Insert Code: CIN286, Version: 17
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MOUSE KIDNEY, STOMACH IFA
KIT/SLIDES
For in-vitro diagnostic use
Product Code: FK314.1, FK314.2
FS314._
Product manufactured by:
The Binding Site Ltd, PO Box 11712, Birmingham B14 4ZB, UK
www.bindingsite.co.uk
Telephone: +44 (0)121 436 1000
Fax: +44 (0)121 430 7061
e-mail: info@bindingsite.co.uk
FDA (USA) Information
Analyte ID codes
AMA: 0439
ANA: 0441
AGPCA: 0442
ASMA: 0451
Complexity Cat: High
1 INTENDED USE
This product is intended for use in the screening and titration of circulating autoantibodies in human serum as an aid in the diagnosis and treatment of various autoimmune diseases. The four major autoantibodies detected are antinuclear antibodies (ANA), antimitochondrial antibodies (AMA), antismooth muscle antibodies (ASMA) and antigastric parietal cell antibodies (AGPCA).
2 SUMMARY AND EXPLANATION
Indirect immunofluorescence is the reference method for screening and titration of circulating autoantibodies in serum. Animal tissue sections, e.g. from mouse, are generally preferred over other commonly-used substrates including human tissue sections and cell preparations; this is primarily due to the lack of interference from HLA and/or other blood group antibodies. Using two different tissues (kidney and stomach) enables autoantibodies to be more easily identified by comparing the results obtained with each tissue.
Particular autoantibodies are associated with a number of different diseases. ANA almost always occur with systemic lupus erythematosus (SLE) but are also commonly found in patients with connective tissue and rheumatoid diseases. AMA are frequently present in primary biliary cirrhosis but may also be detected in patients with other liver diseases. ASMA are frequently associated with chronic active hepatitis and primary biliary cirrhosis, but are also detectable in low concentrations in various other conditions. AGPCA occur in the serum of most patients with pernicious anaemia. A more detailed description of which autoantibodies are associated with which disease is given in section 9 (refs 1-8).
3 PRINCIPLE
The kit uses an indirect immunofluorescence technique (ref. 6) where patient samples and appropriate controls are incubated with the sections. The unreacted antibodies are washed off and then appropriate fluorescein-labelled conjugates are applied. Unbound conjugate is washed off as before. Slides are viewed with a fluorescence microscope and positive samples produce apple-green fluorescence which corresponds to areas of the section where autoantibody has bound.
4 REAGENTS
4.1 Mouse kidney, stomach sections on 5- or 10-well slides.
Kits only.
4.2 ANA homogeneous positive control serum, containing 0.099% sodium azide.
Prediluted, ready for use.
4.3 Mitochondrial positive control serum, containing 0.099% sodium azide. Prediluted,
ready for use.
4.4 Smooth muscle positive control serum, containing 0.099% azide. Prediluted, ready for
use.
4.5 Negative control serum, universally negative for all autoantibodies, containing 0.099% sodium azide. Prediluted, ready for use.
4.6 Affinity purified sheep anti-human IgG (H+L), fluorescein isothiocyanate, containing 0.099% sodium azide. Prediluted, ready for use.
4.7 1% Evans Blue, as an optional counterstain.
4.8 Phosphate buffered saline (PBS), provided as a 20-fold concentrate in liquid form. 4.9 Blotters, to blot the slides after washing.
4.10 Mounting medium, containing an anti-fading agent (DABCO 1, 4, diazabicyclo [2.2.2] octane).
4.11 Coverslips.
5 CAUTION
All donors of human serum supplied (kits only) have been serum tested and found to be negative for Hepatitis B surface antigen and antibodies to Hepatitis C virus and Human Immunodeficiency Virus (HIV 1 & 2). However, these tests cannot guarantee the absence of infective agents. Proper handling and disposal methods should be established as for all potentially infective material and only personnel adequately trained in such methods should be permitted to perform the procedures.
The Evans Blue and the kit controls contain 0.099% sodium azide as a preservative and must be handled with caution – do not ingest or allow contact with the skin or mucous membranes. If contact does occur wash with a large volume of water and seek medical advice. Explosive metal azides may by formed with the lead and copper plumbing; on disposal of reagent, flush with a large volume of water to prevent azide build up.
This product should only be used by suitably trained persons for the purposes stated. Adherence to the given procedure is recommended.
6 STORAGE AND STABILITY
Unopened kits should be stored at 2-8°C and can be used until the given expiry date. DO NOT FREEZE. Once slides are removed from a foil bag, they should be used immediately. Diluted PBS buffer can be stored for up to one month at 2-8°C. All other reagents should be stored at 2-8°C.
7 SPECIMEN COLLECTION
Blood samples should be collected by venepuncture, allowed to clot naturally and the serum separated as soon as possible to prevent haemolysis. The serum may be stored at 2-8°C for up to 7 days prior to assay (ref. 9), or for prolonged storage, aliquoted and stored at -20°C or below. DO NOT freeze and thaw sera more than once. Avoid using lipaemic, haemolysed or microbially contaminated sera as decreased titres or unclear staining patterns may occur.
8 METHODOLOGY
8.1 Materials provided
8.1.1 50T Kit FK314.1
1. 10 x Mouse, kidney, stomach slides – 5-well
2. 1 x 1mL ANA positive control (prediluted)
3. 1 x 1mL Mitochondrial positive control (prediluted)
4. 1 x 1mL Smooth Muscle positive control (prediluted)
5. 1 x 1mL Negative Control (prediluted)
6. 1 x 6.2mL Anti-human IgG (H+L) prediluted FITC
7. 1 x 3mL 1% Evans Blue Counterstain
8. 2 x 60mL PBS concentrate (x20) 9. 1 x 3mL Mounting Medium 10. 20 x Blotters 11. 10 x Coverslips (22 x 70mm) 12. 1 x instruction leaflet 8.1.2 250T Kit FK314.2
1. 25 x Mouse, kidney, stomach slides – 10-well
2. 1 x 1mL ANA positive control (prediluted)
3. 1 x 1mL Mitochondrial positive control (prediluted)
4. 1 x 1mL Smooth Muscle positive control (prediluted)
5. 1 x 1mL Negative Control (prediluted)
6. 1 x 15.5mL Anti-human IgG (H+L) prediluted FITC
7. 1 x 3mL 1% Evans Blue counterstain
8. 2 x 60mL PBS concentrate (x20) 9. 1 x 10mL Mounting Medium 10. 50 x Blotters 11. 25 x Coverslips (22 x 70mm) 12. 1 x instruction leaflet 8.1.3 FS314.1, FS314.A, FS314.2, FS314.B
1. 10 x 5-well slides, 1 x 5-well slide, 25 x 10-well slides, 1 x 10 well slide respectively. 2. 1 x instruction leaflet.
8.2 Additional materials required
8.2.1 Distilled water to dilute the PBS concentrate. 8.2.2 Container for PBS buffer.
8.2.3 Micropipettes and disposable tips to apply patient samples.
8.2.4 Humid chamber for incubation steps (eg. Magnetic Staining Chamber Code: BD010). 8.2.5 Fluorescence microscope with 495nm exciter filter and 515nm barrier filter. 8.2.6 Plastic squeeze bottle for initial wash in PBS.
8.2.7 If slides only are being used, additional components may be obtained from the Binding Site: PBS (CON 3.3), negative control (CON 92), ANA homogeneous control (FA105), mitochondrial positive control (FA128), smooth muscle positive control (FA134), anti-Human IgG (H+L) AFF FITC (FA003), mounting medium (CON 195) and 1% Evans Blue (CON 93).
8.3 Test procedure
Quality control
Positive and negative controls should be used every time a batch of samples is tested. 8.3.1 Mounting medium: Remove the mounting medium from the fridge to allow it to reach
room temperature (18-28ºC) before it is needed.
8.3.2 Dilute PBS concentrate. Dilute PBS concentrate with distilled water (1 part PBS concentrate + 19 parts distilled water) and mix. The PBS is used for diluting patient samples and as a wash buffer.
8.3.3 Dilute patient samples
Screening: Dilute patient samples 1/20 by adding 50µL of serum to 950µL of PBS
buffer.
Titration: Make serial dilutions of positive screened samples with PBS buffer (eg. 1/20,
1/40, 1/80, 1/160 and 1/320, etc.).
For example: Take 100µL of the 1/20 dilution, mix with 100µL PBS to give a 1/40 dilution (repeat for further dilutions).
8.3.4 Substrate slides. Allow substrate slide(s) to reach room temperature (18°C-28°C) prior to removal from pouch(es). Label slides appropriately, place in the humid chamber and add one drop of each positive and negative control to appropriate wells. Add 50µL of diluted patient samples to the remaining wells.
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8.3.5 Slide incubation. Incubate slides for 20 minutes in a humid chamber at room temperature (18-28°C).
8.3.6 PBS wash. Remove slides from humid chamber and rinse briefly with PBS squeeze bottle. Do not squirt directly on to the wells. Place slides in a rack and immerse in PBS and agitate or stir for 5-10 minutes.
8.3.7 Addition of fluorescent conjugate. Shake off excess PBS and blot around wells using blotters provided. Return slides to humid chamber and immediately cover each well with a drop of fluorescent conjugate. DO NOT LEAVE WELLS UNCOVERED FOR LONGER THAN 15 SECONDS. Drying out of the substrate seriously affects the results. 8.3.8 Slide incubation. Incubate slides for 20 minutes in humid chamber at room temperature
(18-28°C), in the dark.
8.3.9 PBS wash. Wash again as described in step 8.3.6. OPTIONAL COUNTERSTAIN. Add 2-3 drops of 1% Evans Blue per 100mL of PBS prior to slide immersion.
8.3.10 Mounting with coverslip. Remove one slide at a time from PBS wash. Quickly dry around the wells and add a drop of mounting medium to each well. Carefully lower the slide onto the coverslip, avoiding air bubbles, but if present do not attempt to remove. Wipe excess medium from around edge of coverslip.
8.3.11 View slides under fluorescence microscope. Slides may be stored for up to 3 days at 2-8°C, in the dark, without significant loss of fluorescence.
9 RESULTS
9.1 Quality control
The ANA positive control should give a bright apple-green homogeneous pattern in cell nuclei. The mitochondrial positive control should give bright apple-green staining of renal tubules and gastric parietal cells. The smooth muscle positive control should give bright apple-green staining of the muscularis layer of the stomach.
The negative control should show dull green staining in all tissues, with no discernible fluorescence. If the controls do not appear as described, the test is invalid and should be repeated.
9.2 Interpretation of results
9.2.1 Negative results
These are seen as dull green staining in all sections, with no discernible fluorescence. Suspected weak reactions should be repeated but at a higher dilution (eg. 1/40). If the repeated result appears the same as the original, the test is regarded as negative.
9.2.2 Positive results
These are seen as significant fluorescence in specific tissue areas giving one or more of the following patterns:
Antinuclear Antibodies (ANA)
ANA stain the nuclei of the following: distal and proximal kidney tubules, gastric parietal and chief cells. Almost all SLE patients have ANA in the serum, but ANA can also be found in various connective tissue diseases including rheumatoid arthritis. ANA can also occur with chronic active hepatitis and primary biliary cirrhosis and in response to certain drug treatments.
Additional information can be obtained by interpreting the ANA nuclear patterns obtained (see below). It is recommended that all positive ANA samples are titred to endpoint to ensure that possible mixed reactions are detected that may otherwise have been missed. Further analysis of such samples for autoantibodies to double stranded DNA and extractable nuclear antigens (ENA) is also advised.
Pattern Common antigens involved Disease association
Homogeneous ds DNA, histones SLE
Rheumatoid arthritis (RA) Mixed connective tissue disease Drug induced lupus Peripheral
(Rim) Native/ds DNA SLE
Speckled Extractable nuclear antigens Ribonucleoprotein, Scl-70, SSB
Scleroderma Sjögren’s syndrome Mixed connective tissue disease SLE
Nucleolar 4-6S RNA Scleroderma
Sjögren’s syndrome
SLE, RA and progressive systemic sclerosis
Tissue Specific autoantibody staining patterns include:
Antibody Tissue associated Main disease association
Antimitochondrial
Antibodies (AMA) Kidney distal tubule cytoplasm and the proximal tubules (to a lesser extent).
Primary biliary cirrhosis & other liver disease
Antiismooth muscle
Antibodies (ASMA) Muscularis layers (stomach) Arteriole muscle layers (other tissues)
Chronic active hepatitis
Antigastric parietal cell
Antibodies (AGPCA) Parietal cells (stomach) Pernicious anaemia Antireticulin antibodies
(ARA) Peritubular fibres & Bowman’s capsules (kidney) Crohn’s disease Coeliac disease Dermatitis hepetiformis NB: Each laboratory should establish at which point a positive result is considered clinically significant.
10 LIMITATIONS OF PROCEDURE
10.1 The light source, filters and optics of different makes of fluorescence microscopes will influence the sensitivity of the assay. The performance of the microscope is significantly influenced by correct maintenance especially centring of the mercury vapour lamp and changing of the lamp after the recommended period of time.
10.2 Staining patterns often change as a sample is titred out to end point. This is usually due to the presence of more than one autoantibody, especially for ANAs.
10.3 Autoantibodies can be activated or induced by a wide range of drugs including oral contraceptives and antibiotics.
10.4 Due to the short distance between wells on the 10-well slides it is possible for cross contamination of samples and controls to occur. Care must be taken, especially at the washing stages, to ensure that this does not happen.
10.5 This test alone should not be considered diagnostic. All other factors including the clinical history of the patients and other serological or biopsy results must also be taken into account.
10.6 Suitability for use with other manufacturers' IFA reagents has not been assessed but use with such reagents should not necessarily be excluded.
FDA information – see front page.
Slides sold separately are classified as Analyte Specific Reagents. Except as a component of the kit, analytical and performance characteristics are not established.
11 EXPECTED RESULTS
11.1 Expected results
% Positive Reference
Patient group No. ANA AMA ASMA AGPCA
Normal donors 60 0 0 0 0 8 Chronic active Hepatitis 50 66 2 58 0 8 Primary biliary cirrhosis 110 10 86 3 0 8 SLE 16 100 0 0 0 * Rheumatoid arthritis 4 100 0 0 0 *
* = Data obtained from in-house studies at The Binding Site Ltd. N.B. It is possible for a sample to test positive for more than one pattern.
11.2 Comparison study
A comparison study was performed on 90 clinical samples using this kit and a commercially available reference method. 87 out of the 90 samples tested gave identical results by the two methods. For the patterns described in section 9.2, the relative sensitivity ranged from 86-100%, the relative specificity was 100% in every case and the relative agreement ranged from 98-100%. For the samples that differed, weak ANA or SMA positive staining was obtained by the reference method only, suggesting that these samples were borderline for the particuar patterns, and/or there are slight differences in sensitivity between the two methods.
12 REFERENCES
1. Tan, E M (1989). Antinuclear Antibodies: Diagnostic markers for autoimmune diseases and probes for cell biology. Adv. Immunol. 44, 93-151.
2. Doniach, D, et al (1986). Tissue antibodies in primary biliary cirrhosis, active chronic
(lupoid) hepatitis, cryptogenic cirrhosis and other liver diseases and their clinical implications. Clin. Exp. Imm. 1. 237-262.
3. Wallington, T B & Gooi H C (1990). Clinical Immunology. A practical approach. Ed. Gooi, H C & Chappel, H. Publ. IRL Press, Oxford UK. 195-220.
4. Cavallaro, J J, et al (1976). Immunofluorescent detection of autoimmune diseases, Immunology Series NO. 7. CDC, Atlanta, GA.
5. Seah, P P et al (1971). Antireticulin antibody: Tissue autoantibodies in dermatitis herpetiformis and adult coeliac disease. Lancet 1, 834-836.
6. Weller, T.H; Coons, A.H: Fluorescent antibody studies with agent of Varicella and Herpes Zoster Propagated in vitro; Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 86: 789 – 794, 1954 7. Goudie, R B et al (1966). Serological and histological diagnosis of primary biliary
cirrhosis. J. Clin. Path. 19, 527-538.
8. R.M. Bernstein et al. Diversity of autoantibodies in Primary biliary cirrhosis and Chronic
active hepatitis. Clin. Exp. Imm. 55: 553-560, 1984.
9. Protein Reference Handbook of Autoimmunity (3rd Edition) 2004. Ed. A Milford Ward, GD Wild. Publ. PRU Publications, Sheffield. 14.
13 SUMMARY OF PROCEDURE
13.1 Equilibrate mounting medium to room temperature. 13.2 Dilute PBS with distilled water.
13.3 Dilute patient sera 1/20 with PBS.
13.4 Equilbrate substrate slides to room temperature (18-28°C).
13.5 Apply 50µL positive and negative controls and diluted patient sera to appropriate wells. 13.6 Incubate in a humid chamber for 20 minutes.
13.7 Wash for 5-10 minutes in PBS.
13.8 Blot around each well and immediately cover each well with a drop of conjugate. 13.9 Incubate as in step 13.6.
13.10 Wash as in step 13.7. 13.11 Mount.
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MAUS-NIERE, MAGEN-KITS/
OBJEKTTRÄGER FÜR DIE IFT
Zur in vitro Diagnostik
Bestell-Nr.: FK314.1, FK314.2
FS314._
In England hergestellt von:
The Binding Site Ltd, P.O. Box 11712, Birmingham B14 4ZB, U.K.
www.bindingsite.co.uk
Vertrieb in Deutschland und Österreich durch:
The Binding Site GmbH, Robert-Bosch-Straße 2A
D-68723 Schwetzingen, Deutschland
Telefon: +49 (0) 6202 92 62 0
Fax: +49 (0) 6202 92 62 222
e-mail: office@bindingsite.de
1 VERWENDUNGSZWECK
Diese Kits/Objektträger dienen zum Nachweis und zur Titration von zirkulierenden Autoantikörpern im Humanserum, zur Unterstützung der Diagnose und Therapie von verschiedenen Autoimmun-Erkrankungen. Die vier häufigsten Autoantikörper sind: antinukleäre Antikörper (ANA), anti-mitochondriale Antikörper (AMA), Antikörper gegen die glatte Muskulatur (ASMA /GMA) und Antikörper gegen Magenparietalzellen (AGPCA).
2 EINFÜHRUNG
Die indirekte Immunfluoreszenz ist die Referenzmethode für den Nachweis und die Titration von zirkulierenden Autoantikörpern im Humanserum. Tierische Gewebeschnitte, wie z. B. von der Maus, werden allgemein gegenüber anderen Gewebeschnitten einschließlich menschlichem Gewebe oder Zellkulturen bevorzugt, da bei ihnen keine Störungen durch HLA und/oder anderen Blutgruppen-Anti-körpern auftreten. Die gleichzeitige Verwendung von zwei unterschiedlichen Geweben (Leber und Magen) erleichtert die Interpretation, durch den Vergleich der Ergebnisse auf den verschiedenen Geweben.
Einzelne Autoantikörper sind mit einer Anzahl von verschiedenen Erkrankungen assoziiert. ANAs werden in der Regel bei systemischem Lupus erythematodes (SLE), aber auch bei Patienten mit Bindegewebs- und rheumatischen Erkrankungen gefunden. AMAs werden häufig bei Patienten mit primärer biliärer Zirrhose gefunden, sie können aber auch bei anderen Lebererkrankungen auftreten. ASMA sind mit der chronischen aktiven Hepatitis und der primären biliären Zirrhose assoziiert, sind aber auch in niedrigen Konzentrationen bei anderen Erkrankungen nachweisbar. AGPCA werden bei Patienten mit perniziöser Anämie gefunden. Eine detaillierte Auflistung, welche Autoantikörper mit welcher Krankheit assoziiert werden, wird in Abschnitt 9 gegeben (Ref. 1-8).
3 TESTPRINZIP
Der Test beruht auf der indirekten Immunfluoreszenz-Technik (IFT) (Ref. 6). Die Patientenseren und entsprechenden Kontrollen werden auf den Gefrierschnitten inkubiert. In einem Waschschritt werden die nicht reagierenden Antikörper entfernt und dann das Fluoreszein-Konjugat zugegeben. Überschüssiges Konjugat wird durch Waschen entfernt. Die Untersuchung der Objektträger erfolgt unter dem Fluoreszenzmikroskop. Positive Proben zeigen in den Bereichen der Gefrierschnitte, in denen die Autoantikörper an entsprechende Strukturen gebunden haben, eine apfelgrüne Fluoreszenz.
4 REAGENZIEN
4.1 Objektträger mit Maus-Niere-Magen-Gefrierschnitten mit je 5- oder 10 Auftragsstellen.
Nur Kits:
4.2 ANA-Homogen-Positiv-Kontrollserum. Enthaltene Konservierungsmittel: 0,099% Natriumazid. Vorverdünnt, gebrauchsfertig.
4.3 Mitochondriale Positiv-Kontrollserum. Enthaltene Konservierungsmittel: 0,099% Natriumazid. Vorverdünnt, gebrauchsfertig.
4.4 Positiv-Kontrollserum für glatte Muskulatur. Enthaltene Konservierungsmittel: 0,099% Natriumazid. Vorverdünnt, gebrauchsfertig.
4.5 Das Negativ-Kontrollserum ist für alle Autoantikörper negativ. Enthaltene Konservierungsmittel: 0,099% Natriumazid. Vorverdünnt, gebrauchsfertig. 4.6 Das Anti-human-IgG-(H+L)FITC-Konjugat ist affinitätsgereinigt und optimal mit
hochaktivem Fluorescein-Isothiocyanat markiert. Enthaltene Konservierungsmittel: 0,099% Natriumazid. Vorverdünnt, gebrauchsfertig.
4.7 Evans Blue: zur optionalen Gegenfärbung.
4.8 Der PBS-Puffer liegt als 20-fach Konzentrat vor und muss vor Gebrauch entsprechend verdünnt werden.
4.9 Blot-Papier: Saugfähige Papierblotter um nach den Waschschritten die Objektträger optimal zu trocknen.
4.10 Das Eindeckmedium ist speziell für die Immunfluoreszenz und enthält DABCO (1,4 diazobicyclo [2.2.2] Octan) als Ausbleich-Schutzfaktor.
4.11 Deckgläschen (22 x 70mm) zum Abdecken der Objektträger.
5 WARNUNGEN UND VORSICHTSMAßNAHMEN
Das Ausgangsmaterial zur Erstellung der Kontrollen stammt aus menschlichem Blut. Jede Einzel-spende wurde bezüglich Antikörpern gegen Human-Immunschwäche-Virus (HIV) 1 und 2, Antikörpern gegen Hepatitis C Virus und Hepatitis-B-Oberflächenantigen (HBsAG) untersucht und als negativ
befunden. Es gibt aber zur Zeit keine absolut sicheren Testmethoden zum Ausschluss von HIV, Hepatitis B-Virus oder anderen Infektionsträgern.
Deshalb sollten die Reagenzien als potentiell infektiös behandelt werden. Umgangs- und Entsorgungsmethoden sollten denen für potentiell infektiösem Material entsprechen.
Das Evans Blue und die Kitkontrollen enthalten 0,099% Natriumazid als Konservierungsmittel. Deshalb sollten die entsprechenden Vorsichtsmaßnahmen beachtet werden. Verschlucken sowie Kontakt mit Haut oder Schleimhäuten vermeiden. Nach Kontakt Hautstelle mit viel Wasser abspülen und ärztlichen Rat einholen. Natriumazid kann mit Blei- oder Kupferrohren explosive Metallazide bilden. Nach der Entsorgung mit ausreichender Menge Wasser nachspülen um Azidablagerungen zu vermeiden. Dieses Produkt sollte nur von entsprechend geschultem Laborpersonal für den angegebenen Verwendungszweck verwendet werden. Die Einhaltung der Arbeitsvorschrift wird empfohlen.
6 LAGERUNG UND STABILITÄT
Ungeöffnete Kits bei 2-8°C lagern, sie sind so bis zum angegebenen Verfallsdatum verwendbar. NICHT EINFRIEREN! Ist der Folienbeutel eines Objektträgers einmal geöffnet, muss er sofort verwendet werden. Der verdünnte PBS-Puffer ist bis zu einem Monat bei 2-8°C haltbar. Alle anderen Reagenzien nach Anbruch bei 2-8°C aufbewahren.
7 PROBENENTNAHME UND -VORBEREITUNG
Blutproben über Venenpunktur sammeln und bei Raumtemperatur gerinnen lassen. Das Serum so schnell wie möglich vom Gerinnsel abtrennen um eine Hämolyse zu vermeiden. Die Seren können bei 2-8°C bis zu 7 Tage vor dem Test gelagert werden (Ref. 9). Für eine längere Lagerung die Seren aliquotieren und bei mindestens -20°C einfrieren. Serum nur einmal einfrieren und auftauen. Keine stark lipämische, hämolytische oder mikrobiell verunreinigte Seren verwenden, da dadurch erniedrigte Titer oder unklare Muster auftreten können.
8 TESTDURCHFÜHRUNG
8.1 Gelieferte Materialien
8.1.1 50 Test-Kit FK314.1
1. 10 x Mouse, kidney, stomach slides – 5-well
(10 x 5 Auftragsstellen Maus-Nieren-Magen-Objektträger) 2. 1 x 1mL ANA positive control
(vorverdünnte ANA-Positiv-Kontrolleserum) 3. 1 x 1mL Mitochondrial positive control
(vorverdünnte Mitochondrial-Positiv-Kontrolleserum) 4. 1 x 1mL Negative Control (vorverdünnte Negativ-Kontrollserum) 5. 1 x 1mL Smooth Muscle positive control
(vorverdünnte Glatte-Muskulatur-Positiv-Kontrollserum)
6. 1 x 6,2mL Anti human IgG (H&L) AFF FITC (anti-human-IgG-(H+L)-FITC-Konjugat)
7. 1 x 3mL 1% Evans Blue Counterstain (1%ige Evans-Blue-Lösung)
8. 2 x 60mL PBS concentrate (x20) (PBS-Konzentrat (20fach))
9. 1 x 3mL Mounting Medium (Eindeckmedium)
10. 20 x Blotters (Blotter)
11. 10 x Coverslips (Deckgläschen) (22 x 70mm)
12. 1 x Arbeitsanleitung
8.1.2 250 Test-Kit FK314.2
1. 25 x Mouse kidney, stomach slides – 10-well
(25 x 10 Auftragsstellen Maus-Nieren-Magen-Objektträger) 2. 1 x 1mL ANA positive control
(vorverdünnte ANA-Positiv-Kontrolleserum) 3. 1 x 1mL Mitochondrial positive control
(vorverdünnte Negativ-Kontrollserum) 4. 1 x 1mL Smooth Muscle positive control
(vorverdünnte Glatte-Muskulatur-Positiv-Kontrollserum) 5. 1 x 1mL Negative Control (vorverdünnte Negativ-Kontrollserum)
6. 1 x 15,5mL Anti human IgG (H&L) AFF FITC
(anti-human-IgG-(H+L)-FITC-Konjugat)
7. 1 x 3mL 1% Evans Blue Counterstain (1%ige Evans-Blue-Lösung)
8. 2 x 60mL PBS concentrate (x20) (PBS-Konzentrat (20fach))
9. 1 x 10mL Mounting Medium (Eindeckmedium)
10. 50 x Blotters (Blotter)
11. 25 x Coverslips (Deckgläschen) (22 x 70mm)
12. 1 x Arbeitsanleitung
8.1.3 Objektträger:
FS314.1 (10 x 5 Auftragsstellen), FS314.A (1 x 5), FS314.2 (25 x 10), FS314.B (1 x 10)
8.2 Benötigte, nicht im Kit enthaltene Materialien
8.2.1 Destilliertes Wsser zum Verdünnen des PBS-Pufferkonzentrats. 8.2.2 Gefäß für PBS-Puffer.
8.2.3 Mikropipetten und Einmal-Spitzen zum Pipettieren der Patientenseren.
8.2.4 Feuchte Kammer für die Inkubationen (z.B. Magnetische Färbekammer, Bestell-Nr.: BD010).
8.2.5 Fluoreszenzmikroskop mit einem 495nm Anregungsfilter und 515nm Barrierefilter. 8.2.6 Spritzflasche für 1. Waschschritt.
8.2.7 Bei Verwendung von Einzelobjektträgern können die zusätzlich benötigten Komponenten bei The Binding Site bestellt werden: PBS-Puffer (Bestell-Nr.: CON3.3), Negativ-Kontrollserum (Bestell-Nr.: CON92), ANA-homogen Positiv-Kontrollserum (Bestell-Nr.: FA105), Mitochondriales Positiv-Kontrollserum (Bestell-Nr.: FA128), Glatte Muskulatur Positiv-Kontrollserum (Bestell-Nr.: FA134), anti-Hu-IgG-(H+L)-FITC-Konjugat (Bestell-Nr.: FA003), Eindeckmedium (Bestell-Nr.: CON 195) und 1%ige Evans-Blue-Lösung (Bestell-Nr.: CON93).
8.3 Testdurchführung
Qualitätskontrolle
Die Negativ- und Positivkontrollen sollten bei jedem Testansatz mitgeführt werden. 8.3.1 Eindeckmedium: Das Eindeckmedium aus dem Kühlschrank nehmen und vor Gebrauch
auf Raumtemperatur (18-28°C) erwärmen lassen.
8.3.2 PBS-Konzentrat verdünnen. Konzentrat mit destilliertem Wasser 1/20 (1 Teil PBS-Konzentrat + 19 Teile destilliertes Wasser) verdünnen und mischen. Der PBS-Puffer in Arbeitskonzentration wird zum verdünnen der Patientenseren und als Waschpuffer verwendet.
8.3.3 Patientenseren verdünnen
Screening: Patientenseren im Verhältnis 1/20 verdünnen (z.B. 50µL Serum + 950µL
PBS-Puffer).
Titration: Von im Screening positiven Proben eine serielle Verdünnungsreihe erstellen
(z.B. 1/20, 1/40; 1/80; 1/160; 1/320; 1/640 usw.) z.B. 100µL eines 1/20 verdünnten Patientenserums mit 100µL PBS-Puffer versetzen - ergibt eine 1:40 Verdünnung.
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8.3.4 Objektträger vorbereiten. Die Objektträger auf Raumtemperatur (18-28°C) erwärmen lassen. Folienbeutel erst direkt vor dem Gebrauch öffnen! Die Objekträger aus dem Folienbeutel nehmen, entsprechend beschriften und in eine feuchte Kammer geben. Je 1 Tropfen der Kontrollen und 50µL der verdünnten Patientenseren auf die jeweiligen Auftragsstellen auftragen.
8.3.5 Inkubation der Objektträger. Die Objektträger 20min. bei Raumtemperatur (18-28°C) in der feuchten Kammer inkubieren.
8.3.6 Waschen mit PBS-Puffer. Die Objektträger aus der feuchten Kammer nehmen und rasch mit PBS-Puffer (Spritzflasche) waschen, dabei nicht direkt in die Auftragsfelder spritzen. Die Objektträger in eine Halterung geben und in ein PBS-Pufferbad eintauchen. Die Objektträger 5-10 min im PBS-Puffer belassen, dabei rühren oder leicht schütteln.
8.3.7 Zugabe von Fluoreszenz-Konjugat. Überschüssigen PBS-Puffer abschütteln und die Objektträger mit dem mitgelieferten Blotpapier (nur Kits!) oder Filterpapier abtrocknen. Die Objektträger wieder in die feuchte Kammer legen und sofort, d. h. innerhalb von
15 sec, auf jede Auftragsstelle einen Tropfen Fluoreszenz-Konjugat geben. Das
Austrocknen des Substrats kann das Ergebnis beträchtlich beeinrächtigen. 8.3.8 Inkubation der Objektträger. Die Objektträger 20 min. bei Raumtemperatur (18-28°C) in
der feuchten Kammer im Dunkeln inkubieren.
8.3.9 Waschen mit PBS-Puffer. Erneut waschen wie unter Punkt 8.3.6 beschrieben. Wenn eine Gegenfärbung gewünscht wird, können bei diesem Waschschritt bis zu 2-3 Tropfen der 1 %igen Evans-Blue-Lösung pro 100mL PBS-Puffer zugegeben werden. 8.3.10 Deckgläschen aufsetzen. Jeweils nur einen Objektträger aus dem PBS-Pufferbad
nehmen. Um die Auftragsstellen herum rasch abtrocknen und jeweils 1 Tropfen Eindeckmedium auf die Auftragsstelle geben. Das Deckgläschen sorgfältig auf den Objektträger legen, wobei Luftbläschen zu vemeiden sind. Eventuell vorhandene Luftblasen nicht versuchen zu entfernen. Überschüssiges Eindeckmedium mit Filterpapier entfernen.
8.3.11 Objektträger unter dem Fluoreszenzmikroskop auswerten. Sie können im Dunkeln bei 2-8°C bis zu drei Tage ohne signifikaten Fluoreszenzverlust aufbewahrt werden.
9 ERGEBNISSE
9.1 Qualitätskontrolle
Die ANA-Positivkontrolle sollte eine kräftige, apfelgrüne, homogene Fluoreszenzfärbung in den Zellkernen erzeugen. Die Mitochondrial-Positivkontrolle sollte eine kräftige, apfelgrüne Fluores-zenfärbung in den Nieren-Tubuli und den Magen-Parietalzellen erzeugen. Die ASMA-Positivkontrolle sollte eine kräftige, apfelgrüne Fluoreszenzfärbung in der Magen-Muskelschicht erzeugen. Die Negativkontrolle zeigt eine matt-grüne Anfärbung des Gewebes ohne erkennbare Fluoreszenz. Erscheint eine der Kontrollen nicht wie beschrieben, sollte der Testansatz verworfen und ein neuer Ansatz gemacht werden.
9.2 Interpretation der Ergebnisse
9.2.1 Negativ
Bei einem negativen Ergebnis zeigen alle Teile des Gewebes eine matt-grüne Färbung ohne erkennbare Fluoreszenz.Seren, die lediglich eine sehr schwache Fluoreszenz zeigen, sollten erneut mit einer Verdünnung von 1: 40 getestet werden. Ist das Ergebnis wie zuvor, so wird die Probe als negativ angesehen.
9.2.2 Positiv
Bei einer positiven Probe wird eine signifikante Fluoreszenz in spezifischen Gewebe-Strukturen gefunden. Folgende Fluoreszenz-Muster können auftreten:
Antinukleäre Antikörper (ANA)
Durch ANA’s werden folgende Zellkerne angefärbt: distale und proximale Nieren-Tubuli, Magen-Parietal- und Hauptzellen. Bei fast allen SLE-Patienten werden ANA’s im Serum gefunden, aber sie können ebenfalls bei verschiedenen Erkrankungen des Bindegewebes, inkl. Rheumatischer Arthritis auftreten. ANA‘s können auch bei der chronischen aktiven Hepatitis und primären biliären Zirrhosen und als Folge von verschiedenen Medikamenten auftreten.
Zusätzliche Informationen können durch die Interpretation des ANA-Musters gewonnen werden (siehe Tabelle unten). Es wird empfohlen, dass alle ANA- positiven Seren bis zum Endpunkt austitriert werden, um sicherzustellen, dass keine gemischten Muster übersehen werden. Weiterhin sollten diese Proben auch auf Autoantikörper gegen Doppelstrang-DNA (dsDNA) und extrahierbare nukleäre Antigene (ENA) untersucht werden.
Muster Beteiligte Antigene Assoziierte Erkrankungen
Homogen dsDNA, Histone SLE
Rheumatische Arthritis (RA) Mischkollagenosen Medikamenten-induzierter Lupus Peripher
(Rim) Native / dsDNA SLE
Gesprenkelt Extrahierbare, nukleoläre Antigene Ribonukleoproteine Scl-70 SSB Sklerodermie Sjögren’s Syndrom Mischkollagenosen SLE
Nukleolär 4-6S RNA Sklerodermie
Sjögren’s Syndrom
SLE, RA und progressive systemische Sklerodermie
Fluoreszenzmuster von gewebespezifischen Autoantikörpern:
Muster Gewebe Assoziierte Erkrankungen
Antimitochondriale
Antikörper (AMA) Niere: distales, tubuläres Zyto-plasma und proximale Tubuli (seltener)
Magen: Zytoplasma der Parietalzellen
Primäre biliäre Zirrhose andere Lebererkrankungen
Antikörper gegen glatte
Muskulatur (ASMA) Magen: Muskelschicht Andere Gewebe: arterielle Muskelschicht
Chronisch aktive Hepatitis
Antikörper gegen
Magenparietalzellen (PCA) Magen: Parietalzellen Perniziöse Anämie Anti-Retikulin Antikörper
(ARA) Niere: Peritubuläre Fibern und Bowman’sche Kapsel Morbus Crohn Zöliakie Dermatitis hepetiformis
Hinweis: Jedes Labor sollte eigene Richtlinien erstellen und festlegen wann ein positives Ergebnis
klinisch relevant ist.
10 GRENZEN DES TESTS
10.1 Die im Fluoreszenzmikroskop verwendete Lichtquelle, Filter und Optik beeinflussen die Sensitivität des Tests. Die Qualität des Mikroskops wird maßgeblich durch die korrekte Wartung, speziell durch Zentrieren der Quecksilberlampe und deren Austausch nach der empfohlenen Brenndauer, beeinflusst.
10.2 Bei der Titration einer Probe bis zum Endpunkt kann sich das Fluoreszenzmuster ändern. Diese Änderung wird durch das Vorkommen von mehreren Autoantikörpern (speziell bei ANAs) verursacht.
10.3 Es ist zu beachten, dass Autoantikörper durch verschiedene Medikamente, einschließlich Antibiotika und Orale Kontrazeptiva, aktiviert oder induziert werden können.
10.4 Aufgrund der nur kleinen Abstände zwischen den Auftragsstellen bei den Objektträgern mit 10 Auftragsstellen besteht eine gewisse Verschleppungsgefahr. Deshalb muss besonders sorgfältig gearbeitet werden, speziell beim Waschen, um eine Verschleppung zu vermeiden.
10.5 Der Test allein ist nicht als diagnostischer Beweis ausreichend. Alle Ergebnisse sollten immer nur im Zusammenhang mit anderen Laborbefunden (Serologie, Biopsie) und dem klinischen Bild des Patienten betrachtet werden.
10.6 Die Verwendung dieser Produkte mit IFT-Reagenzien anderer Hersteller wurde nicht überprüft, ist aber nicht zwangsläufig ausgeschlossen.
FDA (USA) Informationen: siehe englische Packungsbeilage.
11 ERWARTETE ERGEBNISSE UND LEISTUNGSDATEN
11.1 Erwartete Ergebnisse
Patientengruppe Anzahl n ANA AMA ASMA (AG)PCA Ref.
Normale Bluspender 60 0 0 0 0 8 Chronisch-aktive Hepatitis 50 66 2 58 0 8 Primäre biliäre Zirrhose 110 10 86 3 0 8 SLE 16 100 0 0 0 * Rheumatische Arthritis 4 100 0 0 0 *
*Daten stammen aus einer bei The Binding Site Ltd. durchgeführten, internen Studie.
Hinweis: Es ist möglich, dass eine Probe mehrere verschiedene Fluoreszenzmuster aufweisen kann.
11.2 Vergleichsstudie
In einer Vergleichsstudie wurde dieser Kit mit einer kommerziell erhältlichen Referenzmethode verglichen. Es wurden 90 Patientenseren getestet und folgende Ergebnisse erhalten:
87 der 90 getesteten Proben ergaben mit beiden Methoden ein identisches Ergebnis. Es wurde für die in Abschnitt 9.2 beschriebenen Muster eine relative Sensitivität von 86-100%, und eine relative Spezifität von 100 % gefunden. Die relative Übereinstimmung liegt zwischen 98-100%. Die Proben mit abweichendem Ergebnis wurden nur mit der Referenzmethode als schwach ANA- oder ASMA-positiv befunden. Dies bedeutet, dass die Proben grenzwertig sind und/oder die zwei Methoden geringfügige Unterschiede in der Sensitivität aufweisen.
12 REFERENZEN
1. Tan, E M (1989). Antinuclear Antibodies: Diagnostic markers for autoimmune diseases and probes for cell biology. Adv. Immunol. 44, 93-151.
2. Doniach, D, et al (1986). Tissue antibodies in primary biliary cirrhosis, active chronic
(lupoid) hepatitis, cryptogenic cirrhosis and other liver diseases and their clinical implications. Clin. Exp. Imm. 1. 237-262.
3. Wallington, T B & Gooi H C (1990). Clinical Immunology. A practical approach. Ed. Gooi, H C & Chappel, H. Publ. IRL Press, Oxford UK. 195-220.
4. Cavallaro, J J, et al (1976). Immunofluorescent detection of autoimmune diseases,
Immunology Series NO. 7. CDC, Atlanta, GA.
5. Seah, P P et al (1971). Antireticulin antibody: Tissue autoantibodies in dermatitis herpetiformis and adult coeliac disease. Lancet 1, 834-836.
6. Weller, T.H; Coons, A.H: Fluorescent antibody studies with agent of Varicella and Herpes Zoster Propagated in vitro; Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 86: 789 – 794, 1954
7. Goudie, R B et al (1966). Serological and histological diagnosis of primary biliary cirrhosis. J. Clin. Path. 19, 527-538.
8. R.M. Bernstein et al. Diversity of autoantibodies in Primary biliary cirrhosis and Chronic
active hepatitis. Clin. Exp. Imm. 55: 553-560, 1984.
9. Protein Reference Handbook of Autoimmunity (3rd Edition) 2004. Ed. A Milford Ward, GD Wild. Publ. PRU Publications, Sheffield. 14.
13 KURZARBEITSANLEITUNG
13.1 Eindeckmedium auf Raumtemperatur erwärmen lassen. 13.2 PBS-Pufferkonzentrat 1:20 mit destilliertem Wasser verdünnen. 13.3 Patientenseren 1:20 mit PBS-Puffer verdünnen. 13.4 Objektträger auf Raumtemperatur (18-28°C) erwärmen lassen. 13.5 Je 50 µl Kontrollen und verdünnte Patientenseren auftragen.
13.6 20 Minuten bei Raumtemperatur (18-28°C) in einer feuchten Kammer inkubieren. 13.7 Objektträger 5-10 min. mit PBS-Puffer waschen.
13.8 Objektträger aus dem PBS-Bad nehmen, um die Auftragsstellen herum gut abtrocknen, wieder in die feuchte Kammer legen und sofort 1 Tropfen FITC-Konjugat auftragen. 13.9 20 Minuten bei Raumtemperatur (abdunkeln) inkubieren.
13.10 Wie unter Punkt 13.7 beschrieben waschen. 13.11 Objektträger Eindecken und Deckgläschen aufsetzen. 13.12 Objektträger unter dem Fluoreszenzmikroskop auswerten.
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LAMES/KITS D’IMMUNO-FLUORESCENCE
REIN/ESTOMAC DE SOURIS
Pour usage diagnostic in vitro
Code Produit : FK314.1, FK314.2
FS314._
Produits fabriqués en Angleterre par la société :
The Binding Site Ltd, PO Box 11712, Birmingham, B14 4ZB, U.K.
www.bindingsite.co.uk
Distribués en France par la société :
The Binding Site, 14 rue des Glairaux, BP226, 38522 Saint-Egrève Cedex.
Téléphone : 04.38.02.19.19
Fax : 04.38.02.19.20
e-mail : info@bindingsite.fr
1 INDICATIONS
Ces coffrets sont destinés au dépistage et au titrage des autoanticorps circulants dans le sérum humain. Ils apportent une aide au diagnostic et au traitement de plusieurs maladies autoimmunes. Les quatre principaux autoanticorps détectés sont les anti-nucléaires (ANA), les anti-mitochondries (AMA), les anti-muscle lisse (ASMA) et les anti-cellules pariétales gastriques (AGPCA).
2 RESUME ET EXPLICATION
L’immunofluorescence indirecte est la méthode de choix pour le dépistage et la tritration des autoanticorps circulants dans le sérum. Les coupes de tissus d’animaux, par exemple de souris, sont généralement préférées à des coupes de tissus humains ou des cellules. Ceci est lié à l’abscence d’interférences du système HLA ou d’autres anticorps liés aux groupes sanguins. En utilisant deux types de tissus (rein et estomac), il est plus facile d’identifier les autoanticorps en comparant les résultats obtenus sur chacun des tissus.
Les anticorps antinucléaires (ANA) correspondent à une variété d’anticorps contre les constituants du noyau de la cellule comprenant l’ADN, l’ARN, et les différentes protéines nucléaires (réf. 1). Ces ANA sont rencontrés fréquemment chez des patients atteints le lupus érythémateux disséminé (LED) mais aussi de connectivites ou de pathologies rhumatoïdes. Les AMA sont fréquemment présents dans les cirrhoses biliaires primitives, mais peuvent être également rencontrés dans d’autres pathologies du foie. Les ASMA sont trouvés chez des patients atteints d’hépatite chronique active ou de cirrhoses biliaires primitives, mais aussi en faible concentration dans d’autres maladies. Les AGPCA sont présents chez la plupart des patients atteints d’anémie pernicieuse. Une description plus précise des ces anticorps est donnée au pargraphe 9 (réf. 1-8).
3 PRINCIPE
Ce coffret fait appel à une technique d’immunofluorescence indirecte (réf. 6). Les sérums de patients et les contrôles appropriés sont incubés sur les coupes de tissus. Les anticorps non spécifiques sont éliminés par lavage. Un conjugué approprié marqué à la fluorescéine est appliqué. Le conjugué non lié est éliminé par lavage et la lecture des lames s’effectue à l’aide d’un microscope à fluorescence. La positivité des échantillons se traduit par un marquage fluorescent de certaines régions de la coupe de tissus sur lesquelles sont accrochés les autoanticorps.
4 REACTIFS
4.1 Lames de rein, estomac de souris en 5 ou 10 puits.
Coffrets seulement
4.2 Sérum de contrôle positif ANA homogène, contenant 0,099% d’azide de sodium. Prédilué et prêt à l’emploi.
4.3 Sérum de contrôle positif anti-mitochondrie, contenant 0,099% d’azide de sodium. Prédilué et prêt à l’emploi.
4.4 Sérum de contrôle positif anti-muscle lisse, contenant 0,099% d’azide de sodium. Prédilué et prêt à l’emploi.
4.5 Sérum de contrôle négatif, universellement négatif pour tous les autoanticorps, contenant 0,099% d’azide de sodium. Prédilué et prêt à l’emploi.
4.6 Antisérum de mouton anti-IgG(H+L) humaines, purifié par affinité et couplé à l’isothiocyanate de fluorescéine, contenant 0,099% d’azide de sodium. Prédilué et prêt à l’emploi. 4.7 Bleu d’Evans à 1%, comme contre-colorant optionnel.
4.8 Tampon PBS, fourni sous forme liquide concentré 20 fois. 4.9 Buvards pour sécher le pourtour des puits après lavage.
4.10 Milieu de montage contenant un agent anti-fading (DABCO 1, 4, diazabicyclo [2.2.2] octane). 4.11 Lamelles.
5 PRECAUTIONS
Tous les sérums des donneurs humains ont été soumis aux tests des hépatites B et C, de l’HIV1 et HIV2 et se sont avérés négatifs. Toutefois ces tests ne peuvent garantir l’absence totale d’agents infectieux. Tous les échantillons doivent donc être considérés comme potentiellement infectieux. Seul un personnel formé peut utiliser ce matériel.
Le bleu d’Evans et les contrôles du coffret contiennent 0,099% d’azide de sodium, il est recommandé de les manipuler avec précaution – Ne pas ingérer ni mettre en contact avec la peau ou les muqueuses. En cas de contact, rincer à grande eau et consulter un médecin. L’azide peut réagir avec du plomb ou du cuivre pour former de l’azide de métal très explosif. Dans ce cas, laver à grande eau pour empêcher la formation des azides de métaux.
Ce réactif doit être utilisé par du personnel formé. Il est recommandé de suivre scrupuleusement le protocole.
6 STOCKAGE ET STABILITE
Les coffrets non ouverts doivent être stockés à 2-8°C et peuvent être utilisés jusqu’à la date de péremption. Ne pas congeler. Lorsque les lames sont sorties de leur étui, les utiliser immédiatement. Le tampon PBS dilué peut être stocké un mois à 2-8°C. Tous les autres réactifs doivent être stockés à 2-8°C.
7 ECHANTILLONS
Prélever de façon stérile et par ponction veineuse et laisser le sang coaguler à température ambiante, puis séparer le sérum du caillot dès que possible pour éviter l’hémolyse. Les sérums peuvent être conservés à 2-8°C pendant 7 jours avant les tests (réf. 9) ou aliquotés et congelés à -20°C minimum pour une conservation plus longue. Ne pas congéler et décongeler les sérums plus d’une fois. Il est recommandé d’utiliser des sérums non lipidiques, non hémolysés et non contaminés par des bactéries qui pourraient donner des titres faibles ou des marquages flous.
8 METHODOLOGIE
8.1 Matériel fourni
8.1.1 Coffret FK314.1 50 tests
1. 10 x Mouse kidney, stomach slides – 5-well
(10 lames de 5 puits de rein, estomac de souris) 2. 1 x 1mL ANA positive control (contrôle positif ANA prédilué)
3. 1 x 1mL Mitochondrial positive control
(contrôle positif anti-mitochondrie prédilué) 4. 1 x 1mL Smooth Muscle positive control
(contrôle positif anti-muscle lisse prédilué) 5. 1 x 1mL Negative Control (contrôle négatif prédilué)
6. 1 x 6,2mL Anti-human IgG (H+L) prediluted FITC
(conjugué FITC anti-IgG (H+L) humaines)
7. 1 x 3mL 1% Evans Blue Counterstain (bleu d’Evans à 1%)
8. 2 x 60mL PBS concentrate (x20) (tampon PBS (20 fois concentré))
9. 1 x 3mL Mounting Medium (milieu de montage)
10. 20 x Blotters (buvards)
11. 10 x Coverslips (lamelles) (22 x 70mm)
12. 1 fiche technique
8.1.2 Coffret FK314.2 250 tests
1. 25 x Mouse kidney, stomach slides – 10-well
(25 lames de 10 puits de rein, estomac de souris) 2. 1 x 1mL ANA positive control (contrôle positif ANA prédilué)
3. 1 x 1mL Mitochondrial positive control
(contrôle positif anti-mitochondrie prédilué) 4. 1 x 1mL Smooth Muscle positive control
(contrôle positif anti-muscle lisse prédilué) 5. 1 x 1mL Negative Control (contrôle négatif prédilué)
6. 1 x 15,5mL Anti-human IgG (H+L) prediluted FITC
(conjugué FITC anti-IgG (H+L) humaines)
7. 1 x 3mL 1% Evans Blue Counterstain (bleu d’Evans à 1%)
8. 2 x 60mL PBS concentrate (x20) (tampon PBS (20 fois concentré))
9. 1 x 10mL Mounting Medium (milieu de montage)
10. 50 x Blotters (buvards)
11. 25 x Coverslips (lamelles) (22 x 70mm)
12. 1 fiche technique
8.1.3 FS314.1, FS314.A, FS314.2, FS314.B
1. 10 x 5 puits, 1 x 5 puits, 25 x 10 puits, 1 x 10 puits, respectivement. 2. 1 x fiche technique.
8.2 Matériel nécessaire et non fourni
8.2.1 Eau distillée pour diluer le PBS concentré. 8.2.2 Récipient pour le tampon PBS.
8.2.3 Micropipettes et cônes pour le dépôt des échantillons.
8.2.4 Chambre humide pour les étapes d’incubation (ex: Chambre de marquage magnétique Binding Site Réf. BD010).
8.2.5 Microscope à fluorescence avec un filtre excitant à 495nm et un filtre barrière à 515nm. 8.2.6 Flacon plastique pour le lavage initial en PBS.
8.2.7 Si seules les lames sont utilisées, d’autres réactifs peuvent être obtenus chez Binding Site : tampon PBS (CON 3.3), contrôle négatif (CON 92), contrôle homogène ANA (FA105), contrôle positif anti-mitochondrie (FA128), contrôle positif anti-muscle lisse (FA134), conjugué FITC anti-IgG (H+L) humaines (FA003), milieu de montage (CON 195) et le bleu d’Evans à 1% (CON 93).
8.3 Procédure
Contrôle de qualité
Les contrôles positifs et négatifs doivent être utilisés lors de chaque série.
8.3.1 Milieu de montage : Sortir le milieu de montage du réfrigérateur pour qu’il atteigne la température ambiante (18-28°C) avant d’être utilisé.
8.3.2 Diluer le PBS concentré. Diluer le PBS dans de l’eau distillée et mélanger (1 volume de PBS pour 19 volumes d’eau distillée). Le PBS est utilisé pour diluer les échantillons et comme tampon de lavage.
8.3.3 Dilution des échantillons.
Pour le dépistage, diluer les échantillons au 1/20 (mettre 50µL de sérum dans 950µL
de PBS dilué).
Pour la titration, faire des dilutions en cascade du sérum en PBS (1/20, 1/40, 1/80,
1/160, 1/320, etc.). Par exemple : prendre 100µL de la dilution au 1/20 et mélanger avec 100µL de tampon PBS pour obtenr une dilution au 1/40.
8.3.4 Lames. Les ramener à température ambiante (18-28°C) avant de les sortir de leur emballage. Les marquer puis les déposer dans la chambre humide avant le dépôt des contrôles positifs et négatifs (1 goutte) dans les puits 1 et 2. Déposer 50µL d’échantillon dilué dans les autres puits.
8.3.5 Incubation des lames. Incuber les lames pendant 20 minutes en chambre humide à température ambiante (18-28°C).
8.3.6 Lavage. Sortir les lames de la chambre humide et les rincer rapidement à l’aide d’une pissette contenant le tampon PBS. Ne pas diriger le jet directement sur les puits. Mettre les lames sur un portoir et les immerger en PBS sous agitation lente pendant 5 à 10 minutes.
8.3.7 Conjugué fluorescent. Eliminer l’excès de PBS et sécher le pourtour des puits à l’aide des buvards fournis. Remettre les lames en chambre humide et couvrir immédiatement chaque puits avec une goutte de conjugué fluorescent. NE PAS LAISSER LES PUITS A L’AIR PENDANT PLUS DE 15 SECONDES. Un déséchement du substrat peut affecter les résultats.
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8.3.8 Incubation des lames. Incuber les lames pendant 20 minutes en chambre humide à température ambiante (18-28°C). Recouvrir la chambre humide de papier pour éviter l’exposition à la lumière.
8.3.9 Lavage. Procéder comme à la section 8.3.6. Il est possible de faire une contre coloration en ajoutant 2 à 3 gouttes de bleu d’Evans à 1% à 100mL de PBS avant d’immerger les lames.
8.3.10 Montage des lames. Sortir les lames une à une du PBS. Sécher rapidement le pourtour des puits puis déposer une goutte de milieu de montage dans chaque puits. Déposer la lamelle en évitant la formation de bulles d’air. Ne pas essayer d’éliminer les bulles d’air éventuellement apparues. Essuyer l’excès de milieu de montage.
8.3.11 Lecture des lames. La lecture se fait à l’aide d’un microscope fluorescent. Les lames peuvent être stockées 3 jours à 2-8°C sans diminution de l’intensité de fluorescence.
9 RESULTATS
9.1 Contrôle qualité
Le contrôle positif ANA doit donner une fluorescence verte homogène du noyau. Le contrôle positif anti-mitochondrie doit donner une fluorescence verte des tubulles rénaux et des cellules pariétales gastriques. Le contrôle positif anti-muscle lisse doit donner une fluorescence verte de la couche musculaire de l’estomac.
Le contrôle négatif peut présenter un très léger bruit de fond vert pâle sur toutes les coupes de tissu, mais en aucun cas une fluorescence franche.
Si les puits de contrôle ne correspondent pas à la description ci-dessus, le test doit être considéré comme invalide et il est conseillé de le répéter.
9.2 Interprétation des résultats
9.2.1 Négatif
Le contrôle négatif peut présenter un très léger bruit de fond vert pâle sur toutes les coupes de tissus, mais en aucun cas une fluorescence franche. Les réactions faibles doivent être répétées mais à une concentration plus élevée (ex: 1/40). Si le nouveau test paraît identique au précédent, il est considéré comme négatif.
9.2.2 Positif
Un échantillon est considéré positif lorsqu’une fluorescence significative apparaît dans les organelles des tissus spécifiques donnant un des aspects suivants :
Anticorps anti-nucléaires (ANA)
Marquage spécifique des noyaux des tubules distaux et proximaux du rein, les cellules principales et pariétales gastriques. La plupart des patients atteints de LED ont des ANA dans leur sérum, mais les ANA peuvent aussi être retrouvés dans des connectivites et notamment dans l’arthrite rhumatoïde. Les ANA sont également présents lors d’hépatites chroniques actives et de cirrhoses biliaires primitives ou en réponse à certains medicaments.
Des informations complémentaires peuvent être obtenues en interprétant le type de marquage observé (voir ci-dessous) Il est recommandé que tous les sérums positifs pour les ANA soient titrés jusqu’au point final afin de s’assurer que l’on ne rate pas une combinaison d’anticorps. Il est recommandé de procéder à des analyses complémentaires pour les anti-ADN db et les antigènes nucléaires solubles (ENA).
Aspect Antigène impliqué Maladie associée
Homogéne ADN double brin, histones LED
L’arthrite rhumatoïde (RA) Connectivites mixtes Lupus médicalement induit Périphérique
(Rim) ADN double brin, natif LED Moucheté Extractable nuclear antigens
Ribonucléoproteine, Scl-70, SSB, Sclerodermie Syndrome de Sjögren Connectivites mixtes LED
Nucléolaire RNA 4-6S Sclerodermie
Syndrome de Sjögren LED, AR et
Sclérose systémique progressive
Aspect du marquage pour les autoanticorps spécifiques des tissus :
Autoanticorps Tissus associés Principales maladies
associées
Autoanticorps anti-
mitochondries (AMA) Tubules distaux des reins et tubules proximaux (moins) Cytoplasme
Cirrhose biliaire primitives et autres pathologies du foie Autoanticorps anti-
muscle lisse (ASMA) Couche musculaire (estomac) Couche musculaire des artérioles (autres tissus)
Hépatites chroniques actives
Autoanticorps anti-cellules gastriques pariétales (AGPCA)
Cellules pariétales (estomac) Anémie pernicieuse
Autoanticorps anti- réticuline (ARA)
Fibres péritubulaires
Capsules de Bowman (rein) Maladie de Crohn Maladie coeliaque Dermatoses herpétiques Note : Chaque laboratoire doit déterminer le seuil à partir duquel il y aura signification clinique.
10 LIMITES DE LA PROCEDURE
10.1 La qualité des filtres, des optiques et de la source lumineuse peut influencer la sensibilité du test. La performance du microscope est liée à la maintenance et plus particulièrement sur le centrage et le changement de la lampe.
10.2 Les aspects de marquage changent souvent lorsqu’ un échantillon est titré jusqu’à son point final. Ceci est dû à la présence de plusieurs autoanticorps, spécialement pour les ANA.
10.3 Les autoanticorps peuvent être activés ou induits par divers médicaments tels que les contraceptifs oraux ou les anticorps.
10.4 Compte tenu du faible espacement entre les puits sur les lames de 10 puits, il est possible qu’il y ait des contaminations. La plus grande attention est recommandée lors des étapes de lavage.
10.5 Ce test seul ne doit pas être utilisé pour donner un diagnostic. D’autres résultats doivent être pris en compte tels que les signes cliniques, les biopsies ou les tests sérologiques. 10.6 Aucun test n’a été fait avec les réactifs provenant d’autres fournisseurs, mais leur
utilisation n’est pas exclue.
Information FDA (USA) – cf 1ere page
11 VALEURS ATTENDUES ET PERFORMANCES SPECIFIQUES
11.1 Résultats attendus
% Positif
Patient No. ANA AMA ASMA AGPCA Réf
Donneurs normaux 60 0 0 0 0 8 Hépative chronique active 50 66 2 58 0 8 Cirrhose biliaire primitive 110 10 86 3 0 8 LED 16 100 0 0 0 * Arthrite rhumatoïde 4 10 0 0 0 *
* Résultats obtenus au cours d’études internes dans les laboratoires The Binding Site. NB : Il est possible qu’un échantillon soit positif pour plusieurs aspects.
11.2 Etude de comparaison
Une étude de comparaison a été réalisée sur 90 échantillons cliniques en utilisant ce coffret et un autre coffret commercial de référence. 87 des 90 échantillons testés ont donné des résultats identiques avec les 2 coffrets. Pour les aspects décrits dans le paragraphe 9.2, la sensibilité relative atteint 86 à 100%, la spécificité relative était de 100% dans tous les cas et la corrélation relative allait de 98 à 100%. Pour les échantillons qui différaient, le marquage positif ANA faible ou SMA a été obtenu dans chaque cas avec la méthode de référence seulement, suggérant que ces échantillons étaient douteux pour l’aspect en question et/ou qu’il existe une légère différence de sensibilité entre les 2 méthodes.
12 REFERENCES
1. Tan, E M (1989). Antinuclear Antibodies: Diagnostic markers for autoimmune diseases and probes for cell biology. Adv. Immunol. 44, 93-151.
2. Doniach, D, et al (1986). Tissue antibodies in primary biliary cirrhosis, active chronic
(lupoid) hepatitis, cryptogenic cirrhosis and other liver diseases and their clinical implications. Clin. Exp. Imm. 1. 237-262.
3. Wallington, T B & Gooi H C (1990). Clinical Immunology. A practical approach. Ed. Gooi, H C & Chappel, H. Publ. IRL Press, Oxford UK. 195-220.
4. Cavallaro, J J, et al (1976). Immunofluorescent detection of autoimmune diseases,
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5. Seah, P P et al (1971). Antireticulin antibody: Tissue autoantibodies in dermatitis herpetiformis and adult coeliac disease. Lancet 1, 834-836.
6. Weller, T.H; Coons, A.H: Fluorescent antibody studies with agent of Varicella and Herpes Zoster Propagated in vitro; Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 86: 789 – 794, 1954
7. Goudie, R B et al (1966). Serological and histological diagnosis of primary biliary cirrhosis. J. Clin. Path. 19, 527-538.
8. R.M. Bernstein et al. Diversity of autoantibodies in Primary biliary cirrhosis and Chronic
active hepatitis. Clin. Exp. Imm. 55: 553-560, 1984.
9. Protein Reference Handbook of Autoimmunity (3rd Edition) 2004. Ed. A Milford Ward, GD Wild. Publ. PRU Publications, Sheffield. 14.
13 RESUME DE LA PROCEDURE
13.1 Placer le milieu de montage à température ambiante. 13.2 Diluer le PBS dans de l’eau distillée.
13.3 Diluer les sérums au 1/20 dans du PBS. 13.4 Ramener les lames à température ambiante (18-28°C).
13.5 Déposer 50µL de contrôles positifs et négatifs et les sérums de patients dilués dans les puits.
13.6 Incuber 20 minutes en chambre humide. 13.7 Laver 5 à 10 minutes en tampon PBS.
13.8 Sécher autour des puits et couvrer immédiatement chaque puits avec une goutte de conjugué.
13.9 Incuber come à l’étape 13.6. 13.10 Laver comme à l’étape 13.7. 13.11 Monter les lames.
Insert Code: CIN286, Version: 17
thSeptember 2007, Page 7 of 12
KIT/PORTAOBJETOS PARA
INMUNOFLUORESCENCIA - SECCIONES
DE RIÑÓN, ESTÓMAGO DE RATÓN
Spanish
Para uso diagnóstico in vitro
Código Producto: FK314.1, FK314.2
FS314._
Producido por:
The Binding Site Ltd, PO Box 11712, Birmingham B14 4ZB,
U.K.www.bindingsite.co.uk
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Teléfono 902027750
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1 PROPÓSITOEste producto se utiliza para el screening y la titulación de los autoanticuerpos circulantes en el suero humano como auxiliar en el diagnóstico y en el tratamiento de varias enfermedades autoinmunes. Los cuatros principales autoanticuerpos determinados son los antinucleares (ANA), los antimitocondriales (AMA), los antimúsculo liso (ASMA) y los anticélulas parietales gástricas (AGPCA).
2 RESUMEN Y EXPLICACIÓN
La inmunofluorescencia indirecta es el método de referencia para el screening y la titulación de los autoanticuerpos circulantes en el suero. En general se prefieren las secciones de tejido animal, por ejemplo de ratón, a otros substratos utilizados habitualmente, tal como los preparados de células y las secciones de tejido humano; esto se debe principalmente a la ausencia de interferencias con los anticuerpos ante HLA y/o con otros anticuerpos dirigidos contra los grupos sanguíneos. El uso de dos diferentes tejidos (riñón y estómago) permite determinar más facilmente los autoanticuerops comparando los resultados obtenidos con cada tejido.
Determinados autoanticuerpos se asocian a varias patologías distintas. Los ANA casi siempre están presentes en el lupus eritematoso sistémico (LES), pero también se observan habitualmente en pacientes con enfermedades reumatoides y del tejido conectivo. Los AMA se observan con frecuencia en la cirrosis biliar primitiva, pero también pueden detectarse en pacientes con otras enfermedades hepáticas. Los ASMA se asocian con frecuencia a la hepatitis crónica activa y la cirrosis biliar primitiva, pero se determinan también a concentraciones bajas en muchas otras condiciones. Los AGPCA están presentes en el suero de la mayoría de los pacientes con anemia perniciosa. En la sección 9, se proporciona una descripción más detallada sobre las enfermedades a las que se asocian los autoanticuerpos (ref. 1-8).
3 PRINCIPIO
Se utiliza una técnica de inmunofluorescencia indirecta (ref. 6), en la que las muestras de los pacientes y los controles adecuados se incuban con las secciones. Los anticuerpos no específicos se eliminan mediante lavado y, a continuación, se aplica un conjugado adecuado marcado con fluoresceína. El conjugado no unido se elimina mediante lavado, tal como se ha hecho anteriormente. Los portaobjetos se examinan en un microscopio de fluorescencia. Las muestras positivas producen una fluorescencia de color verde brillante que corresponde a las áreas de la sección en las que se ha unido el autoanticuerpo.
4 REACTIVOS
4.1 Secciones di riñón, estómago de ratón en portaobjetos de 5 o 10 pocillos.
Los kits contienen:
4.2 Suero de control positivo ANA homogéneo con el 0,099% de azida sódica. Prediluido,
listo para usar.
4.3 Suero de control positivo mitocondrial, con el 0,099% de azida sódica. Prediluido, listo
para usar.
4.4 Suero de control positivo al músculo liso, con el 0,099% de azida sódica. Prediluido,
listo para usar.
4.5 Suero de control negativo universalmente negativo para todos los autoanticuerpos, con el 0,099% de azida sódica. Prediluido, listo para usar.
4.6 Antisuero de oveja anti-IgG humanas purificado por afinidad (H+L) conjugado con FITC (isotiocianato de fluoresceína) con el 0,099% de azida sódica. Prediluido, listo para
usar.
4.7 Azul de Evans al 1% (coloración de contraste opcional). 4.8 Tampón PBS, solución líquida concentrada (x20).
4.9 Papeles absorbentes, para secar los portaobjetos tras el lavado.
4.10 Solución de montaje, contenente un agente anti-decoloración (DABCO, 1, 4 diazabiciclo [2.2.2] octano).
4.11 Cubreobjetos (22 x 70mm).
5 PRECAUCIONES
Todos los sueros humanos suministrados en el kit han sido sometidos a screening para donantes, resultando negativos a la presencia del antígeno de superficie de la hepatitis B y a la presencia de los anticuerpos ante los virus HIV1, HIV2 y HCV. Sin embargo los sobredichos ensayos no garantizan la ausencia de agentes infecciosos. Deben establecerse métodos de manipulación y eliminación
adecuados para todos los materiales potencialmente infecciosos y los procedimientos deben permitirse sólo a personal experto y autorizado.
El Azul de Evans y los controles del kit contienen el 0,099% de azida sódica como conservante y deben manipularse con precaución – no trague ni permita el contacto con la piel o las mucosas. En caso de contacto, lave con abundante agua y consulte a un médico. Con el plomo y el cobre pueden formarse azidas metálicas explosivas. Cuando se elimine el reactivo, lave con mucha agua los recipientes para evitar la acumulación de azida.
El presente producto debe ser utilizado por personal especializado. Se recomienda observar estrictamente el procedimiento indicado.
6 CONSERVACIÓN Y ESTABILIDAD
Los kits o los portaobjetos no abiertos deben conservarse a 2-8°C y se pueden usar hasta la fecha de caducidad indicada. NO CONGELE. Una vez extraídos los portaobjetos de la bolsa deben utilizarse inmediatamente. El tampón PBS diluido puede conservarse durante un mes a 2-8°C. Todos los reactivos deben conservarse a 2-8°C.
7 RECOLECCIÓN DE MUESTRAS
Las muestras de sangre deben proceder de extracciones venosas, dejadas coagular naturalmente. Separe el suero lo más rápidamente posible para evitar la hemólisis. El suero puede conservarse a 2-8°C durante un máximo de 7 días antes del ensayo (ref. 9), o para periodos más largos, distribuir el suero en alícuotas y conservarlo a -20°C, o temperatura inferior. Evitar repetidas congelaciones y descongelaciones. Evite el uso de sueros lipémicos, hemolizados o contaminados por microbios, puesto que puede dar lugar a títulos más bajos o patrones de coloración poco claros.
8 METODOLOGÍA
8.1 Materiales suministrados
8.1.1 Kit para 50 ensayos FK314.1
1. 10 x Mouse kidney, stomach slide – 5-well (Portaobjetos de 5 pocillos con riñón,
estómago de ratón).
2. 1 x 1mL ANA Positive Control (Control positivo ANA homogéneo. Prediluido, listo para usar).
3. 1 x 1mL Mitochondrial Positive Control (Control positivo mitocondrial, Prediluido, listo para usar).
4. 1 x 1mL Smooth Muscle Positive Control (Control positivo al músculo liso. Prediluido, listo para usar).
5. 1 x 1mL Negative Control (Control negativo. Prediluido, listo para usar)
6. 1 x 6,2mL Anti-human IgG (H+L) AFF FITC (Conjugado anti-IgG (H+L) humanas FITC purificado por afinidad).
7. 1 x 3mL 1% Evans Blue Counterstain (Azul de Evans al 1%).
8. 2 x 60mL PBS concentrate (PBS concentrado, x20). 9. 1 x 3mL Mounting Medium (Solución de montaje).
10. 20 x Blotters (Papeles absorbentes).
11. 10 x Coverslips (Cubreobjetos, 22 x 70mm).
12. 1 folleto de instrucciones.
8.1.2 Kit para 250 ensayos FK314.2
1. 25 x Mouse kidney, stomach slide – 10-well (Portaobjetos de 10 pocillos con riñón,
estómago de ratón).
2. 1 x 1mL ANA Positive Control (Control positivo ANA homogéneo. Prediluido, listo para usar).
3. 1 x 1mL Mitochondrial Positive Control (Control positivo mitocondrial, Prediluido, listo
para usar).
4. 1 x 1mL Smooth Muscle Positive Control (Control positivo al músculo liso. Prediluido, listo para usar).
5. 1 x 1mL Negative Control (Control negativo. Prediluido, listo para usar)
6. 1 x 15,5mL Anti-human IgG (H+L) AFF FITC (Conjugado anti-IgG (H+L) humanas FITC purificado por afinidad, prediluido).
7. 1 x 3mL 1% Evans Blue Counterstain (Azul de Evans al 1%). 8. 2 x 60mL PBS concentrate (PBS concentrado x20). 9. 1 x 10mL Mounting Medium (Solución de montaje). 10. 50 x Blotters (Papeles absorbentes).
11. 25 x Coverslips (Cubreobjetos, 22 x 70mm). 12. 1 folleto de instrucciones.
8.1.3 FS314.1, FS314.A, FS314.2, FS314.B
1. 10 portaobjetos de 5 pocillos, 1 portaobjeto de 5 pocillos, 25 portaobjetos de 10 pocillos, 1 portaobjeto de 10 pocillos respectivamente.
2. 1 folleto de instrucciones.
8.2 Material necesario no suministrado
8.2.1 Agua destilada para diluir el PBS concentrado. 8.2.2 Recipiente para el tampón PBS.
8.2.3 Micropipetas y puntas desechables para dispensar las muestras de los pacientes. 8.2.4 Cámara húmeda para las fases de incubación (p.ej. Cámara de Coloración Magnética,
Código BD010).
8.2.5 Microscopio de fluorescencia con filtro de excitación de 495nm y filtro de barrera de 515nm.
8.2.6 Botella de plástico a presión para el lavado inicial en PBS.
8.2.7 Si se utilizan solamente los portaobjetos, pueden adquirirse los siguientes componentes adicionales de The Binding Site: PBS (CON 3.3), control negativo (CON 92), control homogéneo ANA (FA105), control positivo mitocondrial (FA128), control positivo al músculo liso (FA134), conjugado anti-IgG (H+L) humanas FITC purificado por afinidad (FA003), solución de montaje (CON 195), solución de Azul de Evans al 1% (CON 93).
8.3 Procedimiento
Control de calidad
Los controles negativos y positivos deben efectuarse cada vez que se dosifican las muestras.
8.3.1 Solución de montaje: sacar la solución de montaje de la nevera para llevarla a temperatura ambiente (18-28ºC) antes del uso.
8.3.2 PBS concentrado. Diluya el PBS con agua destilada (1 parte de PBS + 19 partes de agua destilada) y mezcle. El PBS se utiliza para diluir las muestras de los pacientes y como tampón de lavado.
8.3.3 Dilución de muestras de los pacientes.
Screening: Diluir las muestras 1/20 añadiendo 50µL de suero a 950µL de tampón PBS.
Titulación: Efectuar diluciones seriales de las muestras positivas con tampón PBS
