Avaliação in vitro da viabilidade de Enterococcus faecalis e Candida albicans nos túbulos dentinários após a aplicação de hidróxido de cálcio e clorexidina gel 2%

Texto

(1)Avaliação in vitro da viabilidade de Enterococcus faecalis e Candida albicans nos túbulos dentinários após a aplicação de hidróxido de cálcio e clorexidina gel 2%. RONAN JACQUES REZENDE DELGADO. Dissertação apresentada à Faculdade de Odontologia de Bauru, Universidade de São Paulo, como parte dos requisitos para obtenção. do. título. de. Mestre. Odontologia, na área de Endodontia.. Bauru 2007. em.

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(3) Avaliação in vitro da viabilidade de Enterococcus faecalis e Candida albicans nos túbulos dentinários após a aplicação de hidróxido de cálcio e clorexidina gel 2%. RONAN JACQUES REZENDE DELGADO. Dissertação. apresentada. à. Faculdade. de. Odontologia de Bauru, da Universidade de São Paulo, como parte dos requisitos necessários para obtenção do título de Mestre em Odontologia, área de Endodontia. Orientador: Prof. Dr. Norberti Bernardineli. Bauru 2007.

(4) D378a. Delgado, Ronan Jacques Rezende Avaliação in vitro da viabilidade de Enterococcus faecalis e Candida albicans nos túbulos dentinários após a aplicação de hidróxido de cálcio e clorexidina gel 2%/ Ronan Jacques Rezende Delgado -- Bauru, 2007. xxviii, 184 p. : il. ; 30 cm. Dissertação (Mestrado) -- Faculdade de Odontologia de Bauru. Universidade de São Paulo.. Orientador: Prof. Dr. Norberti Bernardineli. Autorizo, exclusivamente pra fins acadêmicos e científicos, a reprodução total ou parcial desta tese, por processos fotocopiadores e/ou meios eletrônicos.. Assinatura do autor: Data: 23/05/07. Comitê de Ética no Ensino e Pesquisa em Animais da FOBUSP: projeto de pesquisa aprovado em 20 de setembro de 2005. Número do protocolo: 28/2006.

(5) Ronan Jacques Rezende Delgado Dados Curriculares 02 de julho de 1978. Nascimento. Belo Horizonte - MG Romeu Jacques Delgado. Filiação. Maria do Rosário Rezende Delgado Graduação. 1997 - 2001. em. Odontologia. pela. Universidade Federal de Minas Gerais Aperfeiçoamento em Endodontia pelo. 2002 - 2002. Centro de Odontologia Avançada de Belo Horizonte – MG Especialização. 2003 - 2004. em. Endodontia. pela. Faculdade de Odontologia de Bauru da Universidade de São Paulo Mestrado em Endodontia pela Faculdade. 2005 - 2007. de. Odontologia. de. Bauru. da. Regional. de. Universidade de São Paulo. CROMG. –. Conselho. Odontologia de Minas Gerais SBPqO. Associações. –. Sociedade. Brasileira. de. Pesquisa Odontológica ABOMG – Associação Brasileira de Odontologia Seção de Minas Gerais.. iii.

(6) “Vence na vida quem diz sim” Chico Buarque e Rui Guerra.

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(8) Dedicatória.

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(10) ______________________________________________________________________ Dedicatória. A Minha Queridíssima Mãe... ...Meu Maior Exemplo... “Tu és a mais bela composição divina, De grandeza inexplicável e superioridade absoluta. Tu alternas e temperas A guerreira e o anjo, A firmeza e a ternura A força e a sensibilidade O poder e o amor. Estás sempre ali, Protegendo estes filhos teus Que para ti, são trunfos, glórias. Amas mais e sempre, E este teu amor nos conforta E nos enche da coragem necessária Para seguirmos em frente. Acabas por fim, Sendo o retrato vivo da perseverança, Da esperança E da luta por um mundo melhor.”. Minha querida mãe, mais uma etapa se cumpriu e novamente nada disso seria possível sem o seu apoio e sua presença. Tê-la por perto nos trás segurança e confiança para seguirmos sempre em frente. A sua personalidade forte e intensa ilumina a todos, nos abastece de energia e nos enche de coragem para nunca recuar. Durante estes dois anos os desafios foram muitos e a saudade enorme. Obrigado pela confiança em mim depositada e por compreender minha ausência nestes anos tão difíceis. Agradeço. pela. doação. extremada. superando. inúmeras. dificuldades, para que seus filhos realizassem seus sonhos.. A. senhora sempre nos transmitiu valores como a dedicação ao trabalho, a honestidade e o respeito ao semelhante. Esta vitória também é sua. Amo-te eternamente.. ______________________________________________________________________ vi.

(11) Ao Meu Querido PAI (in memoriam) “Enquanto houver você do outro lado Aqui do outro eu consigo me orientar A cena repete a cena se inverte enchendo a minha alma d'aquilo que outrora eu deixei de acreditar tua palavra, tua história tua verdade fazendo escola e tua ausência fazendo silêncio em todo lugar metade de mim agora é assim de um lado a poesia o verbo a saudade do outro a luta, a força e a coragem pra chegar no fim e o fim é belo incerto... depende de como você vê o novo, o credo, a fé que você deposita em você e só Só enquanto eu respirar Vou me lembrar de você” O Anjo mais velho O Teatro Mágico. Mais um dia especial e importante pra mim e o senhor novamente não está aqui presente pra me abraçar. Justo você que sempre se desdobrou para dar a mim e ao meu irmão tudo que precisávamos. Justo na hora de colher os frutos de tanto trabalho, você não está aqui para desfrutar de uma vitória que também é sua. Infelizmente não houve tempo, o inevitável nos separou. Já se passaram 8 anos de sua ausência e continuamente diversas situações do dia-dia me remetem ao senhor. Não há um único dia em que você não povoe meus pensamentos. A sua origem simples e a juventude difícil, de muito sacrifício, mostraram-lhe que a educação seria a única alternativa honesta para busca de um futuro melhor. Agradeço por sempre acreditar incondicionalmente em mim. Obrigado por transformar minhas pequenas vitórias em grandes acontecimentos, a fim de reforçar o meu potencial e estimular minha autoconfiança. O senhor estará sempre presente em minha memória e em meu coração.. ______________________________________________________________________ vii.

(12) ______________________________________________________________________ Dedicatória. Ao Meu Queridíssimo Irmão.... Agradeço por compreender meu sonho e minha ausência, respeitando minhas decisões, e por ajudar, a sua maneira, sempre que preciso. Agradeço especialmente por ter segurado toda a barra destes anos difíceis que nossa família passou. Obrigado por sempre me receber de forma alegre e carinhosa em minhas idas a BH. Tenho enorme carinho, respeito e consideração por você.. “Dois irmãos, quando vai alta a madrugada E a teus pés vão-se encontrar os instrumentos Aprendi a respeitar tua prumada E a desconfiar do teu silêncio” Morro dois irmãos / Chico Buarque. A Minha Queridíssima Karina Simone.... Obrigado por estar sempre disponível, por me escutar sem que eu precisasse medir palavras. Por respeitar e apoiar minhas decisões e por proporcionar todo o suporte emocional necessário para superar os momentos mais difíceis. Obrigado por fazer de meus problemas, seus problemas, por ser uma parceira incondicional em todos os momentos. Desculpe pela minha ausência e por não ter estado presente fisicamente nesse período tanto quanto gostaríamos. Obrigado pelos inúmeros momentos felizes que dividimos juntos e que reafirmaram nossos laços de afeto, cumplicidade e carinho.. Saiba que você sempre esteve comigo em meus. pensamentos e em meu coração apesar da distância. Certamente não teria vencido sem você.. “Na minha idéia vives plenamente És a pessoa Com todas as canções Os momentos bons E as horas más Que a memória coa” Romance / Enriquez, Bardotti, Chico Buarque. Amo todos vocês eternamente.... ______________________________________________________________________ viii.

(13) Agradecimentos.

(14) ______________________________________________________________________ Agradecimentos. A Deus.... Agradeço pela saúde concedida ao longo desses anos, pré-requisito necessário. para. vencer. qualquer. desafio.. Obrigado. pela. maravilhosa. oportunidade de aprender a cada dia e pelas pessoas maravilhosas que cruzaram meu caminho aqui em Bauru. Agradeço acima de tudo por ter olhado pelo bem mais precioso durante minha ausência: minha família, especialmente por minha mãe.. “E tudo que eu criar pra mim, vai me abraçar de novo na semana que vem” Criador – O teatro mágico. Aos Meus Familiares.... Agradeço à minha avó pelo exemplo de coragem , firmeza e dedicação na difícil missão de criar seus nove filhos e a todos os tios, tias, primos e primas de nossa grande família. Agradeço em especial aos meus padrinhos José Reis e Dagna pela forma carinhosa e interessada com que sempre se colocaram. Gostaria de manifestar minha eterna gratidão pelo apoio irrestrito dado por vocês a minha querida mãe nesse período tão difícil. Em todos os momentos vocês estiveram firmes dando todo apoio e suporte emocional necessários. Devo a conclusão deste mestrado também a vocês, que fizeram o meu papel junto à ela durante minha ausência. Vocês são pessoas muito especiais para todos nós e a liderança e doação desempenhada por vocês são fundamentais para união de nossa grande família. Agradeço também aos meus queridos primos: Cristiane, Flávia e Gustavo. Agradeço ao Eros Damasceno companheiro incondicional de minha mãe, por ter cuidado dela com tamanho zelo, amor e carinho nestes anos tão difíceis. A sua alegria e amor verdadeiro deram todo o suporte emocional que ela precisava para vencer mais este desafio. A conclusão deste mestrado também se deve a você. A sua presença ao lado dela permitiu que eu permanecesse em Bauru para finalizar meu Mestrado. Receba meu muito obrigado e minha eterna gratidão! À Lourdinha e Raimundo pela atenção, confiança, carinho e respeito com que sempre me tiveram. Obrigado por compreenderem minha ausência durante este período.. ______________________________________________________________________ x.

(15) ______________________________________________________________________ Agradecimentos. Ao Prof. Dr. Norberti Bernardineli.... Agradeço ao meu orientador pela oportunidade de concretizar um sonho profissional tão almejado e pelo aprendizado diário ao longo destes anos. Levarei como exemplo sua forma tranqüila, humilde e imparcial de lidar com seus alunos, sempre privilegiando o respeito a suas individualidades e a liberdade de suas decisões, acreditando que a independência e autonomia são partes fundamentais para o aprendizado. Espero ter sido digno da confiança em mim depositada. Obrigado por sua amizade, cordialidade e disponibilidade.. À Profª. Drª. Ana Paula Campanelli.... Agradeço pela confiança e pela recepção carinhosa e atenta em seu laboratório. Obrigado por permitir o livre acesso às dependências do departamento e por me tratar de forma indiferenciada em relação a seus alunos. A sua participação foi indispensável e decisiva para concretização deste projeto. Obrigado por estar sempre disponível e pela maravilhosa oportunidade de dividir junto a você e seus orientados um ambiente de pesquisa. Agradeço pelo incentivo constante e pelo respeito às minhas limitações. Levarei como exemplo sua forma dedicada, sincera e amistosa de lidar com seus alunos. Quero que saiba que tenho enorme gratidão, admiração e carinho por você.. Aos Professores da Disciplina de Endodontia.... Agradeço ao Prof. Dr. Ivaldo Gomes de Morais pela acolhida sempre amistosa, pela atenção, disponibilidade e pelo exemplo de humildade, correção e de amor à docência. Ao Prof. Dr. Clóvis Monteiro Bramante pelo exemplo de dedicação diária e extremada à carreira docente. Sua competência e credibilidade certamente serão referenciais para todos os seus alunos. Ao Prof. Dr. Roberto. Brandão Garcia por sua imensa disponibilidade, interesse e preocupação com o bem estar de seus alunos. Sua simplicidade, cordialidade e polidez serão exemplos a serem seguidos em minha vida profissional. Agradeço a todos os senhores, acima de tudo, pela oportunidade de trabalho e aprendizado concedidos ao longo destes anos. A vocês minha eterna gratidão!. ______________________________________________________________________ xi.

(16) ______________________________________________________________________ Agradecimentos. Aos Meus Amigos Especiais... ...o Maior Presente que Bauru me Proporcionou... À querida CARLA SIPERT agradeço pelos inúmeros sorrisos e discussões que dividimos juntos. Obrigado por estar sempre disposta a escutar, mesmo tendo sempre tanto a dizer. Pela amizade honesta, sincera e verdadeira. Por estar sempre disponível antes mesmo de lhe pedir auxílio. Aprendi com você em cada minuto de convivência. Saiba que minha admiração e carinho por você são imensos. Parabéns pela pessoa encantadora e radiante que você é. Tenho certeza que um futuro promissor está reservado pra você. Á querida MARCELA CLAUDINO agradeço por estar sempre por perto desde o início. Pelos almoços e jantares em que fomos felizes, simplesmente pelo prazer de estarmos todos juntos. Não há ninguém que não se renda ao seu carisma, ao seu jeito doce de tratar a todos e a sua lealdade. Saiba que tenho enorme consideração e carinho por você. Obrigado por sempre zelar por nossa amizade e parabéns pela família maravilhosa que você tem. Ao meu querido amigo WAGNER BASEGGIO agradeço pelo privilégio de sua amizade ao longo destes anos. Sua inteligência e capacidade diferenciadas são reconhecidas por todos aqueles que apreciam e compreendem o seu verdadeiro valor. O valor de um amigo companheiro, disponível e leal. Aprendi muito com você e obrigado por estar sempre por perto. Á querida CLARICE ELOY agradeço pela alegria contagiante e pelo exemplo de entrega à vida de peito aberto. É maravilhoso poder ter seu sorriso fácil por perto. Obrigado pelos muitos momentos divertidos e pelos problemas que dividimos e superamos juntos. Ao meu querido amigo FERNANDO OROSCO agradeço pela preciosa amizade construída ao longo destes anos. Meu amigo, sempre que precisei você esteve disponível para ajudar no que fosse preciso e com um sorriso aberto no rosto. Você é um grande exemplo de doação desinteressada pelo outro. Obrigado pelos bons momentos que dividimos juntos e saiba que tenho enorme apreço e consideração por você. À querida THAÍS GASPAROTO pela afinidade intensa e instantânea que nos uniu. Além de minha enorme admiração por sua competência e dedicação gostaria de ressaltar o enorme carinho que tenho por você. É impressionante como pessoas felizes precisam de muito pouco para se divertirem juntas. Agradeço pela amizade permanente, sincera e desinteressada. Obrigado por proporcionar alegria mesmo nos momentos mais difíceis.. “Todos juntos somos fortes Somos flecha e somos arco Todos nós no mesmo barco Não há nada pra temer Ao meu lado há um amigo Que é preciso proteger Todos juntos somos fortes Não há nada pra temer.” Todos Juntos Chico Buarque, Enriquez, Bardotti. ______________________________________________________________________ xii.

(17) ______________________________________________________________________ Agradecimentos. Agradeço Também.... Aos funcionários da disciplina de Endodontia Dona Neide Leandro, Edmauro de Andrade, Suely Bettio, Patrícia Lopes e Cleide. Pela forma carinhosa e cordial com que sempre me trataram. Obrigado por se colocarem disponíveis para nos ajudar sempre que preciso. Saibam que terão sempre meu carinho e mina consideração. Obrigado por tudo!!! Aos funcionários da disciplina de Microbiologia e Imunologia Dalva Oliveira, Cláudia Gimenez e Marilza. Pela maravilhosa acolhida recebida durante minha passagem pelo departamento. Agradeço por todo apoio e atenção durante o desenvolvimento deste projeto de pesquisa. Agradeço em especial ao responsável pelo Laboratório de Microbiologia André Luis da Silva pelas valiosas informações e pelo treinamento transmitido no início da execução deste projeto, que foram fundamentais para sua conclusão. Obrigado pela disponibilidade e paciência. Gostaria de ressaltar o meu carinho e apreço por todos vocês. Aos queridos amigos da turma de Mestrado em Endodontia Patrícia Coneglian, Bruno Vasconcelos, Roberta Garcia, Márcia Magro e Ramiro Oropeza. Agradeço pela maravilhosa convivência, recheada de bons momentos, que levarei sempre comigo e dos quais sentirei imensa saudade. Obrigado por todo aprendizado e auxílio conferido ao longo destes anos. Todos vocês, cada um a sua maneira, foram especiais pra mim. Aos queridos amigos de Pós-Graduação do Departamento de Imunologia e Microbiologia Valéria Gelani, Eduardo Figueira e Tatiana Salles. Obrigado por me receberem com tamanho carinho, atenção e respeito durante minha passagem pelo laboratório. Aprendi muito com cada um de vocês durante todo este período. Agradeço por toda colaboração no desenvolvimento desta dissertação. Terão sempre minha gratidão e admiração. Aos alunos de iniciação científica e estagiários do departamento de Imunologia e Microbiologia, Michelle Sabrina, Rodrigo, Ana Paula, Vanessa e Rodolfo pela convivência alegre, amistosa e respeitosa que tivemos durante este período. Obrigado pela disponibilidade, por todo auxílio e principalmente pela oportunidade de aprender sempre.. ______________________________________________________________________ xiii.

(18) ______________________________________________________________________ Agradecimentos Aos queridos amigos da Pós-Graduação, Janine Araki, Luciana Pinto, Kátia Reis, Ericson Janólio, Danielle Albuquerque, Flora Távora e Renata Cordeiro que foram fundamentais para preencher o vazio deixado pela ausência da família. Agradeço pelos vários momentos felizes e de muito aprendizado que dividimos juntos. Obrigado pelos sorrisos sinceros compartilhados. Aos funcionários da biblioteca – FOB / USP, Rita Paglione, Ademir Padilha, Cybelle Fontes, Valéria Ferraz, Vera Boccato, Ana Paula Moço, César Campos, Maria Caetano, Jane Nogueira e Maria Formenti pela acolhida amistosa e pelo suporte fundamental para a conclusão deste trabalho. Ao Centro Integrado de pesquisa (CIP) na figura de seu coordenador Prof. Dr, Vinícius Carvalho Porto e de seus funcionários Marcelo e Dona Neuza pela confiança, disponibilidade e pela concessão ao acesso às dependências do CIP. Agradeço em especial à funcionária Márcia, responsável pelo setor de microscopia, pela disponibilidade, empenho e paciência na capturação das imagens junto ao confocal. À Eliana Soares (TECA) funcionária do Setor de Tecnologia Educacional pela colaboração e atenção na confecção das imagens das culturas microbiológicas. À Sandra Guazi funcionária da Assistência Técnica Financeira pela atenção disponibilizada na aquisição dos marcadores fluorescentes. Ao Prof. Dr. José Roberto Lauris da disciplina de Saúde Coletiva pela colaboração na análise estatística deste trabalho e à Profª. Drª. Vanessa Soares Lara da disciplina de Patologia pela disponibilidade e colaboração. Ao núcleo de apoio à pesquisa/ microscopia eletrônica aplicada à pesquisa agropecuária (NAP/MEPA) da Escola Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz” da Universidade de São Paulo (ESALQ/USP) na figura do Prof. Dr. Elliot Watanabe Kitajima pelo auxílio e permissão para utilização do centro de microscopia eletrônica de varredura. Ao Instituto Lauro de Souza Lima pela atenção e disponibilidade na doação de sangue de carneiro para preparação de meio de cultura. Aos alunos do curso de doutorado em Endodontia Augusto Bodanezi, Ricardo Bernardes, Adriana Lustosa, Fausto Victorino e Jarcio Baldi pelo convívio e experiência profissional compartilhados.. ______________________________________________________________________ xiv.

(19) ______________________________________________________________________ Agradecimentos À Minke Gasparoto pela amizade verdadeira e pelos momentos divertidos que dividimos juntos.. À Aline Araújo e Angélica Lopes pela amizade sincera e honesta construída ao longo da graduação. Nem a distância nem o tempo apagaram a admiração, carinho e respeito que sentimos uns pelos outros.. Aos amigos Ludmilla Moreira, Thereza Cristina Silvestri e Ângelo Basso do curso de Especialização em Endodontia pelos momentos de amizade e aprendizado que dividimos juntos.. À Faculdade de Odontologia de Bauru da Universidade de São Paulo na figura de seu Diretor Prof. Dr. Luiz Fernando Pegoraro e de seu Vice-Diretor Prof. Dr. José Carlos Pereira. À comissão de Pós-Graduação da Faculdade de Odontologia de Bauru da Universidade de São Paulo na figura da Presidente Profª. Drª. Maria Aparecida de Andrade Moreira Machado e do Vice-Presidente Prof. Dr. Paulo César Rodrigues Conti. À secretaria de Pós-Graduação da Faculdade de Odontologia de Bauru da Universidade de São Paulo na figura das funcionárias Giane Quintela, Ana Letícia Momesso e Maria Margareth Mokarzel.. À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pelo auxílio pecuniário concedido, fundamental para conclusão deste curso.. ______________________________________________________________________ xv.

(20) ______________________________________________________________________ Agradecimentos. Minha gratidão e admiração..... Ao Prof. Dr. Alceu Berbert exemplo de dedicação, entusiasmo e amor a profissão. Infelizmente não tivemos o privilégio de sua convivência durante o curso de mestrado, mas certamente sua competência e amor à docência serão referenciais em minha carreira. Minha grande admiração!. Ao Prof. Luiz Carlos Feitosa Henriques docente do Departamento de Odontologia Restauradora da Faculdade de Odontologia da Universidade Federal de Minas Gerais. Agradeço a este educador exemplar, que tive a felicidade de conhecer ainda no meu curso de graduação, pelo aprendizado, pelos conselhos e por ter me estendido à mão no momento em que era apenas um ex-aluno, que não tinha nada a oferecer além do meu esforço e dedicação. Obrigado por sempre ter acreditado em meu potencial e por despertar em mim o interesse pela docência. Seu exemplo de humildade, equidade, respeito e polidez ao se relacionar com seus alunos serão referenciais em minha futura carreira docente. A concretização desta etapa deve-se também a todo o suporte fornecido por você. Minha eterna gratidão e admiração. Obrigado!. À Profª. Drª. Efigênia Ferreira e Ferreira docente do Departamento de Odontologia Social e Preventiva da Faculdade de Odontologia da Universidade Federal de Minas Gerais. Agradeço por despertar em mim o interesse pela pesquisa ainda nos tempos de iniciação científica durante a graduação. Obrigado pela disponibilidade, pelo apoio e pela forma atenciosa com que sempre me tratou.. ______________________________________________________________________ xvi.

(21) ______________________________________________________________________ Sumário. Sumário RESUMO. xxvii. 1 INTRODUÇÃO. 3. 2 REVISÃO DE LITERATURA. 11. 2.1 Microbiologia das infecções endodônticas...............................................................13 2.2 Distribuição dos microorganismos no sistema de canais radiculares........................24 2.3 Medicação intracanal................................................................................................31 2.3.1 Relevância do emprego de medicação intracanal em endodontia .........................31 2.3.2 Hidróxido de cálcio ...............................................................................................36 2.3.3 Clorexidina ............................................................................................................40 2.3.4 Hidróxido de cálcio associado à clorexidina..........................................................44 2.3.5 Comparação da eficácia antimicrobiana entre as medicações intracanais..............45 2.4 Caracterização e análise de viabilidade microbiana..................................................55. 3 PROPOSIÇÃO. 63. 4 MATERIAL E MÉTODOS. 67. 4.1 Seleção e preparo dos dentes .....................................................................................67 4.2 Contaminação dos espécimes ....................................................................................71 4.3 Divisão, preparo e aplicação das medicações intracanais .........................................75 4.4 Coleta das amostras ...................................................................................................79 4.5 Processamento das amostras para cultura microbiológica ........................................80 4.6 Processamento das amostras para microscopia de fluorescência ..............................85 4.7 Microscopia eletrônica de varredura .........................................................................89 4.8 Análise estatística ......................................................................................................90 xvii.

(22) ______________________________________________________________________ Sumário 5 RESULTADOS. 93. 5.1 Avaliação da atividade antimicrobiana das medicações intracanais sobre Enterococcus faecalis através da contagem de UFC .......................................93 5.2 Avaliação da atividade antimicrobiana das medicações intracanais sobre Enterococcus faecalis através de microscopia de fluorescência....................101 5.3 Avaliação da atividade antimicrobiana das medicações intracanais sobre Candida albicans através da contagem de UFC ............................................109 5.4 Avaliação da atividade antimicrobiana das medicações intracanais sobre Candida albicans através de microscopia de fluorescência...........................117 5.5 Microscopia eletrônica de varredura.......................................................................125. 6 DISCUSSÃO. 131. 7 CONCLUSÕES. 147. ANEXOS. 151. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS. 159. ABSTRACT. 183. ______________________________________________________________________ xviii.

(23) ______________________________________________________________________ Lista de Figuras. Lista de Figuras FIGURA 1 Seleção e preparo dos espécimes. ...............................................................69 FIGURA 2 Contaminação dos espécimes. ....................................................................73 FIGURA 3 Aplicação das medicações intracanais........................................................77 FIGURA 4 Coleta das amostras ....................................................................................81 FIGURA 5 Processamento das amostras para cultura microbiológica..........................83 FIGURA 6 Processamento das amostras para microscopia de fluorescência ...............87 FIGURA 7 Avaliação do desempenho antimicrobiano das medicações intracanais sobre Enterococcus faecalis presentes nos túbulos dentinários através da contagem de UFC.............................................................................................................................97 FIGURA 8 Culturas de Enterococcus faecalis...............................................................99 FIGURA 9 Avaliação do desempenho antimicrobiano das medicações intracanais sobre Enterococcus faecalis presente nos túbulos dentinários através da análise por microscopia de fluorescência.........................................................................................105 FIGURA 10 Fotomicrografias de Enterococcus faecalis após aplicação de medicação intracanal.......................................................................................................................107 FIGURA 11 Avaliação do desempenho antimicrobiano das medicações intracanais sobre Candida albicans presente nos túbulos dentinários através da contagem de UFC...............................................................................................................................113 FIGURA 12 Culturas de Candida albicans.................................................................115 ______________________________________________________________________ xix.

(24) ______________________________________________________________________. Lista de Figuras. FIGURA 13 Desempenho antimicrobiano das medicações intracanais sobre Candida albicans presente nos túbulos dentinários através da análise por microscopia de fluorescência..................................................................................................................121 FIGURA 14 Fotomicrografias de Candida albicans após 14 dias de aplicação de medicação intracanal.....................................................................................................123 FIGURA 15 Microscopia eletrônica de varredura de dentina radicular humana submetida à remoção de smear layer e à contaminação por Enterococcus faecalis e Candida albicans...........................................................................................................127. ______________________________________________________________________ xx.

(25) ______________________________________________________________________ Lista de Tabelas. Lista de Tabelas TABELA 1 Distribuição e agrupamento dos espécimes em função do microorganismo e medicação avaliados..........................................................................................................75 TABELA 2 Substâncias neutralizadoras recomendadas em função das medicações intracanais avaliadas..........................................................................................................79 TABELA 3 Distribuição dos espécimes para análise em MEV........................................89 TABELA 4 Avaliação da atividade antimicrobiana de hidróxido de cálcio, clorexidina gel 2% e da associação hidróxido de cálcio e clorexidina gel 2% sobre Enterococcus faecalis através da contagem de UFC.........................................................94. TABELA. 5. Comparação. do. desempenho. antimicrobiano. das. medicações. intracanais sobre E. faecalis, através das médias de logUFC registradas na extensão de 0 – 100 µm da dentina radicular........................................................................................95. TABELA. 6. Comparação. do. desempenho. antimicrobiano. das. medicações. intracanais sobre E. faecalis, através das médias de logUFC registradas na extensão de 100 – 200 µm da dentina radicular....................................................................................95 TABELA 7 Avaliação da atividade antimicrobiana da pasta de hidróxido de cálcio, clorexidina gel 2% e da associação entre hidróxido de cálcio e clorexidina gel 2% sobre Enterococcus faecalis pela determinação de bactérias viáveis e não viáveis através da análise em microscopia de fluorescência de amostras da dentina radicular referentes à extensão de 0 - 100 µm....................................................................................................103 TABELA 8 Avaliação da atividade antimicrobiana da pasta de hidróxido de cálcio, clorexidina gel 2% e da associação entre hidróxido de cálcio e clorexidina gel 2% sobre Enterococcus faecalis pela determinação de bactérias viáveis e não viáveis através da análise em microscopia de fluorescência de amostras da dentina radicular referentes à extensão de 100 - 200 µm................................................................................................103 ______________________________________________________________________ xxi.

(26) ______________________________________________________________________. Lista de Tabelas. TABELA 9 Comparação do desempenho antimicrobiano das medicações intracanais sobre E. faecalis, através da média de porcentagem de bactérias viáveis registradas na extensão de 0 – 100 µm da dentina radicular...................................................................104 TABELA 10 Comparação do desempenho antimicrobiano das medicações intracanais sobre E. faecalis, através da média de porcentagem de bactérias viáveis registradas na extensão de 100 – 200 µm da dentina radicular...............................................................104 TABELA 11 Avaliação da atividade antimicrobiana da pasta de hidróxido de cálcio, clorexidina gel 2% e da associação hidróxido de cálcio e clorexidina gel 2% sobre Candida albicans através da contagem de UFC..............................................................110 TABELA 12 Comparação do desempenho antimicrobiano das medicações intracanais sobre C. albicans, através das médias de logUFC registradas na extensão de 0 – 100 µm da dentina radicular..........................................................................................................111 TABELA 13 Comparação do desempenho antimicrobiano das medicações intracanais sobre C. albicans, através das médias de logUFC registradas na extensão de 100 – 200 µm da dentina radicular...................................................................................................111 TABELA 14 Avaliação da atividade antimicrobiana da pasta de hidróxido de cálcio, clorexidina gel 2% e da associação entre hidróxido de cálcio e clorexidina gel 2% sobre Candida albicans pela determinação de fungos viáveis e não viáveis através da análise em microscopia de fluorescência de amostras da dentina radicular referêntes a extensão de 0 - 100 µm...................................................................................................................119 TABELA 15 Avaliação da atividade antimicrobiana da pasta de hidróxido de cálcio, clorexidina gel 2% e da associação entre hidróxido de cálcio e clorexidina gel 2% sobre Candida albicans pela determinação de fungos viáveis e não viáveis através da análise em microscopia de fluorescência de amostras da dentina radicular referêntes a extensão de 100 - 200 µm.............................................................................................................119. ______________________________________________________________________ xxii.

(27) ______________________________________________________________________ Lista de Tabelas TABELA 16 Comparação do desempenho antimicrobiano das medicações intracanais sobre C. albicans, através da média da porcentagem de fungos viáveis registradas na extensão de 0 – 100 µm da dentina radicular...................................................................120 TABELA 17 Comparação do desempenho antimicrobiano das medicações intracanais sobre C. albicans, através da média da porcentagem de fungos viáveis registradas na extensão de 100 – 200 µm da dentina radicular...............................................................120. ______________________________________________________________________ xxiii.

(28) ______________________________________________________________________ Lista de Abreviaturas. Lista de Abreviaturas • % = por cento • ° = graus • AM = acetoximetil éster • ATCC = The American Type Culture Collections • atm = atmosfera • ATP = do inglês “adenosine tri-phosfate” traduzido como adenosina tri-fosfato • ATPase = do inglês “adenosine tri-phosfatase” traduzido como adenosina trifosfatase • BHI = do inglês “brain heart infusion” traduzido como infusão de cérebro e coração • C. albicans = Candida albicans • C = Celsius • Ca (OH)2 = hidróxido de cálcio • CO2 = dióxido de carbono • DNA. =. do. inglês. “deoxyribonucleic. Acid”. traduzido. como. ácido. desoxirribonucleico • DP = desvio padrão • E. faecalis = Enterococcus faecalis • EDTA = do inglês “ethylenediaminetetracetic acid” traduzido como ácido etilenodiamino tetra-acético • et al = e colaboradores • G = grupos • g = gramas • g = aceleração da gravidade • g/L = gramas por litro • IL = do inglês “interleukin” traduzido como interleucina • log = logarítimo • LPS = do inglês lipopolysaccharide traduzido como lipopolissacarídeo • LTA = do inglês lipoteichhoic acid traduzido como ácido lipoteicóico • M = concentração molar ______________________________________________________________________ xxiv.

(29) ______________________________________________________________________. Lista de Abreviaturas. • MEV = .microscópio eletrônico de varredura • mg/L = miligramas por litro • mL = mililitro • mm = milímetros • mm2 = milímetros quadrados • n = número de espécimes da amostra • N = Newtons • NaOCl = hipoclorito de sódio • nm = nanômetro • OsO4 = tetróxido de ósmio • p = nível de significância, probabilidade • pa = pró-análise • PBS = do inglês “phosphate buffer solution” traduzido como solução de tampão fosfato • PCR = do inglês “polymerase chain reaction” traduzido como reação em cadeia da polimerase • pH = potencial hidrogeniônico • PMCC = .paramonoclorofenol canforado • rpm = rotações por minuto • TNF = do inglês “tumor necrosis factor” traduzido como fator de necrose tumoral • UFC = unidade formadora de colônia • USP = Universidade de São Paulo • VBNC = do inglês “viable but nonculturable” traduzido como viável, mas não cultivável. • µg = micrograma • µL = microlitro • µm = micrometro. ______________________________________________________________________ xxv.

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(31) Resumo.

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(33) ______________________________________________________________________ Resumo. RESUMO Uma infecção pulpar pode resultar na colonização microbiana de todo sistema de canais radiculares incluindo os túbulos dentinários. Estes microorganismos e seus produtos tóxicos são responsáveis pelo desenvolvimento e persistência da periodontite apical de origem endodôntica. O presente estudo objetivou avaliar a viabilidade de E. faecalis e C. albicans em túbulos dentinários após a aplicação de hidróxido de cálcio, clorexidina gel 2%, hidróxido de cálcio associado à clorexidina gel 2% e soro fisiológico, através da análise por cultura microbiológica e microscopia de fluorescência. Para tanto 120 raízes de dentes humanos foram padronizadas e autoclavadas, sendo posteriormente divididas em 2 grupos (n= 60) para contaminação com E. faecalis e C. albicans por 21 dias. Em seguida, foram divididas em 8 grupos (n= 15) para aplicação das substâncias antimicrobianas nos canais radiculares e posterior incubação em estufa por 14 dias. Amostras da dentina radicular na extensão de 0 – 100 µm e de 100 - 200 µm foram coletadas e submetidas à cultura microbiológica através do plaqueamento em meios de cultura. Após 48 horas de incubação promoveu-se a avaliação das UFC. Paralelamente, as amostras foram processadas para análise em microscopia de fluorescência com auxílio de marcadores fluorescentes específicos, a fim de se determinar a proporção de microorganismos viáveis e não viáveis. Outros 6 espécimes foram preparados para análise em MEV. Os resultados mostraram uma maior capacidade de penetração intratubular para E. faecalis quando comparado a C. albicans. A aplicação de medicação intracanal resultou em significativa redução da viabilidade dos microorganismos quando comparado ao grupo controle independente da medicação aplicada e em ambas as porções da dentina radicular avaliadas. Entretanto, ao compararmos individualmente as medicações, observamos o melhor desempenho da clorexidina gel 2 % e da associação de hidróxido de cálcio e clorexidina gel 2% sem diferença significante entre elas. O hidróxido de cálcio apresentou os piores resultados para desinfecção dos canais radiculares contaminados com E. faecalis e C. albicans. Estes achados foram confirmados tanto pela cultura microbiológica quanto pela microscopia de fluorescência. A cultura microbiológica e a microscopia de fluorescência são métodos adequados e complementares para avaliação da viabilidade de E. faecalis e C. albicans e a eficácia da clorexidina gel 2% e da associação hidróxido. xxvii.

(34) ______________________________________________________________________. Resumo. de cálcio e clorexidina gel 2% justificam seu uso em endodontia como medicação intracanal. Palavras chave: Enterococcus faecalis. Candida albicans. Hidróxido de cálcio. Clorexidina. Viabilidade microbiana. Infecção do canal radicular. Microscopia de fluorescência. Endodontia.. ______________________________________________________________________ xxviii.

(35) Introdução.

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(37) 3 ______________________________________________________________________. Introdução. 1. INTRODUÇÃO As patologias pulpares e perirradiculares são usualmente de natureza inflamatória e de etiologia microbiana. Microorganismos e seus produtos exercem um papel fundamental na indução e, principalmente, na perpetuação de tais doenças (KAKEHASHI;. STANLEY;. FITZGERALD101,. 1965,. SUNDQVIST236,. 1976,. MÖLLER et al.151, 1981, TAKAHASHI245, 1998). O tratamento endodôntico tem como principais objetivos a máxima eliminação da infecção instalada no sistema de canais radiculares e a prevenção da introdução de novos microrganismos durante e após o tratamento. A eliminação da infecção do canal radicular propicia um ambiente favorável ao reparo das lesões periapicais, enquanto a persistência de microrganismos exerce um papel relevante nas falhas do tratamento endodôntico (SJÖGREN et al.227, 1997). Embora fatores não-microbianos endógenos ou exógenos possam estar envolvidos em casos de insucesso endodôntico, microorganismos e seus produtos são os principais responsáveis pelo fracasso da terapia. Na maioria das vezes, uma infecção persistente do canal radicular é resultante de um preparo químico-mecânico e de uma medicação intracanal inadequados. Entretanto, em algumas situações, a despeito da realização adequada das medidas de controle da infecção endodôntica, uma infecção persistente pode se desenvolver (CARD et al.28, 2002). Estes microorganismos usualmente estão presentes em áreas do canal inacessíveis aos procedimentos de desinfecção e são resistentes aos agentes químicos empregados. A neutralização destes agentes pelas condições ambientais na região do canal onde os microorganismos estão alojados compromete sua eficácia (PORTENIER et al.182, 2001). A morfologia complexa do sistema de canais radiculares determina áreas inacessíveis ao preparo biomecânico como canais laterais, acessórios, secundários, intercondutos, deltas apicais e túbulos dentinários contribuindo para a permanência de microrganismos nessas regiões (McCOMB; SMITH141, 1975, NAIR et al.154, 1990, LIN et al.125, 1991, SIQUEIRA; UZEDA; FONSECA219, 1996). De acordo com SJÖGREN et al.228, em 1991, o número de microorganismos em um sistema de canais radiculares infectado pode variar de 1x102 a 1x108 microorganismos. Estes estão distribuídos por.

(38) 4 ______________________________________________________________________. Introdução. todo sistema de canais radiculares, podendo ser encontrados em profundidades variadas nos túbulos dentinários, atingindo a superfície radicular externa em alguns casos (HORIBA et al.95, 1992). Possivelmente, por potencializar a eliminação de microorganismos, o emprego de medicação intracanal está diretamente relacionado a uma melhor reparação dos tecidos periapicais e, consequentemente, a um maior índice de sucesso da terapia de dentes com canais infectados (BYSTRÖM et al.21, 1987, SJÖGREN et al.229, 1990, TROPE; DELANO; ØRSTAVIK252, 1999, KATEBZADEH; SIGURDSSON; TROPE107, 2000). A microbiota presente em canais radiculares obturados com insucesso endodôntico difere tanto quantitativa quanto qualitativamente daquela normalmente encontrada em dentes necrosados e não tratados. Observa-se nas infecções secundárias e persistentes um número limitado de microorganismos com predominância de anaeróbios facultativos gram-positivos. Já uma infecção polimicrobiana com predominância de anaeróbios estritos gram-negativos, está comumente associada a canais não tratados endodonticamente (SUNDQUIST et al.237, 1998, MOLANDER et al.150, 1998). A recuperação freqüente de Enterococcus faecalis de canais radiculares com insucesso do tratamento endodôntico tem sido amplamente relatada. Tais estudos demonstraram uma prevalência de 29 - 77% no isolamento desta bactéria (ENGSTRÖM44, 1964, GOLDMAN; PEARSON63, 1969, FABRICIUS et al.52, 1982, GOMES; DRUCKER; LILEY64, 1996, SUNDQUIVIST et al.237, 1998, MOLANDER et al.150, 1998, PECIULIENE et al.172, 2000, PECIULIENE et al.173, 2001, PINHEIRO et al.179, 2003). Entretanto, enterococos não são favorecidos pelas condições presentes em canais radiculares não tratados endodonticamente e quando presentes eles usualmente compõem uma pequena porção da microbiota presente no canal radicular. Enterococcus faecalis parece ter alta resistência a medicamentos usados durante o tratamento, sendo um dos poucos microrganismos que demonstrou in vitro resistir a uma ampla variedade de agentes antimicrobianos principalmente ao hidróxido de cálcio (HOELLMAN et al.92, 1998, DAHLÉN et al.34, 2000; NODA et al.157, 2000, SHEPARD; GILMORE203, 2002; PINHEIRO et al.180, 2003)..

(39) 5 ______________________________________________________________________. Introdução. A ocorrência de fungos nas infecções dos canais radiculares tem sido cada vez mais relatada, contribuindo para o crescente interesse em se determinar o seu real papel nas infecções endodônticas (NAIR et al.76, 1990, SEN; PISKIN; DEMIRCI94, 1995, WALTIMO et al.123, 1997, BAUMGARTNER; WATTS; XIA5, 2000). A maioria dos fungos isolados pertence ao gênero Candida, sendo a espécie Candida albicans a mais freqüente. Embora ainda pouco estudado, já existem trabalhos mostrando semelhança entre C. albicans e E. faecalis em resistir à ação de alguns agentes antimicrobianos utilizados em endodontia (WALTIMO et al.122, 1999). Alguns materiais já estão consagrados no meio endodôntico para utilização como medicação intracanal, entretanto, encontrar novas alternativas é fundamental para combater a resistência apresentada por alguns microorganismos. A clorexidina tem sido amplamente sugerida como material para anti-sepsia de canais radiculares, seja como substância química auxiliar durante o preparo químico-mecânico (FERRAZ et al.55, 2001, GOMES et al.69, 2001, DAMETTO et al.36, 2005) ou como medicação intracanal entre sessões (SIQUEIRA; UZEDA221, 1997, SCHÄFER; BOSSMANN196, 2001, GOMES et al.73, 2003). A clorexidina possui ação antimicrobiana imediata, amplo espectro de ação, relativa ausência de toxicidade, capacidade de adsorção pela dentina e lenta liberação de substância ativa, prolongando sua atividade antimicrobiana residual (GREENSTEIN; BERMAN; JAFFEN75, 1986, WHITE; HAYS; JANER269, 1997). Mesmo apresentando a desvantagem de ser incapaz de dissolver tecido orgânico, a clorexidina se consolidou como material promissor para desinfecção dos canais radiculares (FERRAZ et al.55, 2001, OKINO et al.162, 2004). O hidróxido de cálcio, por seu poder alcalinizante, tem sido um dos principais materiais de escolha para medicação intracanal. O seu representativo destaque entre os fármacos endodônticos deve-se graças a duas expressivas propriedades enzimáticas: a primeira é a inibição de enzimas bacterianas, a partir da ação em nível de membrana citoplasmática conduzindo ao efeito antimicrobiano e a segunda é a ativação enzimática tecidual, observada por sua ação sobre a fosfatase alcalina gerando efeito mineralizador. Estas propriedades são decorrentes de seu elevado pH, com valores aproximados de 12.6, o que estabelece alta liberação de íons hidroxila (ESTRELA et al.49, 1994). Apesar de sua ampla utilização, alguns microorganismos como E. faecalis.

(40) 6 ______________________________________________________________________. Introdução. e C. albicans têm apresentado resistência aos seus efeitos mesmo após a aplicação por período de tempo prolongado questionado sua eficácia (SIQUEIRA; UZEDA220, 1996, WALTIMO et al.263, 1999). Além dos microorganismos apresentarem mecanismos de defesa próprios para escaparem da ação deste medicamento, o aumento do pH é tamponado pela dentina (PORTENIER et al.182, 2001), produtos ácidos bacteianos, e concentração de CO2 (NAKAJO et al.155, 2004). Consequentemente, microorganismos capazes de sobreviver a um pH de 9 - 10 podem permanecer viáveis nos canais radiculares a despeito da presença de hidróxido de cálcio. Novas formulações e associações têm sido sugeridas, a fim de se encontrar uma alternativa mais eficaz para combate à infecção do canal radicular. A associação da clorexidina gel 2% ao hidróxido de cálcio tem como objetivo incrementar suas propriedades antimicrobianas. O hidróxido de cálcio tem a habilidade de induzir a formação de tecido duro, promover o preenchimento do canal, dissolver tecido orgânico e mediar à neutralização de LPS (SAFAVI; NICHOLS192, 1994, GOMES et al.70, 2002). Entretanto, o medicamento não é igualmente eficaz contra todas as bactérias encontradas no canal radicular (GOMES et al.67, 2002). A adição de clorexidina objetiva propiciar um aumento da atividade antimicrobiana tornando o medicamento mais eficaz contra microorganismos resistentes como E. faecalis (GOMES et al.73, 2003) e C. albicans. A multiplicação bacteriana é um importante indicador de viabilidade celular e pode ser observada através de técnicas de cultura microbiológica convencionais. A correta manipulação e o emprego de meios de cultura específicos, associados às adequadas. condições. de. incubação. permitem. a. recuperação. de. diversos. microorganismos. Entretanto, a viabilidade microbiana não se caracteriza apenas pela capacidade de multiplicação. Outros aspectos como respiração, atividade enzimática e integridade da membrana citoplasmática são importantes referências para se determinar viabilidade (WEIGER et al.266, 2002). Microorganismos viáveis não se restringem apenas aqueles cultiváveis, já que algumas espécies sob condições ambientais estressantes podem reter certas funções fisiológicas, mas não podem ser cultivados sob condições normais de cultura, impedindo sua detecção. O estado denominado de “viable but nonculturable” (VBNC) é um mecanismo de sobrevivência adotado por.

(41) 7 ______________________________________________________________________. Introdução. alguns microorganismos quando expostos às condições ambientais adversas. Neste estágio o microorganismo perde a capacidade de crescimento em meio de cultura, mas mantém a viabilidade e patogenicidade e em algumas situações é capaz de retomar a divisão celular após a restituição de condições normais para o crescimento (MASON; HAMER; BRYERS137, 1986, KAPRELYANTS; GOTTSCHAL; KELL103, 1993, OLIVER; BOCKIAN163, 1995, KELL et al.109, 1998, WEIGER et al.267, 2002). Para estudar a efetividade de agentes antimicrobianos, a identificação e quantificação de microorganismos viáveis e não viáveis é essencial. A técnica mais frequentemente usada nestes estudos é o método da cultura microbiológica (CVEK; NORD; HOLLENDER32, 1976, BYSTRÖM; SUNDQVIST24, 1985, ØRSTAVIK; KEREKES; MOLVEN168, 1991, SJÖGREN et al.228, 1991, SJÖGREN et al.227, 1997, DALTON et al.35, 1998, SHUPING et al.206, 2000, PETERS et al.176, 2002). Contudo, apenas microorganismos viáveis são identificados por esse método. Diversos estudos já demonstraram que apenas uma pequena parte dos microorganismos são cultiváveis laboratorialmente em meios de cultura convencionais prejudicando sua identificação (HYSEK et al.96, 1991, WALKER et al.258, 2000). A microscopia de fluorescência tem se revelado um método mais sensível e complementar para caracterização da viabilidade de microorganismos (KARLSSON; MALMBERG104, 1989; HYSEK et al.96, 1991, WALKER et al.258, 2000, DECKER39, 2001, BERNARDEAU; VERNOUX; GUEGUEN14, 2001, WEIGER et al.266, 2002). Através da coloração atribuída por marcadores fluorescentes específicos é possível se determinar a viabilidade microbiana tendo como parâmetro a integridade da membrana citoplasmática que é imprescindível para manutenção da viabilidade celular. A possibilidade de investigar a viabilidade de E. faecalis e C. albicans de forma mais abrangente nos motivaram a analisar o efeito de alguns materiais empregados na terapia endodôntica como medicação intracanal, a fim de verificar a ação antimicrobiana destes medicamentos sobre microorganismos localizados no interior dos túbulos dentinários em diferentes profundidades da dentina radicular. Para tal avaliação, foram empregados dois métodos para determinação da viabilidade de microorganismos: a cultura microbiológica através da contagem de UFC e a.

(42) 8 ______________________________________________________________________. Introdução. microscopia. de. fluorescência. através. microorganismos viáveis e não viáveis.. da. determinação. da. proporção. de.

(43) REVISÃO DA LITERATURA.

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(45) 11 ______________________________________________________________________. Revisão de Literatura. 2. REVISÃO DA LITERATURA A necrose pulpar é a morte da polpa, significando a cessação dos processos metabólicos desse tecido, com conseqüente perda de sua estrutura, bem como de suas defesas naturais (KUTTLER113, 1961). Como exemplo, pode-se mencionar as necroses causadas por traumatismos que levam ao rompimento do feixe vásculo nervoso, aquelas causadas pelas restaurações com materiais irritantes pulpares como adesivos dentinários e resinas compostas sem a devida proteção pulpar, e ainda as que ocorrem como conseqüência de preparos cavitários extensos, em que os cuidados de refrigeração foram negligenciados. Nesses casos, a morte da polpa ocorre, em sua maioria, em condições assépticas podendo ocorrer, a seguir, a invasão microbiana. Embora fatores químicos e físicos possam induzir a necrose pulpar e inflamação periapical, é evidente que os agentes microbianos resultantes da evolução de um processo de cárie dentária, por exemplo, desempenham papel crucial para a propagação e perpetuação de doenças inflamatórias periapicais. O controle da infecção endodôntica permanece como um grande desafio para a endodontia moderna. Apesar dos constantes avanços na evolução dos materiais utilizados para modelagem, desinfecção e obturação do canal, o combate à infecção permanece desafiador devido à complexidade e peculiaridade deste ambiente. O sucesso do tratamento endodôntico está diretamente relacionado à máxima eliminação de microorganismos presente no sistema de canais radiculares previamente a obturação (ZELDOW; INGLE275, 1963; BYSTRÖM et al.21, 1987; SJÖGREN et al.227, 1997). Mesmo com todas as dificuldades inerentes ao combate da infecção no sistema de canais radiculares, estudos confirmam uma alta taxa de sucesso do tratamento endodôntico entre 85% a 95% (SWARTZ; SKIDMORE; GRIFFIN243, 1983; SJÖGREN et al.229, 1990; SMITH; SETCHELL; HARTY230, 1993). Entretanto, ALLEN; NEWTON; BROWN3 (1989) e HEPWORTH; FRIEDMAN90 (1997), analisando o sucesso do retratamento endodôntico, encontraram uma taxa de aproximadamente 66%. Esse índice se apresenta modesto quando comparado com a alta taxa de sucesso do tratamento inicial. O menor índice de sucesso do retratamento pode indicar além de.

(46) 12 ______________________________________________________________________. Revisão de literatura. dificuldades técnicas, devido a fatores iatrogênicos do tratamento anterior, uma dificuldade na eliminação da microbiota do canal radicular de dentes com insucesso endodôntico (MOLANDER et al.150, 1998; SUNDQVIST et al.237, 1998). Os microrganismos presentes nos canais de dentes tratados endodonticamente que fracassaram podem ser derivados daqueles originalmente presentes no canal radicular infectado, de microorganismos introduzidos no canal por procedimentos inadequados durante o tratamento (SIREN et al.225, 1997) ou pela infiltração devido ao selamento coronário deficiente (CHEUNG29, 1996). O saneamento do sistema de canais radiculares pode ser obtido pelos efeitos químicos e mecânicos da instrumentação e irrigação. Entretanto, microorganismos podem encontrar-se em regiões inacessíveis ao preparo biomecânico ou apresentarem resistências às substâncias anti-sépticas comumente utilizadas. Por permanecer no interior do canal radicular por mais tempo, um medicamento intracanal dotado de ação antimicrobiana tem maiores chances de atingir áreas não afetadas pela instrumentação como istmos, ramificações, reentrâncias e túbulos dentinários. Sua ação antimicrobiana potencializa a redução da microbiota endodôntica proporcionando melhor reparação dos tecidos perirradiculares e, consequentemente, um maior índice de sucesso da terapia endodôntica (LOPES; SIQUEIRA130, 2004). O desenvolvimento de um protocolo efetivamente eficaz para desinfecção do sistema de canais radiculares está intimamente atrelado ao avanço da microbiologia como ciência. O emprego de métodos mais precisos e eficazes para identificação, isolamento, cultivo e análise de microorganismos contribuiu enormemente para melhor compreender estes inimigos do sucesso da terapia endodôntica. Entender os fatores de virulência e os motivos que levam estes patógenos a resistir à ação de antimicrobianos, buscando alternativas para o seu combate, certamente constitui-se no principal objetivo deste fascinante desafio da endodontia..

(47) 13 ______________________________________________________________________. Revisão de Literatura. 2.1 Microbiologia das infecções endodônticas As primeiras pesquisas que demonstraram a presença de bactérias no interior do sistema de canais radiculares ocorreram no século XIX quando MILLER148, em 1894, relatou a associação entre bactérias e as patologias pulpar e perirradicular. O estabelecimento de uma relação causal entre microorganismos e as patologias de origem endodôntica só foi efetivamente comprovado, no entanto, em 1965 em estudo realizado por KAKEHASHI; STANLEY; FITZGERALD101. Os autores verificaram que nenhuma alteração patológica ocorria quando da exposição dos tecidos pulpares e periapicais de ratos livres de germes. Ocorria, inclusive, a reparação do tecido pulpar pela deposição de dentina neoformada na área da exposição, isolando o tecido pulpar da cavidade oral. Por outro lado, em animais convencionais, a exposição pulpar levou à necrose e à formação de lesão periapical, concluindo-se que a presença da microbiota é o fator mais determinante no aparecimento da lesão periapical. A confirmação do importante papel desempenhado pelos microorganismos despertou o interesse de vários pesquisadores em identificar as principais espécies envolvidas, suas vias de acesso ao sistema de canais radiculares, o padrão de colonização e as conseqüências da infecção endodôntica para o hospedeiro. Até meados da década de 70, as pesquisas realizadas para identificação dos agentes etiológicos das infecções pulpares apresentavam resultados bastante variados e imprecisos. Esta condição se deve, em parte, às diferentes técnicas bacteriológicas empregadas e às limitações existentes nas técnicas de cultivo e armazenamento. Os estudos microbiológicos das infecções endodônticas indicavam o predomínio de bactérias aeróbias e anaeróbias facultativas relegando menor importância às anaeróbias estritas (BROWN; RUDOLF19, 1957). Contudo, o desenvolvimento das técnicas de cultivo de anaeróbios estimulou o interesse pela avaliação da porcentagem de bactérias anaeróbias presentes em dentes com necrose pulpar e periapicopatias. A partir de então, começaram a surgir os primeiros trabalhos indicando uma maior participação dos anaeróbios nas infecções primárias (MÖLLER152, 1966; ARANKI et al6, 1969; KANTZ; HENRY102, 1974, WITTGOW; SABISTON271, 1975)..

(48) 14 ______________________________________________________________________. Revisão de literatura. O aprimoramento das técnicas de isolamento, transporte e cultivo de anaeróbios permitiu que, em 1976, SUNDQVIST236 revolucionasse os conceitos vigentes até então permitindo uma compreensão mais verdadeira da composição e implicação da microbiota nas infecções endodônticas. Neste estudo foram avaliadas as condições bacteriológicas de 32 canais de dentes unirradiculares com polpas necrosadas e coroas intactas, sem cáries ou restaurações. A perda da vitalidade pulpar foi em decorrência de injúria traumática e não havia a presença de doença periodontal ou fístula envolvida. Em 19 dentes foi detectada, radiograficamente, a presença de lesão perirradicular. Após coleta e processamento microbiológico das amostras os resultados evidenciaram a presença de bactérias apenas em casos de dentes com lesões perirradiculares associadas, ou seja, em 18 dos 19 casos. Este achado confirmou o importante papel desempenhado por bactérias na etiopatogenia destas lesões, além de combater o conceito de que o tecido pulpar necrosado, mesmo na ausência de microorganismos, fosse um irritante tecidual. Dos 18 canais infectados foram isoladas um total de 88 cepas bacterianas. Destas, apenas 5 foram anaeróbias facultativas. Assim bactérias anaeróbias estritas representaram 94,3% das cepas isoladas. Este achado modificou o conceito de que os principais patógenos endodônticos eram bactérias facultativas. O número de espécimes identificadas em cada um dos canais variou de 1 a 12. Houve correlação positiva entre o tamanho da lesão perirradicular e a densidade e número de espécies bacterianas presentes no canal. Além disso, os casos sintomáticos foram diretamente relacionados a um maior número de bactérias. A incidência de agudecimentos e a presença de determinadas espécies de microorganismos foi comprovada pela identificação de Bacteróides melaninogenicus em 7 casos onde houve a presença de sinais e sintomas de inflamação aguda perirradicular. A melhor caracterização da microbiota endodôntica permitiu que novos questionamentos fossem levantados a respeito de como ocorreria o processo de colonização e evolução da infecção endodôntica, a fim de compreender o motivo da prevalência de anaeróbios. Apesar de grande número de espécies microbianas colonizarem a cavidade oral, um grupo relativamente pequeno era detectado em canais radiculares infectados. Diversos fatores seletivos atuam sobre os microorganismos que colonizam o sistema de canais radiculares como: nutrição, potencial de óxido redução, pH, temperatura, interações entre os microorganismos, além dos mecanismos de defesa.

(49) 15 ______________________________________________________________________. Revisão de Literatura. do hospedeiro e presença de agentes antimicrobianos e inibidores (MARSH; MARTIN136, 1992, GOMES; DRUCKER; LILEY64, 1996). A elevada concentração de oxigênio presentes nos tecidos nos estágios iniciais favorece a prevalência de bactérias aeróbias e facultativas. A partir da necrose tecidual, a tensão de oxigênio é reduzida pela ausência da microcirculação. Observa-se, então, uma redução no potencial de óxido-redução proporcionando uma elevação na quantidade de microorganismos anaeróbios estritos (LOPES; SIQUEIRA130, 2004). Outro aspecto importante na seleção de microorganismos seria o pH tecidual. Os tecidos necrosados apresentam pH ligeiramente ácido, aproximadamente 6, o que favorece a colonização bacteriana. Por outro lado, em tecidos sadios, o pH é de aproximadamente 7.2 a 7.4, ou seja, ligeiramente básico o que dificulta a ação de enzimas bacterianas (TRONSTAD et al.250, em 1990). A disponibilidade nutricional é de extrema importância na composição da microbiota das infecções endodônticas (SUNDQVIST240, 1992). O nutriente obtido por bactérias no interior do sistema de canais radiculares advém de produtos da desintegração celular, fluidos teciduais e componentes do tecido conjuntivo. No período inicial observase a prevalência de uma microbiota sacarolítica ocorrendo o rápido esgotamento dos carboidratos disponíveis. A partir de então, instala-se uma microbiota proteolítica capaz de metabolizar proteínas e aminoácidos que se torna a fonte de energia disponível no ambiente (STEEG; HOEVEN232, 1989). Neste momento, predominam as espécies pertencentes aos gêneros Prevotella, Porphyromonas, Eubacterium e Fusobacterium (JANSEN; VAN DER HOEVEN98, 1997, LOPES; SIQUEIRA130, 2004). Outro aspecto determinante na sucessão microbiana é a interação entre microorganismos. A presença de uma determinada espécie pode contribuir ou inviabilizar a sobrevivência de outra(s). Um dos primeiros estudos a avaliar a interação microbiana em infecções endodônticas foi o desenvolvido por FABRICIUS et al.52 em 1982. Os autores avaliaram a capacidade de 11 cepas bacterianas, em culturas puras e mistas, de induzir lesão periapical em macacos. Setenta e cinco dentes tiveram suas polpas desvitalizadas mecanicamente seguidas pela inoculação de cepas bacterianas, puras ou em combinações, com posterior selamento das câmaras pulpares por 6 meses. Após o.