FLÁVIA MARIA NONATO PRETTI ASLANIAN AVALIAÇÃO HISTOLÓGICA E IMUNO-HISTOQUÍMICA DO INFILTRADO CELULAR EM PELE PERILESIONAL

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AVALIAÇÃO HISTOLÓGICA E IMUNO-HISTOQUÍMICA DO INFILTRADO CELULAR EM PELE PERILESIONAL

E NÃO-LESIONAL DO VITILIGO ATIVO ANTES E APÓS PUVATERAPIA

TESE DE DOUTORADO

Universidade Federal do Rio de Janeiro

Curso de Pós - Graduação - Área de Concentração Dermatologia 2007

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AVALIAÇÃO HISTOLÓGICA E IMUNO-HISTOQUÍMICA DO INFILTRADO CELULAR EM PELE PERILESIONAL

E NÃO-LESIONAL DO VITILIGO ATIVO ANTES E APÓS PUVATERAPIA

FLÁVIA MARIA NONATO PRETTI ASLANIAN

Tese apresentada ao corpo docente da Faculdade de Medicina da Universidade Federal do Rio de Janeiro, Curso de Pós-Graduação em Medicina - Área de

Concentração - Dermatologia – como parte dos requisitos necessários à obtenção do grau de Doutora em Medicina.

Aprovada por:

Prof.: Márcia Ramos-e-Silva-UFRJ (Presidente da Banca)

Prof.: Maria Kátia Gomes-UFRJ

Prof.: José Marcos Telles da Cunha-UFRJ

Prof.: Paula Dadalti-UNIGRANRIO

Prof.: Rogério Farias-UFJF

Rio de Janeiro, RJ – Brasil 2007

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Orientadores: Profo. Absalom Lima Filgueira Profª. Tullia Cuzzi

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Aslanian, Flávia Maria Nonato Pretti

Avaliação Histológica e Imuno-histoquímica do Infiltrado Celular em Pele Perilesional e Não-Lesional do Vitiligo Ativo Antes e Após Puvaterapia/ Flávia Maria Nonato Pretti Aslanian – Rio de Janeiro: UFRJ / Faculdade de Medicina, 2007. 172p. il.

Orientadores: Absalom Filgueira; Tullia Cuzzi.

Tese (Doutorado) – Universidade Federal do Rio de Janeiro, Faculdade de Medicina, 2007.

1. Vitiligo. 2.Auto-imunidade. 3.Linfócitos. 4.PUVA. 5. Dermatologia – Teses. I. Filgueira, Absalom .. II. Universidade Federal do Rio de Janeiro, Faculdade de Medicina. III. Título.

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DEDICATÓRIA

Aos meus amores, fonte de vida e inspiração: meu filho Rafael, meu marido Victor e meus pais, José Luiz e Denise.

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AGRADECIMENTOS

Ao Curso de Pós-graduação em Dermatologia da Universidade Federal do Rio de Janeiro-UFRJ, que viabilizou a realização desta tese;

À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), pelo apoio financeiro à tese, concedendo bolsa de estudos;

Ao Coordenador do curso de Pós-graduação em Dermatologia e orientador desta tese Prof. Absalom Lima Filgueira, Prof. Titular de Dermatologia da UFRJ, pelo apoio incondicional em todos os momentos da tese, pela confiança depositada em mim, pela assistência experiente e motivadora, meu reconhecimento e admiração especiais;

À Prof.Tullia Cuzzi, orientadora desta tese, Prof. Adjunta de Dermatopatologia da UFRJ, pela amizade e consideração, pela parceria e ajuda prática e experiente em todas as análises, fundamentais na solução dos problemas, meu carinho e admiração especiais;

Ao Prof.Rogério Farias, Vice-diretor e Prof. Adjunto do Departamento de Morfologia da Universidade Federal de Juiz de Fora, membro da banca examinadora, pela imensa ajuda nas análises imuno-histoquímicas, pela amizade, suporte e incentivo criativo durante toda a tese;

À Prof. Márcia Ramos-e-Silva, Chefe do Serviço de Dermatologia do Hospital Universitário Clementino Fraga Filho (HUCFF)/UFRJ, membro da banca examinadora, pelo apoio fundamental ao meu contato profissional nos Emirados Árabes Unidos e por toda a consideração;

Aos membros da banca examinadora Prof. José Marcos Telles da Cunha, Prof. Maria Kátia Gomes, e Prof.Paula Dadalti, pela disponibilidade e ajuda na pré-defesa, momento crucial para o aperfeiçoamento do trabalho;

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A toda a equipe do laboratório Anticorpos, em especial à Ivana, pelo carinho e ajuda experiente e valiosa nos testes imuno-histoquímicos da tese;

À Rosângela Noé, Estatística da Comissão de Investigação Científica do HUCFF/UFRJ, pela sua assistência importante nas análises estatísticas da tese;

Ao Prof.Ibrahim Galadari, Prof.Titular e Chefe do Serviço de Dermatologia da Universidade dos Emirados Árabes Unidos, pela co-orientação da tese por quase 2 anos, pela oportunidade de aprendizado na sua clínica particular, e pela amizade;

Ao Prof. Pranab Das, Prof. aposentado do Departamento de Patologia da Universidade de Amsterdã, e Coordenador do Grupo Internacional de Desordens Pigmentares, pela colaboração preciosa e experiente nos artigos científicos da tese;

À amiga Daniela Antelo, pela amizade e ajuda preciosa na coleta de biopsias e acompanhamento dos pacientes, fundamentais para o trabalho; agradeço também às Dras. Alba Palermo e Sandra Durães, o carinho e a ajuda nas biopsias;

À auxiliar de enfermagem Rosângela, do Setor de Fotodermatologia do HUCFF/UFRJ, pela amizade e carinho, pela dedicação no atendimento dos pacientes e ajuda valiosa à tese;

À Gilsara, secretária da Pós-Graduação em Dermatologia do HUCFF/UFRJ, pela ajuda e atenção, pela amizade singela;

Aos pacientes e voluntários, pelo desprendimento, confiança e participação ímpar durante a pesquisa, ajudando a aprimorar o conhecimento científico e a buscar benefícios para a saúde das pessoas.

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A Deus, agradeço sobretudo, pela companhia na jornada, sem a qual não haveria o amor, a luz e a persistência necessárias à realização do trabalho;

Ao meu marido Victor, agradeço pelo amor fiel e companheiro, pelo suporte afetivo, intelectual e operacional, que me permitiram resolver as dificuldades que surgiram e prosseguir firme para a realização dos meus objetivos de vida, da família e do trabalho;

Ao meu filho Rafael, pelo sorriso alegre que ilumina tudo, pelo profundo amor partilhado, pelo olhar puro, pela paciência de esperar tantos momentos de estudo;

Aos meus pais Denise e José Luiz, pelo seu amor e suporte incondicional em todos os momentos, nas mudanças, nas incertezas, pela honra de ser sua filha;

Aos meus avós Petrônio e Dolores, padrinhos, eternos amigos, doces, companheiros e motivadores;

Aos meus sogros Layra e Ruben, pela amizade e carinho constantes, pela extrema consideração e atenção comigo;

Ao meu irmão Júnior e às cunhadas Elisa e Tatiana, pelo companheirismo e afeto acolhedores, dando força às realizações;

Aos amigos queridos, pelas experiências partilhadas, pelo carinho e apoio;

À Prof. Rosalind Norden, do Instituto Berlitz, pela doce amizade, motivação e importante suporte na adaptação aos Emirados Árabes, e pela revisão dos artigos científicos da tese;

E a todos os que colaboraram de alguma forma para a concretização deste trabalho.

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“Vitiligo é pior do que diabetes. Eu não conheço nenhum médico que concorde com essa avaliação… Mas eu sou um paciente que convive com ambas as condições e eu não posso compará-las. Eu sei em algum momento no futuro eu poderia morrer das complicações físicas do diabetes tipo 1. Mas em minha experiência, a profunda dor psicológica do vitiligo é uma força a cada dia mais destrutiva em minha vida..”

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RESUMO

Evidências como a associação com condições auto-imunes, auto-anticorpos circulantes, e presença de linfócitos T ativados melanócito-específicos nas lesões sugerem que vitiligo seja uma doença auto-imune. Possivelmente uma agressão imune T-mediada leva à despigmentação. Modificações do infiltrado celular cutâneo, como aquelas causadas pela puvaterapia (PUVA), induzem repigmentação.

Objetivos: Caracterizar histológica e imunofenotipicamente o infiltrado celular na pele perilesional (borda ativa) e não-lesional de pacientes com vitiligo ativo generalizado (não-segmentar), identificando achados inflamatórios e pigmentares, número de linfócitos e células de Langerhans, e sua expressão para o antígeno cutâneo leucocitário (CLA), antes e após PUVA.

Metodologia: Ensaio clínico. Avaliação histológica e imuno-histoquímica do infiltrado celular em borda ativa e pele não-lesional de 22 pacientes com vitiligo, antes e após 30 sessões de PUVA, comparando-os com pele normal de 10 controles saudáveis.

Resultados: Casos de doenças auto-imunes associadas foram observados nos pacientes e nos seus parentes, principalmente o próprio vitiligo, diabetes mellitus e tireoidite auto-imune. A histologia mostrou: infiltração linfocítica epidérmica em alguns casos e redução da pigmentação melânica basal(PMB) em 100% das lesões; diminuição da PMB na pele não-lesional em 50% dos casos. A imuno-histoquímica evidenciou: número reduzido de células CD1a+ e aumento do número de linfócitos T CD8+ na borda e na pele não-lesional dos pacientes. Infiltração linfocítica intraepidérmica ocorreu apenas nas lesões. A PUVA reduziu o infiltrado de células CD1a+, T CD4+, CD8+ e CD3+, e CLA+ em toda a pele dos pacientes; entretanto houve persistência de células CLA+ nas lesões após tratamento.

Conclusões: Vitiligo se apresenta com alterações histológicas e imuno-histoquímicas não só na pele perilesional, mas também na pele clinicamente pigmentada dos pacientes. Há freqüente redução da PMB, aumento do número de linfócitos T CD8+ e reduzido número de células CD1a+ na pele perilesional e também na pele não-lesional. A principal diferença entre estes 2 sítios é a presença de linfócitos T CD8+ intraepidérmicos apenas nas lesões. Isto dá suporte adicional à hipótese de que células T CD8+ melanócito-específicas têm um papel relevante na destruição de melanócitos, e reforça uma etiopatogenia auto-imune para o vitiligo. A PUVA promove marcante diminuição do infiltrado celular em toda a pele, correlacionada com repigmentação, entretanto, a presença significativa de células CLA+ nas lesões após o tratamento denota persistência de atividade imunológica após número pequeno (20-30) de sessões.

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ABSTRACT

The evidence for vitiligo being an autoimmune disease is supported by its close association with other autoimmune conditions, circulating auto-antibodies and activated melanocyte-specific T lymphocytes in the lesions. Possibly a T-mediated immune aggression causes depigmentation. Modifications in the cutaneous cellular infiltrate, such as those caused by puvatherapy (PUVA), induce repigmentation.

Objectives: To characterize histologically and immunofenotipically the cellular infiltrate in the perilesional(active border) and non-lesional skin of patients with active generalized (non-segmental) vitiligo, identifying inflammatory and pigmentary findings, the number of lymphocytes, Langerhans cells, and their expression for the cutaneous lymphocyte-associated antigen (CLA), before and after PUVA.

Methodology: Clinical assay. Histological and immunohistochemical evaluation of the cellular infiltrate in both, active border and non-lesional skin of 22 vitiligo patients, before and after 30 PUVA-sessions, compared to 10 healthy controls.

Results: Cases of autoimmune diseases were observed in vitiligo patients and in their relatives, mainly the proper vitiligo, diabetes mellitus and autoimmune thyroiditis. The histology showed: intraepidermal lymphocytes in some cases; reduction of the epidermal basal pigmentation in 100% of the lesions; reduced epidermal basal pigmentation in 50% of the non-lesional skin. The immunohistochemistry revealed: reduction of CD1a+ cells and increase of T CD8+ lymphocytes in both, perilesional and non-lesional skin. Intraepidermal infiltration of lymphocytes occurred only in the lesions. PUVA reduced the infiltrate of CD1a+, T CD4+, CD8+ and CD3+ lymphocytes and CLA+ cells in the total area of skin, however with persistent CLA+ cells in the lesions.

Conclusions: Vitiligo presents itself with histological and immunohistochemical alterations not only in the perilesional skin, but also in the normally-pigmented skin of the patients. A reduced epidermal basal pigmentation, increased number of T CD8+ lymphocytes and reduced number of CD1a+ cells are observed in both, perilesional and non-lesional skin. The main difference between these 2 sites is the presence of intraepidermal T CD8+ lymphocytes only in the lesions. It adds support that some melanocyte-specific CD8+ T cells play a pivotal role in the destruction of melanocytes and strengthen an autoimmune etiopathology for vitiligo. PUVA markedly diminishes the cellular infiltrate in the total area of skin, correlated with repigmentation, however, the significant presence of CLA+ cells in the lesions after the treatment denotes persistent immunological activity after small number (20-30) of sessions.

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SUMÁRIO 1.INTRODUÇÃO ...22 2.OBJETIVOS...25 2.1. GERAL: ...25 2.2. ESPECÍFICOS:...25 3.FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA ...26 3.1. VITILIGO...26

3.1.1. Sua origem e épocas antigas ...26

3.1.2. Epidemiologia ...27

3.1.3. Fatores precipitantes ...28

3.1.4. Características Clínicas ...28

3.1.5. Achados Histopatológicos ...31

3.1.6. Teorias Etiopatogênicas ...33

3.2. O SISTEMA IMUNE CUTÂNEO NORMAL E NO VITILIGO ...50

3.2.1. Células T na Pele Sadia ...50

3.2.2. O Patrulhamento da Pele: Linfócitos T e expressão do CLA...51

3.2.3. CLA e doenças cutâneas...53

3.2.4. O Papel imune dos melanócitos ...54

3.3. PUVA NO VITILIGO...57

3.3.1. Conceito ...57

3.3.2. Histórico breve...57

3.3.3. Mecanismos de Ação ...57

3.3.4. PUVA e efeito sistêmico ...62

3.3.5. Efeitos da radiação ultravioleta no sistema imune cutâneo ...63

3.3.6. Resposta ao tratamento com PUVA ...64

3.3.7. PUVA e risco potencial a longo prazo ...64

3.4. OUTROS TRATAMENTOS ...66

3.4.1. PUVA Tópica ...66

3.4.2. UVB-banda estreita (narrow band) ...66

3.4.3. Corticoterapia tópica...66

3.4.4. Corticoterapia sistêmica ...67

(14)

3.4.6. Novos Imunomoduladores...68 3.4.7. Laser excimer 308-nm ...68 3.4.8. Despigmentantes...69 3.4.9. Microenxertos ...69 3.4.10. Fenilalanina...69 3.4.11. Pseudocatalase ...70

3.4.12. Vitamina B12 e ácido fólico oral...70

3.4.13. Melagenina ...70 3.4.14. Coadjuvantes ...70 4.MATERIAL E MÉTODOS ...72 4.1. DESENHO DO ESTUDO ...72 4.2. PARTICIPANTES ...72 4.2.1. Casuística...72 4.2.2. Critérios de Inclusão ...73 4.2.3. Critérios de Exclusão...73

4.2.4. Critérios de Inclusão dos Controles ...73

4.2.5. Critérios de Exclusão dos Controles...74

4.3. METODOLOGIA...74

4.3.1. Entrevista e exame clínico...74

4.3.2. Exame oftalmológico ...74

4.3.3. Documentação fotográfica...75

4.3.4. Biopsias de pele e avaliação histológica ...75

4.3.5. Avaliação imuno-histoquímica ...76

4.3.6. Tratamento ...78

4.3.7. Metodologia estatística ...80

5.RESULTADOS...81

5.1. CARACTERIZAÇÃO DA POPULAÇÃO ESTUDADA ...81

5.2. CARACTERIZAÇÃO DA POPULAÇÃO CONTROLE...84

5.3. ANÁLISE HISTOLÓGICA COMPARATIVA DA PELE PERILESIONAL E NÃO-LESIONAL DOS PACIENTES (PRÉ-PUVA) COM A PELE DE CONTROLES...84 5.4. ANÁLISE IMUNO-HISTOQUÍMICA DA PELE PERILESIONAL E

NÃO-LESIONAL DOS PACIENTES COM VITILIGO- ANTES DO TRATAMENTO88 5.5. ANÁLISE COMPARATIVA DOS ACHADOS IMUNO-HISTOQUÍMICOS DA

(15)

PELE PERILESIONAL E NÃO-LESIONAL DOS PACIENTES VERSUS

CONTROLES (PRÉ-TRATAMENTO)...95

5.6. CARACTERIZAÇÃO DO TRATAMENTO DOS PACIENTES COM PUVA .104 5.7. ILUSTRAÇÃO DE CASOS ...106

5.8. ANÁLISE COMPARATIVA DOS ACHADOS IMUNO-HISTOQUÍMICOS DA PELE PERILESIONAL E NÃO-LESIONAL DOS PACIENTES, ANTES E APÓS PUVA...108

5.8.1Ilustrações do efeito PUVA sobre o infiltrado cutâneo ...114

5.9. ANÁLISE COMPARATIVA DOS ACHADOS IMUNO-HISTOQUÍMICOS PÓS-PUVA NA PELE PERILESIONAL E NÃO-LESIONAL DOS PACIENTES COM VITILIGO VERSUS CONTROLES NÃO-TRATADOS ...118

6.DISCUSSÃO ...125 7.CONCLUSÕES ...137 8.SUGESTÕES ...138 REFERÊNCIAS...139 ANEXO 1...154 ANEXO 2...156 ANEXO 3...159 ANEXO 4...160 ANEXO 5...161 ANEXO 6...162 ANEXO 7...171

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LISTA DE ILUSTRAÇÕES

LISTA DE TABELAS

Tabela 1.Efeitos dos psoralenos fotoativados no sistema imune cutâneo... 60

Tabela 2. Principais efeitos RUV-mediados nos constituintes do sistema imune cutâneo... 63

Tabela 3.Descrição dos anticorpos primários utilizados na Imuno-histoquímica... 77

Tabela 4. Dose UVA utilizada no Setor de Fotodermatologia-HUCFF, de acordo com o fototipo do paciente... 79

Tabela 5.Análise comparativa da contagem de células CD1a+ na Pele PL e NL do vitiligo. ... 162

Tabela 6.Análise comparativa da contagem de células CD8+ na Pele PL e NL do vitiligo. ... 162

Tabela 9.Análise comparativa da contagem de células CLA+ na Pele PL e NL do vitiligo. ... 163

Tabela 10.Análise do CD1a segundo o grupo- Pele PL... 163

Tabela 11.Análise do CD1a segundo o grupo- Pele NL ... 163

Tabela 12.Análise do CD8 segundo o grupo- Pele PL... 164

Tabela 13.Análise do CD8 segundo o grupo- Pele NL... 164

Tabela 14.Análise do CD4 segundo o grupo- Pele PL... 164

Tabela 16. Análise do CD3 segundo o grupo- Pele PL... 164

Tabela 18. Análise do CLA segundo o grupo- Pele PL ... 165

Tabela 19. Análise do CLA segundo o grupo- Pele NL... 165

Tabela 20.Contagem de células CD1a+ na Pele PL pré e pós-PUVA ... 165

Tabela 21.Contagem de células CD1a+ na Pele NL pré e pós-PUVA ... 166

Tabela 22.Contagem de células CD8+ na Pele PL pré e pós-PUVA... 166

(17)

Tabela 25.Contagem de células CD4+ na Pele NL pré e pós-PUVA ... 167

Tabela 27.Contagem de células CD3+ na Pele NL pré e pós-PUVA ... 167

Tabela 28.Contagem de células CLA+ na Pele PL pré e pós-PUVA... 167

Tabela 29.Contagem de células CLA+ na Pele NL pré e pós-PUVA... 168

Tabela 30.Contagem de células CD1a+ na Pele PL vs controles... 168

Tabela 31.Contagem de células CD1a+ na Pele NL vs controles... 168

Tabela 32.Contagem de células CD8+ na Pele PL vs controles ... 168

Tabela 33.Contagem de células CD8+ na Pele NL vs controles... 168

Tabela 38.Contagem de células CLA+ na Pele PL vs controles ... 169

Tabela 39.Contagem de células CLA+ na Pele NL vs controles ... 170

LISTA DE GRÁFICOS Gráfico 1.Análise comparativa da contagem de células CD1a+ na pele perilesional e não-lesional dos pacientes com vitiligo... 88

Gráfico 2.Análise comparativa da contagem de células CD8+ na pele perilesional e não-lesional dos pacientes com vitiligo ... 89

Gráfico 5. Análise comparativa da contagem de células CLA+ na pele perilesional e não-lesional dos pacientes com vitiligo ... 90

Gráfico 6. Análise comparativa da contagem de células CD1a+ na pele perilesional de pacientes com vitiligo versus pele de controles ... 96

Gráfico 7. Análise comparativa da contagem de células CD1a+ na pele não-lesional de pacientes com vitiligo versus pele de controles ... 96 Gráfico 8. Análise comparativa da contagem de células CD8+ na pele perilesional

(18)

de pacientes com vitiligo versus pele de controles ... 97 Gráfico 9. Análise comparativa da contagem de células CD8+ na pele não-lesional

de pacientes com vitiligo versus pele de controles ... 97 Gráfico 10. Análise comparativa da contagem de células CD4+ na pele perilesional

de pacientes com vitiligo versus pele de controles ... 98 Gráfico 12. Análise comparativa da contagem de células CD3+ na pele perilesional

de pacientes com vitiligo versus pele de controles ... 99 Gráfico 14. Análise comparativa da contagem de células CLA+ na pele perilesional

de pacientes com vitiligo versus pele de controles ... 100 Gráfico 15. Análise comparativa da contagem de células CLA+ na pele não-lesional

de pacientes com vitiligo versus pele de controles ... 100 Gráfico 16. Distribuição das lesões dos pacientes e casos de repigmentação com a

terapia PUVA em cada diferente localização ... 105 Gráfico 17. Contagem de células CD1a+ na pele perilesional de pacientes com

vitiligo antes e após PUVA ... 109 Gráfico 18. Contagem de células CD1a+ na pele não-lesional de pacientes com

vitiligo antes e após PUVA ... 109 Gráfico 19. Contagem de células CD8+ na pele perilesional de pacientes com vitiligo

antes e após PUVA ... 110 Gráfico 20. Contagem de células CD8+ na pele não-lesional de pacientes com

vitiligo antes e após PUVA ... 112 Gráfico 25. Contagem de células CLA+ na pele perilesional de pacientes com vitiligo

(19)

antes e após PUVA ... 113 Gráfico 26. Contagem de células CLA+ na pele não-lesional de pacientes com vitiligo

antes e após PUVA ... 113 Gráfico 27. Contagem pós-PUVA do número de células CD1a+ na pele perilesional

dos pacientes com vitiligo versus pele de controles não-tratados... 119 Gráfico 28. Contagem pós-PUVA do número de células CD1a+ na pele não-lesional

dos pacientes com vitiligo versus pele de controles não-tratados... 119 Gráfico 29. Contagem pós-PUVA do número de células CD8+ na pele perilesional

dos pacientes com vitiligo versus pele de controles não-tratados... 120 Gráfico 30. Contagem pós-PUVA do número de células CD8+ na pele não-lesional

dos pacientes com vitiligo versus pele de controles não-tratados... 122 Gráfico 35. Contagem pós-PUVA do número de células CLA+ na pele perilesional

dos pacientes com vitiligo versus pele de controles não-tratados... 123 Gráfico 36. Contagem pós-PUVA do número de células CLA+ na pele não-lesional

(20)

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Representação esquemática do melanócito na camada basal da epiderme.

... 56

Figura 2. Adutos monofuncionais ou bi-funcionais (crosslinks) entre o psoraleno e a base pirimidínica de DNA ... 58

Figura 3. Distribuição dos pacientes com vitiligo quanto à faixa etária de aparecimento da doença ... 81

Figura 4. Distribuição dos pacientes quanto ao tempo de evolução da doença ... 81

Figura 5. Biopsias de pele PL (A-B) e NL (C-F) no vitiligo ativo. ... 87

Figura 6. Células CD1a+ positivas bem marcadas na epiderme perilesional de pacientes com vitiligo ativo... 91

Figura 7. Pele perilesional com células CLA+ na epiderme e na derme superior constituindo um infiltrado inflamatório exuberante (100x e 400X)... 92

Figura 8. Pele perilesional(A) e não-lesional (B) do mesmo paciente, mostrando infiltrado de células CLA+ na epiderme e derme superior (100X)... 93

Figura 9. Pele perilesional (A) e não-lesional (B) com células CLA+ (400X) ... 94

Figura 10. Presença de células T CD8+ intraepiteliais na borda “ativa” de lesão de vitiligo ... 102

Figura 11. Pele perilesional com células CLA+ intraepiteliais na topografia de melanócitos na camada basal da epiderme... 103

Figura 12. Padrão de repigmentação folicular em resposta à PUVA... 106

Figura 13. Padrão de repigmentação folicular na face em resposta à PUVA. ... 106

Figura 14. Pré e pós-PUVA com bom resultado... 107

Figura 15. Pré e pós-PUVA com resultado satisfatório ... 107

Figura 16. Células CD1a+ na pele perilesional pré(A) e pós-PUVA(B)... 115

Figura 17. Pele perilesional antes (A) e após (B) fototerapia, com redução importante do infiltrado inflamatório em geral e do número de células CLA+ (100X) ... 116

Figura 18. Pele não-lesional antes (A) e após (B) fototerapia, com redução importante do infiltrado inflamatório em geral e do número de células CLA+ (100X) ... 117

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LISTA DE QUADROS

Quadro 1. Características clínico-laboratoriais dos 22 pacientes com vitiligo acompanhados no HUCFF/UFRJ ... 83 Quadro 2. Características dos indivíduos do grupo controle... 84 Quadro 3. Caracterização da resposta dos pacientes à PUVA ... 104

LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS

8-MOP 8-metoxipsoraleno Acs anticorpos

Ag antígeno

Alfa-MSH hormônio estimulador de melanócitos AntiTPO anticorpos antitireoperoxidase

APCs células apresentadoras de antígeno APO-1 receptor apoptótico celular

BA borda ativa (de lesão)

Ca cálcio

CAT catalase

CD grupo de diferenciação (clusters of differentiation) CL células de Langerhans

CLA antígeno cutâneo linfocitário CMV citomegalovírus

DHA dihidroxiacetona DM diabetes mellitus

DPVS dermatite perivascular superficial leve E-selectina selectina endotelial

ET-1 endotelina-1 FasL ligante de Fas

FM coloração pelo Fontana-Masson FucTVII alfa-1,3- fucosiltransferase VII

GM-CSF fator estimulador de colônia de granulócitos e monócitos H2O2 peróxido de hidrogênio

HE coloração pela hematoxilina-eosina HIV vírus da imunodeficiência humana HLA antígeno leucocitário humano ICAM-1 molécula de adesão intercelular 1 IL interleucina

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LFA-1 alfa-1-beta 2 integrina ou antígeno associado à função linfocitária-1 MAO-A monoamino-oxidase A

MHC complexo principal de histocompatibilidade

NFAT fator nuclear de células T ativadas ou nuclear factor of activated T cells

PCR reação em cadeia de polimerase Pele PL pele perilesional

Pele NL pele não-lesional

PMB pigmentação melânica basal PSGL-1 glicoproteína ligante de p-selectina PUVA puvaterapia

RR risco relativo

RUVA radiação ultravioleta A

SIDA síndrome da imunodeficiência adquirida TMP Trimetilpsoraleno

TNF fator de necrose tumoral

TRP-1 proteína relacionada a tirosinase-1 TRP-2 proteína relacionada a tirosinase-2

TUNEL terminal deoxynucleotide transferase-mediated dUTP-biotin nick-end labeling

UV Ultravioleta UVA ultravioleta A UVB ultravioleta B

VAMA antígenos dos melanócitos associados ao vitiligo VCAM-1 molécula de adesão célulo-vascular-1

VLA-4 alfa 4-beta 1 integrina ou antígeno de expressão muito tardia (very late-activation antigen)

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1. INTRODUÇÃO

Vitiligo se caracteriza pelo desenvolvimento de máculas brancas, como resultado da perda de melanócitos. Seu curso natural é imprevisível, mas a despigmentação freqüentemente progride em áreas expostas da pele, principalmente na face, alterando a aparência do indivíduo consideravelmente (NJOO & WESTERHOF, 2001).

A doença é geralmente abordada como um problema estético, mas na verdade tem repercussões na qualidade de vida dos pacientes, que em muitos casos melhora paralelamente com o grau de repigmentação obtida com o tratamento (NJOO e cols., 2000). Além disto, embora existam várias hipóteses para a sua etiologia, como a neural, a auto-citotóxica e a imunológica (KOVACS, 1998), crescentes evidências sugerem que vitiligo seja mesmo uma doença auto-imune. Sua associação com condições auto-imunes (ALKHATEEB e cols., 2003; LABERGE e cols., 2005), auto-anticorpos antimelanócitos e outros, órgão-específicos (FARROKHI e cols., 2005), e a presença de linfócitos T ativados melanócito-específicos nas lesões reforçam esta hipótese. Adicionalmente, fenômenos imunogenéticos parecem se correlacionar com a duração do vitilligo (ONGENAE e cols., 2003). Ou seja, quanto maior seu tempo de evolução, maior a probabilidade dos pacientes desenvolverem subseqüentemente outra doença auto-imune clínica ou subclínica associada. Isto justifica o seguimento e a investigação das principais condições que se associam ao vitiligo nestes pacientes (BETTERLE e cols., 1985 apud ONGENAE e cols., 2003).

Estudos mostram a participação da imunidade celular no vitiligo tanto localmente na pele afetada, quanto no sangue periférico (ONGENAE e cols., 2003). Infiltrados de linfócitos T CD8-CLA+ intra-epidérmicos têm sido observados em áreas despigmentadas e perilesionais, particularmente em regiões justapostas a melanócitos, através de métodos imuno-histoquímicos (AL BADRI e cols., 1993; LE POOLE e cols., 1996; VAN DEN WINJGAARD e cols., 2000a; WANKOWICZ-KALINSKA e cols., 2003). Esta análise do infiltrado inflamatório que “acompanha” a despigmentação tem sugerido uma reação imune mediada por células T (ONGENAE e cols., 2003), e uma possível destruição dos melanócitos pelos linfócitos T citotóxicos (LE POOLE e cols., 2004). Linfócitos T citotóxicos circulantes, específicos

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para melanócitos, também já foram detectados em altas freqüências em pacientes com a doença (OGG e cols., 1998). Adicionalmente, a hipopigmentação da pele em alguns pacientes com melanoma indica um ataque local específico de células T contra melanócitos na etiopatogenia do vitiligo comum (BECKER e cols., 2002; LEE & MODLIN, 2005). A presença de células T expressando o antígeno cutâneo linfocitário (CLA) nas lesões em atividade sugere um recrutamento destas células da circulação periférica para a pele afetada, e sua participação na resposta imune (AL BADRl e cols., 1993; LE POOLE e cols., 1996; HANN e cols., 1992). Provavelmente o sistema imune está envolvido, não via anticorpos citotóxicos, mas por apoptose induzida pela liberação de citocinas como a interleucina-1 e o TNF-alfa, por linfócitos T ativados (HUANG e cols., 2002).

Alguns autores observaram alterações histológicas também na pele clinicamente sã de pacientes com vitiligo, tais como vacuolização da camada basal, infiltrado mononuclear, degeneração de melanócitos, melanófagos dérmicos, queratinócitos vacuolizados e material granular extracelular, através de microscopia óptica e eletrônica (MOELLMANN e cols., 1982; BHAWAN & BHUTANI, 1983; HANN e cols., 1992; MOSHER e cols., 1999a). Curiosamente, um estudo recente (WANKOWICZ-KALINSKA e cols., 2003) mostrou uma infiltração intraepidérmica de células T paralela à perda localizada de melanócitos (“microdespigmentação”), na pele não-lesional no vitiligo. A existência de uma reação auto-imune na pele normalmente pigmentada dos pacientes teria implicações importantes, como por exemplo, insucesso no tratamento cirúrgico com enxertos autólogos de pele “aparentemente normal”, além da possibilidade de lesões novas nos sítios “não-lesionais”. Os achados descritos não foram posteriormente confirmados.

A puvaterapia (PUVA), que é possivelmente um dos tratamentos mais tradicionais do vitiligo (BETHEA e cols., 1999) parece ter como efeito básico a modulação do sistema imune da pele, em doenças mediadas por células T. Ela é implicada, por exemplo, como responsável pela morte de linfócitos e efeitos anti-inflamatórios no linfoma T cutâneo (MATSUMURA & ANANTHAWAMY, 2004; DE RIE & BOS, 2005). Entretanto, sua atividade imunossupressora no microambiente cutâneo no vitiligo, especialmente na fase de repigmentação, ainda não foi amplamente estudada. Não encontramos na literatura estudos mostrando sua ação sobre linfócitos T-CLA+ no vitiligo em atividade, como já visto na psoríase em estudos com radiação ultravioleta B (SIGMUNDSDOTTIR e cols., 2003).

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Novos estudos sobre a reação imune local no vitiligo poderiam esclarecer questões importantes, como: Qual o grau de comprometimento imunológico da pele na doença? A “universalidade” da pele está comprometida? O que difere os sítios lesionais e não-lesionais dos pontos de vista histológico e do “sistema imune cutâneo”? Que efeito PUVA sobre o microambiente cutâneo resulta em repigmentação? Existe um “controle” da doença com o tratamento? As respostas a estes questionamentos talvez permitam avançar no conhecimento da etiopatogênese do vitiligo e do papel funcional das células T neste processo.

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2. OBJETIVOS

2.1. GERAL:

• Caracterizar imunofenotipicamente o infiltrado celular na pele perilesional (borda ativa) e lesional de pacientes com vitiligo não-segmentar, progressivo, comparando os achados nestes 2 segmentos do tegumento entre si, antes e após 20-30 sessões de fototerapia (PUVA), e com controles saudáveis.

2.2. ESPECÍFICOS:

• Avaliar histologicamente achados inflamatórios e concernentes à pigmentação melânica basal na pele perilesional e não-lesional dos pacientes, comparando estes 2 segmentos do tegumento entre si, e com controles.

• Avaliar o infiltrado celular cutâneo por imuno-histoquímica, identificando os grupos de linfócitos T, as células de Langerhans (CL) e a expressão do antígeno cutâneo leucocitário (CLA) na pele dos pacientes, tanto em área lesional quanto não-lesional, comparando estes 2 segmentos do tegumento entre si, e com controles.

• Avaliar os efeitos da PUVA sobre o infiltrado celular cutâneo, especialmente grupos de linfócitos T, CL e a expressão do CLA, na pele perilesional e não-lesional dos pacientes, comparando os achados imuno-histoquímicos pré e pós-tratamento, e com controles saudáveis.

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3. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA

3.1. VITILIGO

3.1.1. Sua origem e épocas antigas

“Vitiligo” é uma palavra derivada do termo em latim “vitium”, que significa defeito ou mancha e o sufixo “igo” (MOSHER e cols., 1999a); ou da palavra em latim “vitelius”, significando “placas brancas de um bezerro” (FITZPATRICK, 1964).

Classicamente é citado em escritos seculares, como a Bíblia Sagrada e o Alcorão (MOSHER e cols., 1999a). Na Bíblia (1993), há referências a manchas brancas na pele como sendo “chagas de lepra”, porém em algumas citações a leucodermia parece se tratar de vitiligo, como: “se a chaga se estendeu por toda a pele do doente...e o sacerdote que o examinar verificar que a lepra cobre toda a pele...Como se tornou completamente branco é puro”; ou: “se o cabelo na mancha branca se tornou branco…” . Outras partes parecem mesmo se referir à hanseníase, como: “no dia em que se perceber nele a carne viva....a carne viva é impura, é a lepra”. As características das doenças parecem se misturar em algumas citações. Estudos da Bíblia original em grego e hebreu mostraram que algumas doenças despigmentantes agrupadas sob o termo “Zora'at”, traduzido como “lepra”, correspondem a vitiligo, e a maioria das outras não é lepra (GOLDMAN e cols., 1966). Uma citação bíblica do livro dos Reis (BÍBLIA, 1993) parece ser uma das primeiras referências históricas à uma base genética do vitiligo: “a lepra de Naamã se pegará a ti e à toda a tua descendência para sempre. E Giezi saiu da presença de Eliseu coberto de um lepra branca como a neve”....(NAIR, 1978).

No livro indiano Atharvaveda (1500 A.C.) são usados os termos “kilas” (“kil” significa branco, e “as”, jogar fora), e “palita” (“pal” significa cinzento, envelhecido) referindo-se a manchas brancas na pele. No Manusmriti (200 A.C.), o código de comportamento de leis da Índia, diz-se que as vítimas do “suitra” (branqueamento difuso) não eram respeitadas na sociedade. Como o estigma social fazia os pacientes esconderem suas lesões brancas em vilas na Índia, a doença foi e é chamada frequentemente de “doença secreta” (KOVACS, 1998).

No livro sagrado muçulmano, o Alcorão (Koran), as palavras “baras” e “bohak” referem-se à doença com manchas brancas, e envolvem forte discriminação dos

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afetados, podendo levar à sua exclusão da vida social e até da própria família.

Portanto, o estigma associado com o vitiligo data de épocas muito antigas, em que era mais confundido com hanseníase e outras desordens despigmentantes, e é ainda muito intenso em algumas culturas, como no mundo islâmico (observação pessoal).

3.1.2. Epidemiologia

Incidência

Vitiligo é uma doença cutânea relativamente comum que ocorre em aproximadamente 0.1-2% da população mundial (ALKHATEEB e cols., 2003), embora sua incidência varie de 0.14 a 8.8% em diferentes populações (MOSHER e cols., 1999a).

Idade

Pode se desenvolver em qualquer idade, mas aproximadamente 50% dos afetados manifestam a doença antes dos 20 anos, e sua incidência tende a diminuir com o aumento da idade (LERNER, 1959; KOVACS, 1998). Seu início já foi detectado desde o nascimento até 97 anos de idade (KORANNE & SACHDEVA, 1988), porém o vitiligo congênito é muito raro (MOSHER e cols., 1999a).

Num estudo sobre o início tardio do vitiligo foi encontrada uma incidência relativa de vitiligo igual a 2.4% num grupo de 2672 pacientes que frequentavam o ambulatório de Dermatologia por um período de 10 anos. Dentre os afetados, 6,8% tinham mais que 50 anos de idade, sendo que a maioria destes (74%) teve início da doença entre 50-60 anos, e uma minoria (5%) acima de 70 anos. Assim, embora o pico da incidência esteja entre 10 e 30 anos, a doença é vista também no idoso, tendendo a ser mais estável, com nenhuma progressão por quase 2 anos de seguimento, na maioria dos pacientes (DOGRA e cols., 2005).

Incidência racial

Todas as raças são afetadas. Entretanto, o vitiligo parece ser observado mais em áreas fotoexpostas e em fototipos de pele mais escuros (MOSHER e cols., 1999a). Um estudo coreano sugere que pessoas racialmente mais pigmentadas têm

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uma probabilidade mais elevada de desenvolver vitiligo e maior incidência do que pessoas com pele clara. A doença tem um impacto social maior nos indivíduos com tons de pele mais escuros (AHN e cols., 2000), porque neles a despigmentação é mais aparente (LE POOLE e cols., 2004).

Incidência segundo o sexo

Ambos os sexos são afetados igualmente (MOSHER e cols., 1999a; LIU e cols., 2005), embora alguns estudos demonstrem prevalência feminina. Isto pode ser atribuído a uma probabilidade maior das mulheres procurarem atenção médica para o problema e sua preocupação com a estética (HOWITZ e cols., 1977; KOVACS, 1998; MOSHER e cols., 1999a).

3.1.3. Fatores precipitantes

Muitos pacientes atribuem o início da sua doença a eventos específicos nas suas vidas, tais como: estresse emocional intenso, queimadura solar, doença debilitante, procedimentos cirúrgicos, gravidez, parto e trauma físico. Um estudo antigo sobre vitiligo no Brasil mostrou que especialmente em áreas localizadas do corpo, “traumatismo” parece ter um papel preponderante. O autor observou casos nos quais o processo acrômico ocorria exclusivamente nos joelhos, cotovelos, dorso de ambos os pés, e margens ulnares das mãos, locais onde o traumatismo é muito freqüente (COSTA, 1947).

Recentemente, Mason e Gawkrodger (2005) relataram que 22% dos seus pacientes com vitiligo identificaram espontaneamente fatores que tinham desencadeado a doença, tais como: gravidez, fricção, queimadura solar, erupção por droga, dermatite por irritantes, arranhões e coçaduras na pele, e cirurgia. No entanto, com exceção do fenômeno de Koebner, não há provas consistentes de que estes fatores sejam causais ou precipitantes de vitiligo (KORANNE & SACHDEVA, 1988; ORTONNE, 2003).

3.1.4. Características Clínicas

Vitiligo é uma desordem cutânea que pode ser congênita ou adquirida, e se caracteriza por máculas branco-leitosas, acrômicas ou hipocrômicas, bem circunscritas, geralmente sem nenhuma alteração na textura da pele (LE POOLE e

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cols., 1993a; MOSHER e cols., 1999a; VÁZQUEZ-MARTINÉZ e cols., 2006). Microscopicamente as lesões são desprovidas de melanócitos identificáveis.

Os sítios iniciais de aparecimento da doença geralmente são a pele em torno dos orifícios do corpo (face: em torno dos olhos, do nariz, da boca, das orelhas), sobre proeminências ósseas (dorso das mãos e dos pés), áreas fotoexpostas, locais de trauma repetido, tais como cotovelos, joelhos e tornozelos, áreas de dobras (axilas e regiões inguinais), ou áreas pigmentadas do corpo (KORANNE & SACHDEVA, 1988). O envolvimento de mucosas não é infreqüente; a região genital, mamilos, lábios e gengiva podem ser envolvidos. A afecção na região periungueal pode ocorrer isoladamente ou associada a lesões em superfícies mucosas (lábios, pênis distal, mamilos), quando é chamada vitiligo de lábios e pontas/extremidades (”lip-tip vitiligo”) (MOSHER e cols., 1999a). Raramente o prurido pode ocorrer, mesmo quando não há nenhuma queimadura solar associada (BLEEHEN & EBLING, 1998). Cabelo acinzentado pode freqüentemente ser observado sobre as máculas de vitiligo, o que se denomina “leucotríquia” (MOSHER e cols., 1999a).

Pode haver apenas uma ou centenas de máculas, que podem ser pequenas ou grandes no tamanho, e em formas diferentes. Geralmente, o vitiligo progride com o tempo, e então as máculas se ampliam e coalescem. Numa grande coorte de pacientes (n=4118) na China, Liu e colaboradores (2005) observaram que cerca de ¾ de seus pacientes apresentaram vitiligo focal inicialmente; entretanto, mais da metade destes casos pioraram e evoluíram para outros tipos clínicos. Quando o vitiligo se torna extenso de modo que pouco pigmento normal permaneça na pele, as ilhotas remanescentes de pigmentação normal têm bordas côncavas, como se o processo fosse ainda evoluir por inteiro. No vitiligo em fase de repigmentação ativa, as margens perdem seu caráter “impressionista” e transformam-se em formas “surrealistas” e novamente convexas, representando focos de melanócitos migrando para dentro da pele afetada pelo vitiligo (MOSHER e cols., 1999a).

De acordo com o padrão característico de distribuição das lesões, o vitiligo é categorizado nos seguintes grupos (KOVACS, 1998):

1) Vitiligo Generalizado (não-segmentar) : é a apresentação mais comum da doença, caracterizada por despigmentação simétrica, bilateral. Os pacientes afetados têm poucas a muitas máculas espalhadas pelo corpo, envolvendo a face, principalmente nas áreas periorificiais, pescoço, tronco, superfícies extensoras ou proeminências

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ósseas das mãos, punhos e pés, orifícios ou superfícies mucosas. Seu típico curso é lento, progredindo ao longo de anos. Ocasionalmente pode levar à total despigmentação. Outras vezes remissão espontânea e repigmentação são observadas.

2) Vitiligo Focal – máculas despigmentadas numa área localizada, que não seguem a distribuição de um dermátomo, e são limitadas em tamanho e número. Cerca de 20% das crianças com vitiligo têm este padrão (MOSHER e cols., 1999a);

3) Vitiligo Acrofacial- despigmentação da região distal dos dedos e de áreas periorificiais, sendo a última num padrão circunferencial (KOVACS, 1998).

Alguns autores incluem as formas focal, acrofacial e acral como entidades separadas, mas sua história natural e resposta ao tratamento são a mesma, tanto como entidades isoladas, como quando são parte do vitiligo generalizado. Portanto, podem ser consideradas como subtipos do vitiligo generalizado (MORELLI, 2000).

4) Vitiligo Segmentar- caracterizado por máculas unilaterais que ocorrem restritas a um dermátomo, um segmento do tegumento, num padrão assimétrico. Não progride para vitiligo generalizado (GAUTHIER e cols., 2003a), mas tende a se espalhar mais rapidamente dentro do segmento (MORELLI, 2000) e ser resistente ao tratamento. Apresenta início mais precoce (LIU e cols., 2005), curso estável, menos associação com doenças auto-imunes, e não é familial. Fenômeno de Koebner não ocorre. A área trigeminal é o sítio mais envolvido. É bem mais comum em crianças (20%) do que em adultos(5%) (MOSHER e cols., 1999a; HALDER e cols., 1987).

5) Vitiligo Universal- É um vitiligo difuso no qual há poucas áreas remanescentes de pigmentação normal da pele. As áreas fotoexpostas são o local inicialmente afetado na maioria dos pacientes. Tem sido associado com a síndrome de endocrinopatia múltipla (MOSHER e cols., 1999a).

Além dos grupos acima descritos, há um tipo especial de vitiligo denominado vitiligo tricrômico, por Fitzpatrick em 1964. Foi chamado anteriormente de “vitiligo gradata” (PINKUS, 1959). A lesão característica tem um centro acrômico, uma zona intermediária de hipocromia, e a pele não-afetada periférica. Resulta em máculas com 3 tons de cor: marrom, “bronzeado” (marrom mais claro) e branco, no mesmo paciente, e podem evoluir a uma mácula de vitiligo típico. Geralmente, o pêlo nas lesões permanece com cor normal, mas nas lesões mais antigas pode ser

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despigmentado. As bordas das máculas podem tornar-se hiperpigmentadas. O fenômeno de Koebner pode ocorrer. Permanece por ser definido se a forma tricrômica é um fenômeno temporário de vitiligo ativo progressivo ou uma hipomelanose que mostra um padrão incomum de progressão (HANN e cols., 2000).

Um outro tipo diferente de vitiligo, chamado vitiligo inflamatório é mais raro e caracterizado por uma borda eritematosa elevada (“angry-red border”), que pode estar presente já no início da doença ou surgir depois, em torno das clássicas máculas despigmentadas do vitiligo (VERMA, 2005). Pode se associar com dermatite atópica (SUGITA e cols., 2006) e ter características histopatológicas incomuns (nas bordas elevadas) como mudanças psoriasiformes, ampliando a confusão sobre a participação dos fenômenos inflamatórios no vitiligo (VERMA, 2005).

3.1.5. Achados Histopatológicos

De acordo com Ackerman e colaboradores (2000), vitiligo é fundamentalmente um processo inflamatório que se inicia com um infiltrado perivascular superficial leve de linfócitos, e com presença de linfócitos também na epiderme, acompanhada de leve espongiose. No começo, a junção dermo-epidérmica está preenchida pelos melanócitos, mas com o tempo eles desaparecem completamente nos locais afetados. Quando eles desaparecem, nenhuma melanina é produzida e a pigmentação melânica basal da epiderme estará ausente nas lesões pela coloração com Fontana-Masson (FM).

Um estudo de microscopia eletrônica revelou diferenças importantes entre as lesões precoces e lesões tardias de vitiligo (GALADARI e cols., 1993). Graus variáveis de degeneração de melanócitos juncionais e queratinócitos na borda das máculas recentes (< 1 ano de evolução) foram observadas. Agentes citotóxicos contra melanossomos levariam a achados degenerativos em todas as células que contém essas estruturas (melanócitos ou queratinócitos). Já nas lesões de vitiligo com duração de 1 a 5 anos houve uma ausência completa de melanócitos e de pigmentação epidérmica. A conclusão do estudo foi que nas lesões antigas a repigmentação pode ocorrer somente através dos reservatórios de melanócitos nos folículos pilosos, por causa da ausência completa de melanócitos nestes casos. Entretanto, em lesões recentes, a repigmentação pode também ocorrer pela

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reativação de melanócitos remanescentes na área. Isto justifica o tratamento do vitiligo em seus estágios precoces do desenvolvimento.

Resultados similares foram demonstrados por um método imuno-histoquímico altamente específico para a detecção dos melanócitos (anticorpo NKI-beteb): na pele afetada, houve ausência de melanócitos ou sua presença ocasional e com sinais de degeneração; já na pele não-lesional do vitiligo, foram encontrados em grande número, sem diferença aparente em relação à pele de controles normais (LE POOLE e cols., 1993a). Outros autores identificaram mudanças histológicas apenas na pele afetada, tais como: alterações inflamatórias em lesões recentes e mudanças degenerativas em máculas de longa duração, além de alterações degenerativas nos nervos e glândulas sudoríparas (GOKHALE & MEHTA, 1983).

Contrariamente, Hann e colaboradores (1992) observaram os seguintes achados importantes na pele não-lesional de pacientes com vitiligo ativo: mudanças degenerativas nos melanócitos, alteração vacuolar da camada basal, infiltração epidérmica e dérmica de linfócitos, e melanófagos na derme superior. Posteriormente foi descrito que a pele clinicamente sã dos pacientes, em biopsias realizadas até 15 cm das lesões de vitiligo, apresenta: queratinócitos vacuolados, material granular extracelular e vacuolização da camada basal da epiderme. Estes achados sugerem que a pele não-lesional, adjacente ou não à pele vitiligóide, mostra alterações histopatológicas características, indicando que a imunidade celular pode estar envolvida na patogênese do vitiligo (MOSHER e cols., 1999a).

De acordo com vários autores, uma infiltração linfocitária epidérmica e/ou dérmica está presente nas máculas progressivas de vitiligo (NORDLUND & LERNER, 1982; AL BADRI e cols., 1993; AHN e cols., 1994; LE POOLE e cols., 1996; VAN DEN WIJNGAARD e cols., 2000a) e no vitiligo inflamatório (HANN e cols., 2000). Recentemente, foi demonstrado que o infiltrado mononuclear epidérmico ocorre em 80% das lesões e áreas marginais de vitiligo, cujo tempo de evolução variou entre 3-12 semanas, sugerindo a infiltração linfocítica epidérmica como o evento imunológico primário no vitiligo (SHARQUIE e cols., 2004).

Vale frisar que os achados no vitiligo não-segmentar são distintos daqueles do vitiligo segmentar, que tem características peculiares. E os achados inflamatórios no vitiligo em atividade divergem daqueles no vitiligo estável. Portanto, atentar para o grupo/forma clínica que se apresenta é a primeira abordagem para uma avaliação acurada das lesões. Como o estudo do infiltrado cutâneo e da imunidade celular no

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vitiligo estão incluídos nos objetivos deste trabalho, serão melhor discutidos a seguir.

3.1.6. Teorias Etiopatogênicas

A etiopatogenia do vitiligo permanece incerta, mas há várias teorias para explicá-la, tais como: teoria auto-imune, genética, autocitotóxica, neural, além da teoria infecciosa, do estresse oxidativo, da melanocitorragia, quebra da tolerância, e “teoria convergente”, dentre outras.

Há fortes evidências para uma causa auto-imune para o vitiligo, embora a doença seja heterogênea, e partes das teorias pareçam estar corretas em determinados subgrupos de pacientes (NORRIS e cols., 1994 apud Morelli, 2000).

Teoria Auto-imune

Esta teoria é baseada na associação freqüente que existe entre vitiligo e fenômenos auto-imunes (CASTANET & ORTONNE, 1997; ORTONNE, 2003). Há fatores principais que reforçam essa teoria, e serão melhor explicados a seguir:

1) a detecção de anticorpos (Acs) circulantes antimelanócitos (chamados genericamente “anticorpos do vitiligo”) em pacientes com vitiligo;

2) a associação de vitiligo com outras doenças auto-imunes;

3) a detecção de Acs órgão-específicos em pacientes com vitiligo e seus parentes de primeiro grau;

4) a presença de infiltrado linfocitário na borda de lesões de vitiligo; 5) a associação entre melanoma e surgimento de lesões vitiligo-símile;

6) boa resposta clínica a tratamentos “imunossupressores”, como a PUVA, corticoterapia, e novos imunomoduladores, como o tacrolimus;

7) a associação da doença com alguns marcadores HLA.

Vitiligo e auto-anticorpos

Alguns autores estudaram o envolvimento do componente humoral no vitiligo, devido à sua associação com doenças imunes e detecção de auto-anticorpos, tanto nos pacientes como nos seus parentes próximos (CUNLIFFE e cols., 1968). Naughton e colaboradores (1986) encontraram correlação entre a extensão da despigmentação e a presença/nível de Acs antimelanócitos (método de imunoprecipitação), sendo este significativamente mais alto nos grupos com doença

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mais extensa (n=32). Curiosamente, o único paciente no grupo com despigmentação extensa que não apresentou Acs do vitiligo foi um paciente que apresentava repigmentação espontânea.

Uma correlação entre a incidência e nível de Acs antimelanócitos e a atividade de doença no vitiligo (ensaio imunoenzimático- ELISA) também foi descrita. Acs IgG anticélulas pigmentares estiveram presentes em 80% dos pacientes com vitiligo “ativo”(n=24), mas não foram observados em nenhum dos pacientes com doença inativa ou em indivíduos normais (HARNING e cols., 1991). Outro estudo demonstrou Acs antimelanócitos em 17 casos (31%) de vitiligo (n=55) e ausência no grupo-controle (p<0,0001), além de diminuição significativa dos valores de C3 e C4 em ¼ dos pacientes comparados ao grupo controle, talvez pelo seu consumo durante a reação auto-imune (FARROKHI e cols., 2005). Adicionalmente, foi observada uma marcante destruição de melanócitos na pele normal enxertada em ratos nudes* quando injetados com fração IgG do soro de pacientes com vitiligo, reforçando o papel da imunidade humoral na doença. Tal efeito não ocorreu na pele tratada com IgG de controles (GILHAR e cols., 1995).

Outros achados falam contra o envolvimento da imunidade humoral no desencadeamento do vitiligo. Morgan e colaboradores (1986) relataram ausência de Acs antimelanócitos (imunofluorescência indireta com fixação de complemento) em 26 casos de vitiligo estudados, sendo 17 deles vitiligo generalizado. Além disto, já foi observada uma baixa incidência de Acs do vitiligo em pacientes com melanoma, ainda que as células pigmentadas do melanoma expressem antígenos do vitiligo, sugerindo que a liberação destes antígenos não seja a única causa para o achado de Acs do vitiligo nesta doença acrômica (BYSTRYN & NAUGHTON, 1984). Um significativo percentual (25 a 30%) de pacientes afetados não apresentam Acs antimelanócitos, e tais Acs podem ser encontrados em títulos baixos em pequena percentagem de pacientes sem a doença (CASTANET & ORTONNE, 1997). Além disto, Acs circulantes de pacientes com vitiligo reconhecem determinantes antigênicos em outras células, como os queratinócitos (YU e cols., 1993).

Muitos autores têm mostrado uma freqüência aumentada de outras condições auto-imunes em pacientes com vitiligo e parentes próximos, incluindo Acs órgão- específicos. Morgan e colaboradores (1986) observaram auto-anticorpos circulantes * Ratos nudes são ratos nascidos sem o timo e portanto sem linfócitos T. Tumores humanos freqüentemente crescem nestes ratos. Por razões desconhecidas são desprovidos de pêlo.

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em 34,6% dos pacientes com diferentes subtipos de vitiligo (n=26). Dentre os pacientes com vitiligo generalizado, Acs antitireoidianos (padrão antimicrossomal) e antinucleares foram encontrados em 36% (15,3% do grupo total); e Acs antimúsculo liso e antimitocondriais em 9% (3,8% do grupo total). Ao contrário, nenhum caso de vitiligo segmentar apresentou auto-anticorpos circulantes. Ou seja, essa correlação descrita entre a forma clínica da doença e a presença de auto-anticorpos (75% dos pacientes com vitiligo generalizado) mostra que a forma clínica de vitiligo que é melhor associada com auto-imunidade é o vitiligo generalizado. Mandry e colaboradores (1996) também encontraram uma freqüência significativamente aumentada de Acs antitireoglobulina, antimicrossomal, anticélula parietal e antiadrenal em pacientes com vitiligo quando comparados com controles normais.

A tirosinase tem sido implicada como um auto-antígeno no vitiligo de acordo com diferentes estudos (SONG e cols., 1994; BAHARAV e cols., 1996; KEMP e cols., 1997). Auto-anticorpos IgG antitirosinase têm sido observados em pacientes com vitiligo localizado ou generalizado, e seus títulos são bem maiores na forma generalizada do que nos pacientes com doença localizada ou controles saudáveis (BAHARAV e cols., 1996). Contrariamente, outros autores acreditam que outros auto-antígenos do melanócito que não a tirosinase são alvos importantes da resposta auto-imune no vitiligo. Kemp e colaboradores (1997) encontraram baixa freqüência de auto-anticorpos antitirosinase no soro de poucos pacientes (11%) com vitiligo. Xie e colaboradores (1999) também mostraram que os Acs do vitiligo não estão dirigidos à tirosinase, pois ocorreram com freqüência igual nos pacientes com e sem vitiligo.

As moléculas MART-1 e gp-100 são consideradas os antígenos mais imunogênicos das células melanocíticas, e os linfócitos T que infiltram melanomas são frequentemente mais reativos com esses 2 antígenos (OYARBIDE-VALENCIA e cols., 2006).

Vitiligo e doenças associadas

Uma associação com doenças auto-imunes, principalmente doença tireoidiana (CUNLIFFE e cols., 1968; HEGEDUS e cols., 1994; ZETTINIG e cols., 2003; LABERGE e cols., 2005), tem sido evidenciada em pacientes com vitiligo, incluindo crianças e adolescentes. A tireoidite de Hashimoto foi 2,5 vezes mais

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freqüente nestes grupos etários com vitiligo do que numa população saudável pareada por idade e sexo, e geralmente sucede o início do vitiligo (KAKOUROU e cols., 2005). Os estudos mostram diferentes prevalências de tireoidite auto-imune coexistindo com vitiligo em adultos, tais como: 19% (ALKHATEEB e cols., 2003), 21% (ZETTINIG e cols., 2003) até 34%(MASON & GAWKRODGER, 2005).

Membros afetados de famílias com múltiplos casos de vitiligo apresentam elevadas freqüências de tiroidite auto-imune, artrite reumatóide, psoríase, diabetes mellitus (DM) tipo II, anemia perniciosa e doença de Addison. Isto reflete provavelmente um componente genético de suscetibilidade auto-imune herdado nestas famílias (LABERGE e cols., 2005). O DM insulino-dependente é encontrado em 1-7% dos pacientes com vitiligo (MOSHER e cols., 1999a); a relação inversa também já foi descrita, de modo que 4,8% de todos os pacientes diabéticos apresentavam também vitiligo (ALKHATEEB e cols., 2003).

Embora a associação entre psoríase e vitiligo seja conhecida, sua inter-relação ainda não é bem compreendida. Numa série de 4700 pacientes com psoríase na Índia, avaliados num período superior a 14 anos, foram encontrados 38 pacientes (0,8%) com vitiligo. Naqueles afetados pelas 2 doenças, a psoríase ocorreu nas máculas despigmentadas e na pele normal com freqüência igual, sendo incomum a chamada “co-localização” estrita das duas doenças. Além disto, o início e o curso da psoríase e do vitiligo foram independentes (SANDHU e cols., 2004). Entretanto, há relato da ocorrência de lesões psoriásicas confinadas estritamente às áreas de vitiligo (DHAR e cols., 1998), e de uma possível ligação patogênica entre as duas doenças, explicadas por auto-imunidade, neuropeptídeos comuns, e fenômeno de Koebner (MENTER e cols., 1989; PASIC e cols., 2002). No Brasil, foi observada uma prevalência de 3,06% da associação de vitiligo e psoríase, num estudo retrospectivo de 740 pacientes submetidos à fototerapia (CASTRO, 2005).

Numa coorte de 3742 casos de vitiligo na China, as principais condições significativamente associadas à doença em comparação com a população geral foram: alopecia areata, artrite reumatóide, ictiose, e urticaria crônica. As doenças da tireóide foram mais freqüentes nas mulheres com vitiligo, e não significativas em homens afetados. Nestes, mais casos de diabetes (não especificado) foram identificados, entretanto sem significância estatística. Foi também enfatizado o achado incomum de vitiligo associado com artrite reumatóide, que embora sendo válido para a população da China, pode sugerir um papel para o estresse oxidativo

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nas duas doenças (LIU e cols., 2005).

Além das doenças previamente citadas, elevadas freqüências do próprio vitiligo, lupus eritematoso (LE) sistêmico e provavelmente doença inflamatória intestinal já foram encontradas nos casos de vitiligo generalizado e seus primeiros parentes de primeiro grau (ALKHATEEB e cols., 2003). A associação de LE e vitiligo é muito rara e curiosa. Mesmo se for acidental, o aparecimento de lesões de LE em áreas fotoexpostas de vitiligo pode ser explicada pela fotossensibilidade que é comum às duas doenças. Entretanto, os pontos comuns entre estas afecções quando ocorrem na pele não-exposta à luz ainda não foram explicados. O papel do vitiligo nestes casos excepcionais poderia representar uma desordem mais complexa da junção dermo-epidérmica, afetando mais do que o sistema melanocítico e favorecendo subseqüentemente a ocorrência do LE cutâneo (FORESTIER e cols., 1981).

Outras doenças já foram descritas em associação com vitiligo, tais como: miastenia gravis (LAMARTINE DE ASSIS e cols., 1983); síndrome de Sezary (ALCALAY e cols., 1987); esclerodermia (DERVIS e cols., 2004); líquen plano (RUBISZ-BRZEZINSKA e cols., 1996); líquen plano, líquen escleroso e poroceratose actínica disseminada num mesmo paciente de 70 anos (GOLCHAI & RAMEZANPOUR, 2003); cirrose biliar primária e penfigóide bolhoso (HAMILTON & MCKENZIE, 1978; MARCET e cols., 2002). Adicionalmente, o vitiligo tem sido evidenciado como um componente de poliendocrinopatias auto-imunes. Há um relato de vitiligo, tireoidite crônica, anemia perniciosa, concomitantes com DM tipo I lentamente progressivo, caracterizando a síndrome auto-imune poliglandular tipo III, por exemplo (SUZUKI e cols., 2004).

Vitiligo e alterações celulares cutâneas

Com relação ao infiltrado celular nas lesões ativas de vitiligo, os estudos sobre o assunto inicialmente buscaram esclarecer se havia real destruição de melanócitos nas lesões despigmentadas de vitiligo, ou apenas perda da capacidade dos melanócitos de produzirem melanina. Le Poole e colaboradores (1993a) realizaram uma investigação imuno-histoquímica usando um painel de Acs (um policlonal e 17 monoclonais) direcionados contra melanócitos, incluindo o NKI-beteb, que é o mais específico, para verificar a presença ou não de melanócitos viáveis nas

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lesões, e demonstraram uma ausência de melanócitos na pele lesional de vitiligo, comprovando a destruição destas células no percurso etiopatogênico da doença. Nas lesões estacionárias, na qual o processo de destruição já estaria concluído, nenhum remanescente celular foi achado. Uma vez definido que os melanócitos estavam “ausentes” das lesões, a repigmentação só poderia ser obtida pela repopulação das áreas lesadas de 2 formas: através da estimulação da proliferação e migração de melanócitos de áreas perilesionais e folículos pilosos, ou pelo transplante autólogo de melanócitos de áreas pigmentadas.

Um estudo de vitiligo tricrômico usando histologia convencional com hematoxilina-eosina (HE) e imuno-histoquímica com proteína S-100 (e CD1a) demonstrou que o número de melanócitos é maior na pele pigmentada perilesional, seguida pela pele marrom clara (intermediária), e depois pela pele lesional propriamente dita, mas que há ao menos alguns melanócitos na lesão despigmentada, embora em menor proporção que na pele normal (HANN e cols., 2000). Este achado foi contrário aos estudos prévios que relataram “ausência” de melanócitos na lesão de vitiligo, confirmada por microscopia eletrônica (HANN e cols., 1992) ou imuno-histoquímica (LE POOLE e cols., 1993a). Os achados descritos no vitiligo tricrômico sugerem uma progressão mais lenta das lesões do que no vitiligo típico, e esta poderia ser a razão pela qual os melanócitos permaneçam ainda nas áreas despigmentadas.

Outros estudos se sucederam com o objetivo de identificar a composição do infiltrado celular na pele do paciente com vitiligo. Al Badri e colaboradores (1993) compararam a pele das margens de lesões de vitiligo com a pele não-lesional destes pacientes e com controles sem doença cutânea. Evidenciaram um número bem maior de linfócitos T CD3+, CD4+, CD8+ e CLA+ na epiderme e na derme da borda afetada, do que na pele não-lesional do vitiligo ou de controles saudáveis. Além disto, as células T CD3+, CD8+ e CLA+ foram mais freqüentes do que as CD4+, mostrando uma desigualdade no número de linfócitos T helper (CD4+) e T citotóxicos (CD8+) nas lesões de vitiligo. Os linfócitos T CLA+ se coraram mais na epiderme do que na derme, e muitos linfócitos expressavam MHC classe II e interferon gama, denotando sua ativação. Estes achados foram consistentes com a hipótese de destruição de melanócitos mediada por linfócitos no vitiligo.

Le Poole e colaboradores (1996) investigaram o infiltrado inflamatório na pele lesional e não-lesional em 3 casos de vitiligo inflamatório, que sabidamente tem

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alterações histológicas mais exuberantes. Suas principais observações imuno-histoquímicas foram: aumento do número de macrófagos CD68+ na pele , aumento da relação CD8/CD4, e aumento da expressão do CLA nas células que infiltram a pele. Além disto, foi o primeiro relato de que os linfócitos T CD8+ se encontram numa posição justaposta aos melanócitos remanescentes no infiltrado, sugerindo o envolvimento específico destas células na reatividade imune local e destruição de melanócitos. Embora estes infiltrados sejam bem mais facilmente caracterizados nos casos de vitiligo inflamatório, estes achados podem ser estendidos aos casos de vitiligo generalizado, que representam a vasta maioria de pacientes com a doença.

Alguns autores confirmaram o envolvimento in situ de linfócitos T CLA/CD8+ e macrófagos na destruição de melanócitos no vitiligo generalizado, através de imuno-histoquímica simples e com dupla marcação (VAN DEN WIJNGAARD e cols, 2000a). Foram encontrados melanócitos degenerados na pele perilesional, e ausência total de melanócitos NKI-beteb positivos nas lesões de vitiligo. Além de estarem em maior número na pele afetada (relação CD4/CD8=0.48), as células T CD8+ estavam justapostas aos melanócitos remanescentes, o que pôde ser comprovado pela dupla marcação com os Acs NKI-beteb/CD8. Embora a percentagem total de linfócitos T CLA+ não estivesse aumentada em relação a controles normais, estes linfócitos foram encontrados agrupados na junção dermo-epidérmica, onde expressaram granzima-B e perforina, que revelam sua imunorreatividade e habilidade para participar na citotoxicidade, exatamente nos locais de interação com melanócitos. Houve também uma redução do número de células de Langerhans na pele lesional em 7 de 10 pacientes com vitiligo progressivo, sendo que alguns deles recebiam PUVA, que leva a uma depleção destas células segundo alguns autores (KAO & YU, 1990; WESTERHOF e cols, 1986).

Mais recentemente foi demonstrada uma secreção predominante de citocinas do tipo 1 a partir de clones de células CD4+ e CD8+ T perilesionais e também não-lesionais de pacientes com vitiligo, com alta produção de IFN-gama e TNF-alfa, sugerindo que o vitiligo é uma doença Th1-mediada. Este estudo de Wankowicz-Kalinska e colaboradores (2003) confirmou que o infiltrado cutâneo presente na pele perilesional do vitiligo em atividade é composto predominantemente de linfócitos T CD8+, em aposição a melanócitos residuais. Ao contrário, no vitiligo estável os infiltrados de células T se encontram mais profundamente na derme, ao invés de

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próximos à junção dermoepidérmica. Os autores descreveram pela primeira vez que o infiltrado de células T pode estar presente também na pele macroscopicamente normal no vitiligo ativo, ocasionando uma “microdespigmentação”. Tal desaparecimento microscópico de melanócitos ocorreria geralmente na presença de alta percentagem de células T CD4+ quando comparados com a pele perilesional.

Lee e Modlin (2005) também detectaram alta freqüência de linfócitos T citotóxicos para antígenos de melanócitos em pacientes com vitiligo, denotando um ataque direto e específico de células T contra melanócitos. A freqüência de clones de células T “melanócito-específicos” (contra o antígeno Melan-A) se correlacionou ainda com a extensão da doença, sendo mais alta naqueles com vitiligo mais difuso, e menor em pacientes com vitiligo estável (pesquisa ex-vivo). Há também uma associação entre altas freqüências de clones de linfócitos T melan-A-específicos expressando o antígeno CLA na sua superfície e vitiligo auto-imune. Ao contrário, em controles assintomáticos, os clones de linfócitos T citotóxicos detectáveis foram todos CLA-negativos (OGG e cols., 1998). Através da expressão do CLA os linfócitos T migram para a pele, onde expressam o perfil de citocinas do tipo 1 e poderiam mediar a apoptose de melanócitos via granzima/perforina (OYARBIDE-VALENCIA e cols, 2006).

Todos estes dados são consistentes com um papel importante para os linfócitos T CLA+ na destruição de melanócitos no vitiligo. Conflitantes são os achados na pele não-lesional do paciente com vitiligo, sendo necessário definir se há ou não acometimento da pele como um todo ou apenas nas áreas lesionais/perilesionais.

Vitiligo e lesões de vitiligo associadas a melanoma

Vitiligo pode também ocorrer em pacientes com melanoma, e a relação entre ambas as doenças tem sido amplamente estudada. A destruição auto-imune de melanócitos ocorreria tanto no vitiligo associado a melanoma, como no vitiligo comum (YEE e cols., 2000). Cui e Bystryn (1995) demonstraram que Acs antimelanócitos presentes em pacientes com melanoma e vitiligo ligam-se a antígenos semelhantes tanto nos melanócitos normais quanto nas células pigmentares malignas, sugerindo que o vitiligo e o leucoderma “vitiligo-símile” associado com melanoma partilham mecanismos fisiopatogênicos auto-imunes