BÀI GIẢNG CÁC PP SẮC KÍ

Chương1. ĐẠI CƯƠNG VỀ SẮC KÍ

I. LỊCH SỬ PHÁT TRIỂN VỀ PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ:

Phương pháp sắc ký được phát triển vào năm 1903 do nhà thực vật hoc người Nga Michael C.Txvet.

Ông thực sự là người đầu tiên có công tìm ra phương pháp, giải quyết vấn đề tách các chất có tính chất

giống nhau theo một cơ chế độc đáo, hoàn toàn khác với phương pháp tách đã từng có trước đây, tuy nhiên

phát hiện này đã bị lãng quên nhiều năm.

Năm 1941, Martin và Synge đã phát triển sắc ký phân bố trên giấy và đưa ra lý thuyết đĩa để giải

thích các quá trình sắc ký, các tác giả đã ứng dụng để tách các ancaloit từ các cây thuốc phục vụ cho chế tạo

dược phẩm. Do có công trong việc phát triển lý thuyết của phương pháp cho nên năm 1952 hai ông được

nhận giải thưởng Nobel về hoá học.

Cũng từ năm 1952 những máy sắc ký mới ra đời tỏ ra có ưu thế do có hiệu quả tách rất cao. Cột mao

quản và các detectơ sau này được cải tiến tăng độ phân giải và độ nhạy của phương pháp người ta có thể

phân tích được các chất có hàm lượng nhỏ cở ppm và ppb. Từ đây phương pháp được phát triển nhanh, ứng

dụng được nhiều trong thực tế.

Về sắc ký lỏng một kỹ thuật mới được phát hiện từ năm 1970 làm tăng hiệu quả tách đó là sắc ký

lỏng hiệu năng cao (high performance lipuid chromatography- HPLC): Chất nhồi cột được cải tiến, máy tính

và thiết bị vào bổ trợ được đưa vào, tăng cường khả năng của phương pháp.

Ngày nay kỹ thuật ghép nối giữa sắc ký và các phương pháp khác được áp dụng. Đó là kỹ thuật ghép

nối giữa sắc ký và khối phổ ( GC-MS, GC-MS) sắc ký và cộng hưởng hạt nhân, sắc ký đa chiều, sắc ký điện

mao quản (CEC)... Phương pháp có độ chính xác và độ nhạy rất cao, phân tích được nhiều đối tượng phức

tạp hơn.

II. CƠ SỞ LÝ THUYẾT

1. ĐỊNH NGHĨA - PHÂN LOẠI

1.1 Định nghĩa:

Sắc ký là quá trình tách dựa trên sự phân bố liên tục các cấu tử chất phân tích trên hai pha: một pha

thường đứng yên có khả năng hấp thụ chất phân tích gọi là pha tĩnh, một pha di chuyển qua pha tĩnh gọi lạ

pha động; do các cấu tử chất phân tích có ái lực khác nhau với pha tĩnh, chúng di chuyển với tốc độ khác

nhau và tách ra khỏi nhau.

1.2 Phân loại các phương pháp tách sắc ký

1.2.1 Phân loại theo hệ pha

Phương pháp đầu tiên được nhiều người quan tâm, đây là phương pháp phân loại đơn giản theo hệ

pha tức là chất phân tích phân bố giữa hai pha là gì?

Sơ đồ phân loại các phương pháp sắc ký

1

hệ

pha

1.2.2 Phân loại theo cơ chế tách

1.2.2.1 Sắc ký hấp thụ:

Sắc khí hấp thụ là phương pháp dựa trên cơ sở phân bố chất phân tích giữa pha tĩnh và pha động nhờ

tương tác phân tử thông qua các trung tâm hấp thụ. Pha tĩnh là các chất rắn hoặc lỏng có diện tích bề mặt

lớn, bền vững về mặt hoá học. Chúng hấp thụ chất phân tích trên bề mặt của chúng ở các mức độ khác nhau

khi cho pha động chứa chất phân tích tiếp xúa với chúng. Tuỳ thuộc lực liên kết giữa pha tĩnh và từng cấu tử

chất phân tích có trong pha động, khi cho pha động đi qua pha tĩnh chúng sẽ di chuyển với tốc độ khác nhau.

1.2.2.2 Sắc ký phân bố lỏng - lỏng

Sự phân biệt giữa sắc ký phân bố lỏng-lỏng và sự phân bố thông thường là ở chỗ sắc ký phân bố lỏng

- lỏng còn được gọi là sắc ký chiết, pha tĩnh là chất lỏng pha động cũng là chất lỏng, sự phân bố chất phân

tích giữa hai pha lỏng giống như quá trình chiết, còn sự phân bố nói chung là sự phân chia chất phân tích

vào hai pha không cần xét tới lỏng hay rắn.

Điểm khác nhau cơ bản giữa sắc ký phân bố lỏng - lỏng và sắc ký hấp phụ là ở chỗ: sắc ký phân bố

lỏng- lỏng có đường đẳng nhiệt tuyến tính ở khoảng nhiệt độ lớn, phương pháp có độ nhạy cao nhưng có

nhược điểm là pha tĩnh không được bền vững, hiện tương trôi mất pha tĩnh làm cho độ lặp lại bị giảm.

1.2.2.3 Sắc ký ion ( trao đổi ion)

Pha tĩnh thường là pha rắn có khả năng trao đổi ion của nó với các chất phân tích trong pha

động.Chất có khả năng trao đổi cation gọi là cationit, còn chất có khả năng trao đổi anion gọi lá anionit. Lực

liên kết chủ yếu giữa chất phân tích và pha tĩnh chủ yếu là liên kết tĩnh điện , phụ thuộc nhiều vào điện tích

của ion chất phân tích, pH của dung dịch và bán kýnh hidrat hoá của các ion chất phân tích. Ví dụ: phản ứng

trao đổi ion giữa cationit acid mạnh và Ca

2+

_{có thể viết như sau:}

2R-SO

3

H + Ca

2+

= (R-SO

3

)Ca + 2H

+

Phản ứng của anionit bazơ mạnh với Cl

-

_:

-1.2.2.4 Sắc ký rây phân tử (sắc ký loại cở)

Pha tĩnh là các chất rắn có diện tích bề mặt lớn, xốp, có những đường đi trong lòng chất rắn, còn gọi

là mao quản có kých thước cở phân tử. Các phân tử chất phân tích có thể thấm vào chất đó ở mức độ khác

nhau tuỳ theo kých thước của chúng. Các chất phân tích có kých thước lớn không thể đi vào sâu vào pha

tĩnh được, sẽ bị rửa giải nhanh còn các phân tử chất phân tích có kých thước nhỏ phân bố sâu vào pha tĩnh sẽ

bị rửa giải chậm. Thứ tự rửa giải là các chất có kich thước nhỏ đi ra sau và ngược lại. Thời gian lưu của các

chất tỷ lệ nghịch với kých thước phân tử của chúng. Tuy nhiên chất phân tích có thể có tương tác khác với

pha tĩnh. Như vậy một phép sắc ký có thể tách theo một hay nhiều cơ chế khác nhau mà chúng ta không xét

ở đây.

1.2.3 Phân loại theo cách hình thành sắc đồ

1.2.3.1 Phân tích tiền lưu

Các cấu tử A, B, C có ái lực với pha tĩnh là A < B< C. Cho hỗn hợp chất phân tích liên tục đi qua

cột, chất phân tích có ái lực với

pha tĩnh thấp

nhất đi trước, tiếp theo là chất

có ái lực yếu

hơn. Tuy nhiên do chúng ta cho

liên tục chất

phân tích vào nên đi sau A là A

+ B và

A+B+C. Chỉ có một phần chất

tinh khiết A

đi trước

1.2.3.2 Phân

tích thế đẩy

Trong sắc ký này, chúng

ta cũng nạp

lượng nhỏ hỗn hợp chất

phân tích A,

B, C vào cột sau đó cho chất

D là chất đẩy

liên tục đi qua cột.

Ái lực hấp thụ là A

<B < C < D.

Do D đẩy C, C lại đẩy B, B

lại đẩy A nên

sắc đồ có dạng::

1.2.3.3 Phân

tích rửa giải:

Đưa một lượng nhỏ

mẫu bao gồm

các chất A, B, C vào cột sau

đó dùng chất E

có ái lực hấp thụ với pha tĩnh yếu nhất để rửa giải liên tục. Cả A, B, C, E đều tan tốt trong pha động . Thứ tự

ái lực hấp thụ là E < A < B < C. Một câu hỏi đặt ra làm sao E có ái lực hấp thụ yếu nhất với pha tĩnh lại có

thể rửa giải A, B, C ? Để trả lời câu hỏi này chúng ta hình dung là sự tranh chấp những trung tâm hoạt đông

ở pha tĩnh không phải chỉ có một cấu tử chất phân tích tương tác với cấu tử chất rửa giải mà ở đây có thể có

nhiều cấu tử rửa giải tham gia (câu tử có thể là ion hoặc phân tử).

C

B

A

Nồng độ

t. V

Hình 1: Sắc đồ phân tích tiền lưu

A

B

A

A

B

_C

Hình 2: Sắc đồ phân tích thế đẩy

(phần đậm là phần hai cấu tử xen kẽ)

D

t, V

Nồng độ

Giả sử có chất tan C(phân tử hoặc ion) đã hấp thụ vào pha tĩnh, để phân bố C trở lại pha động phải

cần tới nhiều cấu tử rửa giải E. Quy luật ưu thế số đông xem ra có tác dụng. Vì vậy khi rửa giải người ta

thường chất rửa giải có nồng độ lớn hơn chất phân tích rất nhiều.

Tóm

lại một

phép sắc ký

nhìn theo

cách phân

loại nào

cũng có thể

liên quan

đến một hay

nhiều cách

phân loại

khác, thí

dụ ở sắc ký

lỏng- rắn

chỉ đơn giản

là pha tĩnh

là chất rắn,

pha động là

chất lỏng

theo cách

phân loại theo liên kết pha nhưng theo cách phân loại theo cơ chế thì lỏng rắn ở đây có thể là hấp phụ,trao

đổi ion. Tuỳ theo pha tĩnh sử dụng, sắc ký lớp mỏng có thể là sắc ký trao đổi ion, hấp phụ, phân bố, rây phân

tử. Ngược lại sắc ký hấp phụ xét về mặt tương tác pha có thể thuộc loại sắc ký - rắn hay lỏng- rắn.

Sắc ký rửa giải có ứng dụn

Quá t

rình tách sắc ký là một chuỗi các phản ứng phức tạp từ lúc nạp mẫu

vào cột tách cho đến khi các chất phân tích trong mẫu lần lượt đi ra khỏi cột. để hiểu các ơphanr ứng xảy ra

trong đó, trước hết ta xem thí nghiệm của Txvet, tiến hành như sau:

Hòa tan các sắc tố thực vật trong êt dầu hỏa, sau đó nạp một lượng nhỏ vào cột đã nhồi bột CaCO

3

.

Tiếp theo, cho liên tục êt dầu hỏa tinh khiết đi qua, sau một thời gian nhất định sắ tố thực vật đã tách thành

các giải riêng biệt. sau này người ta biết được đó là các α-chlorophyl, chlorophyl, α-xantophyl,

β-xantophyl…, chúng là các chất màu nên khi tách chúng tạo thành các dải màu khác nhau nên Ông gọi đó là

“Chromatography”. Theo tiếng Hy Lạp, “Chroma” là ,màu còn “Graphy” là ghi, danh từ đó còn giữ đến

ngày nay.

Khi các chất phân tích được nạp vào pha tĩnh, lúc đầu các cấu tử phân bố ở pha tĩnh một cách bất kỳ

không chọn lọc, chúng có thể phân bố ở những điểm xen kẽ, tuy nhiên pha tĩnh có ái lực liên kết với tùng

cấu tử khác nhau là không giống nhau. Các chất phân tích có ái lực liên kết với pha tĩnh lớn hơn sẽ phân bố

tốt hơn, các chất có ái lực với pha tĩnh yếu hơn sẽ phân bố vào pha tĩnh ít hơn.

Khi cho dung môi tinh khiết dội qua cột, các chất phân tích lại có điều kiện phân bố lại, các chất

được phân bố tốt hơn có thời gian ở pha tĩnh lớn hơn. Khi chất phân tích ở pha tĩnh chúng không di chuyển

còn khi ở pha động chúng di chuyển. Vì vậy các chất phân bố tốt hơn, chúng di chuyển chậm hơn, các chất

phân bố kém hơn có thời gian ở pha tĩnh ít hơn, kết quả là trong quá trình tách sắc ký chúng sẽ di chuyển

nhanh hơn. Nghĩa là sau mỗi lần hấp thụ và giải hấp các chất phân tích có tính chất giống nhau nên có một

sự chênh lệch rất nhỏ về thời gian nằm ở pha tĩnh. Sau mỗi lần hấp thụ và giải hấp các chất phân tích di

chuyển được những quãng đường rất nhỏ khác nhau.

Chiều cao (h)

Diện tích (S)

Thời gian (t)

Hình 3: Sắc đồ phân tích rửa

Tiếp tục chop ha động đi qua cột, chất phân tích tiếp tục di chuyển, sự kkhacs biệt về quãng đường di

chuyển sẽ càng lớn. tất nhiên khi thời gian di chuyển càng lớn, vunhf chất của từng cấu tử càng rộng do yếu

tố khuếch tán dọc theo cột, sau một thời gian nhất định, các chất phân tích đã tách khỏi nhau, đó là quá trình

tách sắc ký.

g nhiều trong lĩnh vực phân tích do hiệu quả tách cao

2. QUÁ TRÌNH TÁCH SẮC KÝ VÀ CÁC LOẠI LỰC LIÊN KẾT TRONG HỆ SẮC KÝ

2.1 Quá trình tách sắc ký

Quá trình tách sắc ký là một chuỗi các phản ứng phức tạp từ lúc nạp mẫu vào cột tách cho đến khi các chất phân tích trong mẫu lần lượt đi ra khỏi cột. để hiểu các ơphanr ứng xảy ra trong đó, trước hết ta xem thí nghiệm của Txvet, tiến hành như sau:

Hòa tan các sắc tố thực vật trong êt dầu hỏa, sau đó nạp một lượng nhỏ vào cột đã nhồi bột CaCO3. Tiếp theo,

cho liên tục êt dầu hỏa tinh khiết đi qua, sau một thời gian nhất định sắ tố thực vật đã tách thành các giải riêng biệt. sau này người ta biết được đó là các α-chlorophyl, β-chlorophyl, α-xantophyl, β-xantophyl…, chúng là các chất màu nên khi tách chúng tạo thành các dải màu khác nhau nên Ông gọi đó là “Chromatography”. Theo tiếng Hy Lạp, “Chroma” là ,màu còn “Graphy” là ghi, danh từ đó còn giữ đến ngày nay.

Khi các chất phân tích được nạp vào pha tĩnh, lúc đầu các cấu tử phân bố ở pha tĩnh một cách bất kỳ không chọn lọc, chúng có thể phân bố ở những điểm xen kẽ, tuy nhiên pha tĩnh có ái lực liên kết với tùng cấu tử khác nhau là không giống nhau. Các chất phân tích có ái lực liên kết với pha tĩnh lớn hơn sẽ phân bố tốt hơn, các chất có ái lực với pha tĩnh yếu hơn sẽ phân bố vào pha tĩnh ít hơn.

Khi cho dung môi tinh khiết dội qua cột, các chất phân tích lại có điều kiện phân bố lại, các chất được phân bố tốt hơn có thời gian ở pha tĩnh lớn hơn. Khi chất phân tích ở pha tĩnh chúng không di chuyển còn khi ở pha động chúng di chuyển. Vì vậy các chất phân bố tốt hơn, chúng di chuyển chậm hơn, các chất phân bố kém hơn có thời gian ở pha tĩnh ít hơn, kết quả là trong quá trình tách sắc ký chúng sẽ di chuyển nhanh hơn. Nghĩa là sau mỗi lần hấp thụ và giải hấp các chất phân tích có tính chất giống nhau nên có một sự chênh lệch rất nhỏ về thời gian nằm ở pha tĩnh. Sau mỗi lần hấp thụ và giải hấp các chất phân tích di chuyển được những quãng đường rất nhỏ khác nhau.

Hình 4 :Quá trình tách A và B trong cột tách sắc ký .

Tiếp tục chop ha động đi qua cột, chất phân tích tiếp tục di chuyển, sự kkhacs biệt về quãng đường di chuyển sẽ càng lớn. tất nhiên khi thời gian di chuyển càng lớn, vunhf chất của từng cấu tử càng rộng do yếu tố khuếch tán dọc theo cột, sau một thời gian nhất định, các chất phân tích đã tách khỏi nhau, đó là quá trình tách sắc ký

2.2 Các loại lực liên kết trong hệ sắc ký

Trong hệ sắc ký có ba thành phân chủ yếu tác quyết định sự tồn tại của hệ, chất phân tích, pha tĩnh,

pha động tạo nên sự phân bố cần thiết, giúp cho sự di chuyển các chất phân tích dọc theo chiều dài cột với

tốc độ khác nhau. Chúng ta thường nói chất phân tích phân bố giữa hai pha, tuy nhiên đây la cân bằng động

chất phân tích luôn thay đổi pha liên kết (trừ một số trường hợp đặc biệt nó chỉ ở một pha trong suôt quá

trình phân tích) vấn đề là tại sao chất phân tích được giữ trong pha tĩnh? Hơn nữa ba thành phần này tương

tác như thế nào với nhau, bằngc lực liên kết nào mà kết quả các chất phân tích lại phân bố vào pha tĩnh ở

mức độ khác nhau? Câu trả là do bản chất các của các thành phân trong hệ sắc ký. Chất phân tích có thể là

ion, phân tử trung hoá hay chất phân cực, đối tượng liên kết của nó cũng có thể là ion, phân tử, chất phân

cực. Như vậy tuy thuộc vào độ lớn của điện tích kich thước phân tử, độ phân cực mà chúng tương tác với

nhau theo các lực liên kết khác nhau. Người ta chia các lực liên kết thành bốn loại:

2.2.1 lực liên kết ion

Trên bề mặt pha tĩnh có các trung tâm hoạt động là ion. Đó là các phần tử có khả năng phân ly tạo

thành các ion, tạo nên trung tâm hoạt động ion chung tham gia liên kết với các ion chất phân tích trong dung

dịch theo lực tương tác tĩnh điện gọi là liên kết ion. Để giữ các anion chất phân tích trong dung dịch pha tĩnh

cần có các trung tâm cation trên bề mặt, và ngược lại để giữ các cation chất phân tích trong dung dịch pha

tĩnh cần có các ctrung tâm anion cũng tương tự, pha động cũng có các trung tâm hoạt động là các ion, chúng

tham gia tương tác với chất phân tích và pha tỉnh. Chúng có khả năng phân li trong dung dịch tạo thành các

cation và anion.

Thí dụ khi rửa giải các ion kim loại trên cột cationit, ta có thể dùng pha động là dung dịch HCl loãng.

Các phương pháp sắc ký thường gặp có sự tham gia của các liên kết ion gọi là sắc ký ion, sắc ký cặp ion.

2.2.2 Lực phân cực

Trong phân tử chất phân tích, chất rửa giải trong pha động cũng như các phân tử trên bề mặt pha tĩnh

có các trung tâm phân cực, chúng có thể là các lưỡng cực điện cố định, cũng có thể là các lưỡng cực điện do

cảm ứng. Các trung tâm phân cực của chất này liên kết với trung tâm phân cực của chất khác bằng lực liên

kết phân cực. Sự phân cực trong các phân tử đôi khi rất nhỏ và sự chênh lệch về độ phân cực cũng rất nhỏ.

Tuy nhiên, sự chênh lệch này là yếu tố quan trọng để có độ bền liên kết khác nhau, đó là điều cần thiết để

phân chia chúng trong các phép tách sắc ký.

Thí dụ: các Cresol (o-, m-,p- cresol) chỉ khác nhau về vị trí nhóm CH

3

- trong phân tử. Chính sự khác

nhau về vị trí này làm cho mật độ electron trong phân tử cresol khác nhau tạo nên một sự khác biệt nhỏ về

độ phân cực, từ đó lực liên kết với pha tĩnh khác nhau. Là nguyên nhân chênh lệch thời gian lưu trong quá

trình sắc ký

2.2.3 Lực Van- de- Van (lực phân tán)

Lực này có bản chất điện, tuy nhiên không hề có cực điện trong mạng lưới phân tử, cũng không liên

quan tới phân tử lưỡng cực hay cố định.

Tương tác phân tán điển hình là mạch hidrocacbon nó là tương tác phân tử .

Thí dụ n-heptan là chất lỏng chứ không phải là chất khí sự tương tác giữa các phân tử n-heptan là lực

phân tán đủ lớn để giữ chất này ở trạng thái lỏng. Để tách các hidrocacbon người ta dùng hidrocacbon khác

làm pha tĩnh.

2.2.4 Lực tương tác đặc biệt

Lực tương tác đặc biệt là lực tương tác tạo thành do các liên kết hydro, liên kết cho nhận mà có.Sự

hình thành liên kết giữ nguyên tử hidro và các nguyên tử có độ âm điện cao như O, N, F... gọi là liên kết

hidro. Khi tham gia liên kết, các electron còn gọi là đám mây electron chuyển dịch sang nguyên tử có độ âm

điện lớn hơn. Như vậy các nguyên tử có độ âm điện cao hơn, liên kết hidro càng bền chặt.

3. MỘT SỐ ĐẠI LƯỢNG DÙNG TRONG SẮC KÝ

3.1 Hệ số phân bố K

D

và cách xác định

Cấu tử A phân bố giửa pha động và tĩnh khi cân bằng được thiết lập

A

s

¬ 





→

A

m (1)

hệ số phân bố được định nghĩa là tỉ số của nồng chất phân tích giữa hai pha

K

D

=

_{[ ]} ] [ m s A A

(2)

Trong đó : [A

m

] là nồng độ chất phân tích trong pha động

[A

s

] là nồng độ chất phân tích trong pha tĩnh

Cân bằng phân bố trong pha khí gọi là cân bằng động đó là cân bằng giữa lỏng - lỏng, khí-lỏng,

rắn-lỏng. Giả sử chất phân tích được phân bố ở phần nào đó của cột, đĩa thứ n. Nhưng do pha động di chuyển,

chất phân tích lại đi xuống đĩa thứ (n+1) và ở đây lại thiết lập cân bằng mới của cả đĩa thứ n và n+1.

Để cân bằng thiết lập nhanh một yêu cầu rất cần thiết là lớp pha tĩnh phải mỏng, hệ số khuếch tán của

chất phân tích trong pha tĩnh lớn hơn hệ số khuếch tán trong pha động. Hệ số phân bố K

D

có thể được xác

định theo phương pháp tính bằng cách đo nồng độ chất phân tích trong pha động và nồng độ chất phân tích

trong pha tĩnh sau khi đã đạt cân bằng. Một cách gần đúng K

D

được xác định theo công thức sau:

(

1

)

1

.

.

D

M M V

K

M m

−

=

(3)

Trong đó: M là lượng chất ban đầu tính bằng mg

M

1

là lượng chất phân tích còn lại sau khi tiếp xúc mg

V là thể tích pha động ml

m là lượng chât hấp thụ, gam

3.2 Sự liên hệ giữa tốc độ di chuyển của chất phân tích và KD

Chất phân tích A muốn di chuyển được phải ở pha động. Gọi f

A

là phần thời gian A ở pha động:

[ ]

[ ]

[ ] [ ]

.

.

.

m m A m m s s

A V

f

A V

A

V

=

+

(4)

chia cả tử và mẩu cho [A]

m

. V

m

ta có:

1

1

A S D m

f

V

K

V

=

+

(5)

Trong đó k

’

A

là hệ số dung tích.Tốc độ tuyến tính của cấu tử A trong pha động là: u

A

=

u.f

A

= u / (1+k

’A

) (7)

U là tốc độ tuyến tính của pha động (cm/s). Từ biểu thức (6) và (7) ta có nhận xét: Khi K

D

hoặc f

A

càng lớn ;

thời gian chất phân tích trong pha động càng ít, nói cách khác là chất phân tích di chuyển càng chậm, ngược

lại khi f

A

càng nhỏ, chất phân tích di chuyển càng nhanh.

3.3 Thời gian lưu t

R

, thời gian lưu hiệu chỉnh t’

R

Thời gian lưu t

R

là thời gian lúc bắt đầu bơm mẫu vào đầu cột tới khi pic đạt giá trị cực đại.

(8)

L/u là thời gian mà cấu tử không lưu giữ trên cột còn gọi là thời gian chết

(9)

thời gian lưu hiệu chỉnh t

’

R

là thời gian lưu không tính thời gian chết

' '

_t

_t

_t

_.k

t

_RA

=

_RA

−

_m

=

_m

⇒

m R m R V V t t k ' ' ' _{= =}

(10)

3.4 Thể tích lưu V

m

, thể tích lưu hiệu chỉnh V

’m

Thể tích lưu V

R

là thể tích của dung dịch rửa giải từ khi bắt đầu bơm mẫu vào cột cho đến khi pic đạt

cực đại. Gọi F là tốc độ chảy của pha động ml/phút,thể tích lưu V

R

được tính theo công thức:V

RA

= t

RA

F; V

m

= t

m

F

V

RA

= V

m

(1 + k’)

(11)

A A

k

f

_'

1

1

+

=

u

k

L

u

L

t

A A R

)

1

(

+

=

=

) 1 ( . 1 ' A m m s D m R t k V V K t t A = +    + =

Thể tích lưu hiệu chỉnh V

R

’ là thể tích lưu đã loại đi thể tích trống của cột

V

R

’ = V

R

– V

m

= V

m

k

A

’ = K

DA

V

S

Thể tích lưu riêng V

g

là thể tích riêng cho cấu tử, là thể tích dung dịch rửa giải để rửa chất phân tích

trong một đơn vị trọng lượng hay thể tích của pha tĩnh

' RA DA g S

V

K

V

V

=

=

(12)

3.5 Hệ số tách α (còn gọi là hệ số lưu giữ tương đối)

Hệ số tách α là đại lượng đánh giá khả năng tách hai chất bằng phương pháp sắc ký. Nó phụ thuộc

vào hệ số phân bố của chúng và tỷ số của hệ số phân bố của hai chất: một chất phân tích A và một chất khác

B hoặc một chất chuẩn.

Điều kiện để hai chất tách khỏi nhau là α ≠ 1

' DB § B A DA k k K K = = α

≠ 1 (13)

Nói một cách khác hệ số phân bố của hai chất A và B giữa pha tĩnh và pha động phải khác nhau. Mặt

khác tỷ số thể tích lưu của hai chất, t’

RA

/ t’

RB

cũng chính là tỷ số của hệ số phân bố.

Vậy có thể tóm tắt là:

' ' ' ' ' DB § RB RA RB RA B A DA V V t t k k K K = = = = α

(14)

3.6 Đĩa lý thuyết và xác định số đĩa lý thuyết bằng thực nghiệm

3.6.1 Khái niệm đĩa lý thuyết:

Đĩa lý thuyết là phần nào

đó của cột

mà ở đó cân bằng được thiết lập.

Theo quan

niệm của Martin và Synge, cân

bằng được

thiết lập nhanh chóng, tức thời.

Tuy nhiên

điều này gặp khó khăn khi giải

thích hiện

tượng giãn rộng vùng mẫu, hiện

tương pic

sắc ký không cân đối.

Amundson và Lapidus và sau đó

là Van

Deemter cho rằng đĩa được cân

bằng khi

đạt cân bằng chuyển khối lượng chất tan từ pha động vào pha tĩnh và ngược lại và tác giả đã đưa ra thuyết

tốc độ.

Như vậy có thể nói rằng phần nhỏ của cột gọi là đĩa lý thuyết khi đạt được cân bằng phân bố chất

phân tích.

Gọi n là số đĩa lý thuyết,

σ

là độ lệch chuẩn;

σ

~

n

. Đối với cột sắc ký n càng lớn pic càng hẹp,

thời gian lưu tỷ lệ với số đĩa lý thuyết n, t

R

~ n, nên ta có thể vết:

n n t_R =

σ

hay

2       = σR t n

Mặt khác:

w = 4

σ

hay

4

W = σ

Số đĩa lý thuyết có thể viết lại là:

(15)

3.6.2 Đĩa lý thuyết có tính thời gian không lưu giữ, n

ef

(16)

Vì từ (8) ta có t

m

= t

R

/(1+k

’

). Chiều cao đĩa lý thuyết hiệu lực được tính:

(16)

Từ (15) và (16) ta có:

(17)

3.7 Sắc đồ.

Sắc đồ là sự biểu diễn sự phụ thuộc diện tích (S) hoặc chiều cao (h) tín hiệu đo được có thể là độ hấp

thụ quang,cũng có thể là độ dẫn điện hoặc là tần số xung điện ...liên quan chặt chẽ tới nồng độ chất phân

tích có trong mẫu và thời gian. Các tín hiệu này được gọi là “ pic” sắc ký.Để tính toán hàm lượng chất phân

tích, tính diện tích pic sắc ký là chính xác nhất.Ngày nay hầu hết các máy hiện đại đều được trang bị các

thiết bị tÍnh diện tích của pic sắc ký một cách tự động

Hình 6: Sắc đồ hai cấu tử A&B

3.8 Độ phân giải và cách làm tăng độ phân giải:

3.8.1 Độ phân giải

RB RB

V

t .

' '

_,

RB RB

V

t

RA RA

V

t ,

' ' RA ¶

,

V

RA

t

h

S,

A

W

¦

W

B

V

t,

m

t

0

t

(

)

_{( )}

2 2 2 ' 2 ' ef 2 2 2

16

16

16

R m R m

t

t

n

t

t k

w

W

W

−

=

=

=

(

)

(

)

2 2 2 ef

16

2 2

.

2

1

1

R

t

k

k

n

n

w

_k

_k

=

=

+

+

f f n L H =

(

)

(

2

)

2 ' 2 ef 2 '

1

16

_{R m}

k

L

w

H

H

k

t

t

+

=

=

−

Độ phân giải nói lên mức độ tách cấu tủ khỏi nhau trong một phép tách sắc ký. Hai cấu tử A và B

được tách khỏi nhau càng triệt để, độ phân giải càng cao. Độ phân giải được đánh giá qua các đại lượng đặc

trưng là: thời gian lưu, t

RA

, t

RB

và rộng pic W

A

, W

B

.

Độ phân giải R được tính theo công thức:

(18)

Trong đó: t

RB

– t

RA

= Δt

R

là sự chênh lệch thời gian lưu(cũng có thể dùng thể tích lưu V

RA

- V

RB

)của hai cấu tử

A và B. Đại lượng này được so sánh với tổng bán chiều rộng pic, đo bằng giây hoặc mililít, nói lên khả năng

tách của cột.

Khi tăng chiều dài cột, số đĩa lý thuyết tăng: t

R

~ n, chiều rộng pic tỷ lệ với

n

Vì vậy R~

n n

hay R~

L

3.8.2 Cách làm tăng độ phân giải

Cách thứ nhất: Dựa trên sự thay đổi cấu trúc cột. Trong phương pháp này có các biện pháp: Tăng

chiều dài cột, sử dụng chất nhồi có kých thước hạt nhỏ hơn, đồng đều hơn, thay đổi pha tĩnh và cuối cùng là

giảm đường kinh cột

Cách thứ hai: Dưa trên cách vận hành cột: đó là tôi ưu hoá tôc độ pha động, giảm lượng mẫu, giảm

nhiệt độ cột (GC) và cuối cùng là thay đổi thành phần pha động (LC)

3.9 Thuyết tốc độ, phương trình Van Deemter

Thuyết được các tác giả Lapidus và Amundsion đưa ra năm 1952, sau này được Van Deemter phát

triển.

Theo thuyết này các yếu tố: đường kýnh hạt nhồi, kỷ thuật nạp cột và các yếu tố tốc độ của pha

động, hệ số khuếch tán của chất phân tích trong pha động và pha tĩnh ảnh hưởng rất nhiều tới sự giản rộng

vùng chất phân tích hay độ rộng của pic trong sắc đồ. Đại lượng đặc trưng cho độ giản rộng của vùng chất

phân tích là chiều cao đĩa lý thuyết H, được hình thành do ba thành phần H

1

,H

2

, H

3

.

H = H

1

+ H

2

+ H

3

(19)

H

1

là đại lượng khuếch tán xoáy, đặc trưng cho sự đồng đều của cột nhồi, đường kính của hạt nhồi, khả

năng nạp cột

H

1

= 2λd

p

(20)

Trong đó λ là hệ số nạp cột, nếu nạp cột tốt thì λ= 1,5; d

p

là đường kính hạt nhồi

H

2

là đại lượng khuếch tán theo chiều dọc. Nó được hình thành do sự khuếch tán của chất phân tích về

hai đầu của cột, phụ thuộc vào tốc độ của pha động, hệ số khuếch tán của chất phất phân tích trong pha

động, đường đi của chất phân tích, được biểu diển bằng phương trình:

H

2

= B/u trong đó B= 2γD

m

(

)

B

W

2

+

−

=

A RA RB

W

t

t

R

Là đại lượng đặc trưng cho hệ số khuếch tán của chất phân tích trong pha động và hệ số đường đi của nó.

Trong điều kiện nạp cột tốt, đường đi của chất phân tích không quá khúc khuỷu, γ = 1; D

m

là hệ số khuếch

tán của chất phân tích trong pha động, như vậy H

2

có thể viết lại là:

H

2

= 2γD

m

/u (21)

H

3

là đại lượng đặc trưng cho quá trình chuyển khối lượng là yếu tố phụ thuộc vào tốc độ hấp thụ và

giải hấp. Quá trình này phụ thuộc vào cả pha động và pha tĩnh, vì vậy H

3

có thể viết: H

3

= (C

S

- C

m

)u (22)

Trong đó C

s

là hệ số dặc trưng cho quá trình chuyển khối lượng của chất phân tích trong pha tĩnh, phụ thuộc

vào pha tĩnh, nó có giá trị nhỏ khi tốc độ dòng F≥1ml/phút, C

s

≈0 C

s

= K.d

f2

/D

s

(23)

Trong đó: K- hệ số

D

s

- hệ số khuếch tán chất phân tích trong pha tĩnh

d

f2

- chiều dày pha tĩnh

C

m

là hằng số chuyển khối của chất phân tích trong pha động, phụ thuộc vào pha động, được xác định theo

biểu thức:

C

m

= βd

p2

/D

m

(24)

β là hệ số thực nghiệm có giá trị từ 0,5- 1

D

m

là hệ số khuếch tán của chất phân tích trong pha động.

Tổng hợp lại H có biểu thức tổng quát là:

H = 2λd

p

+ 2γD

m

/u + (Kd

f2

/D

s

+ βd

f2

/D

m

)u (25)

Phương trình trên được viết tắt là:

H = A+B/u +Cu

(26)

Trong thực tế có thể tính

gần đúng

H= 3-4d

p

Để xét cực tiểu chiều cao

của đĩa lý

thuyết lấy đạo hàm của phương

trình

Van Deemter ta có:

H

’

_{= -B/u}

2

_+C

Tại cực tiểu H

’

_{=0 => u}

tư

=

C B

III. BÀI TẬP

Bài 1:

Trên sắc ký đồ người ta thu được 3 pic ở 0,84 phút và 10,60 phút và 11,08 phút tương ứng với các

hợp chất A,B và C. Hợp chất A không lưu giữ bởi pha tĩnh lỏng. Các pic của các hợp chất B và C có dạng

đường Gauss có chiều rộng tương ứng 0,56 và 0,59 phút. Chiều cao cột sắc ký bằng 28,3cm. .

1. Tính số đĩa lý thuyết (n) của cột sắc ký và chiều cao đĩa lý thuyết (H) của pic B,C.

2. Tính giá trị trung bình T và

σ

của cột.

3. Tính chỉ số lưu giữ của chất B,C.

H min H u B Cu s cm u, / A tu u

4. Thể tích của chất lỏng được giữ trên bề mặt của chất mang của cột bằng 12,3ml. Thể tích của pha động

bằng 17,6ml. Hãy tính hệ số phân bố B,C.

Giải:

1. Tính n và H:

+ Đối với pic B:

2 2 B

10,60

16

16

5733

W

0,56

RB B

t

n

=



_



_÷

=



_



_÷

=









+ Đối với pic C

2 2 C

11,08

16

16

5643

W

0,59

RC C

t

n

=



_



_÷

=



_



_÷

=









Vậy số đĩa lý thuyết của cột tương đương 5688 đĩa lý thuyết.

+ Chiều cao đĩa lý thuyết:

3

28,3

4,975.10 (

)

5688

L

H

cm

n

−

= =

=

2. Tính

σ

và T:

Từ

2 2 3 2 2

.

5688.(4,975.10 )

0,375(

)

n

n H

cm

H

σ

_σ

−

=

⇒ =

=

=

Ta có:

.

RB

10,6.0,375

0,141(

)

28,3

B

t

T

phut

L

σ

=

=

=

RC

.

11,08.0,375

0,147(

)

28,3

C

t

T

phut

L

σ

=

=

=

0,141 0,147

0,144(

)

2

T

=

+

=

phut

3. Chỉ số lưu giữ của chất B,C:

Ta có:

0,84

0,079

10,6

m B RB

t

R

t

=

=

=

0,84

0,076

11, 08

m C RC

t

R

t

=

=

=

4. Hệ số phân bố B,C:

Ta có:

(1

) 17,6(1 0,079)

16,68

.

.

0,079.12,3

m m B B B m B S B S

V

V

R

R

k

V

k V

R V

−

−

=

⇒

=

=

=

+

(1

) 17,6(1 0,076)

17, 40

.

.

0,076.12,3

m m C C C m C S C S

V

V

R

R

k

V

k V

R V

−

−

=

⇒

=

=

=

+

Bài 2

Tính số đĩa lý thuyết hiệu lực n

ef

và H

ef

của hệ sắc ký có tính chất sau:

t

RA

=

280 ;

s t

RB

=

300 ;

s

14 ;

15 .

A B

Giải:

Theo lý thuyết ta có số đĩa lý thuyết hiệu lực n

ef

là:

(

)

2 2 1 ' ' + = k k n

_{; với k’ là tỷ số dung tích.}

2 16     − = W t t n R M ef 2

280

16

6400

14

A

n

=



_



_÷

=





2

300

16

6400

15

B

n

=



_



_÷

=





Từ đó ta có:

Đối với pic A:

'

280 10

27;

10

R M M

t

t

k

t



−





−



=

_

_{ }

=

_

=









2

27

6400

5951,07

27 1

A ef

n

=



_



_÷

=

+





Đối với pic B:

'

300 10

29;

10

R M M

t

t

k

t



−





−



=

_

_{ }

=

_

=









2

29

6400

5980, 4

29 1

B ef

n

=



_



_÷

=

+





Vậy,

n

ef

=

5065,7

;

300

0,053

5965,7

ef

H

=

=

.

Bài 3

Pic sắc ký của hợp chất X được phát hiện sau 15 phút sau khi đưa mẫu vào

(lúc đó của hợp chất Y không được giữ bởi vật liệu của cột xuất hiện qua 1,32 phút). Pic của chất X có dạng

đường phân bố Gauss với bề rộng của đáy là 24,2s. Độ dài của cột là 40,2cm.

1. Tính số đĩa lý thuyết trong cột.

2. Tính H của cột.

3. Tính T và

σ

của cột.

4. Tính chỉ số lưu giữ của chất X.

5. Từ phương pháp chuẩn bị đã biết rằng thể tích của chất lỏng được giữ trên bề mặt của chất mang của cột

bằng 9,9ml. Thể tích của pha động bằng 12,3ml. Hãy tính hệ số phân bố X.

6. Tiêu chuẩn phân chia X và Y là bao nhiêu nếu yếu tố phân chia đối với X và Y bằng 1,011.

Giải:

1. Số đĩa lý thuyết (n):

22130 2 , 24 60 . 15 16 W 16 2 2 X =       =     = RX X t n

2. Tính H:

Ta có

1,82.10 ( ) 22130 2 , 40 ₃ cm n L H H L n_{= ⇒ = = =} −

3. Tính

σ

và T:

Từ

. 2 22130.(1,82.10 3)2 0,27( ) 2 2 cm H n H n=

σ

⇒

_σ

= = − =

Ta có:

0,101( ) 2 , 40 27 , 0 . 15 .R _phut L t T =σ = =

4. Chỉ số lưu giữ của chất X:

Ta có:

0,088 15 32 , 1 = = = R m t t R

5. Hệ số phân bố X (k

X

):

Ta có:

12

,

9

9

,

9

.

088

,

0

)

088

,

0

1

(

3

,

12

.

)

1

(

.

=

−

=

−

=

⇒

+

=

S m X S m m

V

R

R

V

k

V

k

V

V

R

6. Tiêu chuẩn phân chia (R

s

):

Ta có:

) 0,4 011 , 1 1 1 ( 4 22130 ) 1 1 ( 4 − = − = = α n RS

với

α

là yếu tố phân chia.

Bài 4: Một hệ thống sắc ký lỏng hoạt động với các thông số sau đây:

-

Chiều dài của phần cột được nhồi pha tĩnh: 25,2 cm.

-

Tốc độ dòng: 0,312 ml/phút.

-

Thể tích pha động (V

m

): 1,40 ml.

-

Thể tích pha tĩnh (V

s

): 0,168 ml.

Sau khi cho qua cột một hỗn hợp chứa 4 cấu tử A,B,C và D thu được một sắc ký đồ cung cấp các dữ kiện

sau:

Cấu tử

Thời gian lưu giữ,phút

Chiều rộng chân pic,phút

Không lưu giữ bởi cột

1,2

A

4,7

0,48

B

8,8

0,92

C

12,5

1,34

D

13,8

1,44

Hãy tính:

1. Số đĩa lý thuyết đối với mỗi pic,giá trị trung bình,độ lệch chuẩn của n và chiều cao đĩa lý thuyết của

cột.

2. Hệ số chứa và hệ số phân bố của từng cấu tử.

3. Độ phân giải R

S

, độ chọn lọc α đối với 2 cấu tử C,D.

4. Chiều dài cột nếu muốn đạt được độ phân giải 1,5 đối với 2 cấu tử C,D.

Giải

1. Sử dụng phương trình :

16( )

2

w

R

t

n

=

tính được số đĩa lý thuyết

A: n = 1534

B: n = 1463

C: n = 1392

D: n = 1469

n

tb

= 1500

25, 2

0,017

1500

tb

L

H

cm

n

=

=

=

2 2 2 2

.

1500.(0,017)

0,66(

)

n

n H

cm

H

σ

_σ

=

⇒ =

=

=

2. Hệ số chứa và hệ số phân bố của từng cấu tử.

Áp dụng công thức '

X R m m

t

t

k

t

−

=

_{ta tính được hệ số chứa của từng cấu tử :}

k’

A

= 2,9 ; k’

B

= 6,3; k’

C

= 9,4 k’

D

= 10.

Từ công thức '

X X S M

K V

k

V

=

ta tính được hệ số phân bố của từng cấu tử :

K

A

= 24; K

B

= 53; K

C

= 78; K

D

= 87;

3. Độ phân giải R

S

, độ chọn lọc α đối với 2 cấu tử C,D.

C D

2

0,94

w

w

87

1,12

78

R s D C

t

R

K

K

α

∆

=

=

+

=

=

=

4.Chiều dài cột để độ phân giải giữa các cấu tử đạt yêu cầu tối thiểu là 1,5 đối với 2 cấu tử C,D;k’ và α

không thay đổi khi n và L tăng.

Gọi n

1

,n

2

là số đĩa lý thuyết của cột cũ và cột mới,ta có:

,1 1 2 ,2 2 2

0,94

1500

3800

1,50

s s

R

n

n

R

=

n

⇔

=

n

⇒

=

Chiều dài cột để độ phân giải tăng lên 1,5:

L

2

= H.n

2

= 0,017. 3800 = 65 cm.

Bài 5:

Cho hệ sắc ký có tính chất sau:

t

RA

=

280 ;

s t

RB

=

300 ;

s

W

A

=

14 ;

s W

B

=

15 .

s

Cột có chiều dài là

3,2m. Thay đổi chiều dài từ 320 cm lên 400 cm. Tính độ phân giải?

Giải:

400

280.

350( )

320

RA

t

=

=

s

300.

400

375( )

320

RB

t

=

=

s

2 2 A

280

16.

16

6400

W

14

RA A

t

n

=



_



_÷

=



_



_÷

=









2 2 B

300

16.

16

6400

W

15

RB B

t

n

=



_



_÷

=



_



_÷

=









2

400

16.

6400.

8000

W

320

R

t

n

=



_



_÷

=

=





Ta có:

n

16.t

W

W

.

16

2 R 2

=

⇒













=

t

R

n

2 A

16.(350)

W

15,65( )

8000

s

=

=

B 2

16.(375)

W

16,77( )

8000

s

=

=

(

)

2. 375 350

1,54

15,65 16,77

R

=

−

=

+

Bài 6

Trong sắc ký khí tốc độ di chuyển của pha động có thể đo được trực tiếp, nếu đưa vào một lượng nào

đó của chất tan tương tự như metan,nó không được giữ bởi pha tĩnh. Trong cột mao quản có chiều dài 50m;

thời gian lưu trữ của metan bằng 71,5s;còn thời gian giữ của n-heptadecan là 12,6 phút. Hãy cho biết:

a. Tốc độ di chuyển của pha động bằng bao nhiêu?

b. Tốc độ di chuyển của dải n-heptadecan bằng bao nhiêu?

Giải

a. Ta có L = 50 m = 5000 cm.

T

R

= 71,5 s

Vậy tốc độ di chuyển của pha động là:

5000

69,93

/

71,5

R

L

F

cm s

t

=

=

=

b. Đối với n-heptadecan: t

R

= 12,6 phút = 756 s.

Vậy tốc độ di chuyển của dải là:

5000

6,61

/

756

F

=

=

cm s

.

Bài 7

Một cột sắc ký mao quản dài 30m, chạy một chất chuẩn ở hai tôc độ pha động khác nhau, cho các số

liệu sau:

Tốc độ (cm/s)

Số đĩa lý thuyết

0,5

150 000

120 000

Xác định vận tốc tối ưu,chiều cao đĩa lý thuyết cực tiểu và số đĩa lý thuyết ở vận tốc tối ưu đó,cho

A=0.

Giải

TN

1

H

1

= 3000/150000 = 0,02 cm

TN

2

H

2

= 3000/120000 = 0,025 cm.

Ta có phương trình:

0,02

0,5

0,5

0,025

1

B

C

B

C

=

+

= +

Giải phương trình ta được : C= 0,02 s ; B = 0,005 cm

2

_/s.

U tối ưu = (B/C)

1/2

_{= 0,5 cm/s}

H

min

= 2(B.C)

1/2

= 0,02 cm.

Số đĩa lý thuyết ở vận tốc tối ưu là:

3000

150000

0,02

n

=

=

.

Bài 8 Một cột dài 360 cm dùng để tách propan và butan bằng phương pháp sắc ký khí. Dùng thước người

ta đo được khoảng cách từ lúc bơm mẫu đến đỉnh của pic sắc ký lần lượt là 152,5 mm và 415,5 mm,bề rộng

chân các pic lần lượt là 13,5 mm và 33,8 mm. Tính số đĩa lý thuyết và chiều cao đĩa lý thuyết ứng với mỗi

chất.

Giải

Sử dụng phương trình :

16( )

2

w

R

t

n

=

tính được số đĩa lý thuyết

n(propan) = 2042

n(butan) = 2416

Chiều cao đĩa lý thuyết

H

L

n

=

ta được

H(propan) = 0,176 cm

H(butan) = 0,149 cm.

Bài 9 Một hỗn hợp chứa metyl xiclohexan,metyl xiclohexen và toluen được tách bằng phương pháp sắc ký

lỏng – khí trên cột nhồi dài 42 cm. Sắc ký đồ cung cấp thời gian lưu của chúng lần lượt là 10,1 ; 11,0 ; 13,5

và chiều rộng pic lần lượt là 0,75 ; 0,80 ; 1,05 phút. Hãy tính:

1. Số đĩa lý thuyết đối với mỗi pic, giá trị trung bình,độ lệch chuẩn của n và chiều cao đĩa lý thuyết của

cột.

2. Độ phân giải giữa metyl xiclohexan và metyl xiclohexen,giữa metyl xiclohexen và toluen. Cho biết

khí được sử dụng là không khí với t

R(KK)

= 1,2 phút (không khí được xem là cấu tử không bị lưu giữ

bởi cột).

3. Hãy tính chiều dài cột để độ phân giải giữa các cấu tử đạt yêu cầu tối thiểu là 1,5.

Giải

Ký hiệu A : metyl xiclohexan

B: metyl xiclohexen

C: toluen.

1. Sử dụng phương trình :

_{16( )}

2

w

R

t

n

=

tính được số đĩa lý thuyết

A: n = 2902

B: n = 3025

C: n =2645

n

tb

= 2900

420

0,015

2900

tb

L

H

cm

n

=

=

=

2 2 2 2

.

2900.(0,015)

0,81(

)

n

n H

cm

H

σ

_σ

=

⇒ =

=

=

2. Độ phân giải giữa metyl xiclohexan và metyl xiclohexen,giữa metyl xiclohexen và toluen

, A B , A B

2

1,16

w

w

2

2,70

w

w

R s A B R s B C

t

R

t

R

− −

∆

=

=

+

∆

=

=

+

3.Chiều dài cột để độ phân giải giữa các cấu tử đạt yêu cầu tối thiểu là 1,5.

Vì R

s,A-B

= 2,70>1,5 nên chỉ cần tính chiều dài để độ phân giải giữa A-B đạt yêu cầu 1,5.

Gọi n

1

,n

2

là số đĩa lý thuyết của cột cũ và cột mới,ta có:

,1 1 2 ,2 2 2

1,16

2900

4800

1,50

s s

R

n

n

R

=

n

⇔

=

n

⇒

=

Chiều dài cột để độ phân giải tăng lên 1,5:

L

2

= H.n

2

= 0,015. 4800 = 73 cm.

Bài 10:

Một phép sắc ký khí sử dụng cột dài 36 m, chạy chất chuẩn ở 3 thí nghiệm với tốc độ pha động khác

nhau cho các pic có thời gian lưu và độ rộng pic như sau:

Thí nghiệm

u (cm/s)

t

R

(s)

w (s)

1

10

300

20

2

20

250

16

3

30

150

10

Xác định vận tốc tối ưu, số đĩa lý thuyết cho cột vận hành ở vận tốc tối ưu đó

Giải :

Theo phương trình Van-Deemter, muốn xác định được vận tốc tối ưu, H

min

và số đĩa lý thuyết ta cần

xác định các hệ số A, B, C. Muốn vậy ta xác định số đĩa lý thuyết và chiều cao đĩa lý thuyết cho từng thí

nghiệm :

Ta có : L=36 m = 3600 cm

TN 1:

3600 20 300 16 2 1  =      = n 1,00( ) 3600 3600 1 cm H = =

TN 2:

3906 16 250 16 2 2  =      = n 0,92( ) 3906 3600 2 cm H = =

TN 3:

3600 10 150 16 2 3  =      = n 1,00( ) 3600 3600 3 cm H = =

Thay các số liệu vào phương trình trên ta có hệ phương trình sau:

C B A 10 10 00 , 1 = + +

(1)

C B A 20 20 92 , 0 = + +

(2)

A B 30C 30 00 , 1 = + +

(3)

Giải hệ gồm 3 phương trình (1), (2) và (3) ta được:

A= 0,36 (cm), B = 4,8 (cm

2

_{/s) và C = 0,016 (s)}

Vận tốc tối ưu, H

min

và số đĩa lý thuyết được tính là :

) / ( 32 , 17 016 , 0 8 , 4 _{cm s} C B u_toiuu = = = ) ( 914 , 0 016 , 0 . 8 , 4 2 36 , 0 . 2 min A BC cm H = + = + = 3939 914 , 0 3600 = = = H L n

TÀI LIỆU THAM KHẢO.

1. Từ Vọng Nghi , Nguyễn Văn Ri, Nguyễn Xuân Trung, Trần Tứ Hiếu – Hoá học phân tích –

Tập 2 –NXB Khoa học kỹ thuật.

2.TS-Nguyễn Đình Lâm- Cơ sở lý thuyết và ứng dụng của sắc ký-Bài giảng.

3.TS- Nguyễn Bá Hoài Anh-Đại cương về sắc ký –Bài giảng.

4.KS-Phan Hiền Lương- Phương pháp sắc ký lỏng HPLC.

Chương 2. SẮC KÍ LỎNG HIỆU NĂNG CAO

Sắc ký là quá trình tách dựa trên sự phân bố liên tục các cấu tử chất phân tích lên 2 pha: một pha thường đứng yên, có khả năng hấp phụ chất phân tích gọi là pha tĩnh, một pha di chuyển qua pha tĩnh gọi là pha động; do các cấu tử chất phân tích có ái lực khác nhau với pha tĩnh, chúng di chuyển với tốc độ khác nhau và tách ra khỏi nhau.

Quá trình sắc ký khác cơ bản với quá trình tách khác ở 2 điểm:

- Sự phân bố chất phân tích lên 2 pha lặp đi lặp lại nhiều lần (hàng ngàn lần, thậm chí hàng triệu lần). - Pha động đi qua pha tĩnh.

1.2. VÀI NÉT VỀ LỊCH SỬ PHÁT TRIỂN CỦA PHƯƠNG PHÁP HPLC

Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC – High Performance Liquid Chromatography), trước kia gọi là phương pháp sắc ký lỏng cao áp (High Pressure Liquid Chromatography).

Phương pháp này ra đời từ năm 1967-1968 trên cơ sở phát triển và cải tiến từ phương pháp sắc ký cột cổ điển. Ban đầu, phương pháp được thực hiện ở áp suất thường vì chất nhồi cột có kích thước lớn. Cơ chế tách là sắc ký hấp phụ, sắc ký phân bố nhưng do tốc độ phát triển nhanh của phương pháp, các chất nhồi cột khác nhau ngày càng được cải tiến, hiệu quả tách của cột ngày càng được nâng cao.

Sắc ký lỏng hiệu năng cao bao gồm nhiều phương pháp có đặc thù riêng, đó là sắc ký lỏng pha liên kết, sắc ký lỏng – lỏng, sắc ký trao đổi ion lỏng – rắn, sắc ký hấp phụ lỏng – rắn.

Hiện nay phương pháp HPLC ngày càng phát triển và hiện đại hoá cao nhờ sự phát triển nhanh chóng của ngành chế tạo máy phân tích và được sử dụng nhiều trong lĩnh vực kiểm nghiệm, đặc biệt là trong kiểm nghiệm thuốc và hiện là công cụ đắc lực trong phân tích các thuốc đa thành phần (cho phép định tính và định lượng).

1.3. NGUYÊN TẮC CỦA PHƯƠNG PHÁP HPLC

Nguyên tắc của phương pháp HPLC là quá trình tách các chất ở trạng thái lỏng dựa trên sự phân bố liên tục các chất lên 2 pha: Một pha đứng yên có khả năng hấp phụ chất phân tích gọi là pha tĩnh; một pha di chuyển qua pha tĩnh để mang chất phân tích ra khỏi cột tách gọi là pha động. Do các chất phân tích có ái lực khác nhau với pha tĩnh nên chúng di chuyển với tốc độ khác nhau và được tách ra khỏi nhau.

Hình: Minh hoạ quá trình tách các chất A và B trong cột tách sắc ký.

Như vậy có thể nói HPLC là một sắc ký cổ điển đi kèm với một detectơ nhạy để phát hiện chất phân tích sau khi tách ra khỏi cột trong quá trình chạy sắc ký.

Với những tiến bộ kỹ thuật về cột tách và detectơ đã chuyển phương pháp phân tích này có một tốc độ nhanh và chính xác nhờ hệ thống bơm cao áp khoảng 300 atm nhằm tạo dòng chảy với lưu lượng vài ml/phút. Vì vậy người ta gọi là sắc ký lỏng hiệu năng cao.

Ưu điểm của phương pháp này là lượng mẫu phân tích rất ít chỉ cần khoảng 20µL/1 lần phân tích và mẫu chỉ cần hoà tan mà không cần làm bay hơi, do đó HPLC có thể phân tích được các chất mà không sợ gây ra sự phân hủy do nhiệt độ trong quá trình phân tích.

1.4. CÁC GIAI ĐOẠN CHẠY SẮC KÝ HPLC

* Giai đoạn tách:

- Thực hiện phép tách các chất ở trạng thái lỏng trong cột sắc ký dưới áp suất cao (200 ÷ 500 atm). Vì vậy phải chuyển toàn bộ chất phân tích vào trong dung dịch (thường là hòa tan trong dung môi làm pha động). Phương pháp này thích hợp cho tách các chất có nhiệt độ sôi cao cũng như nhiệt độ sôi thấp (trừ những chất là thể khí ở điều kiện thường).

- Dùng thiết bị bơm mẫu để bơm chất phân tích vào đầu cột tách → chất phân tích được hấp phụ trên bề mặt pha tĩnh.

- Dùng bơm cao áp để bơm dung môi rửa giải qua cột (có thể là dung môi đơn hoặc hỗn hợp các dung môi) để rửa giải chất phân tích ra khỏi cột (do lực liên kết giữa các cấu tử chất phân tích với pha tĩnh khác nhau mà chúng tách ra khỏi nhau).

- Kỹ thuật chạy sắc ký:

+ Kỹ thuật cố định pha động (giữ thành phần và vận tốc pha động không đổi).

+ Kỹ thuật građient pha động (biến đổi pha động liên tục). Građient có thể là từng bậc hoặc liên tục tùy thuộc vào mẫu phân tích và thành phần pha động sao cho quá trình tách sắc ký xảy ra hoàn toàn.

* Giai đoạn phát hiện và xử lý kết quả phân tích:

- Các chất phân tích sau khi tách ra khỏi nhau được phát hiện nhờ 1 bộ dò gọi là detectơ.

- Việc ghi nhận và xử ký kết quả được thực hiện nhờ máy tính chuyên dụng, kết quả cho một sắc ký đồ trong đó chứa các thông tin cần thiết như : thời gian lưu, diện tích và chiều cao pic, hệ số phân giải, hệ số đối xứng… + Với 1 chất sẽ có 1 thời gian lưu đặc trưng cho chất đó nên ta có thể căn cứ vào tính chất này để phân tích định tính. + Độ lớn pic được đặc trưng bằng diện tích hay chiều cao, 2 đại lượng này tỉ lệ với nồng độ chất phân tích trong 1 khoảng xác định nào đó, được sử dụng để định lượng chất phân tích.

1.5. CỘT TÁCH TRONG HPLC

Cột tách là bộ phận quan trọng nhất của hệ thống sắc ký, bao gồm các vấn đề: các loại cột tách, chất liệu làm cột, kích thước cột, kích thước hạt nhồi, cách nạp cột,…

Hỗn hợp các chất tan có thể được tách hoàn toàn ra khỏi nhau hay không được xác định bởi hiệu quả của cột tách và bởi độ chọn lọc của hệ pha. Do vậy điều quan trọng là phải chế tạo được các cột tách có hiệu quả.

* Cột tách trong HPLC có 3 loại:

+ Cột thường. + Cột mao quản.

+ Cột kích thước nhỏ (cột micro).

* Chất liệu làm cột: là thép đặc biệt, nếu làm bằng thủy tinh thì phải bọc thép ở ngoài vì phép sắc ký này được

thực hiện ở áp suất rất cao. * Kích thước cột: Loại cột tách Đường kính (mm) Chiều dài (cm) Tốc độ chảy (mL/phút) Số đĩa lý thuyết Cột thường 4,0 ÷ 4,6 15 ÷ 30 1 ÷ 2 40.000 ÷ 60.000