Potencial do efeito antimicrobiano in vitro de quitosana extraída de Mucor circinelloides UCP 050: uma abordagem para uso em sistemas de conservação de alimentos

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(1)Ana Elizabeth C. Fai _____________________________________________________________. 0. ANA ELIZABETH CAVALCANTE FAI. POTENCIAL DO EFEITO ANTIBACTERIANO IN VITRO DE QUITOSANA EXTRAÍDA DE Mucor circinelloides UCP 050: UMA ABORDAGEM PARA USO EM SISTEMAS DE CONSERVAÇÃO DE ALIMENTOS. RECIFE 2008.

(2) Ana Elizabeth C. Fai _____________________________________________________________. 1. UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM NUTRIÇÃO. POTENCIAL DO EFEITO ANTIBACTERIANO IN VITRO DE QUITOSANA EXTRAÍDA DE Mucor circinelloides UCP 050: UMA ABORDAGEM PARA USO EM SISTEMAS DE CONSERVAÇÃO DE ALIMENTOS. ANA ELIZABETH CAVALCANTE FAI. RECIFE 2008.

(3) Ana Elizabeth C. Fai _____________________________________________________________. 2. ANA ELIZABETH CAVALCANTE FAI. POTENCIAL DO EFEITO ANTIBACTERIANO IN VITRO DE QUITOSANA EXTRAÍDA DE Mucor circinelloides UCP 050: UMA ABORDAGEM PARA USO EM SISTEMAS DE CONSERVAÇÃO DE ALIMENTOS. Dissertação. apresentada. ao. Programa. de. Pós-. graduação em Nutrição, Departamento de Nutrição do Centro de Ciências da Saúde da Universidade Federal de Pernambuco em cumprimento aos requisitos para obtenção do título de Mestre em Nutrição - Área de Concentração: Ciências dos Alimentos.. Orientador (a): Profª. Drª. Tânia Lúcia Montenegro Stamford Co - orientador (a): Profª. Drª. Thayza Christina Montenegro Stamford. RECIFE 2008.

(4) Ana Elizabeth C. Fai _____________________________________________________________. Fai, Ana Elizabeth Cavalcante Potencial do efeito antimicrobiano in vitro de quitosana extraída de Mucor circinelloides UCP 050: uma abordagem para uso em sistemas de conservação de alimentos / Ana Elizabeth Cavalcante Fai. – Recife : O Autor, 2008. 94 folhas + 16 anexos: il., fig., tab., graf. Dissertação (mestrado) – Universidade Federal de Pernambuco. CCS. Nutrição. 2008. Inclui bibliografia e anexos. 1. Quitosana. 2. Patógeno alimentar. 3. Propriedade antibacteriana. 4. Conservantes de alimentos. I. Título. 612.39 664.024. CDU (2. ed.) CDD (22. ed.). UFPE CCS03-2008. 3.

(5) Ana Elizabeth C. Fai _____________________________________________________________. ANA ELIZABETH CAVALCANTE FAI. POTENCIAL DO EFEITO ANTIBACTERIANO IN VITRO DE QUITOSANA EXTRAÍDA DE Mucor circinelloides UCP 050: UMA ABORDAGEM PARA USO EM SISTEMAS DE CONSERVAÇÃO DE ALIMENTOS. Aprovada em 07 de fevereiro de 2008. 4.

(6) Ana Elizabeth C. Fai _____________________________________________________________. 5. Dedico Essa dissertação aos meus pais, Maria das Graças Cavalcante Fai e Andres Bartolome Fai (in memoriam) e aos meus irmãos Maria Julieta Fai Serpa e Rafael José Serpa Cavalcante Fai. Obrigada por confiar em mim e acreditar em meu potencial. Longe ou perto, mas sempre morando em meu coração. Amo vocês!.

(7) Ana Elizabeth C. Fai _____________________________________________________________. 6. “Pouca ciência afasta de Deus, muita a Ele reconduz”. Louis Pasteur. “Nenhuma mente que se abre para uma nova idéia voltará a ter o tamanho original”. Albert Einstein. “Um cientista em seu laboratório não é somente um técnico, é também uma criança colocada diante de fenômenos naturais que a impressionam como um conto de fadas”. Marie Curie.

(8) Ana Elizabeth C. Fai _____________________________________________________________. 7. AGRADECIMENTOS. A Deus por sempre me proteger e guiar meus passos. A Profª. Drª. Tânia Lúcia Montenegro Stamford pela orientação e dedicação sem as quais não seria possível realizar este sonho. Agradeço por ter me ensinado o verdadeiro objetivo da pesquisa científica e por ter me ajudado a crescer como pesquisadora e como ser humano. Minha estima especial a Drª. Thayza Christina Montenegro Stamford pela total dedicação. Agradeço a Deus pela sua co-orientação, valiosos ensinamentos e pelo exemplo de pesquisadora que é. Obrigada pela paciência, delicadeza e confiança, imprescindíveis para a realização deste trabalho. As palavras se tornam pequenas para tamanho agradecimento. A Profª. Drª. Galba Maria de Campos-Takaki pelo prestimoso estímulo, ensinamentos e por disponibilizar gentilmente o laboratório do Núcleo de Pesquisa em Ciências Ambientais da Universidade Católica de Pernambuco, possibilitando a realização deste trabalho. Agradeço por me ensinar o verdadeiro significado da palavra colaboração em pesquisa. Ao meu namorado Pedro Henrique P. Buarque de Gusmão pelo carinho, compreensão e incentivo constante. Obrigada por você existir e fazer parte da minha vida. A amiga e ex-professora Drª. Evânia Altina Teixeira de Figueiredo pela constante preocupação e incentivo desde a época da graduação até os dias atuais. Agradeço por todo o conhecimento de microbiologia que me foi transmitido e por acreditar sempre no meu potencial. A Universidade Federal de Pernambuco, em especial ao Departamento de Nutrição pela oportunidade de realizar meu curso de Mestrado nesta renomada instituição. Aos professores Dr. José Almiro da Paixão, Drª. Janete Magali de Araújo e Drª. Erilane C. L. Machado pela disponibilidade e colaborações proporcionadas. Ao Departamento de Química Fundamental da Universidade Federal de Pernambuco por todo auxílio e atenção prestados, durante a fase experimental desta pesquisa, em especial aos professores doutores Petrus Santa Cruz e André Galembeck e suas equipes. Ao Magnífico Reitor da Universidade Católica de Pernambuco, Pe. Pedro Rubens Ferreira Oliveira, S.J., pelo acesso aos laboratórios do Núcleo de Pesquisa em Ciências Ambientais para realização deste trabalho. A minha turma de mestrado, Amanda, Daniela, Emmanuela e Teresa pela amizade, apoio e saudável convivência durante o curso..

(9) Ana Elizabeth C. Fai _____________________________________________________________. 8. A Aline, Amanda, Claudinha, Deborah, Gustavo, Janaína, Jay, Lely, Paulo Henrique, Rafael, Suelen, Tatty, Victor e Vladimir pelo convívio e amizade. Sinceramente, muito obrigada! Aos colegas do Núcleo de Pesquisa em Ciências Ambientais da Universidade Católica de Pernambuco pela troca de experiências e convívio agradável durante a fase experimental deste trabalho, e em especial a Marta Cristina Freitas da Silva pela amizade, apoio e auxílio na produção de quitosana microbiana. Aos técnicos Salatiel José de Santana e Severino Humberto de Almeida pela amizade e colaboração durante a fase experimental dessa pesquisa. A Neci Nascimento, secretária da Pós-Graduação em Nutrição, pelo auxílio, presteza e amizade durante o curso de Mestrado e a Girleide Lopes pela disponibilidade e assistência. Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico-CNPq, pela bolsa de Mestrado concedida. A todos que de alguma maneira, direta ou indireta, contribuíram para a realização deste trabalho, os meus mais sinceros agradecimentos..

(10) Ana Elizabeth C. Fai _____________________________________________________________. 9. RESUMO. Recentemente, a quitosana vem despertando bastante interesse em relação às suas aplicações em produtos alimentícios e farmacêuticos. Entre outras, a atividade antimicrobiana deste biopolímero tem sido apontada como uma das suas mais interessantes propriedades. O objetivo deste estudo foi extrair e caracterizar a quitosana da biomassa de Mucor circinelloides (UCP 050) e avaliar a efetividade desta na inibição do crescimento in vitro de cepas de bactérias patogênicas/deteriorantes de interesse em alimentos. Quitosana proveniente de caranguejo foi utilizada para comparação. A fim de determinar as concentrações mínimas bacteriostáticas e bactericidas das quitosanas foi realizado o teste de Heilman. Foi utilizada fermentação submersa para produção de quitosana por Mucor circinelloides (UCP 050) utilizando como substrato meio de cultura alternativo a partir de Jacatupé (Pachyrhizus erosus, (L) URBAN). Avaliou-se, ainda, o crescimento de M. circinelloiodes em diferentes tempos (24, 48, 72 e 96 horas), incubado a 28ºC e 150 rpm. Quitina e quitosana foram extraídas por tratamento álcali-ácido e a quitosana caracterizada por espectroscopia ao raio de Infravermelho, viscosidade, análise térmica e difração de raio X. M. circinelloides crescido em meio de cultura jacatupé apresentou rendimento de biomassa máximo (20.7 g.L-1) em 96 horas, enquanto a maior produção de quitosana (64 mg.g-1) e quitina (500 mg.g-1) foram observadas em 48 e 72 horas de crescimento, respectivamente. A quitosana caracterizada apresentou grau de deacetilação de 83% e massa molecular de 2,6 x 104 g/mol. A difração de raio X apresentou um pico de maior intensidade próximo ao angulo de 20.0- 2θ (d = 4.4534 Å) e a análise termogravimétrica demonstrou um processo de desidratação, seguido da decomposição do polímero, com geração de material carbonizado. As curvas de calorimetria apresentaram um pico largo endotérmico e um segundo pico endotérmico. A quitosana microbiológica e de crustáceo demonstraram concentração mínima inibitória idênticas para todas as bactérias ensaiadas, de 1,50 Salmonella mg.mL-1 para Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, enterica, Escherichia coli e Yersinia enterocolitica e 0,625 mg.mL-1 para Pseudomonas aeruginosa. Nenhuma concentração de ambas quitosanas demonstrou ação bactericida para a cepa de S. entérica. A quitosana microbiológica apresentou menor concentração mínima bactericida frente P. aeruginosa quando comparada com a quitosana de crustáceo, sendo de 2,5mg.mL-1 e 5,0 mg.mL-1, respectivamente. Os resultados obtidos destacam a quitosana como um promissor agente de conservação de alimentos de origem natural.. Palavras-chave: quitosana; patógeno alimentar; propriedade antibacteriana; conservante de alimentos..

(11) Ana Elizabeth C. Fai _____________________________________________________________. 10. ABSTRACT. Chitosan has recently gained more interest due to its applications in food and pharmaceutics. Among others, the antimicrobial activity of chitosan has been pointed out as one of its most interesting properties of chitosan. The purpose of this study was to extract and characterize chitosan from Mucor circinelloides (UCP 050) and evaluate the in vitro antibacterial activity of chitosan against food pathogenic and spoilage bacteria. Chitosan from crabs was used to comparison. The antibacterial activity was carried determining the minimum inhibitory and bactericidal concentration by Heilman test. Submerged fermentation was carried for chitosan productions by M. circinelloides (UCP 050) in an economic culture medium, Yam Bean (Pachyrhizus erosus L. Urban). The assay also evaluate the growth of M. circinelloiodes in different times of growth (24, 48, 72 and 96 hours), incubated at 28ºC in an orbital shaker at 150 rpm. Chitin and chitosan were extracted by alkali-acid treatment. Fungi chitosan was characterized by infrared spectroscopy, viscosity, thermal analysis and X-ray diffractometry. M. circinelloides grown in the yam bean medium produced higher yields of biomass (20.7 g.L-1) in 96 hours. The high level of chitosan (64 mg.g-1), and chitin (500mg.g-1) were produced at 48 and 72 hours of growth, respectively. Chitosan showed degree of deacetilation and viscosimetric molecular weight as: 83% and 2.70 x 104 g/mol, respectively. X-ray diffraction showed strong Bragg refractions at an angle 20.0- 2θ (d = 4.4534 Å) and thermal analyses demonstrated a process of dehydration, followed of the polymer decomposition, with generation of carbonized material. DSC curves showed two thermal events; the first was a wide endothermic peak, and the second event was an endothermic peak. Both chitosan had identical minimum inhibitory concentration for all bacteria assayed, which was 1,50 mg.mL-1 for Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Salmonella enterica, Escherichia coli and Yersinia enterocolitica and 0,625 mg.mL-1 for Pseudomonas aeruginosa. Neither concentration of both chitosan showed bactericide effect against S. enterica strain. Microbiological chitosan showed lower minimum bactericide concentration against P. aeruginosa than crustacean chitosan, which was 2,5 mg.mL-1 and mg.mL-1, respectively. The results obtained in this study demonstrate the potential of chitosan as a novel food preservative of natural origin.. Keywords: chitosan; foodborne pathogen; antibacterial property; food preservative..

(12) Ana Elizabeth C. Fai _____________________________________________________________. Sumário 1.0 INTRODUÇÃO. 15. 2.0 REVISÃO DE LITERATURA. 17. 2.1 Quitina e Quitosana 2.1.1 Considerações gerais 2.1.2 Produção de quitina e quitosana 2.1.3 Biossíntese de quitina e quitosana 2.1.4 Ciclo biológico de quitina e quitosana 2.1.5 Aplicações quitina e quitosana 2.2 Quitosana: promissor agente conservante de alimentos 2.2 .1 Atividade antimicrobiana 2.2.2 Atividade antioxidante 2.2.3 Biofilmes. 17 17 19 21 22 23 26 28 34 36. 3.0 OBJETIVOS. 39. 4.0 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS. 40. Primeiro artigo Título - Chitosan from Mucor circinelloides: growth, production and physico-chemical characterization Abstract. 53. 1. Introduction. 54. 2. Materials and methods. 55. 2.1 Microorganisms 2.2 Culture medium 2.3 Growth profile 2.4 Glucose and nitrogen consumption and pH determination 2.5 Chitin and Chitosan Extraction 2.6 Chitin and chitosan characterization 2.6.1 Infrared spectroscopy (Deacetylation degree - DD%) 2.6.2 Molecular weight 2.6.3 Thermal analysis 2.6.4 X-ray diffraction 2.7 Statistic analysis 3. Results and discussion. 55 56 56 57 57 57 57 58 58 59 59 59. 4. Conclusion. 65. 5. Acknowledgements. 66. 6. References. 66. 11.

(13) Ana Elizabeth C. Fai _____________________________________________________________. Figures. 69. Segundo artigo Título - Microbiological chitosan potentiates the antibacterial activity against food and spoilage bacteria Abstract. 75. 1. Introduction. 76. 2. Materials and Methods. 79. 2.1 Bacterial strains and culture conditions 2.2 Chitosan preparation 2.3 Chitosan from M. circinelloides extraction 2.4 Chitin and chitosan characterization 2.4.1 Infrared spectroscopy (Deacetylation degree - DD%) 2.4.2 Molecular weight 2.5 Antimicrobial activit. 79 79 80 80 80 81 81. 3. Results and discussion. 82. 4. Conclusion. 86. 5. Acknowledgements. 86. 6. References. 86. Figures. 91. Tables. 92. CONCLUSÕES. 93. ANEXOS. 94. 12.

(14) Ana Elizabeth C. Fai _____________________________________________________________. Lista de figuras Revisão de literatura Figura 1- Estrutura química (a) quitina, (b) quitosana. 17. Figura 2- Arranjo das cadeias de α e ß quitina, antiparalelo (a) e 19 paralelo (b) Figura 3- Esquema da síntese de quitina e quitosana nos crustáceos e nos fungos da Ordem Mucorales. 21. Figura 4- Ciclo biológico de quitina. 23. Figura 5- Esquema das aplicações da quitosana na indústria de alimentos. 25. Primeiro artigo Título: Chitosan from Mucor circinelloides: growth, production and physico-chemical characterization Figure 1- Profile of growth of M. circinelloides UCP 050 in yam bean medium at 28ºC, 150rpm, during 96h of cultivation. 69. Figure 2- Chitin and chitosan yields (mg/mL) from M. circinelloides (UCP 050) grown in yam bean medium, at 28ªC, 150rpm during 96 h of cultivation. 70. Figure 3- Infrared spectra of chitosan from Mucor circinelloides UCP 050. 71. Figure 4- X-ray diffraction of chitosan from Mucor circinelloides (UCP 050). 72. Figure 5- DSC and TGA termograms of chitosan from Mucor circinelloides UCP 050, under continuous flow of dry nitrogen gas (50mL.min-1), at a heating rate of (10°C min-1). 73. Segundo artigo Título - Microbiological chitosan potentiates the antibacterial activity against food and spoilage bacteria Figure 1- Infrared spectra of chitosan from Mucor circinelloides UCP 050.. 91. Figure 2- Infrared spectra of chitosan from crabs (Sigma®).. 91. 13.

(15) Ana Elizabeth C. Fai _____________________________________________________________. Tabelas Segundo artigo Título: Microbiological chitosan potentiates the antibacterial activity against food and spoilage bacteria Table 1-Minimum inhibitory concentration (mg.mL-1) of chitosan from 92 crustacean and fungi against food pathogenic and spoilage bacteria Table 2-Minimum bactericidal concentration (mg.mL-1) of chitosan from crustacean and fungi against food pathogenic and spoilage 92 bacteria. 14.

(16) Ana Elizabeth C. Fai _____________________________________________________________. 15. 1.0 Introdução. A exigência por alimentos seguros, com uma vida útil prolongada e de alta qualidade nutritiva e sensorial é crescente (CHI et al., 2006). Os consumidores e os próprios órgãos de saúde pública estão especialmente preocupados com os efeitos decorrentes do uso de vários aditivos químicos em produtos alimentícios e sua relação com a saúde (RHOADES & ROLLER, 2000; BARRETEAU et al., 2006). Este cenário tem incentivado a pesquisa de novos agentes naturais que possam ser empregados de forma a complementar os métodos de preservação de alimentos que se dispõe atualmente (SOUZA et al. 2005; DEVLIEGHERE et al., 2004a; KANATT, 2008a). Destaca-se, entre estes, a quitosana, heteropolimero composto por unidades repetidas de β-1,4 N-acetilglucosamina e β (1-4)-D-glicosamina, encontrada na parede celular de fungos sendo a Classe Zygomycetes, e em particular a Ordem Mucorales, a que apresenta maior quantidade de quitina e quitosana (CAMPOSTAKAKI, 2005; FRANCO et al., 2005; STAMFORD et al., 2007). A quitosana também pode ser obtida através da deacetilação da quitina, podendo o grupo Nacetil sofrer vários graus de deacetilação, gerando assim diversos derivados (OKAWA et al., 2003; SANTOS et al., 2003). A literatura atual é vasta em material sobre quitina e quitosana, podendo-se encontrar várias revisões que abordam diferentes aspectos destes polímeros (TSIGOS et al., 2000; KIM & RAJAPAKSE, 2005; RINALDO, 2006; NO et al., 2007). A quitosana apresenta um amplo espectro de possíveis aplicações em biomedicina (MARTINO et al., 2005), produtos farmacêuticos, biotecnologia.

(17) Ana Elizabeth C. Fai _____________________________________________________________. 16. (COSTA. &. SILVA. et. al.,. 2006),. nanotecnologia. (MURUGADOSS. CHATTOPADHYAY, 2008) e ciência de alimentos (SHAHIDI et al., 1999; LIU et al., 2008). As características físico-químicas deste biopolímero, derivadas de sua capacidade de formação de complexos polieletrolíticos e propriedades de biodegradabilidade, biocompatibilidade aos tecidos e bioatividade, justificam a razão pela qual o modo de obtenção e produção deste polissacarídeo tem sido extensivamente. estudado. na. atualidade. (HARISH. PRASHANTH. &. THARANATHAN, 2006; YEN & MAU, 2007). Na indústria alimentícia, a quitosana também oferece um amplo espectro de possíveis aplicações, como seja, formação de filmes biodegradáveis (MENG et al., 2008) recuperação de sub-produtos, imobilização de enzimas (KUMAR,2000), purificação de água (ZENG et al., 2008), clarificação de sucos de frutas (CHATTERJEE et al., 2005), agente antioxidante (SHAHIDI et al., 2002; KANATT et al., 2004), destacando-se sua eficácia quanto à preservação da qualidade microbiológica do alimento (QUIN et al., 2006; NO et al., 2007; KANATT et al., 2008b). Neste sentido, frente ao reconhecido potencial antimicrobiano da quitosana e considerando a obtenção deste polímero a partir de fungos como uma alternativa rentável e promissora, esta pesquisa teve como objetivo extrair e caracterizar a quitosana da biomassa de Mucor circinelloides e avaliar a eficácia desta na inibição do crescimento in vitro de cepas de bactérias patogênicas/deteriorantes de interesse em alimentos..

(18) Ana Elizabeth C. Fai _____________________________________________________________. 17. 2.0 Revisão de Literatura. 2.1 Quitina e Quitosana 2.1.1 Considerações gerais. A quitina é um polímero natural, álcali-ácido insolúvel, linear que apresenta unidades repetidas de β-1,4 N-acetilglucosamina e β (1-4)-D-glicosamina (figura 1a) e com exceção da celulose é o polissacarídeo mais abundante e largamente distribuído na natureza (CANELLA & GARCIA, 2001; MUZZARELLI, 2001). A quitina é encontrada no exoesqueleto dos crustáceos, insetos e, em especial, na parede celular de fungos. A quitosana (figura 1b) é um heteropolimero natural, amino catiônico, composto por unidades β-1,4 D-glucosamina ligadas a resíduos de N-acetilglucosamina, sendo encontrada na parede celular de fungos. A quitosana também pode ser obtida através da deacetilação da quitina, podendo o grupo Nacetil sofrer vários graus de deacetilação, gerando assim diversos derivados (KHAN et al., 2002; ANDRADE et al., 2003; OKAWA et al., 2003).. (a) Figura 1- Estrutura química (a) quitina, (b) quitosana Fonte: Craveiro et al., 1999.. (b).

(19) Ana Elizabeth C. Fai _____________________________________________________________. 18. A quitina foi isolada pela primeira vez em 1881 por Braconnot, quando trabalhava com Agaricus volvaccus e outros fungos, recebendo a denominação inicial de fungina (CAMPANA-FILHO et al., 2007). Odier em 1823 isolou um resíduo insolúvel de insetos, chamando-o de quitina, nome derivado da palavra grega Chiton, que significa carapaça ou caixa protetora. Contudo, Odier relatou que havia isolado a quitina mediante vários tratamentos de soluções de hidróxido de potássio concentrado. Isto, o levou a um equívoco, pois na realidade ele isolou a quitosana. A quitosana, por sua vez, foi descoberta em 1859 por Rouget e seu nome foi proposto em 1894 por Hoope-Seyler devido ao fato desta substância possuir a mesma quantidade de nitrogênio que a quitina original (CRAVEIRO et al., 1999; CAMPOS-TAKAKI, 2005). Polissacarídeos conhecidos por apresentarem polimorfismo, quitina e quitosana podem assumir três diferentes arranjos de suas cadeias nas regiões cristalinas as quais são dependentes da polaridade adquirida pelas cadeias de açúcar. As formas são denominadas α, ß e γ (Figura 2) e podem ser evidenciadas através do estudo de difração de raios-x. A conformação polimérica α apresenta uma disposição alternada de cadeias paralelas e antiparalelas que é dominante sobre as demais, além de ser mais estável e resistente. Esta forma é encontrada em crustáceos, cutícula de artrópodes, parede celular de fungos e insetos, estando geralmente associada a proteínas e materiais inorgânicos. As conformações ß e γ estão relacionadas à flexibilidade e dureza, ressaltando-se que estas podem ser convertidas à forma α através de tratamentos químicos adequados. A ocorrência de forma ß é evidenciada em organismos marinhos como lulas e algas microscópicas e possui um arranjo de cadeias dispostas em paralelo. A forma γ todavia não foi completamente caracterizada, embora haja sugestões de que tenha duas cadeias.

(20) Ana Elizabeth C. Fai _____________________________________________________________. 19. paralelas e uma antiparalela (CAMPOS-TAKAKI, 2005; RINALDO, 2006; YEN & MAU, 2007).. Figura 2 - Arranjo das cadeias de α e ß quitina, antiparalelo (a) e paralelo (b) Fonte: Tharanathan & Kittur, 2003. 2.1.2 Produção de quitina e quitosana. Exoesqueletos de crustáceos constituem a fonte tradicional para obtenção de quitina e quitosana. O conteúdo de quitina nos crustáceos varia de acordo com a espécie estando o rendimento entre 2 a 12% da massa corpórea total, e de 13 a 42% na casca. A quitosana é obtida pela deacetilação da quitina utilizando NaOH 50% e temperatura em torno de 110ºC (SYNOWIECHI & AL-KHATEEB, 2003). Existem várias limitações em relação à viabilidade do processo de obtenção da quitina e quitosana proveniente de crustáceos, tais como: adaptação ao clima, sazonalidade, locais de confinamento e o processamento em larga escala associado com a conversão química de quitina em quitosana pela quitina deacetilase (POCHANAVANICH & SUNTORNSUUK, 2002; AMORIM et al., 2005; FRANCO et al., 2005; SILVA et al., 2006a). Utilização de massa micelial de fungos como fonte alternativa de quitina e quitosana tem demonstrado grandes vantagens, tais como: extração simultânea de quitina e quitosana, independência dos fatores de sazonalidade, produção em larga.

(21) Ana Elizabeth C. Fai _____________________________________________________________. 20. escala (AMORIM et al., 2001; AMORIM, et al., 2006; STAMFORD, et al., 2007). A quantidade destes polissacarídeos extraídos da biomassa varia de acordo com a espécie de fungo e condições nutricionais, principalmente, a fonte de carbono utilizada. Fungos da Divisão Zygomycotina apresentam quitina e quitosana simultaneamente em sua parede celular (TSIGOS et al., 1999; FRANCO et al., 2005; AMORIM, et al., 2006). Várias pesquisas utilizando fungos como fonte alternativa de quitina e quitosana relatam rendimentos iguais ou superiores, destes polímeros, aos obtidos quando utilizadas fontes tradicionais (ANDRADE et al., 2003; AMORIM et al., 2005). Estudos utilizando biomassa de Mucor rouxii e M. javanicus obtiveram rendimento de quitosana em torno de 8% e de quitina entre 8,9% e 23,9% (SYNOWIECK & AL-KHATEEB, 1997; ANDRADE et al., 2003). Em recentes estudos, tem se estabelecido métodos de otimização para processos de produção de quitina e quitosana a partir de massa micelial de Cunninghamella elegans, assim como a utilização de meios de cultura alternativos e de baixo custo econômico, sendo relatados rendimentos de quitosana entre 5% e 8%, e de quitina em torno de 23% a 40% (ANDRADE et al., 2000, AMORIM et al., 2001; FRANCO et al., 2005, STAMFORD et al., 2007). Nwe et al. (2001) avaliando a produção de quitosana por vários Zygomycetes, utilizando batata doce como meio de cultura básico, obtiveram os melhores resultados com Gongronella butleri apresentando rendimento de quitosana entre 7,9 a 11,6% e 8,2 a 12,7% em fermentação submersa e sólida, respectivamente..

(22) Ana Elizabeth C. Fai _____________________________________________________________. 21. 2.1.3 Biossíntese de quitina e quitosana. A biossíntese de quitina difere significativamente em fungos e crustáceos, contudo, etapas da via de produção e maquinaria enzimática para regulação catalítica são similares, como observado na figura 3.. Figura 3 - Esquema da síntese de quitina e quitosana nos crustáceos e nos fungos da Ordem Mucorales Fonte: Stamford, 2006 Nos crustáceos a síntese inicia-se pela conversão de glicose-6-fosfato em Nacetilglicosamina- 1-fosfato, envolvendo uma série de etapas que requerem várias reações enzimáticas. A N-acetilglicosamina-1-fosfato reage com a UTP formando a UDP-NAcetilglicosamina, que finalmente, transfere a N acetilglicosamina para a polimerização de cadeias de quitina em um processo mediado pela enzima quitinasintetase e íons Mg+2 , como catalisador, resultando na formação de uma longa cadeia de sub-unidades monossacarídicas unidas por ligações β-1→4 (CABIBI, 1987). A quitosana é obtida pela deacetilação da quitina mediante tratamento.

(23) Ana Elizabeth C. Fai _____________________________________________________________. 22. químico com NaOH em alta temperatura (DAVIS & BARTINICK, 1984; BARTNICKI-GARCIA, 1989). Nos fungos a síntese de quitina e de quitosana ocorrem simultaneamente. A síntese de quitina é altamente compartimentalizada. A enzima quitina sintetase ocorre na forma de zimógeno, sendo distribuída em regiões específicas da superfície celular, em vesículas especializadas chamadas quitossomas (BARTNICKIGARCIA, 1989). A montagem macromolecular inicia-se fora do citoplasma, onde a enzima protease atua na superfície celular ativando o zimogêno. Desta forma a UDP-N acetilglicosamina é produzida a partir da glicose, e a quitina sintetase catalisa a transferência do N-acetilglicosamina para polimerização da cadeia formando quitina. A quitosana presente na parede celular de alguns fungos da Ordem Mucorales, é formada a partir da deacetilação da cadeia de quitina nascente, pela ação da quitina deacetilase, durante a biossíntese de quitina. As sínteses de quitina e de quitosana são realizadas pela organização espacial da síntese de quitina na superfície celular (DAVIS & BARTNICKI-GARCIA, 1984; STAMFORD, 2006). 2.1.4 Ciclo biológico de quitina e quitosana. De acordo com Craveiro et al. (1999), quitina e quitosana são biologicamente sintetizadas em um total de, aproximadamente, um bilhão de toneladas anualmente, sendo biodegradadas sem acúmulo excessivo na natureza, através do “ciclo da quitina” (figura 4). As enzimas hidrolíticas envolvidas nesse processo (lisoenzima, quitinase, quitina desacetilase e quitosanase) estão largamente distribuídas nos tecidos e fluídos corporais dos animais e plantas, bem como no solo.

(24) Ana Elizabeth C. Fai _____________________________________________________________. 23. impedindo naturalmente o excesso destes polímeros, contribuindo para a preservação do ambiente.. Quitina desacetilase QUITINA. QUITOSANA. Quitinase Lisozima. Quitina oligossacarídeos. Quitosanase. Quitosana oligossacarídeos. N-acetil-ß-Dglicosaminidase. N-acetil-D-glicosamina. D-glicosamina. Figura 4 - Ciclo biológico de quitina Fonte: Craveiro et al, 1999. 2.1.5 Aplicações quitina e quitosana. O interesse comercial nas aplicações de quitosana e derivados aumentou vertiginosamente nas últimas três décadas, o que pode ser constatado pelo depósito de patentes no Japão, Europa, China, Coréia e, principalmente, nos EUA. Assim, conforme o “United States Patent and Trademark Office”, foram registradas 5946 patentes patentes relacionadas à quitosana no período 1976-2006 apenas nos EUA (CAMPANA-FILHO et al., 2007). A literatura apresenta uma grande diversidade de fontes para produção de quitina e quitosana, as quais influenciam as diferentes propriedades destes polímeros e derivados, possibilitando o aumento do potencial biotecnológico e aplicações comerciais (HARISH PRASHANTH & THARANATHAN, 2006;.

(25) Ana Elizabeth C. Fai _____________________________________________________________. 24. MAIA et al., 2006; YEN & MAU, 2007). As principais propriedades deste polissacarídeo reatividade. do. são: grupo. bioatividade, amino. biodegradabilidade,. deacetilado,. biocompatibilidade,. permeabilidade. seletiva,. ação. polieletrolítica, habilidade em formar gel e filme, habilidade de quelação e capacidade adsortiva (SYNOWIECKI & AL-KHATEEB, 2003; THARANATHAN & KITTUR, 2003). A quitosana vem sendo extensivamente estudada devido às suas propriedades peculiares que lhe conferem um aproveitamento bastante versátil, tais como: carreador de fármacos de liberação controlada e DNA (MITRA et al., 2001; KATO et al., 2004; KIM et al., 2004; SUNIL et al., 2004), regeneração de tecidos epiteliais (KARIMAN, 2007; LI et al., 2007a; NIEKRASZEWICZ et al., 2007), confecção de membranas artificiais (DUREJA et al., 2001; COSTA et al., 2006), promotor de osteogênese (MUZZARELLI & MUZZARELLI, 2002; MURUGAN & RAMAKRISHNA, 2004; MARTINO et al., 2005; PARK et al., 2005; HAMILTON et al., 2007), antibacteriano (MUZZARELLI et al., 1990; CHUNG et al., 2004; YADAV & BHISE, 2004; JING et al., 2007), coadjuvante da higiene oral (ENEL et al., 2000; SANO et al., 2002; SANO et al., 2003; HAYASHI et al., 2007), absorção de gordura e redução do colesterol sérico (KIM et al., 2005; RODRÍGUEZ & ALBERTENGO, 2005; FEOFILOVA, 2007; LIU et al, 2008), componente de cosméticos (MASATO, 2002; KOHEI & MAKI, 2006), remoção e recuperação de diferentes resíduos (VIVEK & TORRES, 2000; LIMA et al., 2006), biotransformação e detecção de pesticidas (DU et al., 2007; YOSHIZUKA et al., 2007), recobrimento de sementes na agricultura (VELÁSQUEZ, 2003), remoção de corantes, aminoácidos e proteínas (CRAVEIRO et al., 1999; BORDERÍAS et al.,.

(26) Ana Elizabeth C. Fai _____________________________________________________________. 25. 2005), como agente de floculação no tratamento de efluentes aquosos (DÍAZ et al., 2007; ZENG et al., 2008). As possibilidades de aplicações são ainda enriquecidas pelo fato da quitosana poder ser preparada em diferentes formas, tais como soluções de viscosidade controlada, géis, filmes e membranas, microesferas e nanopartículas (CAMPANA-FILHO et al., 2007; MURUGADOSS & CHATTOPADHYAY, 2008). Na indústria alimentícia, a quitosana oferece um amplo espectro de aplicações (SHAHIDI et al., 1999; KUMAR, 2000; JIANG & LI, 2001; AGULLÓ et al., 2003; THARANATHAN & KITTUR, 2003; BORDERÍAS et al., 2005; BAUTISTA-BAÑOS et al., 2006; BORGOGNI et al., 2006; Li et al., 2007b), conforme esquematizado na figura 5. Quitosana. FUNÇÃO DE ADITIVO. Antibacteriano Conservante e antifúngico. Estabilizante. Antioxidante. Emulsificante. Controle da oxidação lipídica Prevenção do escurecimento enzimático. EMBALAGENS ATIVAS. OUTRAS FUNÇÕES. Formação de biofilmes. Recuperação de subprodutos. Redução da taxa respiratória em frutos. Purificação de água. Barreira à perda de umidade. Clarificação de sucos de frutas. Redução da produção de etileno e poligalacturonase em frutos. Encapsulação de aromas. Manutenção da cor por mais tempo. Figura 5 - Esquema das aplicações da quitosana na indústria de alimentos.

(27) Ana Elizabeth C. Fai _____________________________________________________________. 26. 2.2 Quitosana: promissor agente conservante de alimentos. Atualmente, a qualidade é um componente fundamental dos alimentos, como a segurança alimentar (inocuidade) é componente indispensável da qualidade (SILVA et al., 2006b). No entanto, a manutenção da qualidade de diversos produtos alimentícios durante sua vida útil só é possível graças à atuação dos conservantes químicos, tornando a produção de alimentos um tanto complexa, uma vez que, os consumidores exigem alimentos seguros para o consumo, com mínimo de aditivos químicos e que apresentem a conveniência de possuir uma extensa vida de prateleira, estabelecendo-se, assim, um paradoxo. No Brasil, o uso de aditivos alimentares é norteado pelo Ministério da Saúde e regulamentado pela Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA), considerando aditivo alimentar qualquer ingrediente adicionado intencionalmente aos alimentos, sem propósito de nutrir, com o objetivo de modificar as características físicas, químicas, biológicas ou sensoriais, durante a fabricação, processamento,. preparação,. tratamento,. embalagem,. acondicionamento,. armazenagem, transporte ou manipulação de um alimento, de acordo com as diretrizes preconizadas pela Portaria nº 540 (BRASIL, 1997). De acordo com esta mesma Portaria os aditivos são classificados quanto à função, sendo classificados como agentes conservantes as substâncias que têm a finalidade de impossibilitar ou retardar a deterioração microbiana ou enzimática dos alimentos. A quitosana apresenta-se perfeitamente compatível com esta definição, considerando suas propriedades físico-químicas e o reconhecido potencial antimicrobiano e antioxidante..

(28) Ana Elizabeth C. Fai _____________________________________________________________. 27. O uso de aditivos químicos é, no entanto, uma das práticas mais discutidas e polêmicas. Se por um lado seu uso é imprescindível, por outro a debilidade e incertezas de ambos os estudos negativos e positivos relacionados à toxicidade dos aditivos químicos gera controvérsias. Dessa forma, justifica-se a atual tendência adotada pela indústria de alimentos de uma política decrescente do uso de aditivos químicos. A toxicidade da quitosana é menor do que a glicose ou sacarose. A dose letal de glicose em mamíferos é da ordem de 8 a 12 gramas enquanto que 18 gramas de quitosana por quilograma de massa corporal em mamíferos não apresenta qualquer sinal de toxicidade ou mortalidade (CRAVEIRO et al. 1999, YADAV & BHISE, 2004). Estudos indicam que a quitosana é benéfica e segura para o consumo humano. Entretanto, como qualquer outra substância, se utilizada de forma inadequada ou em excesso pode ser nociva ao organismo. Os problemas referidos, decorrentes de doses excessivas da quitosana, foram causados por desidratação gástrica e pelo impacto em decorrência do aumento do volume da mesma uma vez que esta consiste em uma fibra natural que em meio ácido se expande para formar um gel no estômago (COSTA SILVA et al., 2006). A quitosana vem sendo utilizada na indústria de alimentos nos Estados Unidos, Alemanha e Japão, sendo reportado neste último, como agente conservante em: macarrão, molho de soja, sardinha, entre outros; contudo, dados quanto às condições de processamento/formulação, todavia são escassas (ROLLER & COVILL, 1999; RODRÍGUEZ et al., 2002)..

(29) Ana Elizabeth C. Fai _____________________________________________________________. 28. 2.2 .1 Atividade antimicrobiana. Com o intuito de evitar ou retardar a deterioração microbiana de alimentos a quitosana e seus derivados têm sido amplamente pesquisados como agentes antimicrobianos, e nos últimos anos têm recebido uma atenção especial, graças aos resultados promissores neste âmbito de aplicação (TIKHONOV et al., 2006; QIUPING & WENSHUI, 2007). Pesquisas têm demonstrado que a quitosana apresenta ser eficiente como antimicrobiano contra vários microrganismos como Staphylococcus aureus, Escherichia coli (ZHENG & ZHU, 2003; LI et al., 2007b), Salmonella. typhimurium, Streptococcus faecalis (CHUNG et al., 2004), Salmonella entérica, S. paratyphi, Pseudomonas aeruginosa (YADAV & BHISE, 2004), Listeria monocytogenes (COMA et al., 2002), Bacillus. cereus, Shigella dysenteriae, Aeromonas hydrophila, Fusarium, Alternaria, Helminthosporium (COSTA SILVA et al., 2006), Sacharomyces cerevisiae, S. ludwigii, Zygosaccharomyces baillii, Cryptococcus albidus, Candida sp., Rhodotorula sp. (WANG, 1992; RHOADES & ROLLER, 2000; SAGOO et al., 2002). O mecanismo de ação da quitosana sobre os microrganismos não está completamente elucidado, mas várias propostas são sugeridas (NO et al., 2007). Estudos. mais. recentes. revelam. que. o. mecanismo. da. atividade. antimicrobiana da quitosana está intimamente relacionado às propriedades físicoquímicas da solução de quitosana (grau de deacetilação e massa molar), concentração utilizada e tempo de exposição, além das características inerentes à membrana do microrganismo (COSTA SILVA et al., 2006; KANATT et al., 2008b)..

(30) Ana Elizabeth C. Fai _____________________________________________________________. 29. Alguns pesquisadores correlacionam a atividade antimicrobiana da quitosana à formação de complexos polieletrolíticos, uma vez que seus grupos amínicos protonados provavelmente se ligam seletivamente à superfície celular carregada negativamente dos microrganismos, alterando a atividade celular e a permeabilidade da membrana, resultando na perda de componentes intracelulares e conseqüente inibição microbiana (AVADI et al., 2004; TSAI & HWANG, 2004; YADAV & BHISE, 2004; CHEN et al., 2006). Pesquisas demonstram que o efeito antimicrobiano da quitosana é distinto em bactérias Gram-positivas e negativas (LIU et al., 2004). A atividade antimicrobiana da quitosana em bactérias Gram-negativas tem sido associada à natureza catiônica da quitosana que permite a interação e formação de complexos polieletrólitos. com. os. polímeros. aniônicos. presentes. na. superfície. do. microrganismo pertubando a integridade da membrana. Em bactérias Grampositivas a hipótese é de que a quitosana forma filmes ao redor da célula, inibindo a absorção de nutrientes (HELANDER et al., 2001; DEVLIEGHERE et al., 2004b; HARISH PRASHANTH & THARANATHAN, 2006; KANATT et al., 2008a). Estudos recentes relatam que a quitosana induz à desorganização molecular e mudanças morfológicas em fungos fitopatógenos como: Fusarium oxysporum, Sclerotio sclerotiorum, Rhizopus stolonifer, Penicillium digitatum, Colletotrichum gloesporioides. (BAUTISTA-BAÑOS. et. al.,. 2004),. Aspeegillus. niger. (PLASCENCIA-JATOMEA et al., 2003), entre outros. A quitosana também apresenta a função de agente quelante de íons metálicos. Dessa forma é sugerido ainda que este polissacarídeo poderia interferir na produção de toxinas no crescimento microbiano (BORDERÍAS et al., 2005)..

(31) Ana Elizabeth C. Fai _____________________________________________________________. 30. Altieri et al. (2005) estudando a eficiência antibacteriana da quitosana em queijo muzarela mantido sob temperatura de refrigeração, constataram que a quitosana inibiu o crescimento de microrganismos do grupo Coliforme e de Pseudomonas spp. Inferiram ainda, que a presença deste polissacarídeo não afetou a viabilidade e crescimento das bactérias ácido láticas, ao contrário, observou-se um sutil estímulo com relação à sua multiplicação, de forma a não comprometer a funcionalidade tecnológica que esta classe de microrganismos exerce sobre este produto, demonstrando assim, que o uso de quitosana seria uma opção vantajosa para estender a vida de prateleira deste alimento em termos tecnológicos e econômicos. Lee et al. (2002) e Barreteau et al. (2006) sugerem que oligossacarídeos de quitosana e a própria quitosana de baixa massa molecular exerceriam um efeito benéfico seletivo sobre o crescimento e atividade biológica de bactérias probióticas tais como Bifidobacteria e Lactobacillus. Martinez-Castellanos. et. al.. (2007). reportaram. que. Lactobacillus. acidophillus, L. plantarum e Lactobacillus spp. podem ser impregnados em películas de quitosana conservando sua viabilidade mesmo em concentrações elevadas deste polissacarídeo (20g/L). Dentro do conceito de tecnologia de barreiras de proteção o uso de biofilmes de quitosana associado a bactérias láticas é de grande potencialidade, visto que lactobacilos produzem ácido lático, bacteriocinas e outros compostos que inibem o desenvolvimento de patógenos e deteriorantes de alimentos, além de serem importantes probióticos (SAAD, 2006). Tsai & Hwang (2004) examinando a atividade antibacteriana in vitro frente a algumas bactérias patógenas e probióticas relataram que para a quitosana com grau de deacetilação entre 70 e 95%, a concentração mínima letal para Escherichia.

(32) Ana Elizabeth C. Fai _____________________________________________________________. 31. coli, Staphylococcus aureus, Vibrio cholerae, V. parahemoliticus, Listeria monocytogenes e Shigella dysenteriae foi de 50 a 200 p.p.m., enquanto para Clostridium perfrigens e bactérias probióticas dos gêneros Lactobacillus e Bifidobacterium foi de 250, 500 e 1000 p.p.m., respectivamente. Fica evidente que a resistência destas espécies probióticas testadas é mais elevada, quando comparada às patógenas alimentares e intestinais, o que leva a crer que superfície celular destes microrganismos é distinta, fazendo-se necessárias mais pesquisas acerca das mesmas para se alcançar uma explicação conclusiva. Outra constatação interessante destes mesmos autores refere-se à baixa eficiência antibacteriana da quitosana frente C. perfrigens testada in vivo após a ingestão na forma de pó em animais de laboratório, atribuindo-se este fato fundamentalmente às diferenças de pH (nas condições do intestino o pH é maior que 7,0, estando acima do pKa da quitosana), havendo portanto menos grupos amínicos protonados desfavorecendo a interação com a superfície celular, e à própria conformação da molécula que quando in vitro (pH<7) poderia estar mais disponível devido ao desdobramento da cadeia por conta de uma maior repulsão eletrostática dos grupos positivamente carregados. Juneja et al. (2006) demonstraram que a adição de quitosana (concentração 3% p/p) em carne bovina e de peru cozidos foi eficiente para reduzir significativamente o risco potencial de germinação de esporos de Clostridium perfrigens durante a etapa de resfriamento de 54,4 ºC a 7,2ºC por até 18h. É valido ressaltar que não obstante a quitosana apresente potencial para ser utilizada como agente antimicrobiano natural é imprescindível que sejam estimadas as características da matriz alimentar em questão, considerando-se os efeitos dos.

(33) Ana Elizabeth C. Fai _____________________________________________________________. 32. próprios constituintes, o pH do produto, a combinação de procedimentos a que este é submetido, as propriedades reológicas e demais aspectos físicos-químicos. Devlieghere et al. (2004b) estudaram a ação antimicrobiana da quitosana in vitro frente a alguns constituintes alimentares, constatando que há interferência do NaCl devido à interação eletrostática derivada da dissociação desta molécula, sendo que no caso das proteínas esta ação seria mais dependente do pH do meio às próprias cargas aminoacídicas, visto que se estas estiverem abaixo do ponto isoelétrico não haverá perda de atividade antimicrobiana, enquanto a gordura não apresentou nenhum efeito adverso quanto a esta propriedade da quitosana. Rodriguez et al. (2003) demonstrou que o uso de quitosana como biofilme para revestir pizzas pré-cozidas (0,079g/100g pizza) foi eficiente para estender a vida de prateleira durante o armazenamento devido sua ação antifúngica, reduzindo o crescimento de Alternaria sp, Penicillium sp e Cladosporium sp. No entanto, após o processamento térmico parte desta atividade antimicrobiana foi perdida justificando-se tal fato, em razão da reação de Maillard visto que o grupamento amínico comprometido com o açúcar redutor nesta reação, em temperatura elevada, não é mais disponível para a formação de complexos polieletrolíticos, desprendendo-se, portanto, que o uso de quitosana incorporado como agente antimicrobiano em massas alimentícias fermentadas perde parte de sua propriedade funcional se submetido a tratamento térmico (RODRÍGUEZ et al., 2002). Vale ressaltar que alguns estudos revelam que os produtos resultantes da reação de Maillard (PRM) apresentam ação antibacteriana (EINARSSON et al., 1983; NAKAMURA et al., 1991; CHUYEN, 1998; CHEVALIER et al., 2001; USUI et al., 2004; CHUNG et al, 2006), sendo inclusive sugerida, sua aplicação como um aditivo conservante de alimentos (GOULD, 1995; LEISTNER, 2000)..

(34) Ana Elizabeth C. Fai _____________________________________________________________. 33. Contudo, a literatura ainda é restrita em relação aos efeitos deletérios dos PRM sobre microrganismos patógenos alimentares. Neste sentido, Huang et al. (2007) estudaram a eficácia antibacteriana de uma solução de quitosana antes, durante e depois da reação de Maillard induzida pela adição de xilose e aquecimento a 95º/60horas. Examinaram, ainda, o efeito da adição de quitosana e dos PRM sobre a vida de prateleira de macarrão de massa fresca armazenado a 4ºC. Os autores verificaram que a atividade antibaceriana da quitosana aumentou na fase inicial da reação de Maillard, observando que, a atividade mínima inibitória para Bacillus subtilis decaiu de 250mg/mL para 50mg/mL. Constataram também que bactérias Gram-positivas são mais sensíveis aos PRM que Gram-negativas. Por fim, concluíram que a adição de 0,05mL/100mL de solução de quitosana e de PRM na formulação de macarrão de massa fresca resultou em extensão de vida de prateleira de 6 e 14 dias, respectivamente. Chi et al. (2006) relataram efeito sinérgico sobre a propriedade bactericida de filmes de quitosana enriquecidos com extrato puro de óleo de orégano, incorporadas em fatias de mortadela armazenada a 10ºC/5 dias, observando-se uma redução do número de células de Listeria monocytogenes e Escherichia coli O157:H7 de aproximadamente 4 logs decimais, comparada com 1 a 3 logs quando aplicado somente o filme de quitosana, constatando ainda que este tipo de processo é aceito em termos sensoriais. Greco et al. (2007) reportaram que baixa concentração de quitosana (0,015% p/v) com grau de deacetilação de 90% e PM de 300KDa é eficiente para inibir o crescimento de Candida krusei em suco de maçã. Agregar a quitosana em uma etapa prévia à pasteurização dos sucos, diminuiria a carga microbiana inicial,.

(35) Ana Elizabeth C. Fai _____________________________________________________________. 34. permitindo tratamentos térmicos menos enérgicos, fazendo-se necessários mais estudos a este respeito. Não obstante sua comprovada eficiência antimicrobiana vale ressaltar que a quitosana aplicada como um aditivo natural, complementar aos processos de conservação tradicionais, não deve ser vista como um incentivo para o descuido das boas práticas higiênico-sanitárias durante a fabricação de alimentos, uma vez que esta ação configura na verdade, em mais uma etapa neste processo, ou seja, aumentam-se os pontos críticos de controle. Neste sentido, um passo adicional, como a incorporação de quitosana, requer um estrito cumprimento das “Boas Práticas de Fabricação” para que os produtos cheguem às etapas finais com o maior nível de qualidade possível.. 2.2.2 Atividade antioxidante. Os processos de preservação de alimentos são determinados primeiramente pelo controle do desenvolvimento microbiano. Contudo, outros fatores devem ser controlados tais como a ocorrência de reações químicas e enzimáticas que comprometem a qualidade sensorial do produto. Diversos estudos têm reportado a habilidade antioxidante da quitosana, tendo sido avaliado seu uso em carnes e derivados e frutos do mar que contém quantidades. significativas. de. ácidos. graxos. insaturados,. particularmente. susceptíveis à oxidação lipídica durante seu processamento e armazenamento (KANATT et al., 2004). Shahidi et al. (2002) verificaram que a adição de quitosana mostrou-se eficiente como agente de controle da oxidação lipídica em bacalhau.

(36) Ana Elizabeth C. Fai _____________________________________________________________. 35. (Gadus morhua), enquanto Darmadji & Izumimoto (1994) verificaram o efeito antioxidante da quitosana em carne picada. Kanatt et al. (2004), por sua vez, estudaram o efeito da adição de quitosana em carne de cordeiro submetida a processo de irradiação, constatando que este polissacarídeo minimizou os efeitos deste processo sobre a peroxidação lipídica, uma vez que esta reação é justamente o fator limitante ao uso da irradiação em carnes. O mecanismo de ação antioxidante da quitosana nestes produtos é atribuído à sua capacidade de quelar íons metálicos, tais como o ferro, ligado às moléculas de hemoglobina e mioglobina, o qual age como catalisador desta reação (KAMIL et al., 2002; BARRETEAU et al., 2006). Em função da habilidade de se complexar a íons metálicos a quitosana é também um promissor agente de controle do escurecimento enzimático em vegetais, visto que a polifenoloxidase, enzima responsável por este fenômeno, possui cobre no seu centro ativo e funciona como oxidase de função mista, atuando na hidroxilação de monofenóis para diidroxifenóis e em seguida oxidando estes últimos para o-quinonas.. No caso dos vegetais, poder-se-ia sugerir, assim, o uso. da quitosana como biofilme de revestimento, visto que esta agiria como fator de duplo impacto haja vista sua habilidade de bloquear dois componentes essenciais à reação: o oxigênio (atmosfera modificada) e a própria enzima. Ressalta-se que neste caso este método de preservação seria eficaz somente no início do processo uma vez que a formação da quinona é dependente do oxigênio e da polifenoloxidase, porém, uma vez formadas, as reações subseqüentes ocorrem espontaneamente sem a dependência destes elementos para formação de melanina (ARAÚJO, 1999; ASSIS & LEONI, 2003)..

(37) Ana Elizabeth C. Fai _____________________________________________________________. 36. 2.2.3 Biofilmes. Usar revestimentos e coberturas em frutas e vegetais com o objetivo de aumentar seu período de preservação não consiste em prática recente. No entanto, as coberturas denominadas “comestíveis” como hoje conhecemos datam das décadas finais do século passado. Este renovado interesse deve-se à demanda dos consumidores por alimentos de alta qualidade, preocupações ambientais em relação ao acúmulo de embalagens não biodegradáveis e a oportunidade de se criar alternativas de mercado para a produção de filmes de fontes renováveis (FRANCHETTI & MARCONATO, 2006; BOTREL et al., 2007; MENG et al, 2008). A quitosana destaca-se por sua capacidade de atuar como uma barreira à perda de umidade, controlar a respiração do fruto e apresentar alto potencial antimicrobiano, além de prevenir o escurecimento enzimático, ressaltando-se que esta é biodegradável o que a torna “ambientalmente correta” (ASSIS & LEONI, 2003; BORDERÍAS et al., 2005; GALLETI et al., 2006; CHIEN et al., 2007a). Neste âmbito de aplicação pode-se considerar, na realidade, os biofilmes a base de quitosana como embalagens ativas, pois além de atuarem como uma barreira a agentes externos, apresentam uma série de funções desejáveis à manutenção da qualidade do vegetal ou fruto revestido. Apresenta como uma das vantagens, sobre a embalagem convencional, o fato da quitosana apresentar propriedades como agente antimicrobiano e antioxidante atendendo a atual demanda por alimentos minimamente processados e livres da incorporação de conservantes químicos (COMA et al., 2002; OLIVEIRA & OLIVEIRA, 2004)..

(38) Ana Elizabeth C. Fai _____________________________________________________________. 37. Botrel et al. (2007) desenvolveram um revestimento antimicrobiano para alho minimamente processado constituído de amido de mandioca adicionado de quitosana, constatando que este foi viável para reduzir significativamente a microbiota presente durante 20 dias de estocagem. Qiuping & Wenshui (2007) pesquisando novas técnicas de preservação e manutenção da qualidade de cerejas da Índia (Ziziphus mauritina, cv. Cuimi), à temperatura ambiente, constataram que o uso de biofilme combinando quitosana e 1-metilciclopropeno foi eficaz para incrementar a vida útil deste fruto em oito dias. Observaram diminuição da sua taxa respiratória e de produção de etileno e poligalacturonase, pelas cerejas, observando também redução da perda de peso, maior conservação da coloração verde e níveis mais altos de ácido ascórbico e sólidos solúveis totais. Chien et al. (2007b) reportaram a eficiência do biofilme de quitosana para retardar o escurecimento, a deterioração e a perda de água em pitayas vermelhas (Hylocereus undatus) fatiadas, mantendo o conteúdo de sólidos solúveis totais, acidez titulável e ácido ascórbico. Verificaram, ainda, que este revestimento não influenciou na qualidade sensorial de pitayas vermelhas, sugerindo assim, o uso de coberturas de quitosana para preservar frutos minimamente processados de forma geral. Têm sido conduzidas, ainda, análises detalhadas dos filmes de quitosana por microscopia eletrônica de varredura e de força atômica indicando estrutura descontínua, que caracteriza certa porosidade residual no filme formado, apresentando, de forma geral, espessura extremamente fina, não superior a 1,5 mm. Essas características são desejáveis para coberturas de frutos, visto que, apesar de se almejar baixar a taxa respiratória com vistas a retardar o amadurecimento, é.

(39) Ana Elizabeth C. Fai _____________________________________________________________. 38. necessário que haja nos revestimentos a manutenção de uma respiração mínima, evitando a ocorrência de processo fermentativo (ASSIS et al. 2002). Contudo, observa-se, todavia, grande distância entre pesquisa e realidade comercial, evidenciando-se que um dos aspectos que têm dificultado o uso da quitosana na indústria alimentícia é a falta de padronização da mesma. As quitosanas disponíveis, principalmente no Brasil, são de procedências diversas e apresentam diferentes graus de pureza e densidade molar, além de não seguirem industrialmente um procedimento comum de deacetilação, tornando os materiais comerciais consideravelmente diferentes entre si, dificultando, dessa maneira, o estabelecimento de um processamento padrão de géis e a obtenção de filmes e revestimentos com características reprodutíveis (ASSIS & LEONI, 2003). Ressaltase a primazia da quitosana extraída de fungos quanto à aplicação deste biopolímero no segmento alimentício, visto que a derivada de crustáceos é considerada relativamente inconsistente quanto às suas propriedades físico-químicas devido à variação da própria matéria-prima, contaminação por proteínas, carbonato de cálcio e efeitos cáusticos dos produtos químicos necessários à síntese em altas temperaturas resultando em hidrólise da cadeia (NADARAJAH et al., 2001)..

(40) Ana Elizabeth C. Fai _____________________________________________________________. 39. 3.0 Objetivos 3.1. Geral Extrair e caracterizar a quitosana da biomassa de Mucor circinelloides (UCP 050) e avaliar a efetividade desta na inibição do crescimento in vitro de cepas de bactérias patogênicas/deteriorantes de interesse em alimentos.. 3.2. Específicos . Investigar a eficiência do meio de cultura produzido a partir de Jacatupé (Pachyrhizus erosus L. Urban) para o crescimento de Mucor circinelloides e produção de quitina e quitosana;. . Extrair e caracterizar quitosana da biomassa de Mucor circinelloides;. . Verificar a sensibilidade de cepas de bactérias patogênicas/deteriorantes de interesse em alimentos frente à ação da quitosana;. . Verificar a concentração inibitória mínima e máxima da quitosana sobre as cepas ensaiadas..

(41) Ana Elizabeth C. Fai _____________________________________________________________. 40. 4.0 Referências Bibliográficas AGULLÓ, E.; RODRÍGUEZ, M. S.; RAMOS, V.; ALBERTENGO, L. Present and future role of chitin and chitosan in food. Macromolecular Bioscience, v.3, n.10, p.521-530, 2003. ALTIERI, C.; SCROCCO, C.; SINIGAGLIA, M.; DEL NOBILE. Use of chitosan to prolong mozzarella cheese shelf life. Journal Dairy Science, v. 88, p.2683-2688, 2005. AMORIM, R. V. S.; PEDROSA, R. P.; KAZUTAKA, F.; MARTÍNEZ, C. R.; LEDINGHAM, W. M.; CAMPOS-TAKAKI,G. M. Alternative carbon sources from sugar cane process for submerged cultivation of Cunninghamella bertholletiae to produce chitosan. Food Technology Biotechnology, v.44, n.4, p.519-523, 2006. AMORIM, R.V.S.; CAMPOS-TAKAKI, G.M.; LEDINGHAM, W.M. et al. Screening of chitin deacetylase from Mucoralean strains (Zygomycetes) and its relationship to cell growth rate. Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology, v.31, p. 19-23, 2005. AMORIM, R.V.S.; SOUZA, W.; FUKUSHIMA, K.; CAMPOS-TAKAKI, G.M. Faster chitosan production by mucoralean strains in submerged culture. Brazilian Journal of Microbiology, v.32, p.20-23, 2001. ANDRADE, V.S.; NETO, B.B.; SOUZA, W.; CAMPOS-TAKAKI, G.M. A factorial designs analysis of chitin production by Cunninghamella elegans. Canadian Journal of Microbiology, v.46, n.11, p.1042-1045, 2000. ANDRADE, V.S; NETO, B.B; FUKUSHIMA, K.; CAMPOS-TAKAKI, G.M. Effect of medium components and time of cultivation on chitin production by Mucor circinelloides (Mucor javanicus IFO 4570)- A factorial study. Revista Iberoamericana de Micologia, v.20,p.149-153, 2003. ARAÚJO, J. M. A. Química de Alimentos: Teoria e prática. 2ed. Viçosa: UFV.1999. 416p. ASSIS, O. B. G.; LEONI, A. M. Filmes comestíveis de quitosana. Biotecnologia Ciência e desenvolvimento, v.30, p. 33-38, 2003. ASSIS, O. B. G.; VIEIRA, D. C.; BERNARDES-FILHO, R.; CAMPANA-FILHO, S. P. AFM characterization of chitosan self-assembled films. The International Journal of Polymeric Materials, v.51, n.7, p. 633-638, 2002. AVADI, M.R.; SADEGHI, A.M.M.; TAHZIBI, A.; BAYATI, K.H.; POULADZADEH, M., ZOHURIAAN-MEHR, M.J.; RAFIEE-TEHRANI, M. Diethylmethyl chitosan as an antimicrobial agent: Synthesis, characterization and antibacterial effects. European Polymer Journal, v.40, p.1355-1361, 2004..

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