UNIVERSIDADE FEDERAL DE VIÇOSA
PRÓ-REITORIA DE EXTENSÃO E CULTURA
DEPARTAMENTO DE ZOOTECNIA
82ª SEMANA DO FAZENDEIRO
PRODUÇÃO DE EMBRIÕES BOVINOS IN VIVO E IN VITRO.
Jurandy Mauro Penitente Filho, M.Sc.
Viçosa – MG
2011
Índice
Introdução... 1
Dinâmica folicular... 1
Produção in vivo de Embriões Bovinos... 2
Seleção e Sincronização das receptoras... 2
Sincronização de receptoras com PGF2α... 3
Uso do GnRH e suas associações... 3
Associação de progestágenos e estradiol... 5
Tratamentos que aumentam a concentração de P4 plasmática e a taxa de prenhez... 6
Seleção e Superovulação (SOV) das doadoras... 7
Protocolos de SOV e IA das doadoras usando cio natural... 8
E2 + Implante de P4... 8
Inseminação com tempo fixo... 8
Coleta de Embriões... 10
Rastreamento e classificação de embriões... 10
Transferência dos embriões... 11
Produção in vitro de Embriões Bovinos... 11
Coleta dos Complexos cumulus oócitos (CCOs)... 12
Classificação de oócitos... 12
Maturação in vitro... 13
Fertilização in vitro... 13
Cultivo in vitro de embriões... 14
Micromanipulação de Embriões... 14
Bipartição de Embriões... 14
Separação de Blastômeros... 15
Referências... 16
1
Introdução
A utilização e o desenvolvimento de biotécnicas da reprodução animal são condições indispensáveis para o aumento da eficiência produtiva. Nesse sentido, especialmente no que se refere aos ruminantes domésticos, biotécnicas como a inseminação artificial, fertilização in vitro e a transferência de embriões vêm sendo utilizadas com sucesso (FIGUEIREDO et al., 2007).
A produção de embriões bovinos in vivo, através da superovulação das doadoras e posterior lavagem uterina, é consagrada mundialmente como forma eficiente de multiplicação rápida dos indivíduos considerados de melhor mérito genético dentro de um rebanho. Os embriões também podem ser produzidos no laboratório utilizando técnicas de fecundação in vitro ou por clonagem de células embrionárias ou somáticas.
Os avanços obtidos nas biotécnicas reprodutivas ao longo dos anos permitiram uma maior participação da fêmea bovina no processo de melhoramento genético do rebanho. Isso porque o número de descendentes deixados por uma única fêmea ao longo de sua vida reprodutiva aumentou significativamente com o aperfeiçoamento das técnicas de transferência e produção in vitro de embriões, entretanto, uma das principais desvantagens da PIV ainda está na baixa produção e qualidade de embriões (GONÇALVES et al., 2007) levando a baixas taxas de gestação após inovulação, além do elevado custo de produção de cada embrião.
Dinâmica folicular
A unidade funcional da gônada feminina e que contém o gameta feminino é o folículo; a principal função do folículo é proporcionar um ambiente ideal para o crescimento e maturação do ovócito, bem como produzir hormônios como o estradiol (E2) e peptídeos (PRESTES &
ALVARENGA, 2006).
Ao nascimento, as fêmeas dos mamíferos possuem, em seus ovários, folículos primordiais contendo ovócitos estacionários no estado dictióteno da prófase I da meiose.
Esses ovócitos vão sofrer maturação na fase de crescimento do folículo e reinício da meiose (maturação final) no folículo pré-ovulatório, somente após a puberdade (PRESTES &
ALVARENGA, 2006).
O desenvolvimento folicular de bovinos ocorre em um padrão de ondas. Cada onda de crescimento folicular é caracterizada por um grupo de pequenos folículos que são recrutados e iniciam uma fase de crescimento comum por cerca de três dias. Destes folículos, apenas um continua seu desenvolvimento, enquanto os outros sofrem decréscimo de tamanho, estabelecendo-se então, o fenômeno da divergência folicular (BARUSELLI et al., 2007).
Vacas e novilhas podem ter duas ou três ondas por ciclo, com um folículo tornando-se dominante em cada uma delas. Por isso, uma população de pequenos, médios e grandes folículos é encontrada em cada ovário, durante todos os dias do ciclo estral (BORGES et al., 2001).
Cada onda de crescimento folicular é dividida em quatro fases: emergência, seleção, dominância e atresia ou ovulação. A emergência de uma onda é caracterizada por um crescimento de mais de 20 folículos pequenos que são estimulados pelo FSH (REIS, 2004). A concentração de FSH atinge seu pico quando o maior folículo denominado dominante (FD) atinge o tamanho de 4 a 5 mm (Figura 1; NASSER, 2006).
2 Figura 1: Fases do crescimento folicular: Recrutamento (dependente de FSH); Seleção e dominância (dependente de LH); e Ovulação ou atresia ( dependente da presença ou não do pico de LH) Fonte: TECNOPEC, 2008
Uma das maneiras do FD manter seu “status” é produzir substâncias que inibam o desenvolvimento de outros folículos antrais. Uma dessas substâncias é a inibina, um hormônio peptídeo produzido pela granulosa que inibe a secreção do FSH por efeito de retro alimentação negativa sobre a liberação de FSH, aparentemente através de efeito direto sobre a hipófise (FLORIANI, 2006).
A dinâmica folicular em animais zebuínos tem-se mostrado diferente da de bovinos de raças européias, de modo que o diâmetro dos FD e a área do CL são menores nas fêmeas zebuínas (BORGES et al., 2004). E em zebuínos, existem relatos que descrevem maior incidência de três ondas, sendo notificada à presença de até quatro ondas de crescimento folicular por ciclo estral (BARUSELLI et al., 2007). Rasi (2005) ressalta que a emergência da 3ª onda folicular está associada a uma fase luteínica mais prolongada (Figura 2).
Figura 2: Esquemas de ciclo estral de duas (A) e três ondas foliculares (B). Fonte: TECNOPEC, 2008
Produção in vivo de Embriões Bovinos
Seleção e Sincronização das receptoras
As receptoras de embriões necessitam de cuidados tão rigorosos quanto os dispensados às doadoras. Os cuidados, em relação à sanidade (IBR, BVD, Leptospirose, Tuberculose,
B A
3 Brucelose, Tricomonose), nutrição, mineralização de qualidade e fertilidade, influem de forma significativa sobre os resultados da técnica.
Geralmente como receptoras são utilizadas fêmeas cruzadas (zebu x taurino), jovens, com boa capacidade de conversão alimentar, com alta fertilidade e boa habilidade materna são consideradas as melhores receptoras, por isso, mais procuradas. Em geral, quando as receptoras pariam e desmamavam suas crias eram descartadas, porém atualmente o reaproveitamento de receptoras tem se tornado uma prática cada vez mais comum, pois os preços praticados pelos fornecedores de receptoras têm se tornado cada vez maior.
Algumas considerações devem ser feitas em relação à sincronia da receptora com a doadora, tendo em vista que no momento da coleta, os embriões apresentam uma importante variabilidade em seus estágios de desenvolvimento (24 a 36 h de diferença). Sendo assim é adequado ter um grau de sincronia de aproximadamente 24 horas entre a doadora e a receptora, o que permite eleger a receptora mais apropriada para cada tipo de embrião coletado.
Sincronização de receptoras com PGF2α
A PGF2α e seus análogos são os hormônios mais utilizados na sincronização de cio.
Porém, a PGF2α apresenta alguns limitantes em seu uso, tais como: necessidade de pessoas qualificadas para detecção de cio, alta variabilidade das respostas ao tratamento e limitada quantidade de receptoras detectadas em cio.
Vários estudos sobre o uso de prostaglandinas demonstraram que a variação do intervalo entre a aplicação aos sinais de cio e ovulação pode ser atribuída ao estado da onda folicular no momento do tratamento. Se a luteólise for induzida antes da metade do período estático do folículo dominante, indica que este será o folículo ovulatório, sendo que o intervalo tratamento-cio será curto entre 2 e 3 dias. Porém, se a luteólise for induzida após esse momento, o folículo ovulatório será da próxima onda folicular e o intervalo tratamento- cio será maior, entre 4 a 6 dias.
Além disso, estudos revelam que a PGF2α não é efetiva nos primeiro 5 a 6 dias do ciclo estral. Um dos protocolos de sincronização de cios mais usados e mais eficiente, consiste na administração de 2 doses de PGF2α num intervalo de 11 a 14 dias, o que possibilitará que todos animais tratados estejam em fase luteal no momento da segunda aplicação. Este método é facilmente aplicado a um programa de TE, visto que permite que a primeira dose de PGF2α
seja administrada na receptora no momento em que a doadora estiver em cio, antes da superovulação (SOV), com a 2a dose sendo aplicada após 11-12 dias, ou seja 12 horas antes da aplicação de PGF2α na doadora, fazendo com que o cio da receptora e doadora sejam o mais sincrônicos possível.
Uso do GnRH e suas associações
Um protocolo muito usado para sincronizar a ovulação de receptoras é conhecido como OVSYNCH e consiste no seguinte esquema (Esquema 1) de tratamento:
4 Esquema 1: Protocolo OVSYNCH de sincronização da ovulação.
GnRH PGF2α GnRH TETF*
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
*Transferência de embriões em tempo fixo, Fonte: TECNOPEC. 2008
A administração de GnRH e seus agonistas (GnRHa), induz a liberação de LH e FSH.
A liberação de LH induz a ovulação ou a luteinização de grandes folículos presentes no momento do tratamento. A ovulação do folículo dominante permite a liberação de FSH, podendo ser complementado pelo GnRH exógeno, culminando com mais liberação de FSH, para iniciar o recrutamento de uma nova onda folicular.
O mecanismo de ação do GnRH consiste: a primeira dose irá induzir a liberação de LH, resultando em ovulação ou luteinização do folículo dominante induzindo, consequentemente, a emergência de uma nova onda folicular dentro de 2 dias. A administração de PGF2a 7 dias após tem função de induzir a luteólise; 2 dias depois se administra outra dose de GnRH com a intenção de induzir outro pico de LH e sincronizar a ovulação do folículo dominante existente (MARTINEZ et al., 2001).
O sistema OVSYNCH mostrou melhores resultados quando usados em vacas do que em novilhas. Resultados de outro estudo confirmaram que o GnRH nem sempre resulta em ovulação ou luteinização do folículo dominante em novilhas. Vale ressaltar que a emergência folicular será efetiva somente quando o tratamento causar ovulação (MARTINEZ et al., 1999). Para novilhas têm se obtido maior taxa na sincronização quando entre o GnRH e a PGF2a for administrado um implante de CIDRB (Esquema 2) visando prevenir o aparecimento do cio, que ocorre em muitos casos antes da segunda dose de GnRH (MARTINEZ et al., 2001).
Esquema 2: Tratamento para TETF, com OVSYNCH associado a progesterona sem a necessidade de detecção de cio.
GnRH PGF2α GnRH TETF
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
Implante de progesterona Fonte: BÓ et al., 2001
O início do protocolo OVSYNCH em determinado estágio do ciclo estral é associado com redução na fertilidade; por exemplo, se a 1º dose de GnRH for aplicada entre o D9 e D12 do ciclo estral, a mesma pode não resultar em ovulação com conseqüente não formação do CL. Neste estágio vacas que possuem apenas 2 ondas foliculares, comumente possuem pequeno potencial de folículo dominante, que não é responsivo ao GnRH. Consequentemente, não há formação de um CL 2 a 4 dias após a injeção de GnRH. O ciclo segue normalmente com a secreção de PGF2α uterina causando a luteólise, sem o aparecimento de cio induzido e sim fisiológico. Outra fase crítica para o uso do OVSYNCH é quando o ovário se encontra no metaestro. Neste estágio, houve uma ovulação fisiológica prévia e o potencial do folículo
5 dominante ainda é pequeno e não é responsivo ao LH (< 9 mm), não havendo resposta à aplicação do GnRH (MOREIRA et al., 2000).
Algumas estratégias vêm sendo desenvolvidas para minimizar o número de vacas que se encontram nestes estágios críticos do ciclo estral no início do tratamento OVSYNCH. Um método é a aplicação de 2 doses de PGF2α com intervalo de 11 - 12 dias entre as doses, em um intervalo de 14 dias antes do início do tratamento com OVSYNCH. Com este tratamento se todas as vacas estiverem ciclando espera-se que 90% das vacas estejam no momento ideal para começar o protocolo.
Associação de progestágenos e estradiol
A função principal do estradiol é de induzir a regressão dos folículos antrais em crescimento. Os resultados mais eficazes foram obtidos quando o estradiol foi aplicado até 1 dia depois da inserção do implante de progesterona.
O mecanismo pelo qual o estradiol causa regressão folicular envolve a inibição do FSH, até que o estradiol seja metabolizado. A partir de então, o FSH volta a aumentar seus níveis e uma nova onda folicular é recrutada. A dose de 5 mg de E2, causa uma emergência folicular 4 dias após sua aplicação. O benzoato de estradiol (BE) na dose de 5 mg possui efeito similar, além do que demonstra atividade luteolítica.Os ajustes nos protocolos são controversos, mas tem-se notado uma maior sincronização da emergência folicular, quando o BE é aplicado no D0 juntamente com 50 mg de P4, do que quando é aplicado apenas BE, mesmo sem ter sido observados aumentos nas taxas de prenhez (MOREIRA et al., 2001; Esquema 3)
Esquema 3: Protocolo de sincronização da ovulação associando progestágeno +BE+GnRH
BE PGF2α GnRH
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
Implante de progesterona Fonte: Kastelic et al., 1996
Tríbulo (2000) sugere a aplicação de CIDR-B, combinado com 2 mg de BE e 50 mg de P4, no dia 0 e uma aplicação de PGF2a no dia 7, ou seja, no momento da retirada do CIDR, e mais uma dose de 1mg de BE no D8, sendo que para todas vacas foram consideradas que o D9 era o dia do estro. (Esquema 4; Figura 4)
Esquema 4: Protocolo de sincronização da ovulação associando progestágeno +BE
BE + P4 PGF2α BE
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
Implante de progesterona ESTRO
Fonte: Tríbulo, 2000
6 Figura 4: Protocolo TECNOPEC para TETF em receptoras cíclicas (A) e Protocolo de ovulação simples (B)
Tratamentos que aumentam a concentração de P4 plasmática e a taxa de prenhez Fêmeas que falham na concepção apresentam menores níveis de progesterona do que aquelas que concebem. O desenvolvimento embrionário e a habilidade do concepto em secretar Interferon τ estão relacionados com a concentração sérica de progesterona.
Uma forma estudada para aumentar a concentração de progesterona plasmática a indução de múltiplas ovulações, através da indução de um maior recrutamento folicular pela utilização de eCG (gonadotrofina coriônica eqüina) durante o protocolo de sincronização (Esquema 5; Figura 5)
Esquema 5: Protocolo de TETF, usando Novormon® (eCG) e inovulação no D17, sem detecção de cio. (Prolise® = PGF2α; RIC-BE®= BE; DIB = P4)
BE eCG
PGF2α
BE Inovulação
TETF
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
Implante de progesterona
Fonte: TECNOPEC, 2008
Figura 5: Protocolo TECNOPEC para superovulação de receptoras
A B
7 Outro protocolo para SOV das receptoras indicado pela TECNOPEC (2008) como o de melhor resultado é o de inovulação em tempo fixo com Folltropin®. (Esquema 6; Figura 6)
Esquema 6: Protocolo TECNOPEC para inovulação em tempo fixo com uso de Folltropin®
BE BE+PGF2α
+FSH
Inovulação TETF
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
Implante de progesterona
Figura 6: Protocolo TECNOPEC de sincronização das receptoras com Folltropin® Seleção e Superovulação (SOV) das doadoras
Entende-se por doadoras as fêmeas que de alguma forma venham contribuir para o ganho genético de um rebanho ou de outros que irão adquirir produtos descendentes desses animais. As doadoras devem ter as características superiores à média de produtividade encontrada no rebanho, pois assim multiplica-se qualidade.
Vacas sadias que já atingiram a puberdade devem ser escolhidas. Doadoras que apresentam problemas reprodutivos, ciclo estral irregular, metrite e/ou anestro não respondem bem ao tratamento superovulatório.
A SOV é o aumento do número fisiológico de ovulações, próprio de cada espécie, provocado através da administração exógena de gonadotrofinas. Nos bovinos, considera-se que houve resposta ao tratamento quando se conseguem mais de duas ovulações (PFEIFER et al., 2005). A SOV, portanto, é um método de estimular diversos folículos terciários a se desenvolverem até o estágio de pré-ovulação, com subsequente ovulação (RASI, 2005).
A resposta das doadoras a SOV apresenta grande variabilidade tanto na taxa de ovulação, quanto na produção de embriões viáveis. Há grande efeito da idade da doadora, do coeficiente de endogamia da doadora, da ordem de colheita, da dose da droga e do número de inseminações sobre esses resultados (PEIXOTO et al., 2002). As doadoras podem ser superovuladas repetidamente a cada 40 dias, durante um período de 1 a 2 anos, com resultados satisfatórios (HASLER, 2003).
O hormônio mais usado atualmente para tratamentos superovulatórios em bovinos é o FSH, comercialmente representados no Brasil pelo Pluset® e Foltropin®.
8 Protocolos de SOV e IA das doadoras usando cio natural:
Utilizando o cio natural realizam-se oito aplicações de FSH com intervalos de 12 horas, para aumentar o recrutamento dos folículos e no 3° dia da SOV, realizam-se duas aplicações de PGF2α promovendo a luteólise, para que haja redução da P4 e consequente pico de LH, ocorrendo assim a ovulação (Esquema 7; RASI, 2005).
Esquema 7: Protocolo de SOV baseado no cio natural associado com FSH + PGF2α
DIA 0 10 11 12 13 14 15
MANHÃ CIO FSH FSH FSH
PGF2α FSH CIO IA
TARDE FSH FSH FSH
PGF2α
FSH IA
Fonte: Rasi, 2005
E2 + Implante de P4:
O uso de P4 e E2 em protocolos foi um grande avanço para a biotecnologia da reprodução animal, permitindo que a SOV fosse iniciada em fases aleatórias do ciclo estral dos bovinos pelo fato de sincronizar o início da onda folicular. Esses protocolos são tão eficazes no gado taurino quanto no zebuíno (BARUSELLI et al., 2006). O BE, em protocolos de SOV, é utilizado com a função de suprimir o desenvolvimento folicular, e sua resposta é mais eficaz quando combinada com aplicação de P4 IM na introdução de implante vaginal, CIDR®, de P4 (Esquema 8; RASI, 2005).
Esquema 8: Protocolo de SOV com E2+P4+ CIDR+PGF2α ( 8 a 12 dias após o cio)
DIA 0 4 5 6 7 8 9
MANHÃ P4 + E2 +CIDR IN
FSH FSH FSH FSH
CIDR OUT
CIO IA
TARDE FSH FSH FSH
PGF2α
FSH IA
Fonte: Rasi, 2005
Inseminação com tempo fixo
Nem sempre a ovulação está sincronizada nos tratamentos de SOV e, portanto há dificuldade no acerto das inseminações realizadas, levando á recuperação de inúmeras estruturas não fecundadas. O GnRH tem sido utilizado para controle da ovulação no final destes protocolos, assim como o LH (Esquemas 10, 11 e 12).
Esquema 10: Protocolo de SOV baseado no cio natural associado com FSH + PGF2α e GnRH/LH para a inseminação em tempo fixo.
DIA 0 10 11 12 13 14 15
MANHÃ CIO FSH FSH FSH
PGF2α
FSH GnRH / LH IA
TARDE FSH FSH FSH
PGF2α
FSH IA
9 Esquema 11: Protocolo de SOV com E2+P4+ CIDR+PGF2α ( 8 a 12 dias após o cio) + Gnrh/LH para a inseminação em tempo fixo
DIA 0 4 5 6 7 8 9
MANHÃ P4 + E2 CIDR IN
FSH FSH FSH
PGF2α FSH CIDR OUT
GnRH / LH IA
TARDE FSH FSH FSH
PGF2α
FSH IA
Esquema 12: Protocolo de SOV com aspiração folicular + CIDR e GnRH/LH para a inseminação em tempo fixo.
DIA 0 2 3 4 5 6 7
MANHÃ FSH FSH FSH FSH
CIDR OUT
GnRH / LH IA TARDE AspiraçãoCI
DR IN
FSH FSH FSH PGF2α
FSH IA
Segundo Manual da Tecnopec (2008) o protocolo de TETF para doadoras taurinas consiste em aplicar no dia do início do protocolo (D0) 3ml de BE (Ric-BE®) e inserir um dispositivo de liberação de P4 (Primer®), no D4 iniciar a SOV com 8 doses de FSH (Folltropin®) aplicadas de 12/12 horas, no D6 as 18h se usa PGF2α (Prolise®), no D7 às 18h se retira o dispositivo de liberação de P4, no D8 as 18h usa-se LH (Lutropin®), no D9 se faz duas IA sendo uma as 6h e outra as 18h. A coleta dos embriões é realizada no D15 (Esquema 13).
Esquema 13: Protocolo TETF doadoras taurinas
DIA 0 4 5 6 7 8 9 15
MANHÃ
Inserir PRIMER
+ 3ml RIC-BE
Folltropin Folltropin Folltropin Folltropin IA
Coleta de embriões TARDE
Folltropin Folltropin Folltropin + 2ml Prolise
Folltropin Retirada PRIMER
Lutropin IA
Fonte: TECNOPEC, 2008.
Já o protocolo recomendado para SOV em doadoras zebuínas é diferente das doadoras taurinas, onde o indutor de ovulação (LH) é aplicado com 12 horas de antecedência e as IAs também são adiantadas 12 horas em relação às doadoras taurinas (Esquema 14).
Esquema 14: Protocolo TETF doadoras zebuínas
DIA 0 4 5 6 7 8 9 15
MANHÃ
Inserir PRIMER
+ 3ml RIC-BE
Folltropin Folltropin Folltropin Folltropin Lutropin IA
Coleta de embriões TARDE
Folltropin Folltropin Folltropin + 2ml Prolise
Folltropin Retirada PRIMER
IA
Fonte: TECNOPEC, 2008.
10 Coleta de Embriões
A lavagem uterina é realizada 6 a 8 dias após manifestação do cio do tratamento superovulatório.
A coleta normalmente é realizada com o animal posicionado em estação, por método transcervical, utilizando-se um sistema fechado. Realiza-se anestesia epidural, utilizando-se 2 a 4 ml de lidocaína 2% e limpeza do reto e região da vulva. Utiliza-se um cateter de silicone contendo um balão inflável na sua extremidade distal, guiado inicialmente por um mandril de metal em seu lúmen para torná-lo rígido, para que o cateter seja introduzido e posicionado em um dos cornos uterinos. Remove-se o mandril e infla-se o balão com 10 a 20 ml de ar, para evitar refluxo de líquido durante a lavagem. O balão deve estar no terço médio do útero, para que a lavagem seja realizada no terço final. O cateter é acoplado a um equipo ligado a uma bolsa de um litro de PBS e a um filtro próprio para embriões. Todo o equipamento está disponível comercialmente com custos acessíveis. Lava-se cada corno uterino aproximadamente 10 vezes, massageando levemente, utilizando-se 500ml de PBS para cada.
O PBS deve estar numa temperatura de 25 a 30ºC (ambiente). Manter 2-3 cm de líquido no filtro durante a lavagem, para que as estruturas não grudem no fundo. O filtro com as estruturas coletadas deve seguir para o laboratório (Figura 7).
Figura 7: Lavagem uterina para coleta de embriões Rastreamento e classificação de embriões
O conteúdo do filtro é transferido para placa de Petri previamente quadriculada para procura dos embriões. Realiza-se 2 procuras completas removendo todas as estruturas viáveis e inviáveis encontradas. Estas estruturas são transferidas para outra placa de Petri contendo gotas de BSA 0,4%. Os embriões viáveis encontrados são lavados pelo menos 10 vezes em gotas de solução de BSA 0,4%, como recomendação da IETS (International Embryo Transfer Society), para remoção de agentes que podem estar aderidos à zona pelúcida.
Critérios para avaliação de embriões bovinos (IETS, 1998):
EXCELENTE ou BOM – GRAU I – estágio de desenvolvimento corresponde ao esperado; massa embrionária simétrica e esférica com blastômeros individuais que são uniformes em tamanho, cor e densidade; forma regular, a ZP não deve apresentar superfície côncava ou plana, deve ser lisa e, preferencialmente intacta; menos de 15% de células extrusadas.
11 REGULAR – GRAU II - estágio de desenvolvimento corresponde ao esperado; forma regular, ZP intacta ou não, irregularidades moderadas na forma geral da massa embrionária ou no tamanho;pelo menos de 50% das células compõem massa embrionária viável; menos de 15% de células extrusadas.
POBRE – GRAU III - estágio de desenvolvimento não corresponde ao esperado;
irregularidades maiores na forma geral da massa embrionária ou no tamanho; menos de 75%
das células degeneradas; pelo menos 25% das células compõem massa embrionária viável.
MORTO OU DEGENERADO – GRAU IV - estágio de desenvolvimento não corresponde ao esperado, embrião em degeneração; massa embrionária de menos de 25% de todo material celular presente no interior da ZP.
Transferência dos embriões:
Somente embriões classificados como grau I a III devem ser transferidos para receptoras. A transferência, de preferência deve ser realizada por via transcervical. O embrião precisa ser previamente acomodado no centro de uma palheta de 0,25ml com BSA, como mostra a Figura 8.
Figura 8: Esquema de palheta contendo embrião
As receptoras devem estar sincronizadas com a idade do embrião, ou seja, se o embrião tem 7 dias, a receptora deve ter ciclado 7±1 dias atrás. Antes de transferir os embriões, avaliar o CL da receptora, confirmando assim a ovulação. A TE ou inovulação consiste na deposição do embrião no terço médio-final do corno uterino ipsilateral ao corpo lúteo. Através de aplicador, semelhante ao utilizado na inseminação artificial, passa-se a cérvix, realizando-se a inovulação o mais cranialmente possível, na luz do corno uterino ipsilateral ao CL. Possibilita inovular muitas receptoras por dia com baixos custos, por isso é a técnica mais utilizada a campo.
Produção in vitro de Embriões Bovinos
As diversas vantagens e aplicações da produção in vitro de embriões (PIV) estão relacionadas à: determinação e controle do sexo dos produtos; aumento da eficiência dos programas de produção; rápidas e melhores possibilidades para executar programas de cruzamento; avaliação do efeito materno sobre a descendência; rápida multiplicação de raças;
facilidade de importação e exportação de material genético da fêmea; formação de bancos de gametas congelados; aumento da eficiência do sêmen congelado de alto valor genético; e estudo e desenvolvimento de outras biotécnicas reprodutivas a partir da micromanipulação de gametas e embriões (GONÇALVES et al., 2002).
Gonçalves et al. (2007) afirmam que o advento da aspiração folicular in vivo ou OPU (ovum pick up; Figura 9) e o aprimoramento das condições de cultivo in vitro tornaram viável à aplicação da PIV em escala comercial. Os índices atuais de blastocistos obtidos com a técnica de produção in vitro de embriões giram em torno de 20 a 50% (média de 35%).
ALGODÃO BSA AR BSA AR BSA
12 Segundo Gonçalves et al. (2002), cada fêmea bovina é capaz de produzir 50 a 100 embriões/ano, com um regime de duas punções semanais por doadora, durante vários meses.
Figura 9 – Esquematização da metodologia de Ovum pick up (OPU).
Coleta dos Complexos cumulus oócitos (CCOs):
A OPU apresenta uma maior flexibilidade em relação a TE, pois permite a obtenção de oócitos de fêmeas a partir dos 6 meses de idade (ainda com resultados inferiores nessa idade), de vacas prenhes até o terceiro mês de gestação ou mesmo após o parto.
A aspiração folicular duas vezes por semana produz uma maior percentagem de embriões grau 1 e um maior número de embriões transferíveis do que aspirações realizadas uma vez por semana (GIBBONS et al., 1994). No entanto, a aspiração folicular semanal de animais da raça Nelore pode produzir um bezerro por semana via PIV (WATANABE et al., 1998), isso demonstra a capacidade da associação OPU/FIV em multiplicar de maneira rápida e eficiente animais geneticamente superiores.
Além da OPU, a obtenção de oócitos a partir de ovários de abatedouro é uma ferramenta de grande valia para pesquisa. Metodologias de recuperação como slicing e aspiração folicular com agulha hipodérmica acoplada a uma seringa ou a uma bomba de vácuo proporcionam número suficiente de oócitos com boa morfologia para estudos in vitro (GONÇALVES et al., 2007).
Classificação de oócitos:
Os complexos cumulus-oócito (COC´s) coletados devem ser separados em quatro categorias, de acordo com as características baseadas na compactação e transparência das células do cumulus e homogeneidade e transparência do ooplasma, utilizando o sistema de classificação descrito por Leibfried & First (1979). Consideram-se COC´s viáveis os de classificação I a III, sendo os COC´S de classe IV descartados.
Grau I: Oócitos com cumulus compacto e mais de três camadas de células. Ooplasma com granulações finas e homogêneas, preenchendo o interior da zona pelúcida e de coloração marrom (Figura 10A).
Grau II: Oócitos com menos de três camadas de células do cumulus oophorus.
Ooplasma com granulações distribuídas heterogeneamente, podendo estar mais concentradas no centro e mais claras na periferia ou condensadas em um só local aparentando uma mancha escura. O ooplasma preenche todo espaço interior da zona pelúcida (Figura 10B).
13 Grau III: Oócitos que possuem o cumulus presente, mas expandido. Ooplasma contraído, com espaço entre a membrana celular e a zona pelúcida, preenchendo irregularmente o espaço perivitelino, degenerado, vacuolizado ou fragmentado (Figura 10C).
Grau IV: Oócitos desnudos sem células do cumulus, citoplasma com cor e granulação anormais ou com células expandidas com aspecto apoptótico (Figura 10D).
Figura 10 – Classificação de Oócitos.
Maturação in vitro:
Para que o oócito seja capaz de ser fecundado e posteriormente se desenvolver até o estágio de blastocisto, precisa ser maturado e, durante essa fase, sofrer diversas transformações tanto em seu citoplasma quanto em seu núcleo. Durante todo o seu desenvolvimento, o oócito se encontra no estágio diplóteno da prófase I ou estádio de vesícula germinativa (VG). In vivo, o reinício da meiose, ou maturação, tem início após o pico préovulatório de LH durante o estro e, in vitro, a retirada do oócito do contato com as células foliculares é suficiente para dar início ao processo de maturação nuclear. A maturação nuclear do oócito compreende a progressão do estágio diplóteno da primeira prófase meiótica até a fase de metáfase II (MII). Em bovinos, o período de maturação varia de 18 a 24 horas em atmosfera controlada contendo 5% de CO2 em ar e umidade saturada (GONÇALVES et al., 2007).
Diferentes condições de cultivo e protocolos já foram testadas in vitro para a maturação de oócitos, vários meios de maturação, tais como fluído sintético de oviduto (SOF; GANDHI et al., 2000;), Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), Ham’s F-10, Ham’s F-12 (SMETANINA et al., 2000) e meio de cultivo tecidual 199 (TCM 199), têm sido utilizados.
Fertilização in vitro:
O co-cultivo (espermatozóide e oócito) é realizado em temperatura de 39 °C, atmosfera com 5% de CO2 e umidade saturada. Os espermatozóides viáveis contidos em uma palheta de sêmen precisam ser separados do plasma seminal, crioprotetores, extensores e dos espermatozóides mortos antes de serem co-cultivados com os oócitos. Em bovinos, os métodos de separação espermática mais utilizados são o gradiente de PERCOLL e o swim-up.
Após a separação, os espermatozóides são diluídos a uma concentração de 1 a 5 x 106 sptz/ml de meio (GONÇALVES et al., 2007).
O co-cultivo (espermatozóide e oócito) é realizado em temperatura de 39 °C, atmosfera com 5% de CO2 e umidade saturada. Os espermatozóides viáveis contidos em uma palheta de sêmen precisam ser separados do plasma seminal, crioprotetores, extensores e dos espermatozóides mortos antes de serem co-cultivados com os oócitos. Para bovinos, os métodos de separação espermática mais utilizados são o gradiente de PERCOLL e o swim-up.
14 Após a separação, os espermatozóides são diluídos a uma concentração final de 1 a 5 x 106 espermatozóides viáveis/ml de meio (GONÇALVES et al., 2007).
Cultivo in vitro de embriões:
Em alguns laboratórios o co-cultivo de embriões com células somáticas foi utilizado por muitos anos com bons resultados. Entretanto, esse sistema tem sido substituído ao longo do tempo por sistemas mais simples que utilizam meios semi-definidos como os meios Charles Rosenkrans-1 (CR-1), Charles Rosenkrans-2 (CR-2; ROSENKRANS et al.,1993), meio simples otimizado enriquecido com potássio (KSOM) e fluído sintético de oviduto (SOF) associados a uma atmosfera gasosa controlada contendo baixa tensão de oxigênio (GONÇALVES et al., 2007). Fatores de crescimento como o fator de crescimento semelhante à insulina (IGF-1) e fator de crescimento e transformação β1 (TGFβ1) têm sido adicionados ao meio de cultivo in vitro objetivando melhorar o desenvolvimento embrionário (MATSUI et al., 1997).
O tempo de cultivo in vitro varia de 7-9 dias, dependendo do objetivo da rotina de PIV, em temperatura de 39 ºC com atmosfera controlada (5% de O2, 5% de CO2 e 90% de N2) e umidade saturada. A taxa de blastocisto geralmente é avaliada no 7º dia de cultivo in vitro sendo que, os blastocistos produzidos podem permanecer na estufa de cultivo até o 9º dia caso se deseje avaliar a taxa de eclosão in vitro (GONÇALVES et al., 2007).
Micromanipulação de Embriões
Os avanços obtidos nas biotécnicas reprodutivas ao longo dos anos permitiram uma maior participação da fêmea bovina no processo de melhoramento genético do rebanho. Isso porque o número de descendentes deixados por uma única fêmea ao longo de sua vida reprodutiva aumentou significativamente com o aperfeiçoamento das técnicas de transferência e produção in vitro de embriões, entretanto, uma das principais desvantagens da PIV ainda está na baixa produção e qualidade de embriões (GONÇALVES et al., 2007) levando a baixas taxas de gestação após inovulação, além do elevado custo de produção de cada embrião.
Nesse contexto, a produção de animais geneticamente idênticos é de grande utilidade à indústria pecuária, principalmente por aumentar o número de descendentes de pais geneticamente valiosos. Além disso, o uso de animais monozigóticos em vários estudos comparativos reduziria substancialmente o número de animais necessários para a geração de dados estatisticamente válidos (YANG & ANDERSON, 1992).
Bipartição de Embriões:
Apenas 25% da massa celular total do embrião é requerida para manter sua viabilidade embrionária. Neste caso embriões bipartidos podem manter ainda razoável capacidade de desenvolvimento (WILLADSEM & POLGE, 1981).
Uma das aplicações da micromanipulação de embriões estaria relacionada à possibilidade de obtenção de células para análises genéticas, como determinação de sexo, diagnóstico e prevenção de disseminação de doenças genéticas entre outras (GARCIA &
RODRIGUES 2002).
15 A bipartição de embriões com finalidades comerciais iniciou-se em meados da década de 80 (BAKER & SHEA, 1985). A partir deste período, vislumbrou-se a possibilidade de aumentar a progênie de machos e fêmeas pela coleta e posterior bipartição de embriões.
Diferentes protocolos têm sido empregados para bipartição de embriões de bovinos, ovinos, caprinos e outras espécies (HERR et al., 1990).
Para o processo de bipartição, os embriões selecionados são transportados para placa de Petri e lavados 4 vezes em solução de PBS, visando à remoção de todo o conteúdo protéico da superfície da ZP.
Com o auxílio de um estereomicroscópio com base de transiluminação acoplado a um dispositivo de micromanipulação mecânico, cada estrutura é posicionada de forma a permitir uma divisão o mais equitativa possível da massa embrionária, objetivando a separação do embrião em duas metades com a maior semelhança. Este procedimento simplificado de bipartição embrionária utiliza lâmina metálica de microcirurgia (Figura 11).
Os embriões podem ser bipartidos nas fases de mórula, blastocisto inicial e blastocisto.
Embriões na fase de mórula podem ser bipartidos em qualquer sentido. Aqueles na fase de blastocisto são divididos de forma a se obter metades equitativas da blastocele e botão celular.
Figura 11 – Sequência de Bipartição de uma mórula.
Separação de Blastômeros:
A totipotência dos blastômeros isolados ou em grupos pequenos já foi relatada, principalmente com células originadas de embriões de 2 a 8 células. Para embriões com estágio de desenvolvimento mais adiantado a totipotência é dependente de um grupo maior de células (WILLIANS et al., 1984).
A separação dos blastômeros de embriões de 2 ou 4 células pode ser obtida pela ruptura da zona pelúcida e posterior proteólise ou separação mecânica. Uma vez rompida a zona pelúcida, os blastômeros podem ser separados por repetidas aspirações e retorno do conteúdo para uma placa de Petri com meio de cultivo apropriado (LINDSEY, 2001).
Tagawa et al. (2008) utilizaram processos enzimáticos e mecânicos para a separação de blastômeros de embriões bovinos. Estes autores expuseram os embriões em estágio de 2 células à pronase durante 1 a 2 minutos, para remoção da zona pelúcida.
Quando cultivados em WOW (Well of the well culture system), os blastômeros de embriões bovinos de oito células produzidos in vitro, mesmo após separação em duas metades, mostraram a mesma capacidade de desenvolver para o estágio de blastocisto quanto os embriões de oito células intactos cultivados pelo método padrão de cultivo in vitro. Além disso, uma alta taxa de gestação foi obtida com a transferência desses blastocistos (TAGAWA et al., 2008).
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