISMAN; LEEBEEK, 2007).
Diversas técnicas como: abordagens sistêmicas, ligaduras mecânicas, exclusões vasculares, uso do eletrocautério, ablação por radiofrequência, coagulação por micro-ondas e feixe de argônio vêm sendo utilizadas visando o controle do sangramento. Os agentes hemostáticos também vêm sendo usados com grande aceitação no ambiente cirúrgico, como terapia adjuvante na obtenção de hemostasia, quando o controle do sangramento por métodos convencionais é ineficaz (SILESHI; ACHNECK; LAWSON et al., 2009).
Apesar do desenvolvimento das técnicas cirúrgicas, a perda sanguínea é ainda uma das principais causas de mortalidade pós-operatória. Outras complicações incluem as fístulas biliares e acúmulo de líquido intraperitoneal (GARCIA et al., 2004).
Na última década os avanços no campo da biotecnologia disponibilizaram inúmeros agentes hemostáticos tópicos. Eles estão divididos em duas categorias: os ativos, que interagem biologicamente sobre a cascata de coagulação e os passivos, que atuam ao promover, pelo contato, a ativação da agregação plaquetária. Os agentes hemostáticos passivos incluem colágenos, celulose e gelatinas; os agentes ativos incluem trombina e produtos combinados (SAMUDRALA, 2008).
Entre os vários agentes hemostáticos tópicos disponíveis, encontram-se o Gelfoam® e TachoSil®, objetos deste estudo.
Gelfoam® é uma esponja cirúrgica estéril de gelatina absorvível, composta por pele de suíno, dobrável, capaz de absorver e de manter em suas malhas muitas vezes o seu peso em sangue total. É preparada com uma solução de gelatina especialmente tratada, purificada e aquecida até alcançar a porosidade adequada, sendo absorvida dentro de quatro a seis semanas. Seu uso foi introduzido em 1945, apresenta grande poder hemostático quando aplicado à superfície hemorrágica após saturação com solução fisiológica salina ou simplesmente comprimida e aplicada seca (GELFOAM®..., 2012).
TachoSil® contém fibrinogênio e trombina na forma de um revestimento seco na superfície de uma esponja de colágeno. Em contato com fluidos fisiológicos, como sangue, linfa ou solução salina fisiológica, os componentes do revestimento se dissolvem e se difundem parcialmente na superfície da ferida. Em seguida, ocorre a reação de fibrinogênio com trombina que dá início a última fase da coagulação sanguínea fisiológica. O fibrinogênio é convertido em monômeros de fibrina que se polimerizam espontaneamente em um coágulo de fibrina, mantendo a esponja de colágeno firmemente aderido à superfície da ferida. A fibrina sofre então uma ligação cruzada pelo fator XIII endógeno, criando uma rede firme e mecanicamente estável com boas propriedades adesivas e selantes (TACHOSIL®..., 2009).
Agentes hemostáticos têm sido amplamente utilizados, com vários estudos quanto a vantagens e desvantagens de cada um, embora muitos resultados sejam ainda conflitantes (BERREVOET; HEMPTINNE, 2007b; BOONSTRA et al., 2009; SPOTINZ; BURKS, 2010).
O desafio constante da perda sanguínea no transoperatório de hepatectomia tem levado à utilização cada vez mais crescente de agentes hemostáticos, embora não se tenha muito claro seus verdadeiros efeitos e complicações. Muitos têm sido os estudos sobre o uso de agentes hemostáticos em ressecção hepática, porém grande parte destes, não tem resultados clinicamente relevantes, pois a maioria tem a hemostasia como foco (BOONSTRA et al., 2009). Mais estudos são necessários, não apenas relacionados ao tempo de hemostasia, mas também nas complicações locais da superfície de ressecção e alterações hematológicas e bioquímicas. TachoSil® possui eficácia comprovada na hemostasia (SIMO et al., 2012). Gelfoam® vem sendo há muito tempo utilizado em diversas especialidades cirúrgicas (PONTES; VIEIRA, 2004; ROSLINDO; VIOLA; GASPAR, 2007; KANG; NA; JIN, 2012).
1.1 OBJETIVO
Comparar a hemostasia em ratos submetidos à hepatectomia utilizando dois agentes hemostáticos, TachoSil® e Gelfoam®, avaliando através de estudo macroscópico, histológico, hematológico e bioquímico do fígado pós-hepatectomia.
2 REVISÃO DE LITERATURA
A revisão de literatura considerou os objetivos da pesquisa. Em busca de estudos relevantes associados ao tema pesquisou-se nas bases de dados PubMed, Scielo, Biblioteca Virtual em Saúde (BIREME), MedLine, Literatura Latino-Americana e do Caribe em Ciências da Saúde (LILACS). Os termos utilizados na busca foram as subseções do corpo da revisão de literatura, além do nome comercial dos produtos em estudo. Procedeu-se a varias pesquisas em sites comerciais, sobre as recomendações do fabricante.
2.1 HISTÓRICO
O fígado tem sido alvo de interesse de vários pesquisadores ao longo do tempo. Muitos vêm relatando seus achados focados na curiosidade e encantamento pela sua importância e complexidade. Na Grécia Antiga o mito de Prometeu relata que por revelar o segredo do fogo dos Deuses do Olimpo, este foi acorrentado e condenado a alimentar diariamente uma águia com seu fígado que era parcialmente devorado, mas regenerava-se todas as noites, tornando-se fonte renovável de alimento, prolongando assim o sofrimento de Prometeu (GODOY; MATIAS; COELHO, 2006).
Em 1840, Walaeus fez a primeira descrição sobre o envoltório vasculobiliar, porém somente em 1854, Francis Glisson redefiniu e descreveu essa estrutura anatômica, em sua publicação “Anatomia Hepatis”, que marcou o início dos estudos da fisiologia do fígado (FONSECA NETO, 2006).
A capacidade de regeneração desse órgão foi há tempos reconhecida. Teve o primeiro modelo experimental introduzido em 1931, com a ressecção dos lobos lateral esquerdo e mediano do fígado de ratos, preservando cerca de 30% do órgão com evidência de recuperação da massa hepática ressecada até quando o fígado atinge seu peso original, no período aproximado de 14 dias (FAUSTO; RIEHLE, 2005).
O processo de regeneração hepática pode ser constatado por alguns métodos, tais como peso do fígado, número de mitoses, componentes do ácido desoxirribonucleico (DNA), índice de síntese de antígenos nucleares avaliados por imunoistoquímica, expressão de genes, variações dos níveis de proteína sérica, testes sorológicos, determinações enzimáticas de marcadores de proliferação e citometria (ASSY; MINUK, 1997).
A partir do século XVII, através da dissecção de cadáveres, os cirurgiões começaram a se familiarizar com os lobos do fígado que, à época foi dividido em direito e esquerdo. Mesmo na ausência de conhecimento da anatomia hepática, operações em pacientes vítimas de trauma eram realizadas certamente com altos índices de mortalidade. Vários estudos anatômicos foram realizados, particularmente dos elementos vasculares. Os trabalhos de Couinaud (1954), divulgados por Bismuth em 1982 estabeleceram definitivamente a segmentação hepática. O registro da primeira ressecção hepática verdadeira aconteceu em 1952, realizada por Lotart-Jacob. Foi o marco inicial da era moderna da cirurgia hepática (TRIVINO; ABID, 2003).
2.2 HEPATECTOMIA
Os avanços da tecnologia voltados para os equipamentos, a evolução da anestesiologia com monitorização hemodinâmica avançada, os cuidados intensivos e o crescente aperfeiçoamento das técnicas cirúrgicas contribuíram, cada vez mais, para a segurança dos procedimentos. O impulso no tratamento das lesões hepáticas está relacionado aos métodos de imagem que têm permitido melhor identificação de lesões hepáticas possibilitando a ressecção de neoplasias malignas do fígado e algumas lesões benignas em pacientes assintomáticos (TORRES et al., 2004).
Apesar dos avanços no aprimoramento das habilidades e conhecimentos da estrutura anatomovascular do fígado, condição indispensável para o desenvolvimento das hepatectomias, grandes perdas sanguíneas com significativos índices de morbimortalidade ainda são comuns. Cuidadoso planejamento pré-operatório é exigido, uma vez que a identificação cuidadosa dos fatores de risco
minimizam as complicações pós-operatórias (BARBOSA; FERREIRA; SZUTAN, 2010).
As hepatectomias vão desde pequenas ressecções de tumores periféricos até as ressecções centrais ou trisegmentectomias. A natureza da doença hepática, sua gravidade e o tipo de operação a ser realizada, devem ser levados em consideração para o planejamento pré-operatório (BARBOSA; FERREIRA; SZUTAN, 2010).
As ressecções parciais do fígado para tratamento de lesões quer sejam malignas ou benignas, mas em particular as que têm estreita proximidade com grandes estruturas vasculares podem trazer complicações, principalmente pelo tempo operatório, disfunções hepáticas e pelo sangramento que se acentua caso os pacientes sejam cirróticos (BISMUTH; CASTAING; GARDEN, 1989). Manobras para reduzir o sangramento nas hepatectomias incluem exclusão vascular total ou aferente e suas variações com ou sem controle de vazão de todo o fígado ou parte dele (SILVA et al., 2011).
As vantagens e desvantagens da exclusão vascular parcial sem aplicação do pré-condicionamento isquêmico quanto à disfunção hepática foram avaliadas em 114 pacientes. Eles foram submetidos à hepatectomia parcial durante o período de 1998 a 2008, sendo aplicada em 57 deles a exclusão parcial vascular. A idade variou de 35 a 73 anos e 57 pacientes eram do sexo feminino. A função mitocondrial foi avaliada 30 minutos após a ressecção hepática no fígado remanescente e aminotransferases séricas foram determinadas antes do procedimento cirúrgico e durante sete dias no pós-operatório. O tempo de exclusão vascular parcial variou de 30 a 60 minutos. Não houve diferença de função mitocondrial, das enzimas aminotransferases entre os dois grupos. Os resultados demonstram que exclusão vascular parcial não induziu a alterações significativas típicas de isquemia e reperfusão no fígado remanescente (SILVA et al., 2011).
Em pesquisa experimental com ratos da linhagem Wistar, Salomão et al. (2012), avaliaram a regeneração hepática com modulação pelo pré-condicionamento isquêmico após isquemia, reperfusão e hepatectomia parcial. Vinte e quatro ratos foram distribuídos em quatro grupos: Grupo Controle submetido à laparotomia, simulação cirúrgica; Grupo Hepatectomia submetido à hepatectomia parcial; Grupo Isquemia e Reperfusão; e Grupo Pré-condicionamento Isquêmico. O estudo revelou que houve regeneração dos fígados em torno de 60%. O grupo controle apresentou
maior valor de Alanina aminotransferase (ALT) e Aspartato aminotransferase (AST). Observou-se que o grupo pré-condicionamento isquêmico teve valores de ALT e AST menores do que os do Grupo Isquemia e Reperfusão. Quanto às transaminases, houve diferenças significantes entre os grupos. Concluiu-se que o pré-condicionamento isquêmico diminuiu a lesão hepática pós-hepatectomia, porém não melhorou a regeneração após a lesão de isquemia e reperfusão. Comparado ao estudo de Silva et al. (2011), a ausência do emprego da técnica de isquemia e reperfusão não interferiu na dosagem das enzimas aminotransferase, AST e ALT.
Nas manobras de exclusão vascular total, adotadas nas hepatectomias para ressecção de grandes segmentos, ocorre significativa diminuição da perda sanguínea, porém transtornos hemodinâmicos e metabólicos, como disfunção hepática no pós–operatório, são frequentes (VAN GULIK et al., 2007). Para compensar as perdas sanguíneas impõem-se as hemotransfusões, com risco de transmissão de doenças virais, reações de hipersensibilidade e imunodepressão (BERREVOET; HEMPTINNE, 2007b).
Kooby et al. (2003), avaliaram a influência de transfusões perioperatórias em pacientes submetidos à ressecção hepática para metástases colorretais evidenciando o aumento da mortalidade perioperatória relacionada à quantidade de hemoderivados recebidos. Pacientes que receberam mais de duas unidades de concentrado de hemáceas tiveram taxa de mortalidade superior àqueles que não necessitaram de terapia de reposição.
2.3 HEMOSTASIA
O alto índice de mortalidade com predominância nas complicações hemorrágicas, a frequente necessidade de hemotransfusões com consequentes comorbidades e o tempo prolongado nas hepatectomias, justificam o constante progresso ao longo dos últimos 50 anos com atenção voltada principalmente para o controle de sangramento (FOSTER; BERMAN, 1977).
Assim como ocorreram avanços no conhecimento da anatomia cirúrgica do fígado, visando principalmente o controle das perdas sanguíneas, seguidos dos avanços no conhecimento da fisiologia hepática, chegou-se também na secção
parenquimatosa a semelhantes progressos com a evolução da digitoclasia para técnicas mais eficazes e seguras, com a introdução de diversos equipamentos e materiais concebidos para a secção e hemostasia do tecido hepático (BENEVENTO; CARGANO; DIONIGI, 1997).
A perda sanguínea maior na ressecção hepática decorre de pequenos vasos, por não serem previamente ligados (OGILVIE, 1953). As técnicas para dissecção têm evoluído para o uso de diversos dispositivos: bisturi elétrico, aspirador ultrassônico, dissecador de jato d’água, ablação por radiofrequência, coagulação por micro-ondas e bisturi de argônio, além de outros métodos (MATOS FILHO et al., 2009).
A fonte do sangramento pode ser difusa, de difícil identificação, inerentes à coagulopatias induzidas pela própria cirurgia ou ainda por administração prévia de antiplaquetários ou anticoagulantes (BOCHICCHINO et al., 2004).
Os métodos hemostáticos mais comumente utilizados, que incluem suturas e dispositivos de geração de calor, são muitas vezes insuficientes e inadequados para um procedimento específico ou de localização anatômica dificultada. A hemostasia, nestes casos, pode ser conseguida também através da aplicação de agentes hemostáticos tópicos, que podem ser eficazes a depender da sua composição e do seu mecanismo de ação (BOUCHER; TRAUB, 2009).
Samudrala (2008) divide os agentes hemostáticos em duas categorias: em uma delas encontram-se os que agem de forma biológica ativa sobre a cascata de coagulação, são os agentes hemostáticos tópicos ativos e, na outra estão aqueles cujo mecanismo básico de ação visa fornecer uma estrutura física em torno da qual as plaquetas podem agregar até um coágulo se formar, são os agentes hemostáticos tópicos passivos. Estes não possuem componentes ativos e incluem colágeno, celulose e gelatinas, enquanto os agentes ativos têm como componente principal a trombina bovina ou trombina humana (BOUCHER; TRAUB, 2009).
Uma série de hemostáticos sejam os ativos ou os passivos, como: esponjas de gelatina, colágeno, celulose oxidada, trombina, selantes e adesivos, têm sido utilizados e estudados não somente quanto à eficácia na homeostase, como também quanto à segurança no que se refere às reações adversas por estes apresentadas (SAMUDRALA, 2008).
Gelfoam® é exemplo de um dos primeiros modernos agentes hemostáticos. Está incluído no grupo dos hemostáticos passivos, introduzido na década de 1940.
Sua fórmula fundamental é esponja de gelatina, biologicamente reabsorvível, composta da pele de suínos purificada. Seu mecanismo de ação é através de suporte mecânico quando aplicado em superfície hemorrágica. Está indicado nos seguintes campos da cirurgia: neurocirurgia, otorrinolaringologia, cirurgia óssea, cirurgia abdominal, cirurgia ginecológica, cirurgia colorretal e cirurgia urológica. Apresenta-se em forma de esponja dobrável, é preparado com uma solução de gelatina especialmente tratada e purificada. Na utilização deve ser cortado no tamanho desejado e utilizado na menor quantidade necessária para obtenção da hemostasia. Quando utilizado a seco deve ser comprimido antes da aplicação e quando utilizado com solução salina, deve ser imerso na solução, retirado, comprimido com técnica asséptica para remover as bolhas de ar presentes nas malhas e recolocado na solução salina até o momento do uso quando, então, deverá ser pressionado moderadamente no local do sangramento até que seja alcançada a hemostasia (GELFOAM®..., 2012).
Estudos variados da eficácia e da segurança de Gelfoam® nas diversas especialidades cirúrgicas estão na literatura, sendo este avaliado de forma isolada ou comparando-o com outros agentes.
Em estudo da ação do Gelfoam®, comparada a ação de Bioplast® em loja cirúrgica das tíbias direita e esquerda de ratos, foi demonstrado que os dois agentes hemostáticos tiveram eficácia no controle hemorrágico. Estimularam a osteogênese nos defeitos ósseos nos períodos avaliados, provocando um padrão de formação de tecido ósseo semelhante, sendo destacada a ação do Gelfoam® quanto à estimulação mais intensa de reparação óssea nos períodos iniciais (ROSLINDO; VIOLA; GASPAR, 2007).
Na área de otorrinolaringologia, Gelfoam® tem sido utilizado especialmente em otologia para acomodação de tecidos e também em hemostasia. Pontes e Vieira (2004), em relato de caso, citam tal uso em tratamento de emergência para correção de insuficiência glótica por alterações estruturais em profissional da voz, com resultado positivo, embora em curto espaço de tempo, permitindo que ela retornasse às suas atividades profissionais.
Com o objetivo de analisar não só os efeitos hemostáticos, mas também a cicatrização, Kang, Na e Jin (2012) realizaram estudo experimental em ratos, para comparar os dois hemostáticos passivos: Gelfoam® esponja de gelatina e Surgicel® (celulose oxidada). Comparou o efeito de cicatrização da ferida, observando
qualquer proliferação de tecido de granulação, o grau de inflamação e a presença ou ausência de macrófagos e corpos estranhos. Concluiu que os animais do grupo Gelfoam® apresentaram maiores sinais de inflamação, menor proliferação de tecido de granulação e tempo mais prolongado para absorção comparado ao grupo Surgicel®.
Outro estudo, comprovando o retardamento na cicatrização e a presença de reações inflamatórias severas foi desenvolvido por Kang, Na e Jin (2012), em pesquisa experimental em ratos, utilizando para hemostasia do parênquima hepático, hemostáticos a base de gelatina e celulose. Após três dias, o grupo de celulose mostrou a formação de granulação limitada a reações inflamatórias agudas semelhantes ao grupo controle. No 28º dia, foi observado moderada formação de tecido de granulação com reações inflamatórias moderadas também semelhantes ao grupo controle. No grupo de gelatina, após três dias, foi observada a presença de gelatina rodeada por alterações inflamatórias severas. Após 28 dias, a mesma quantidade de gelatina podia ainda ser observada.
Os agentes hemostáticos tópicos ativos participam diretamente do final da cascata de coagulação para induzir a formação de um coágulo no local do sangramento. O componente básico destes agentes é a trombina, comumente utilizada em formulações combinadas com alguns agentes hemostáticos passivos e também associada aos selantes de fibrina (SAMUDRALA, 2008). Além de participar ativamente da cascata de coagulação, a trombina atua sobre células do músculo liso, promovendo vasoconstrição que ajuda na hemostasia (LEW; WEAVER, 2008).
Inicialmente a fonte de trombina era de origem bovina e sua eficácia comprovada tornou-a uma ferramenta popular no auxilio à hemostasia. Com o aumento da exposição de grande número de pacientes, surgiram os primeiros relatos questionando o uso dessa trombina, em que quatro pacientes com exposição prévia à trombina bovina desenvolveram anticorpos, resultando em anomalias hemorrágicas. A ausência de preparação alternativa de trombina fez crescer a popularidade da trombina bovina, porém a trombina humana e trombina recombinante estão disponíveis, o que representa um desafio para a trombina bovina, embora não haja garantia absoluta de que a trombina humana esteja livre de patógenos veiculados pelo sangue (LEW; WEAVER, 2008; JACKSON, 2001).
Em quase todas as especialidades cirúrgicas, houve relatos de eventos adversos relacionados ao uso de trombina bovina (HAM; WESLEY; WEAVER, 2010).
TachoSil® faz parte do grupo de hemostáticos ativos, apresenta-se em forma de esponja esbranquiçada, com o lado ativo revestido de seus componentes trombina e fibrinogênio humano, veiculados por colágeno de tendões equino, riboflavina, albumina humana, cloreto de sódio, citrato de sódio e cloridrato de L- arginina. Todos os componentes de origem bovina foram substituídos, limitando os riscos associados ao material bovino. A face amarela representa a parte ativa do TachoSil® que interage quando entra em contato com o sangramento. A absorção acontece em 12 semanas após aplicação e sua indicação não se limita somente a hemostasia, mas também a selagem de tecidos para dar sustentação às suturas, a fim de evitar aderências e erosões, proteger os nervos e ocluir estruturas como bronquíolos, vasos linfáticos e ductos biliares. Deve ser administrado em grávidas ou lactentes somente se for estritamente necessário (TACHOSIL®..., 2009).
TachoSil® foi aprovado pelo Food and Drug Administration (FDA) em 2010, indicado como adjuvante da hemostasia em cirurgia cardiovascular em que o controle do sangramento por técnicas cirúrgicas tais como ligaduras, suturas ou cauterização são impraticáveis ou ineficazes (SPOTNITZ; BURKS, 2010). Seu uso vem sendo aplicado e avaliado em estudos experimentais e clínicos em áreas diversas da cirurgia, bem como em cirurgia hepatobiliar. Tal como ocorre com Gelfoam®, TachoSil® vem sendo avaliado também de forma isolada ou comparado com outros agentes.
Comparando TachoSil® ao feixe de argônio, foi inicialmente realizado por Fischer et al. (2011) estudo prospectivo, randomizado, aberto, multicêntrico com avaliação intra e pós-operatória, de dois grupos de pacientes tratados durante ressecção hepática planejada. O primeiro com hemostasia secundária por TachoSil® e duração da drenagem, o volume e o conteúdo. No grupo de pacientes que fez uso de TachoSil®, o tempo médio de hemostasia foi menor em comparação com feixe de argônio. Quanto ao volume e duração de drenagem do fluido, os grupos não diferiram, porém foi confirmado que a hemostasia com TachoSil® é significativamente mais rápida do que a alcançada pelo feixe de argônio.
Um, entre poucos estudos utilizando hemostático foi desenvolvido em crianças por Mirza et al. (2011). Crianças de quatro semanas a seis anos,
submetidas à ressecção hepática com ou sem transplante, foram tratadas com TachoSil® após tratamento hemostático primário. Foram avaliados o tempo de hemostasia e a segurança, pela manifestação de eventos adversos tais como: infecções pós-operatórias, rejeição ao enxerto e reoperações. Os resultados revelaram tempo de hemostasia de três minutos e ocorrência de eventos dentro do esperado, com complicações associadas a patologias de base, ao procedimento ou ao uso de medicações imunossupressoras. Concluindo que a utilização de TachoSil® para a hemostase após tratamento hemostático primário, parece ser segura e eficaz em crianças submetidas à ressecção hepática.
Quanto à resistência à tração, um estudo foi desenvolvido por Lacaze et al. (2012), que utilizando modelo experimental canino comparou cinco agentes hemostáticos: Tissel®, Tissucol®, TachoSil®, Quixil® e Beriplast®. Hepatectomia parcial foi realizada e os selantes de fibrina foram alocados sobre o fígado. As propriedades de adesão significativamente mais elevadas foram observadas em Tissel® e Tissucol® comparada com Quixil® ou Beriplast (p = 0,002 e 0,001, respectivamente). Do mesmo modo, TachoSil® demonstrou propriedades adesivas significativamente maiores em comparação com Beriplast (p = 0,009) ou Quixil® (p = 0,014). Não foram observadas diferenças significantes entre Tissel®, Tissucol® e TachoSil® ou entre Beriplast® e Quixil®. Os resultados demonstraram que os variados selantes de fibrina apresentam diferentes padrões de adesividade, levando a possibilidade de melhores escolhas na prática clínica.
O sucesso da cirurgia está diretamente relacionado ao conhecimento de um método apropriado para o controle do sangramento. Os agentes tópicos podem ser eficazes como coadjuvantes para auxiliar na hemostasia, mas também oferecem riscos à sua utilização. A trombina bovina presente nos hemostáticos ativos está associada a coagulopatias (LAWSON et al., 1985); mas a trombina humana apesar de relativa segurança, ainda não oferece garantia absoluta de ser completamente livre de patógenos veiculados pelo sangue (JACKSON, 2001; HEFFERNAN et al., 2007).
3 METODOLOGIA
3.1 PRINCÍPIOS ÉTICOS
O presente estudo é etapa da linha de pesquisa desenvolvida pela Faculdade Evangélica do Paraná, sua elaboração observou as normas para apresentação de documentos científicos da Associação Brasileira de Normas Técnicas (ABNT). Espera-se que seus resultados contribuam para aprofundar o conhecimento sobre a ação dos hemostáticos de uso tópico na hemostasia do parênquima hepático. Obedeceu-se aos princípios éticos em experimentação animal preconizados pela Sociedade Brasileira de Ciência em Animais de Laboratório (SBCAL), teve aprovação do Comitê de Ética e Experimentação Animal (CEEA) da Universidade Estadual do Maranhão (UEMA), sob protocolo nº 039\2012. (ANEXO 1). O tamanho da amostra foi determinado observando-se as recomendações da SBCAL, que exige redução do número de animais usados em pesquisas experimentais.
Os experimentos foram realizados no Laboratório de Pesquisa em Cirurgia Experimental da Universidade Federal do Maranhão (LABCEMA), sendo adotada a Nomina Anatômica Veterinária (1983).
3.2 CUIDADOS COM OS ANIMAIS
Foram submetidos ao estudo 24 ratos (Rattus norvegicus – Wistar) adultos do sexo masculino, com peso médio de 327 ± 40,18g, procedentes do Biotério da Universidade Estadual do Maranhão (UEMA). Após pesagem em balança de precisão (Plenna®, São Paulo, Brasil), os animais foram identificados e mantidos em observação por um período mínimo de sete dias antes da primeira operação, em gaiolas de polipropileno com cobertura de proteção de grade metálica inoxidável, medindo 46 cm x 31 cm x 16 cm, forradas com maravalha, cada uma contendo quatro animais. Receberam água e ração padrão para espécie (Purina®, São Paulo,
Brasil), ad libitum. Permaneceram em ambiente com temperatura de 23 ± 2º C, umidade relativa do ar entre 40 e 70 %, sem ruídos, em ciclos circadianos de claro-escuro, com 12 horas de luz de baixa intensidade e 12 horas de escuridão antes e durante todo o período da experimentação. Durante o período de observação não foram identificados sinais de doença ou quaisquer anormalidades que pudessem levar a exclusão de qualquer um dos animais.
3.3 DISTRIBUIÇÃO DA AMOSTRA
Os 24 ratos foram aleatoriamente divididos em dois grupos de 12, denominados grupo Gelfoam® e grupo TachoSil®. O grupo Gelfoam® foi subdividido em dois subgrupos de seis, denominados subgrupo Gelfoam® D3, que corresponde ao 3º dia pós-operatório, data em que foram reoperados e submetidos à eutanásia e subgrupo Gelfoam D14 que corresponde ao 14º dia pós-operatório, quando também foram reoperados e submetidos à eutanásia. O mesmo ocorreu com o grupo TachoSil®, que subdiviu-se também em dois subgrupos: subgrupo TachoSil® D3 e subgrupo TachoSil® D14 (FIGURA 1).
3.4 HEMOSTÁTICOS UTILIZADOS
Os hemostáticos utilizados neste experimento estão disponíveis comercialmente e são utilizados em seres humanos. Gelfoam® (2012) (FIGURA 2) e TachoSil® (2009) (FIGURA 3).
FIGURA 2- GELFOAM® FIGURA 3 - TACHOSIL®
3.5 ANESTESIA
No dia da primeira operação, após pesagem em balança eletrônica digital, os animais foram contidos manualmente e submetidos à anestesia intramuscular com cloridrato de quetamina 5% na dosagem de 60 mg /Kg associado com cloridato de xilazina 2% - 10mg /Kg. A via de administração foi a face posterior da coxa.
Considerou-se o animal anestesiado no momento em que se apresentou imóvel, com reflexos interdigitais e corneanos abolidos, respirando normalmente e apresentando extremidades rosadas de acordo com o procedimento proposto por White, Johnston e Eger (1974).
Após a anestesia, cada animal foi posto em posição de decúbito dorsal e mantido com contenção dos membros anteriores e posteriores em prancha de
madeira (23 x 17 cm) (FIGURA 4). Realizou-se a epilação da região ventral superior do abdome (5,0 x 4,0 cm) e antissepsia da região abdominal com Polivinilpirrolidona Iodo® (PVPI), dispondo-se a seguir um campo cirúrgico fenestrado estéril sobre o animal de forma a expor o campo operatório.
FIGURA 4 – POSICIONAMENTO PARA CIRURGIA
3.6 ATO OPERATÓRIO
Os animais foram submetidos à laparotomia longitudinal a partir de 1 cm abaixo do processo xifóide, no sentido craniocaudal (FIGURA 5); procedeu-se à diérese da pele, do tecido celular subcutâneo, do plano musculoaponeurótico e peritônio com bisturi de lâmina nº 15 (FIGURA 6).
A hepatectomia foi padronizada de acordo com o peso do animal e o peso do fígado, tendo sido estabelecido após teste em quatro ratos fora do estudo. Eles foram pesados vivos e a seguir definida a média de peso. Foram anestesiados e submetidos a eutanásia, sendo seus fígados ressecados para pesagem e definição da proporção rato/fígado.
Após abertura, explorou-se a cavidade abdominal em busca de quaisquer anormalidades que pudessem excluir o animal, porém nada foi encontrado. O lobo mediano foi identificado, exteriorizado e seccionado com tesoura metzenbaum curva de 23 cm (FIGURA 7).
FIGURA 7 – RESSECÇÃO DO LOBO MEDIANO DO FÍGADO.
FIGURA 5 – DELIMITAÇÃO DA INCISÃO
A ressecção do segmento hepático foi feita em todos os animais por um único cirurgião. A data de realização da primeira operação de cada grupo (Gelfoam® e TachoSil®) foi denominado D0.
A hemostasia foi realizada de acordo com o hemostático preconizado para cada grupo. No grupo TachoSil®, foi colocado na área cruenta do fígado o hemostático nas dimensões de 2 x 2 cm (FIGURA 8), pressionando-o na área seccionada por dois minutos (FIGURA 9). No grupo Gelfoam®, utilizou-se também 2x2 cm do hemostático, repetindo-se a mesma manobra citada para o grupo TachoSil® por igual período de tempo. Antes do fechamento da cavidade abdominal foi realizada limpeza da área seccionada com gaze umedecida em solução de cloreto de sódio a 0,9% para confirmação da hemostasia. Confirmado o controle do sangramento procedeu-se à síntese da parede abdominal com fio Mononylon* Ethicon® 4-0 por planos em sutura contínua. A porção seccionada do fígado foi pesada em balança de precisãoe a seguir desprezada.
FIGURA 8 – PORÇÃO DE GELFOAM®
3.7 PÓS-OPERATÓRIO
Após recuperação anestésica, os animais foram preservados da dor recebendo analgesia com aplicação de morfina na dose 2,5 mg\kg. Foram mantidos nas gaiolas, devidamente higienizadas, nas mesmas condições de temperatura e luminosidade do pré-operatório e tiveram livre acesso à água e ração após 12 horas da operação. Durante o período pós-operatório os animais foram diariamente avaliados para averiguação de complicações tais como: sangramento, deiscência de sutura, sinais inflamatórios e seromas.
3.8 REOPERAÇÃO E EUTANÁSIA DOS ANIMAIS
No 3º dia de pós-operatório do grupo Gelfoam®, os seis animais do subgrupo denominado Gelfoam® D3 foram submetidos a reoperação; os seis animais do subgrupo Gelfoam® D14 foram igualmente reoperados no 14º dia e da mesma forma os animais do grupo TachoSil® foram reoperados no 3º e no 14º dia.
Os animais foram anestesiados com a mesma técnica utilizada na primeira operação e submetidos a laparotomia, realizando reabertura da cavidade abdominal sob duas incisões transversais e mais uma longitudinal paralela à distância de 1 cm à esquerda da cicatriz mediana, decorrente do ato operatório prévio, objetivando não alterar as possíveis aderências das estruturas abdominais à parede. Foi realizada averiguação da cavidade à procura de evidências de hematomas, coleções de fluidos, abscessos, aderências e fístulas (FIGURA 10). Quando encontradas, as aderências foram classificadas conforme escore de Nair (NAIR; BHAT; AURORA, 1974) (ANEXO 2).
Os achados macroscópicos foram devidamente registrados. Logo após, foi realizada hepatectomia total e os segmentos de fígado retirados, foram pesados (FIGURA 11), fixados em formaldeído a 10% (FIGURA 12) e a seguir encaminhados para análise histológica. Após coleta sanguínea, a eutanásia dos animais deu-se por exsanguinação e, para aqueles que resistiram, realizou-se overdose com quatro vezes o valor da dose para indução anestésica.
FIGURA 11 – PESAGEM DO FÍGADO
NA REOPERAÇÃO FIGURA 12 – FIXAÇÃO DO FÍGADO EM FORMALDEÍDO A 10% FIGURA 10 – AVALIAÇÃO MACROSCÓPICA DA CAVIDADE:
3.9 COLETA SANGUÍNEA
Após hepatectomia total, realizou-se a coleta sanguínea através de punção da veia cava caudal (FIGURA 13). Colheu-se 5 ml de sangue, distribuindo-os em dois diferentes tubos de ensaio. Ao primeiro contendo solução de Ácido Ácido Etilenodiaminotetracético (EDTA), transferiu-se 2 ml de sangue para dosagem de leucócitos (LEU), hemoglobina e hematócrito (HTM); para o segundo tubo de ensaio contendo gel separador, transferiu-se 3 ml de sangue para dosagem de AST, ALT e fosfatase alcalina (ALP). Todos os exames foram realizados no Laboratório Cernitas em São Luis – MA. Tomou-se como referência para as análises bioquímicas e hematológicas deste estudo os parâmetros descritos por Melo et al. (2012), para ratos Wistar machos.
FIGURA 13- ACESSO VENOSO PARA COLETA SANGUÍNEA
3.10 ANÁLISE HISTOLÓGICA
As peças retiradas foram identificadas de acordo com o animal e seu respectivo grupo, fixadas e encaminhadas para o Serviço de Patologia (UDT-MED) onde a preparação histológica foi feita pela técnica convencional de inclusão em
parafina, seccionados com micrótomo produzindo cortes de cinco micrômeros, corados pela hematoxilina e eosina (HE) e tricrômico de Masson. O conteúdo das lâminas foi examinado com auxilio de microscópio OLYMPUS CX31, por um único patologista sem conhecimento dos grupos em estudo.
Os critérios para análise histológica foram avaliados segundo a classificação de Cotran et al. (1999), inflamação aguda, inflamação crônica, proliferação fibroblástica, fibrose (colagenização) e neoformação capilar. Utilizou-se para sua quantificação histológica um escore e um somatório da presença de congestão vascular, edema, polimorfonucleares, mononucleares, proliferação fibroblástica e angiogênese de acordo com protocolo de análise histológica baseado no grau de intensidade para cada lâmina. Cada item foi graduado de 0 a 3 da seguinte maneira: ausente = 0; discreto =1; moderado=2; acentuado=3. Ao final realizou-se análise estatística dos dados encontrados.
3.11 ANÁLISE ESTATÍSTICA
Os dados foram avaliados pelo programa SPSS for Windows 20 (2011). Inicialmente, Foi feito o teste de normalidade de Shapiro Wilk. Nas variáveis com distribuição normal foi aplicado o teste de Análise de Variância Multivariada (MANOVA) com interação dos dois fatores (Grupo e Tempo). As variáveis que não possuem distribuição normal foram aplicados os testes não paramétricos de Mann Whitney para se avaliar o efeito do grupo e do tempo. O nível de significância para se rejeitar a hipótese de nulidade será de 5%, ou seja, considerou-se como estatisticamente significante um valor de p < 0,05.
4 RESULTADOS
4.1 CARACTERIZAÇÃO DOS ANIMAIS QUANTO AO PESO
O peso médio dos animais dos grupos Gelfoam® e TachoSil® no D0 (data da primeira operação) não apresentou diferença estatisticamente significante (p< 0,05) , todos os animais são machos para evitar influências hormonais. As amostras deste estudo foram homogêneas, com idade e peso médio semelhantes (TABELA 1).
TABELA 1 - PESO MÉDIO DOS ANIMAIS NO PRÉ-OPERATÓRIO
4.2 AVALIAÇÃO MACROSCÓPICA
4.2.1 Grupo Gelfoam®
Todos os ratos sobreviveram nos períodos trans e pós operatório. Durante o período que antecedeu a reoperação dos animais, não foram observadas complicações da ferida operatória tais como: sangramento, deiscências de sutura, sinais inflamatórios ou seromas.
Nos seis animais do grupo Gelfoam® D3 não foi evidenciada presença de coleções ou abscessos intra-abdonimais, porém todos apresentaram aderências: 50% grau I, 33% grau II e 16,6% grau III.
No subgrupo Gelfoam® D14 os seis animais tinham aderências que variaram do grau II, ao IV. 50% dos animais possuíam aderências grau II, 33,3% grau III e 16,6% grau IV (TABELA 2).
VARIÁVEL GRUPO MÉDIA DP p
Peso no D0 * Gelfoam® 332,5 87.8 0,289
TABELA 2 - ACHADOS NA REOPERAÇÃO DOS RATOS DO GRUPO GELFOAM® NOS PERÍODOS D3 E D 14 QUANTO AS ADERÊNCIAS
GRUPO Grau 0 n(%) Grau I n (%) Grau II n(%) Grau III n(%) Grau IV n (%)
Gelfoam® D3 0 3 (50%) 2 (33,3%) 1 (16,6%) 0
Gelfoam® D14 0 0 3 (50%) 2 (33,3%) 1 (16,6%)
No subgrupo Gelfoam® D14, foi encontrada formação de abscesso no parênquima hepático de um animal equivalendo a 16,66% destes (TABELA 3).
TABELA 3 - ACHADOS MACROSCÓPICOS NA REOPERAÇÃO DOS RATOS DO GRUPO GELFOAM® NOS PERÍODOS D3 E D14
GRUPO FORMAÇÃO DE ABSCESSO
Gelfoam® D3 n (%) 0 (0,0%)
Gelfoam® D14 n (%) 1 (16,66%)
4.2.2 Grupo Tachosil®
As hepatectomias dos animais do grupo TachoSil® ocorreram sem complicações no transoperatório e a hemostasia foi alcançada utilizando-se a mesma técnica aplicada para o grupo Gelfoam®. Não houve morte dos animais nos períodos trans e operatórios até a reoperação dos mesmos. No período pós-operatório não foram identificadas complicações relacionadas a sangramento, deiscência de suturas ou seromas. Quanto ao exame macroscópico da cavidade abdominal dos seis animais do grupo TachoSil® D3, constatou-se que apenas dois apresentaram aderências, destes 16% grau I e 16% grau II.
No grupo TachoSil®, período D14, não foram identificadas formações de abscesso ou coleções intra abdominais. Três animais apresentaram aderências, destes 33,3% grau I e 16,6% grau II (TABELA 4).
TABELA 4 - ACHADOS NA REOPERAÇÃO DOS RATOS DO GRUPO TACHOSIL® NO PERÍODO D3 E D14 QUANTO AS ADERÊNCIAS
GRUPO Grau 0 n(%) Grau I n (%) Grau II n(%) Grau III n(%) Grau IV n (%)
TachoSil® D3 4 (66,6%) 1 (16,6%) 1 (16,6%) 0 0
TachoSil® D14 3 (50%) 2 (33,3%) 1 (16,6%) 0 0
O exame macroscópico revela a presença de aderências em 100% dos animais do grupo Gelfoam®, enquanto no grupo TachoSil® foram evidenciadas em apenas 41,6% dos animais.
4.3 ANÁLISE HISTOLÓGICA
Somente no grupo Gelfoam® foram encontradas reações gigantocelulares tipo corpo estranho (FIGURA 14) em quatro animais equivalendo a 33,33% destes.
A análise descritiva das variáveis histológicas no primeiro período de observação entre os subgrupos Gelfoam® D3 e TachoSil® D3 revelou mediana acentuada nas variáveis edema e polimorfonucleares no subgrupo Gelfoam® D3 (FIGURA 15), enquanto no subgrupo TachoSil® D3 as mesmas variáveis apresentaram mediana moderada, evidenciando infiltrado inflamatório agudo mais intenso no subgrupo Gelfoam® D3. As variáveis mononucleares, proliferação fibroblástica, angiogênese e colágeno estão ausentes no subgrupo Gelfoam® D3, enquanto no subgrupo TachoSil® D3 a mediana das mesmas variáveis foi: discreto a moderado para mononucleares, discreto para proliferação fibroblástica, moderado para angiogênese e discreto para colágeno (TABELA 5), revelando diferença estatística significante (p<0,05) entre as mesmas variáveis nos dois subgrupos de acordo com o teste de Mann Whitney (TABELA 6).
TABELA 5 - DESCRIÇÃO DAS VARIÁVEIS HISTOLÓGICAS NOS SUBGRUPOS GELFOAM® E TACHOSIL® NO PERÍODO D3
GELFOAM® D3 TACHOSIL® D3
Variável N Mediana N Mediana
Congestão vascular 6 Moderado 6 Moderado
Edema 6 Acentuado 6 Moderado
Polimorfonucleares 6 Acentuado 6 Moderado
Mononucleares 6 Ausente 6 Discreto/Moderado
Proliferação fibroblástica 6 Ausente 6 Discreto
Angiogênese 6 Ausente 6 Moderado
Colágeno 6 Ausente 6 Discreto
FIGURA 14 – FOTOMICROGRAFIA MOSTRANDO REAÇÃO GIGANTOCELULAR TIPO CORPO ESTRANHO NO PARÊNQUIMA HEPÁTICO DE ANIMAL DO GRUPO GELFOAM D3. HE, 100X
TABELA 6 - TESTE DE MANN WHITNEY DAS VARIÁVEIS HISTOLÓGICAS EM RELAÇÃO AOS GRUPOS NO PERÍODO D3
VARIÁVEL GRUPO N POSTO MÉDIO p
Congestão vascular TachoSil® Gelfoam® 6 6 7,0 6,0 0,523 Edema TachoSil® Gelfoam® 6 6 7,8 5,3 0,176 Polimorfonucleares TachoSil® Gelfoam® 6 6 7,8 5,3 0,176 Mononucleares TachoSil® Gelfoam® 6 6 4,3 8,8 0,019 Proliferação Fibroblástica TachoSil® Gelfoam® 6 6 4,3 8,7 0,023 Angiogênese TachoSil® Gelfoam® 6 6 4,3 8,7 0,027 Colágeno TachoSil® Gelfoam® 6 6 3,9 8,5 0,008
A análise descritiva entre os subgrupos Gelfoam® D14 e TachoSil® D14 revelou predomínio de edema nos animais do subgrupo TachoSil® D14 (TABELA 7), com diferença estatística significante (p<0,05) de acordo com o teste de Mann Whitney (TABELA 8). No que diz respeito às variáveis congestão, mononucleares, proliferação fibroblástica e colágeno, estas revelaram medianas semelhantes em
FIGURA 15 - FOTOMICROGRAFIA MOSTRANDO EDEMA E POLIMORFONUCLEARES NO PARÊNQUIMA HEPÁTICO DE ANIMAL DO GRUPO GELFOAN® D3. HE, 100x
ambos os subgrupos, apenas a variável angiogênese revelou medianas diferentes entre os dois subgrupos sem diferença estatística significante (p<0,05.) (TABELA 8).
TABELA 7 - DESCRIÇÃO DAS VARIÁVEIS HISTOLÓGICAS NOS GRUPOS GELFOAM® E TACHOSIL® NO PERÍODO D14
GELFOAM® TACHOSIL®
Variável N Mediana N Mediana
Congestão vascular 6 Discreto 6 Discreto
Edema 6 Discreto 6 Moderado
Polimorfonucleares 6 Discreto 6 Acentuado
Mononucleares. 6 Discreto 6 Discreto
Proliferação Fibroblásstica 6 Discreto 6 Discreto
Angiogênese 6 Moderado 6 Discreto
Colágeno 6 Discreto 6 Discreto
TABELA 8 - TESTE DE MANN WHITNEY DAS VARIÁVEIS HISTOLÓGICAS EM RELAÇÃO AOS GRUPOS NO PERÍODO D14
Variável Grupo N Posto Médio p
Congestão vascular Gelfoam® 6 5,6 0,560
TachoSil® 6 6,5 Edema Gelfoam® 6 4,3 0,047 TachoSil® 6 8,1 Polimorfonucleares Gelfoam® 6 4,6 0,105 TachoSil® 6 7,7 Mononucleares Gelfoam® 6 6,8 0,174 TachoSil® 6 5,0
Proliferação Fibroblástica Gelfoam® 6 5,5 0,273
TachoSil® 6 6,6
Angiogênese Gelfoam® 6 7,2 0,140
TachoSil® 6 4,6
Colágeno Gelfoam® 6 6,3 0,641
4.4 PARÂMETROS HEMATOLÓGICOS
Nos resultados da análise hematológica intragrupos, observou-se que nos subgrupos Gelfoam® D3 e Gelfoam® D14 houve diferença estatisticamente significante (p<0,05) entre quase todas as variáveis, exceto na contagem de linfócitos, conforme demonstra a (TABELA 9).
TABELA 9 - PARÂMETROS HEMATOLÓGICOS DOS ANIMAIS DOS SUBGRUPOS GELFOAM® NOS PERÍDO D3 E D14
Comparando os resultados do subgrupo TachoSil® D3, com os resultados do subgrupo TachoSil® D14 evidenciou-se diferença estatística significante (p<0,05) entre a média das variáveis hematócrito e hemoglobina, com valor inferior no primeiro período de observação (TABELA 10).
TABELA 10 - PARÂMETROS HEMATOLÓGICOS DOS ANIMAIS DOS SUBGRUPOS TACHOSIL® NOS PERÍODOS D3 E D14
VARIÁVEL PERÍODO MÉDIA DP p
Leucócitos mm3 3 9,0 2.4 0,017 14 6,7 0.8 Linfócitos % 3 56,0 5.0 0,131 14 60,0 7.2 Eosinófilos % 3 1,5 0.6 0,029 14 3,1 2.4 Hematócrito % 3 29,3 2.5 0,000 14 39,2 1.2 Hemoglobina g\dL 14 3 13,7 17.8 2.5 1.2 0,000
VARIÁVEL PERÍODO MÉDIA DP p
Leucócitos mm3 14 3 7,3 6,9 1.3 1.8 0,667 Linfócitos % 14 3 66,2 64,8 5.8 6.4 0,893 Eosinófilos % 14 3 1,5 2,0 0.5 0.7 0,135 Hematócrito % 14 3 29,6 32,2 1.8 1.5 0,029 Hemoglobina g\dL 3 13,8 1.1 0,041 14 15,3 1.8
Na análise intergrupos, no primeiro período de observação, identificou-se contagem de linfócitos superior no subgrupo TachoSil® D3 com diferença estatisticamente significante (p<0,05) comparada ao subgrupo Gelfoam D3 (TABELA 11). No segundo período de observação identificou-se valor de hematócrito e hemoglobina no subgrupo TachoSil® D14 menor quando comparado ao grupo Gelfoam® com diferença estatística significante (p<0,05) (TABELA12).
TABELA 11 - PARÂMETROS HEMATOLÓGICOS DOS ANIMAIS DO SUBGRUPO GELFOAM® E TACHOSIL® NO PERÍODO D3
VARIÁVEL SUBGRUPOS MÉDIA DP p
Leucócitos mm3 Gelfoam® D3 9,0 2.4 0,239 TachoSil® D3 7,3 1.3 Linfócitos % Gelfoam® D3 56,0 5.0 0,008 TachoSi®l D3 66,2 5.8 Eosinófilos % Gelfoam® D3 1,5 0.6 0,880 TachoSil® D3 1,5 0.5 Hematócrito % Gelfoam® D3 29,3 2.5 0,866 TachoSil® D3 29,6 1.8 Hemoglobina g\dL Gelfoam® D3 13,7 0.2 0,855 TachoSil® D3 13,9 0.4
TABELA 12 - PARÂMETROS HEMATOLÓGICOS DOS SUBGRUPOS GELFOAM® E TACHOSIL® NO PERÍODO D14
Comparando-se finalmente a média geral entre as variáveis dos grupos Gelfoam® e TachoSil®, observou-se que embora a contagem de leucócitos totais não tenha diferido entre os dois grupos, evidenciou-se discreto aumento de linfócitos no grupo TachoSil® com diferença estatística significante (p<0,05%). Ainda no grupo TachoSil® as variáveis hematócrito e hemoglobina revelaram valores inferiores com com diferença estatística significante (p<0,05) (TABELA 13).
TABELA 13 - MÉDIA GERAL DOS PARÂMETROS HEMATOLÓGICOS DOS ANIMAIS NOS GRUPOS GELFOAM® E TACHOSIL®
VARIÁVEL SUBGRUPO MÉDIA DP p
Leucócitos mm3 Gelfoam® D14 6,7 0.8 0,504 TachoSil® D14 6,9 1.8 Linfócitos % Gelfoam® D14 60,0 7.2 0,109 TachoSil® D14 64,8 6.4 Eosinófilos % Gelfoam® D14 3,1 2.4 0,398 TachoSil® D14 2,0 0.7 Hematócrito % Gelfoam® D14 39,2 1,2 0,000 TachoSil® D14 32.2 1,5 Hemoglobina g\dL Gelfoam® D14 17,8 0.4 0.001 TachoSil® D14 15,3 1.0
VARIAVEL GRUPOS MÉDIA DP p
Leucócitos % Gelfoam® 7,5 1.8 0,742 TachoSil® 7,1 1.5 Linfócitos % Gelfoam® 58,7 6.7 0,003 TachosS®l 65,5 6.0 Eosinófilos % Gelfoam® 2,7 2.2 0,180 TachoSil® 1,8 0.6 Hematócrito % Gelfoam® 35,9 5.2 0,023 TachoSil® 31,6 2.0 Hemoglobina g\dL Gelfoam® 16,4 2.1 0,044 TachoSil® 14,6 1.3
4.5 PARÂMETROS BIOQUÍMICOS
As enzimas hepáticas transaminase AST, transaminase ALT e ALP foram dosadas em todos os animais dos grupos TachoSil® e Gelfoam®.
Na análise intragrupos, identificou-se nos subgrupos Gelfoam® elevações dos níveis séricos principalmente de AST no primeiro período de observação (D3) e ALP, no segundo período (D14), com diferença estatística significante (p<0,05) (TABELA 14).
TABELA 14 - PARÂMETROS BIOQUÍMICOS DOS ANIMAIS DO SUBGRUPO GELFOAM® NO PERÍODOS D3 E D14
Nos subgrupos TachoSil® destacou-se a variável AST com nível elevado no segundo período de avaliação (D14), com diferença estatística significante (P<0,05) (TABELA 15).
TABELA 15 - PARÂMETROS BIOQUÍMICOS DOS ANIMAIS DO SUBGRUPO TACHOSIL® NOS PERÍODOS D3 E D14
VARIÁVEL TEMPO MÉDIA DP p
AST U\L 3 191.8 43,6 0,010 14 127.8 10,7 ALT U\L 3 71.5 2,.6 0,915 14 76,5 11,5 ALP U\L 3 304,8 60,5 0,034 14 408.7 64.2
VARIÁVEL TEMPO MÉDIA DP p
AST U\L 14 3 203.7 267,0 40.6 4.0 0,035 ALT U\L 14 3 89,0 76,5 11.5 5.0 0,465 ALP U\L 14 3 505,0 256,0 248.8 49.8 0,223
Na análise intergrupos, houve aumento de AST e ALT no grupo TachoSil®, com diferença estatística significante (p<0,05) entre a média geral destas variáveis (TABELA 16).
TABELA 16 - MÉDIA GERAL DOS PARÂMETROS BIOQUÍMICOS DOS GRUPOS GELFOAM® E TACHOSIL®
VARIÁVEL GRUPOS MÉDIA DP p
AST U\L Gelfoam® 153,4 42,3 0,000
TachoSil® 245.9 45.1
ALT U\L Gelfoam® 70,6 15.4 0,032
TachoSil® 85.0 10.7
ALP U\L Gelfoam® 367,1 79,9
0,660
