UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE - FURG INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS - ICB
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FISIOLÓGICAS: FISIOLOGIA ANIMAL COMPARADA
SUPEREXPRESSÃO DO HORMÔNIO DO CRESCIMENTO (GH) E AS RESPOSTAS AO ESTRESSE ABIÓTICO EM UM MODELO DE ZEBRAFISH (Danio rerio) TRANSGÊNICO
Tese de conclusão de doutorado apresentada pela MSc. Daniela Volcan Almeida como parte dos requisitos para obtenção do título de doutora em Ciências Fisiológicas: Fisiologia Animal Comparada desenvolvida sob orientação do Prof. Dr. Luis Fernando Marins e co-orientação do Prof. Dr. Adalto Bianchini
RIO GRANDE, FEVEREIRO DE 2013
SUMÁRIO 1
RESUMO ... 3 2
ABSTRACT... 4 3
INTRODUÇÃO GERAL ... 5 4
HORMÔNIO DO CRESCIMENTO (GH) ... 5 5
TRANSGENIA E HORMÔNIO DO CRESCIMENTO ... 7 6
SALINIDADE E HORMÔNIO DO CRESCIMENTO EM PEIXES ... 8 7
TEMPERATURA E HORMÔNIO DO CRESCIMENTO EM PEIXES ... 11 8
OXIGÊNIO E HORMÔNIO DO CRESCIMENTO EM PEIXES ... 15 9
METABOLISMO ENERGÉTICO E HORMÔNIO DO CRESCIMENTO EM PEIXES ... 17 10
MODELO DE ESTUDO ... 19 11
OBJETIVO GERAL ... 21 12
ARTIGO 1 ... 23 13
ARTIGO 2 ... 36 14
ARTIGO 3 ... 51 15
CONCLUSÕES GERAIS ... 73 16
PERSPECTIVAS ... 74 17
REFERÊNCIAS GERAIS ... 75 18
Dedico este trabalho aos meus pais. O verdadeiro sentido da minha existência.
AGRADECIMENTOS 1
Normalmente os agradecimentos são as primeiras palavras escritas em uma tese de 2
doutorado, mas eu tive dificuldade de começar a escrevê-los, não por não saber o que 3
escrever ou a quem agradecer, mas porque cada dia passa surgem pessoas que merecem o 4
meu muito obrigada, por até mesmo um simples sorriso. Então vou tentar agradecer, de 5
alguma forma, todos aqueles que me ajudaram a concluir mais esta etapa da minha formação.
6
Primeiramente, gostaria de agradecer aos meus pais Cirio Almeida e Hilda Almeida, a 7
quem também dedico este trabalho. Meus queridos pais, não há palavras que eu escreva aqui 8
que possa expressar minha gratidão e meu amor por vocês! Vocês me motivam, me aguentam, 9
me ajudam e me amam incondicionalmente, nada por ser maior que o nosso amor! Obrigada!
10
Aos meus irmãos Rodrigo Volcan e Renata Volcan, que juntamente com suas famílias, 11
me apoiam todos os dias. Apesar da distância estamos sempre muito próximos de coração. A 12
Romi Lamb e Marcelo Tavares meus irmãos de coração, muito obrigada por fazerem parte da 13
nossa família. O meu muito obrigada também aos meus pequenos grandes amores André 14
Almeida e Pedro Almeida, meus sobrinhos amados que alegram tanto a minha vida!
15
A família Chanin por me aceitarem como parte de família e me acolherem com tanto 16
carinho. O meu obrigada aos meus sogros Ricardo e Leda, aos meus cunhados Taís, Renan e 17
Fábio, e um agradecimento especial a minha pequena afilhada, Helena, que foi a hora do meu 18
descanso nos últimos dias.
19
O meu muito obrigada especial ao meu orientador Luis Fernando Marins, que sempre 20
com muita paciência, me ensina, me ajuda e me motiva! Obrigada Luf por estes 10 anos de 21
orientação e amizade. Gostaria de agradecer também a Ana, esposa do Luf, que muitas vezes 22
teve que esperar pelo Luf em nossas intermináveis reuniões e discussões de resultados.
23
Obrigada também ao meu querido co-orientador Adalto Bianchini, mesmo sempre cheios de 24
compromissos consegue orientar e contribuir de uma forma tão carinhosa!
25
Gostaria de agradecer aos meus amigos de Furg, que hoje são minha família. Tatiana 26
Ávila, nossas conversas me iluminam! Lupe teu coração é bom demais! Liane tuas palavras me 27
confortam e o sorriso do Gael me preenche de amor! Maíra tu me inspira! Bruna tua energia 28
contagia! Márcio tua amizade e coração me fazem acreditar num mundo melhor! Fred teu 29
bom humor e dedicação me fazem te querer perto de mim! Cecília e Isabel foi bom demais 30
dividir estes anos com vocês! Camila tua disposição me faz querer estar mais perto dos 31
amigos! Mari teu alto astral me faz tão bem! Michele C. tuas palavras me fazem feliz! Carol 32
Reyes tua sensibilidade e dedicação me tranquilizam! Bruno obrigada pela ajuda nas 1
traduções!
2
E a todos os colegas e professores de fisiologia, obrigada por tornar nosso ambiente de 3
trabalho um lugar tão especial! Principalmente, a prof. Gilma Trindade que tem sempre uma 4
palavra de conforto para dar! A todo pessoal do laboratório de Biologia Molecular do ICB, que 5
sempre compartilham de bons e maus resultados!
6
As minhas amigas Luluzinhas, Cláudia, Caroline, Renata, Lilian, Lisiane e Andressa!
7
Como já falei uma vez, somos sete amigas fisicamente diferentes e apenas um coração!
8
Obrigada por me apoiarem e incentivarem sempre! Um obrigada também aos meninos, 9
Ederson, Robert, Samuel, Felipe e Juninho! Que por fazerem vocês felizes, me fazem também!
10
Aos professores doutores que aceitaram contribuir com a avaliação deste trabalho:
11
Luis Eduardo Nery, Elton Collares, Ricardo Robaldo e Bruno Brasil. Tenho certeza que 12
independente do resultado final deste processo, sairei dele uma pessoa melhor.
13
E por fim gostaria de agradecer ao meu grande amor, Carlo Chanin, que assim como 14
eu, sentiu nossa distância. Ao teu lado sou completa! Te amo!
15 16 17
RESUMO
1
RESUMO 1
Peixes transgênicos que superexpressam o gene do hormônio do crescimento (GH) 2
podem apresentar taxas de crescimento almejadas para a produção na aquicultura. No 3
entanto, o aumento do nível de GH causado pela transgenia pode modificar as respostas 4
biológicas frente à presença de estressores bióticos e abióticos. Desta forma, o principal 5
objetivo deste estudo foi analisar os efeitos do excesso de GH promovido pela transgenia 6
sobre a tolerância a diferentes estressores abióticos, em um modelo de peixe (Danio rerio) 7
transgênico para o GH. A exposição às variações de salinidade, temperatura e oxigênio foram 8
os parâmetros considerados como estressores abióticos. A alteração da tolerância a estes 9
fatores, promovida pela superexpressão do GH foi avaliada em nível de expressão de genes, 10
atividades enzimáticas e produtos metabólicos, com a finalidade de entender os mecanismos 11
destas modificações. No primeiro estudo, peixes transgênicos adultos foram expostos à 12
salinidade hiperosmótica de 11 ppt e os resultados demonstraram que o excesso de GH 13
aumenta a atividade da enzima Na+,K+,ATPase e aumenta, consequentemente, a absorção de 14
Na+. O excesso de Na+ nos peixes transgênicos pode justificar a maior taxa de mortalidade 15
destes animais. No segundo estudo, as respostas ao estresse térmico foram analisadas em 16
peixes transgênicos adultos e juvenis expostos à alta temperatura (39oC) e baixa temperatura 17
(13oC). Estes experimentos demonstraram um aumento na sobrevivência dos peixes 18
transgênicos juvenis expostos à 13oC, e uma diminuição nos adultos e juvenis transgênicos 19
expostos à 39 oC. Associado a estes resultados, houve uma alteração no padrão de expressão 20
das proteínas de choque térmico (HSPs), relacionado à idade e à temperatura. No último 21
estudo, peixes transgênicos e não-transgênicos foram expostos ao estresse hipóxico (1.5 22
mgO2/L). Os resultados indicam que os peixes transgênicos são mais suscetíveis à baixa 23
concentração de oxigênio. Adicionalmente, foi observado um aumento na atividade da enzima 24
lactato desidrogenase (LDH) e na concentração de lactato nos peixes transgênicos. Assim estes 25
resultados sugerem que o excesso de GH promovido pela transgenia prejudica a habilidade de 26
manter o metabolismo aeróbico em baixos níveis de oxigênio, ativando o metabolismo 27
anaeróbico nestes animais. Em conclusão, a exposição a distintos estressores abióticos 28
mostrou que a superexpressão do GH pode alterar, de forma diferenciada, a tolerância termal, 29
osmótica e hipóxica, de acordo com a idade e ao tipo de estresse.
30 31
ABSTRACT
2
ABSTRACT 1
Growth hormone (GH) transgenic fish may show growth rates sought for production in 2
aquaculture. Nevertheless, the increased GH level caused by transgenesis can modify the 3
biological responses to presence of biotic and abiotic stressors. Therefore, this study aimed to 4
analyze the effects of GH excess on tolerance to variations of salinity, temperature and 5
oxygen, in a GH transgenic fish (Danio rerio) model. In addition, gene expression, enzymatic 6
activities and metabolic products were evaluated after tolerance tests, in order to understand 7
the physiologic alteration promoted by GH overexpression. In the first study, adult transgenic 8
fish were exposed to hyperosmotic salinity of 11 ppt. The results showed that GH transgenic 9
fish were more susceptible to hyperosmotic salinity than non-transgenic fish. Besides, GH- 10
transgenic fish showed an increase of Na+, K+, ATPase enzyme activity, which could be 11
associated to higher mortality in this group. In the second study, GH transgenic fish (juveniles 12
and adults) and non-transgenic fish (juveniles and adults) were exposed to high temperature 13
(39oC) and low temperature (13oC). These experiments showed that GH transgenesis increased 14
survival in juveniles under low temperature, and decreased in both juveniles and adults, under 15
high temperature. Associated to these results, there is an alteration in HSPs gene expression 16
pattern related to age and temperature. In the last study, transgenic and non-transgenic fish 17
were submitted to hypoxic stress. The results indicated that transgenic fish are more 18
susceptible to low levels of oxygen (1.5 mgO2/L). Additionally, an increase of lactate 19
dehydrogenase (LDH) activity and lactate concentration was observed in transgenic fish. Taken 20
altogether, these findings indicate that GH-transgenesis impaired the ability of juvenile 21
zebrafish to sustain the aerobic metabolism, thus inducing the anaerobic metabolism when 22
fish were challenged to low oxygen levels in the water. In conclusion, the exposure to different 23
abiotic stressors has shown that GH overexpression can alter thermal, osmotic and hypoxic 24
stress tolerance differently according to the age and stress.
25 26 27
INTRODUÇÃO GERAL
3 INTRODUÇÃO GERAL
1
HORMÔNIO DO CRESCIMENTO (GH) 2
O hormônio do crescimento (GH), em teleósteos, é um hormônio polipeptídico de 3
cadeia única, com peso molecular de aproximadamente 21-23 KDa. O GH, também 4
denominado de somatotropina, contêm duas pontes de disulfeto intramoleculares altamente 5
conservadas, com importante atividade biológica, bem como um sítio N de glicosilação1. A 6
região flanqueante 5’ do gene do GH contêm múltiplos elementos regulatórios de transcrição, 7
incluindo o fator de transcrição específico da pituitária (PIT-1), a proteína de ativação-1 (AP-1) 8
e elemento de resposta ao monofosfato de adenosina cíclico (CRE). A via de sinalização de 9
transcrição do gene do GH contêm vários genes interdependentes como IGF (fator do 10
crescimento tipo insulina), PIT1 (fator de transcrição específico da pituitária), GHRH (hormônio 11
liberador do GH), GHR (receptor do GH), GHRHR (hormônio liberador do GHR) e outros (Cogan 12
e Phillips, 1998). Dentre esses, o GHR e o IGF são importantes mediadores dos efeitos 13
biológicos do GH.
14
Como em mamíferos, o GHR de peixes é da família dos receptores tipo citoquinas e 15
contém domínios extracelular, transmembrana e intracelular. O domínio extracelular tem 16
resíduos de cisteínas e dois domínios antiparalelos com sítios de ligação do GH. O domínio 17
intracelular apresenta dois sítios ricos em prolina e um sítio de ligação para Janus quinase 18
(JAK), o qual é essencial para a sinalização promovida pelo GH. O outro sítio está envolvido na 19
internalização do GHR (Lichanska e Waters, 2008).
20
Resumidamente, a via pela qual o processo do crescimento se desenvolve começa pela 21
síntese do GH na adenohipófise, o qual é liberado na corrente sanguínea de onde vai atuar em 22
determinados órgãos, através da sua associação com GHR presentes na superfície das células- 23
alvo. A ativação da sinalização (Figura 1) começa com a dimerização do GHR, visto que o GH 24
possui dois sítios de ligação com afinidades diferentes, permitindo com que uma molécula de 25
GH interaja sequencialmente com duas moléculas de GHR. A ligação do GH com o GHR induz a 26
fosforilação2 e consequente ativação de membros da família JAKs. Uma vez ativada, as JAKs 27
fosforilam regiões específicas do receptor ricas em tirosinas, as quais irão servir de sítios de 28
ancoragem para as moléculas conhecidas como sinais de tradução e ativadores da transcrição 29
1Glicosilação é uma modificação pós-traducional, na qual ocorre a adição de sacarídeos à cadeia proteica. Na N- glicosilação o sacarídeo é adicionado no grupo NH4 do aminoácido arparagina.
2 Fosforilação é a adição de um grupo fosfato em uma proteína ou qualquer outra molécula.
INTRODUÇÃO GERAL
4 (STATs), que também são fosforiladas pelas JAKs, formando dímeros e translocando-se para o 1
núcleo para ativar genes específicos envolvidos no desenvolvimento das respostas biológicas 2
ao GH, como o gene do IGF (para revisão ver Frank e Fuchs 2008).
3
Existem vários mecanismos que controlam a via clássica de sinalização do GH, 4
principalmente quando há excesso ou baixa produção do hormônio. Esses mecanismos são a 5
regulação da atividade das STATs por ação das proteínas SOCS (supressores de sinalização de 6
citocinas), processos de desfosforilação pelas tirosinas-fosfatases (PTPs) e ainda pela 7
degradação do complexo GH/GHR/JAK por ação da ubiquitina (Lanning e Carter-Su, 2006).
8 9
10
Figura 1 – Representação esquemática da principal via de sinalização induzida pelo hormônio do crescimento (GH).
11
O GH circulante na corrente sanguínea interage com duas moléculas de receptor do GH (GHR), em dois diferentes
12
sítios de ligação. Essa interação ativa uma cascata de sinalização complexa, incluindo a fosforilação de proteínas,
13
como JAKS e STATs, que resultará na expressão de genes, principalmente IGF-1.
14
As ações biológicas mediadas pelo GH culminam, de uma forma geral, na promoção do 15
crescimento. Esse hormônio intensifica praticamente todos os aspectos da captação de 16
aminoácidos e da síntese de proteínas pelas células, além de promover o aumento do 17
crescimento muscular e da síntese de cartilagem. Além de estar envolvido no controle do 18
crescimento, o GH também afeta o metabolismo de gorduras, proteínas e carboidratos; e 19
exerce suas funções tanto, diretamente sobre os órgãos alvo quanto, pela estimulação da 20
produção de fatores de crescimento (para revisão ver Canosa et al. 2007).
21
INTRODUÇÃO GERAL
5 A maioria das ações de promoção de crescimento promovida pelo GH em peixes e em 1
outros animais é mediada pelo IGF-1. O GH circulante estimula a síntese e secreção de IGF-1 2
no fígado e outros órgãos como brânquias e músculo. O IGF-1, por sua vez, se liga nos 3
receptores de IGF-1, resultando na promoção do crescimento e outras ações biológicas como 4
metabolismo energético e osmorregulação.
5
O sistema GH-IGF-1 em peixes teleósteos é complexo, considerando principalmente a 6
duplicação do genoma destes organismos durante sua evolução, assim múltiplas formas de 7
GH, GHR e IGF-1 tem sido descritas (Sheridan e Hagemeister, 2010). Os efeitos do GH, em 8
peixes, são conhecidos basicamente através dos estudos de administração direta do hormônio 9
ou transferência do gene por manipulação genética (Devlin et al. 2004).
10
TRANSGENIA E HORMÔNIO DO CRESCIMENTO 11
A trangênese é uma ferramenta da engenharia genética e molecular que envolve a 12
introdução de um DNA exógeno no organismo por processos que não ocorrem 13
espontaneamente na natureza (Houdebine, 2002). Essa ferramenta apresenta um grande 14
potencial para modificar características de interesse para cultivo, bem como para produção de 15
conhecimentos nas ciências básicas. Devido a grande aplicabilidade da transgenia nas mais 16
diversas áreas, atualmente existe uma série de técnicas disponíveis para produzir peixes 17
transgênicos. Essas têm sido desenvolvidas com objetivo de aumentar a eficiência de 18
integração dos transgenes transferidos ao genoma do organismo receptor, produzir 19
transgênicos puros na primeira geração e produzir transgênicos em grande quantidade. Entre 20
essas técnicas disponíveis, a microinjeção em ovos recém fertilizados destaca-se por sua 21
simplicidade e confiabilidade (Udvadia and Linney, 2003; Zbikowska, 2003).
22
Os estudos iniciais com transgenia em peixes focaram, principalmente, o impacto da 23
transferência do gene do GH na taxa de crescimento (Zhu et al. 1985). Esse estudo foi o 24
pioneiro do desenvolvimento de peixes transgênicos para o GH e demonstrou que os animais 25
transgênicos podem apresentar uma maior taxa de crescimento em relação aos não- 26
transgênicos. A partir do estudo de Zhu e colaboradores (1985) inúmeras espécies de peixes 27
tem sido manipuladas geneticamente com a finalidade de alterar outras características 28
importantes para o cultivo, como reprodução, resistência a doenças e qualidade da carne 29
(Hallerman et al. 2007).
30
O primeiro animal geneticamente modificado para o consumo humano, o salmão do 31
Atlântico (Salmo salar) está em processo final de liberação para a comercialização nos Estados 32
Unidos da América. Este peixe foi geneticamente modificado para o gene do GH do salmão do 33
Pacífico (Oncorhynchus tshawytscha) e é capaz de crescer durante todo o ano, e não somente 34
INTRODUÇÃO GERAL
6 nos períodos de primavera e verão como os peixes selvagens. O objetivo desta modificação é 1
aumentar a velocidade na qual os peixes crescem, sem afetar o tamanho final e nem outras 2
características. A agência americana Food and Drug Administration EUA (FDA) realizará uma 3
consulta pública e logo poderá emitir uma avaliação final autorizando a empresa AquaBounty a 4
vender o peixe (Maxmen, 2012).
5
Além do aumento na taxa de crescimento, a transgênese para o GH também é capaz de 6
gerar conhecimentos significativos na área da fisiologia do crescimento, comportamento e 7
ecologia. Hallerman et al. (2007) revisaram os principais efeitos do GH e mostraram que este 8
hormônio afeta não somente o crescimento, mas também outras características fisiológicas e 9
comportamentais, considerados como efeitos pleiotrópicos3 do GH. Por exemplo, o salmão 10
transgênico para o GH (Salmo salar) possui características fenotípicas que influenciam o 11
sucesso reprodutivo (Moreau et al. 2011), promove o aumento do metabolismo respiratório 12
(Deitch et al. 2006) e diminui o comportamento anti-predação (Abrahams e Sutterlin, 1999).
13
Neste contexto, cabe ainda ressaltar que cada espécie apresenta um histórico genético e 14
que os eventos de integração do transgene dão origem a uma linhagem transgênica única.
15
Além disso, a expressão fenotípica de um transgene é dependente não somente destes 16
fatores, mas também do ambiente que os animais transgênicos estão inseridos (Devlin et al.
17
2004). Desta forma, torna-se evidente a necessidade de conhecer qual a ação biológica que 18
essa manipulação genética pode gerar, principalmente, em relação a parâmetros abióticos 19
importantes como salinidade, oxigênio e temperatura.
20
SALINIDADE E HORMÔNIO DO CRESCIMENTO EM PEIXES 21
Todas as células vivas necessitam de um ambiente osmótico estável para manutenção 22
de suas funções vitais. Para manter as concentrações de soluto dentro do limite de 23
compatibilidade com a vida os peixes desenvolveram excelentes estratégias, ao longo da 24
evolução, denominadas estratégias de osmorregulação. A manutenção da homeostase 25
eletrolítica e do volume de água exibe diferentes mecanismos de acordo com o ambiente e as 26
características fisiológicas de cada organismo.
27
Em peixes teleósteos de água doce a concentração de sais no plasma (~300mOsm/L) é 28
hiperosmotica em relação ao meio (~1mOsm/L), assim há uma tendência de um influxo de 29
água para o animal e perda de sais para o meio. Para compensar este influxo unidirecional de 30
3 Pleiotropia é o nome dado aos múltiplos efeitos de um gene.
INTRODUÇÃO GERAL
7 água, peixes de água doce ingerem pouca água e excretam grandes volumes de urina diluída 1
(para revisão ver Greenwell et al. 2003).
2
O processo osmorregulatório é realizado por diferentes órgãos e é regulado por diversos 3
hormônios e enzimas, os quais também podem afetar o metabolismo energético. Cada órgão 4
envolvido nos mecanismos osmorregulatórios apresenta estratégias distintas de regulação 5
iônica. Por exemplo, ao contrário do rim de teleósteos marinhos, o rim de teleósteos de água 6
doce deve eliminar grandes quantidades de água enquanto limitam a perda de NaCl, para isto 7
há uma alta taxa de filtração glomerular junto com uma reabsorção eficiente dos íons Na+ e Cl- 8
(Para revisão ver Evans et al. 1999; Evans, 2008) 9
Em brânquias de peixes de água doce pode ocorrer a redução da permeabilidade 10
relativa para diminuir a perda de íons e/ou mecanismos elaborados para aumentar a entrada 11
de íons, envolvendo, principalmente, trocadores Na+/H+ (NHE) e a enzima Na+,K+-ATPase (NKA) 12
(Parks et al. 2008). Outros órgãos apresentam grande importância no processo 13
osmorregulário, como o intestino, que são capazes de absorver e excretar eletrólitos. Ao longo 14
do sistema gastrointestinal existem diferenças regionais na magnitude do fluxo de água e 15
eletrólitos, devido às diferenças na densidade e proporção da Na+,K+-ATPase, co- 16
transportadores Na+K+2Cl-, canais de íons, aquaporinas e da permeabilidade das junções que 17
ligam as células epiteliais (Buddington e Krogdahl, 2004).
18
As brânquias de peixes de água doce (Figura 2) devem captar Na+, Ca+2 e outros íons da 19
água, geralmente contra fortes gradientes eletroquímicos. Em geral, as células captam Na+ 20
através do canal de sódio apical, embora exista um gradiente desfavorável para esta captação 21
de Na+. Essas células criam um gradiente eletroquímico favorável a partir da bomba protônica 22
(H+-ATPase) que acidifica a água na camada limite. Uma vez dentro da célula o Na+ é 23
transportado para o líquido extracelular pela NKA basolateral ou pelo trocador Na+/HCO3-
24
Concomitantemente, as células importam Cl- para dentro da célula usando um trocador Cl- 25
/HCO3-
apical, o qual é enviado para o sangue através de canais de Cl- basolaterais. Os íons 26
HCO3-
e H+, que são trocados pelos íons Cl- e Na+, são, em geral, resíduos metabólicos, pois 27
ambos são derivados do gás carbônico (CO2)produzidos pelo metabolismo. A enzima anidrase 28
carbônica (AC), que é a enzima chave nestes processos, cataliza reações de hidratação e 29
desidratação do CO2. 30
As brânquias de peixes apresentam diferentes tipos celulares, nas quais tanto a 31
presença quanto a abundância das proteínas envolvidas no processo de osmorregulação são 32
célula-específica. No peixe zebrafish (Danio rerio), por exemplo, existem três tipos de ionócitos 33
(Hwang, 2009), sendo que a expressão da AC citosólica ocorre somente na célula rica em 34
presença da bomba protônica (H+-ATPase). Este tipo de ionócito é chamado de HR e apresenta 35
INTRODUÇÃO GERAL
8 uma alta expressão da H+-ATPase na membrana apical, sendo responsável pela entrada de Na+ 1
e saída de H+. O segundo tipo de ionócito presente no epitélio branquial do zebrafish é 2
chamado de célula NaR. Esta célula é rica em mitocôndrias, com uma alta expressão de NKA na 3
membrana basolateral. A célula NaR corresponde a célula de cloreto clássica de água doce, 4
sem a presença detectável da expressão de AC. O terceiro tipo de ionócito é o que apresenta 5
uma alta expressão do cotransportador Na+-Cl-, chamado de células NCC.
6
7
Figura 2 – Representação esquemática do mecanismo iono-osmoregulatório em células brânquiais de peixes de
8
água doce. O CO2 (produzido pelo metabolismo) reage com moléculas de água, através da ação catalítica da enzima
9
anidrase carbônica (AC). Esta reação produz moléculas de HCO3-
e prótons H+. Os prótons H+ são bombeados para
10
fora da célula pela bomba eletrogênica de prótons (HATPase), aumentando a quantidade de carga negativa na
11
membrana apical. A negatividade da membrana estabelece um gradiente eletroquímico que favorece a entrada de
12
Na+. O Na+ entra pelo canal de sódio (CN) e é transportado para o sangue através da enzima Na+, K+-ATPase (NKA).
13
Concomitantemente, o Cl- é importado para dentro da célula usando um trocador Cl-/HCO3-
apical (AE) e é enviado
14
para o sangue através do canal de Cl- (CC). Baseado em Evans et al. 2005.
15
A manutenção da homeostasia iônica, promovida pelas diferentes proteínas citadas 16
anteriormente, é importante para o perfeito funcionamento de inúmeros processos 17
fisiológicos, dentre eles o crescimento. A relação do parâmetro abiótico salinidade com o 18
crescimento já esta descrito para inúmeras espécies de peixes (Boeuf e Payan, 2001), incluindo 19
o “sea bream” (Sparus sarba), que em condições isosmóticas demonstrou um aumento das 20
taxas de crescimento.
21
O aumento da taxa de crescimento de peixes em ambientes isosmóticos atribui-se ao 22
fato de que para manter seu equilíbrio fisiológico um animal requer uma composição 23
relativamente constante e bem definida de seus fluidos corpóreos, assim, ao encontrarem 24
ambientes isosmóticos eles economizam a energia dos processos osmoregulatórios e então 25
direcionam esta energia para o crescimento e conversão alimentar. Desta forma, a aclimatação 26
ou aclimatização a salinidades intermediárias pode estimular a produção do GH.
27
INTRODUÇÃO GERAL
9 A principal função na regulação osmótica do GH parece estar associada com a função 1
osmorregulatória branquial, incluindo a atividade e distribuição das células de cloreto 2
(Mancera e McCormick, 1998). Além das células de cloreto, o GH influência mecanismos de 3
transporte iônico, incluindo a bomba Na+,K+-ATPase, uma enzima de membrana que 4
transporta ativamente K+ para dentro da célula e Na+ para fora, contra um gradiente de 5
concentração (Geering, 1990). A bomba de sódio é uma enzima heterodimérica composta por 6
uma subunidade catalítica (subunidade α) e uma subunidade glicosilada β, as quais são 7
codificadas por genes distintos. Recentemente, foi demonstrado que tratamentos com GH, em 8
filamentos branquiais isolados de “sea bream” (Sparus sarba), aumenta a atividade da Na+,K+- 9
ATPase aumentando a transcrição de ambos os genes que codificam para essa enzima (Deane 10
e Woo, 2005). Além da Na+,K+-ATPase, tratamentos com GH em salmão do Atlântico (Salmo 11
salar) demonstrou um aumento na abundância do co-transportador Na+,K+,2Cl-, devido, 12
provavelmente, ao aumento correspondente do número de células de cloreto (Pelis e 13
McCormick, 2001).
14
Em geral, os efeitos osmorregulatórios do GH são mediados via regulação do IGF-1, 15
aumentando a habilidade hipo-osmorregulatória em peixes anádramos4 como trutas (Madsen, 16
1990) e salmões (Sakamoto et al. 1993; Shrimpton et al. 1995). Embora estudos com espécies 17
de não-salmonídeos demonstraram que as ações fisiológicas do eixo GH-IGF-1 não está restrita 18
a peixes salmonídeos (Mancera e Mccormick, 1999). A expressão do IGF-1 no fígado aumenta 19
durante a “esmoltificação” do salmão e no sangue ocorre o aumento dos níveis de GH e IGF-1 20
(para revisão ver Sakamoto e McCormick, 2006).
21
TEMPERATURA E HORMÔNIO DO CRESCIMENTO EM PEIXES 22
Peixes são vertebrados ectotérmicos que habitam ambientes aquáticos os quais podem 23
apresentar variações de temperatura, salinidade, concentração de oxigênio, turbidez, entre 24
outros. A temperatura é um fator importante, pois afeta a distribuição biogeográfica destes 25
animais. Além disto, a flutuação diária e estacional de temperatura tem um importante 26
impacto fisiológico para as inúmeras espécies de peixes.
27
A fisiologia adaptativa à temperatura de peixes varia amplamente de espécie para 28
espécie. Porém, dentro do nível molecular de complexidade biológica, a termotolerância pode 29
4Anádramos são animais aquáticos que se reproduzem em água doce mas se desenvolvem até a fase adulta em água salgada.
INTRODUÇÃO GERAL
10 ser associada a uma família de proteínas denominadas Proteínas de Choque Térmico (Heat 1
Shock Proteins – HSP).
2
As HSPs foram, primeiramente, descobertas nas glândulas salivares das moscas 3
Drosophila melanogaster expostas a severos choques térmicos. Outros estudos demonstraram 4
que choques térmicos intermediários aumentaram a síntese de novas HSPs. Este aumento foi 5
associado com uma maior tolerância a altas temperaturas, as quais seriam normalmente letais.
6
Posteriormente, foi encontrado que não somente a tolerância à temperatura foi aumentada, 7
mas também a resistência a outros fatores como hipoxia, isquemia, inflamação e exposição a 8
toxinas celulares (Para revisão versão Snoeckx et al. 2001).
9
Em células não estressadas, as HSPs têm funções essenciais em vários aspectos do 10
metabolismo de proteínas (Morimoto, 1993). Portanto, a síntese de HSPs é considerada uma 11
potente rota fisiológica para a manutenção da homeostasia celular contra fatores externos 12
estressores. O aumento da demanda energética frente a uma situação de estresse é 13
ectotérmicos apresentam mecanismos fisiológicos adaptativos para enfrentar as variações 14
ambientais de temperatura, como alterações na viscosidade da membrana (Guschina e 15
Harwood, 2006). Tanto o calor como o frio podem alterar a composição lipídica das 16
membranas celulares (Hazel, 1979) e essa composição pode ser um fator importante na 17
determinação da expressão das HSPs. A alteração da fluidez da membrana correlacionada à 18
expressão das HSPs pode explicar os diferentes padrões de tolerância as diferentes 19
temperaturas.
20
Do ponto de vista evolutivo, as HSPs são uma família de proteínas celulares altamente 21
conservadas presentes em todos os animais analisados até hoje, incluindo peixes (Iwama et al.
22
1998). As principais famílias de HSPs são denominadas de acordo com seu peso molecular, 23
destacando-se as HSP90 (85-90 KDa), HSP70 (68-73 KDa) e HSPs de baixo peso molecular (16- 24
47 KDa).
25
As HSP90s são proteínas citoplasmáticas, as quais interagem com proteínas 26
desnaturadas para proteção de uma agregação ou degradação irreversível. Estas proteínas 27
agem como uma chaperona5, prevenindo interações que impeçam a estruturação final das 28
proteínas (Wiech et al. 1992). As HSP90s são também importantes na formação do complexo 29
dos receptores esteróides (Pratt, 2008). Enquanto a maioria das chaperonas são conhecidas 30
por se ligarem a proteínas recém sintetizadas impedindo a agregação e promovendo o 31
5 Chaperona: são proteínas que usam a energia da hidrólise de ATP para auxiliar no enovelamento correto das proteínas, para estas adquirirem sua conformação funcional.
INTRODUÇÃO GERAL
11 enovelamento correto em compartimento do citosol, a HSP90 intervém interagindo com as 1
proteínas na fase intermediária de enovelamento (Zhao e Houry, 2005). Além disso, em casos 2
de danos, elas atuam com outras proteínas de choque térmico para manter a integridade das 3
proteínas.
4
Em células eucarióticas, as HSP70s funcionam, principalmente, como chaperonas 5
moleculares. Membros constitutivos da família da HSP70, incluindo as unidades mitocondriais 6
(mtHSP70), nuclear/citoplasmáticas (HSC70) e do retículo endoplasmático (GRP78), estão 7
envolvidas em duas principais funções distintas em células não estressadas. Na primeira, as 8
HSPs agem na fase inicial da síntese de novas proteínas, reconhecendo uma pequena região de 9
aminoácidos hidrofóbicos na superfície das proteínas. Junto com um grupo de proteínas 10
HSP40, um monômero de HSP70 liga-se à proteína-alvo e hidrolisa uma molécula de ATP em 11
ADP, sofrendo alteração conformacional que faz com que a HSP70 se ligue fortemente à 12
proteína-alvo. Após a dissociação da HSP40, é induzida a dissociação da HSP70 pela religação 13
de ATP e da liberação de ADP. Os ciclos repetidos de ligação e liberação das HSPs auxiliam o 14
correto dobramento da proteína-alvo, como ilustrado nas figuras 3 e 4. A segunda função das 15
HSP70s é o carregamento de proteínas por translocação em diferentes compartimentos 16
celulares. Ambas as funções envolvem a interação de diferentes motivos de ligação com 17
interações hidrofóbicas não-específicas.
18
19
Figura 3 – Representação esquemática do mecanismo de ação das proteínas de choque térmico (HSPs). As proteínas
20
recém-sintetizadas ou mal dobradas são reconhecidas pelas HSPs, formando complexos. O reestabelecimento do
21
dobramento correto das proteínas usa ATP. Se as proteínas recém-sintetizadas ou mal dobradas não são
22
reconhecidas pelas HSPs, estas proteínas são capazes de formar agregados (Wilhelmus et al. 2007).
23
Dentre as HSPs de baixo peso molecular, as HSP47s são as proteínas de choque térmico 24
que interagem com moléculas de procolágeno durante seu dobramento, estruturação e 25
transporte do retículo endoplasmático. O fato de que a HSP47 seja a única proteína de 26
estresse induzida pelo choque térmico no retículo endoplasmático está associado com a 27
INTRODUÇÃO GERAL
12 prevenção do desdobramento do procolágeno, já que o colágeno maturo é instável em 1
temperatura superiores à temperatura corporal (Nagata, 2003).
2
A regulação transcricional da síntese de novas proteínas HSPs é modulada pela ligação 3
de fatores de transcrição (HSFs) em regiões específicas dos promotores de genes que 4
codificam para HSPs. Essas regiões são chamadas de elementos de resposta ao choque 5
térmico (HSE).
6
Quatro diferentes HSFs têm sido identificados em vertebrados: HSF1, HSF2, HSF3, e 7
HSF4 (Morimoto, 1998). Os HSFs apresentam um domínio de ligação ao DNA, o qual é o 8
responsável pela ligação da proteína com o HSE. Em peixes, o HSF1 responde ao choque 9
termal. Sob condições não-estressantes, o monômero HSF1 está associado a um complexo de 10
chaperonas (HSP70, HSP90 e HSP40) no citosol. Durante o estresse termal, as chaperonas se 11
dissociam do complexo e se ligam a proteínas desnoveladas. A dissociação do complexo libera 12
os monômeros HSFs, os quais se movem para o núcleo e se ligam aos HSEs. Homotrímeros de 13
HSF1 se ligam ao HSE e são fosforilados por proteínas quinases C ou outras serina/treonina 14
quinases, permitindo assim a transcrição de novas HSPs.
15 16
17
Figura 4– Ilustração do modelo regulatório de ativação transcricional da síntese de HSPs. Sob condição de
18
não estresse, monômeros dos fatores de choque térmico (HSF1) estão associados a um complexo de chaperonas,
19
como HSP740, 70 e 90. Durante situações de estresse térmico, as chaperonas se dissociam do complexo e se ligam a
20
proteínas desnoveladas. A dissociação do complexo libera os monômeros de HSF1, que migram para o núcleo,
21
formam trímeros e ligam-se aos elementos de resposta ao choque térmico (HSE). Modificado de Tomanek e
22
Somero, 2002.
23
INTRODUÇÃO GERAL
13 As HSPs apresentam um importante papel em resposta a uma ampla variedade de 1
estímulos, especialmente durante a exposição a estressores abióticos e bióticos (Iwama et al.
2
1998; Basu et al. 2002). Por exemplo, no peixe teleósteo marinho Sparus sarba a 3
administração exógena do GH diminuiu a expressão da HSP70, evidenciando uma possível 4
relação entre a presença do hormônio e a síntese de HSP70 (Deane et al., 1999; Deane e Woo, 5
2010). No entanto, pouco é conhecido sobre o mecanismo desta provável relação em peixes.
6
Uma possível explicação é que a transcrição dos genes que codificam para as HSPs pode 7
ser mediada pela via de sinalização JAK/STAT, a qual é a principal via de sinalização do GH.
8
Embora o mecanismo de indução dos genes hsps já esteja bem descrito na literatura e 9
demonstre o predominante envolvimento do HSF1, estudos tem mostrado que a indução de 10
genes da HSP90 e HSP70 pode ser mediada pela via de sinalização JAK/STAT, ativando 11
principalmente os fatores STAT1, STAT3 e NF-IL6. A interação destes fatores com o HSF1 forma 12
com complexo capaz de se ligar aos HSEs, nos promotores dos genes das HSPs (Stephanou et 13
al. 1999; Madamanchi et al. 2001).
14
OXIGÊNIO E HORMÔNIO DO CRESCIMENTO EM PEIXES 15
O oxigênio é um dos elementos mais importantes na manutenção da vida animal, sendo 16
essencial na respiração dos organismos aeróbicos. O contínuo suprimento de oxigênio é 17
fundamental, pois este é o aceptor final de elétrons na cadeia respiratória. Além disso, o 18
oxigênio molecular está envolvido em várias reações metabólicas.
19
A baixa concentração de oxigênio no ambiente (hipoxia) ou a ausência do mesmo 20
(anoxia) são fatores ambientais importantes que podem ser detectados pelos animais em dois 21
níveis diferentes: (i) em nível de indivíduo como um todo, com respostas na escala de sistema 22
de órgãos, como o aumento da ventilação para impedir a queda da pressão parcial de O2 no 23
sangue e; (ii) em nível intracelular, nas quais respostas são desencadeadas se a taxa de 24
fornecimento de O2 pelos sistemas circulatório e respiratório estiver desemparelhada com a 25
taxa de consumo de O2 na célula.
26
A disponibilidade de oxigênio em ambientes aquáticos é um fator limitante e a 27
exposição à hipoxia, em peixes, pode promover a ativação do metabolismo anaeróbico, 28
produzindo ATP a partir do glicogênio e fosfocreatina. Enzimas envolvidas neste processo são 29
induzidas pela hipoxia, como a lactato desidrogenase (Wenger, 2000; Almeida-Val et al. 2011).
30
A homeostase de oxigênio é coordenada molecularmente por diferentes vias, dentre 31
elas está aquela regulada pelo fator induzido pela hipoxia (HIF-1, do inglês hypoxia-inducible 32
factor 1) (Firth et al. 1994; Maxwell, 2005).
33
INTRODUÇÃO GERAL
14 O fator HIF é ativado em baixas concentrações de oxigênio e coordena alterações na 1
transcrição, a qual promove mudanças adaptativas, incluindo o aumento da eritropoiese, 2
glicólise e angiogênese. O HIF é um complexo proteico heterodimérico, com uma subunidade α 3
e uma subunidade β (Wang et al. 1995). A regulação pelo oxigênio é através da subunidade α.
4
O HIFα sofre três tipos de modificações enzimáticas pós-traducionais, as quais promovem a 5
base do sistema de regulação medido pelo oxigênio: i) por hidroxilação através da ação da 6
enzima asparaginil hidroxilase, a qual previne o recrutamento do HIFα; ii) por hidroxilação 7
através da enzima prolil hidroxilase, a qual permite a ligação da ubiquitina; e iii) por 8
ubiquitinação por um complexo de ubiquitina específico.
9
10
Figura 5 – Representação esquemática da sinalização molecular induzida por hipoxia. Em normoxia, o fator induzido
11
por hipoxia (HIF-α) é hidroxilado pela enzima prolil hidroxilase (PHD), a qual é sensível ao oxigênio e é direcionado
12
para a rápida degradação proteassomal por um complexo proteico denominado ubiquitina ligase E3. Em condição
13
de hipoxia, ocorre a inibição da hidroxilação do HIF-α pela inibição do fator de inibição do HIF (FIH), este então é
14
estabilizado e translocado para o núcleo onde se une a subunidade HIF-β para forma um fator transcricional ativo, e
15
assim se ligar aos elementos de resposta à hipoxia (HRE) e iniciar a transcrição de genes alvos.
16
Sob condições de normoxia, o HIF-α é hidroxilado em qualquer um dos seus dois 17
resíduos prolil, e é direcionado para a rápida degradação proteassomal por um complexo 18
proteico denominado ubiquitina ligase E3. Adicionalmente, o HIF-α é hidroxilado no resíduo de 19
asparagina pelo fator de inibição do HIF (FIH). Em condição de hipoxia (Fig. 5), o HIF-α é 20
estabilizado e translocado para o núcleo onde se une ao HIF-β para forma um fator 21
transcricional ativo, e assim se ligar aos elementos de resposta à hipoxia (HRE) e iniciar a 22
transcrição de genes alvos (Kiriakidis et al. 2007).
23
INTRODUÇÃO GERAL
15 Os danos causados pela exposição a baixos níveis de oxigênio podem ser prevenidos.
1
Estudos com ratos tem mostrado que a administração de GH pode prevenir o dano causado 2
pela hipoxia/isquemia inibindo a morte neuronal (Scheepens et al. 2001), além de apresentar 3
efeitos anti-apoptóticos (Shin et al. 2004). Esses estudos sugerem a aplicação de GH no 4
tratamento de patologias neonatais promovida por hipoxia. No entanto, em peixes, estudos 5
relacionando GH e hipoxia investigam, principalmente, o efeito da transgênese para o GH 6
sobre características fisiológicas, as quais podem contribuir para melhorar a capacidade destes 7
animais em ocupar novos ambientes.
8
O efeito da superexpressão do GH sobre a tolerância a hipoxia foi analisado em tilápias 9
(Oreochromis sp.) transgênicas para o GH e revelou que os peixes transgênicos desenvolvem 10
mecanismos para compensar sua maior demanda metabólica e assim mantêm a capacidade de 11
tolerância a baixos níveis de oxigênio (McKenzie et al. 2003). No entanto, associado a maior 12
taxa de crescimento, o salmão transgênico para o GH (Salmo salar) apresentou um maior 13
consumo de oxigênio e um limite crítico de concentração de oxigênio menor que os peixes 14
controles (Stevens et al. 1998).
15
METABOLISMO ENERGÉTICO E HORMÔNIO DO CRESCIMENTO EM PEIXES 16
Já está bem descrito que peixes transgênicos para o GH têm elevada demanda 17
metabólica (Stevens et al. 1998, Deitchet et al. 2006) e este aumento pode ser considerado um 18
efeito colateral da transgenia. Para prover a energia necessária imposta pelo crescimento 19
acelerado, os peixes transgênicos para o GH devem alterar as vias metabólicas de obtenção de 20
energia (Leggatt et al. 2009). Em salmão transgênico para o GH (Oncorhynchus kisutch) ocorre 21
um aumento da atividade de enzimas da via glicolítica (Blier et al. 2002; Leggatt et al. 2009; Hill 22
et al. 2000). Da mesma forma, a atividade das enzimas da via glicolítica foi aumentada no 23
salmão transgênico (Salmo salar), indicando uma maior taxa metabólica nestes animais 24
(Levesque et al. 2008). Consequentemente, o rápido crescimento promovido pela transgenia 25
está associado com a maior demanda por oxigênio.
26
A produção de energia para as células animais ocorre a partir de moléculas de 27
alimento para sintetizar ATP, seguindo a equação: ADP + Pi + energia das moléculas de 28
alimento → ATP, onde ADP é difosfato de adenosina e Pi é o íon fosfato inorgânico (HPO42-
). A 29
síntese de ATP pode ser realizada basicamente por duas categorias de vias bioquímicas, as 30
aeróbicas que requerem O2, e as anaeróbicas que funcionam sem O2. 31
O metabolismo aeróbico é ocorre basicamente pela oxidação completa de moléculas 32
de alimento até a produção de CO2 e H2O e captura de energia a partir das ligações do ATP. As 33
INTRODUÇÃO GERAL
16 reações principais que compreendem este metabolismo são a glicólise, ciclo de Krebs, a cadeia 1
de transporte de elétrons e a fosforilação oxidativa.
2
Resumidamente, a glicólise é uma série de reações enzimáticas, nas quais a glicose (ou 3
glicogênio) é convertida em acido pirúvico. O ácido pirúvico, então é oxidado nas mitocôndrias 4
por uma série cíclica de reações, chamada de Ciclo de Krebs (ou ciclo do ácido cítrico). As 5
reações do Ciclo de Krebs são enzimaticamente catalizadas (Figura 6). Dentre as enzimas que 6
catalizam as reações do Ciclo de Krebs está a citrato sintase.
7
8
Figura 6 – As principais reações do ácido cítrico (ciclo de Krebs). Baseado em Nelson e Cox, 2012.
9 10
A citrato sintase cataliza a reação de condensação de um resíduo de acetato, contendo 11
dois carbonos, de uma molécula de acetil coenzima A com uma molécula de oxaloacetato, 12
contendo quatro carbonos, para formar um citrato de seis carbonos. O suprimento adequado 13
de oxigênio é o motor indireto do Ciclo de Krebs, pois mesmo ele não participando 14
diretamente do ciclo ele é essencial na disposição das coenzimas reduzidas NADH2 e FADH2. 15
Quando ocorre a deficiência no suprimento de O2, os elétrons que entram na cadeia de 16
transporte de elétrons não podem ser descarregados no final pela redução do O2, assim, na 17
maioria dos animais, todos os citocromos e todos os constituintes da cadeia de transporte de 18
elétrons tornam-se completamente reduzidos. Consequentemente, a fosforilação oxidativa 19
não pode ocorrer e a cadeia transportadora de elétrons não pode mais servir como um 20
mecanismo de reoxidação das coenzimas reduzidas NADH2 e FADH2, que são produzidas pela 21
glicólise e pelo Ciclo de Krebs.
22
Apenas alguns tecidos animais são capazes de produzir ATP na ausência ou em baixas 23
taxas de O2. A glicólise anaeróbica é a principal rota catabólica, na qual as moléculas de NADH2
24
INTRODUÇÃO GERAL
17 são reoxidadas em NAD, passando seus elétrons (hidrogênios) para o ácido pirúvico, o qual é 1
reduzido em ácido láctico (Figura 7). A capacidade de realizar glicólise anaeróbica é 2
determinada basicamente pela taxa de expressão da enzima lactato desidrogenase (LDH). A 3
LDH é a enzima que reduz o ácido pirúvico em ácido láctico. A grandes concentrações de 4
lactato, a enzima exibe inibição por feedback e a taxa de conversão do piruvato a lactato é 5
reduzida.
6
7
Figura 7 – Glicólise anaeróbica. O ácido pirúvico é reduzido por ação catalítica da enzima lactato desidrogenase
8
(LDH) e permite a produção de adenosina trifosfato (ATP) na ausência de oxigênio. Baseado em Nelson e Cox, 2012.
9 10
MODELO DE ESTUDO 11
O paulistinha Danio rerio (Hamilton,1822) é um peixe da família Cyprinidae, da ordem 12
Cypriniformes. Este peixe é conhecido mundialmente como zebrafish, devido a presença de 13
listras escuras ao longo do corpo. É uma espécie bentopelágica que pode ser encontrada em 14
uma ampla variedade de habitats de água doce e tem sido considerada como um sistema 15
modelo para estudos do desenvolvimento, toxicologia e de transgenia. Dentro das vantagens 16
desta espécie, podem-se destacar os baixos custos de manutenção, pequeno espaço 17
necessário, rápido ciclo de gerações, grande número de descendentes, estágios de 18
desenvolvimento bem caracterizados, e ovos com córion relativamente fino e translúcido, 19
adequados para os procedimentos de microinjeção e manipulação genética.
20
O modelo utilizado neste estudo foi o zebrafish transgênico para o gene do GH da 21
linhagem F0104. Essa linhagem carrega o transgene pc A-prGH constituído pelo promotor da 22
-actina da carpa (Cyprinus carpio), associado ao cDNA do GH do peixe-rei marinho 23
(Odonthestes argentinensis), o qual mostrou-se eficiente para induzir a via de sinalização 24
INTRODUÇÃO GERAL
18 intracelular do GH a níveis elevados em embriões de tilápia (Marins et al. 2002). Para a 1
identificação dos indivíduos transgênicos, foi co-injetado o transgene pc A-GFP, o qual é 2
constituído do promotor da -actina da carpa (Cyprinus carpio), associado ao gene da proteína 3
verde fluorescente (GFP) da medusa Aequorea victoria. A co-injeção deste transgene permite a 4
visualização, em microscópio de fluorescência, da expressão exógena da GFP permitindo a 5
identificação in vivo dos indivíduos que carregam o transgene para o gene do GH exógeno 6
(Figueiredo et al. 2007).
7
Esta linhagem apresentou resultados diferentes entre indivíduos hemizigotos (HE) e 8
homozigotos (HO), tendo os hemizigotos apresentado taxas de crescimento superiores aos 9
controles não-transgênicos. Já os animais transgênicos homozigotos, mostraram taxa de 10
crescimento semelhantes aos observados para os animais controles não-transgênicos em 11
condições de alimentação controlada (Figueiredo et al. 2007b). Rosa et al. 2008 observaram 12
que houve um aumento na geração de espécies reativas de oxigênio nos animais HO da 13
linhagem F0104, provavelmente relacionado ao efeito anabólico do GH, e como consequência 14
do aumento do consumo de oxigênio e da taxa metabólica destes indivíduos.
15
16
Figura 8. Peixes zebrafish (Danio rerio) transgênicos para o hormônio do crescimento (GH) e a proteína verde
17
fluorescente (GFP) (A) e não-transgênicos (B) expostos à luz natural. Peixes transgênicos (C) e não-transgênicos (D)
18
exposto à luz ultravioleta, onde se observa expressão da GFP somente nos animais transgênicos (C).
19
OBJETIVO GERAL
19 OBJETIVO GERAL
1
O principal objetivo deste estudo foi analisar os efeitos da superexpressão constitutiva 2
do gene do hormônio do crescimento (GH) sobre a tolerância a diferentes estressores 3
abióticos, em um modelo de peixe (Danio rerio) transgênico para o GH.
4 5
Objetivos específicos 6
Fator abiótico: Salinidade 7
Analisar a influência da salinidade na taxa de crescimento de zebrafish não- 8
transgênicos;
9
Determinar a salinidade letal média (SLM) para o zebrafish adultos;
10
Determinar a tolerância de zebrafish transgênicos adultos da linhagem F0104 à SLM;
11
Analisar o efeito da salinidade na expressão de genes relacionados com a 12
osmorregulação, eixo somatotrópico e metabolismo energético em não-transgênicos e 13
transgênicos adultos;
14
Analisar o efeito da salinidade na atividade da Na+,K+-ATPase, na concentração de 15
sódio corporal e conteúdo de ATP na brânquias, em não-transgênicos e transgênicos 16
adultos;
17 18
Fator abiótico: Temperatura 19
Determinar se a superexpressão do hormônio do crescimento (GH) modifica a 20
capacidade de tolerância de adultos e juvenis de zebrafish não-transgênicos e 21
transgênicos à baixa (13oC) e a alta (39oC) temperaturas;
22
Analisar a expressão de genes que codificam para as principais proteínas de choque 23
térmicos em adultos e juvenis de zebrafish não-transgênicos e transgênicos, em 24
diferentes temperaturas;
25
Analisar a expressão de genes que codificam para as principais proteínas do eixo 26
somatotrópico em adultos e juvenis de zebrafish não-transgênicos e transgênicos, em 27
diferentes temperaturas;
28 29 30
OBJETIVO GERAL
20 Fator abiótico: Oxigênio
1
Avaliar se a superexpressão do GH causada pela transgenia pode promover um efeito 2
protetor a baixos níveis de concentração de oxigênio;
3
Determinar a tolerância de juvenis de zebrafish não-transgênicos e transgênicos à 4
hipoxia;
5
Determinar a expressão dos principais genes envolvidos na tolerância à hipoxia em 6
juvenis de zebrafish não-transgênicos e transgênicos;
7
Determinar a taxa de consumo de oxigênio de juvenis de zebrafish não-transgênicos e 8
transgênicos;
9
Analisar a atividade de enzimas lactato desidrogenase, citrato sintase e conteúdo de 10
lactato de juvenis de zebrafish não-transgênicos e transgênicos;
11 12 13
ARTIGO 1
21
ARTIGO 1 1
2
Título: GROWTH HORMONE TRANSGENESIS AFFECTS OSMOREGULATION AND ENERGY 3
METABOLISM IN ZEBRAFISH (Danio rerio) 4
5
Autores: Daniela Volcan Almeida, Camila de Martinez Gaspar Martins, Márcio de 6
Azevedo Figueiredo, Carlos Frederico Ceccon Lanes, Adalto Bianchini e Luis Fernando Marins 7
8
Artigo publicado na revista Transgenic Research 9
DOI: 10.1007/s11248-12-9627-x 10
11
Reprodução da publicação autorizada pela editora Springer 12
Número da Licença 3075910994027 13
14
O R I G I N A L P A P E R
Growth hormone transgenesis affects osmoregulation and energy metabolism in zebrafish (Danio rerio)
Daniela Volcan Almeida• Camila de Martinez Gaspar Martins• Ma´rcio de Azevedo Figueiredo•Carlos Frederico Ceccon Lanes• Adalto Bianchini•Luis Fernando Marins
Received: 11 January 2012 / Accepted: 1 June 2012 / Published online: 19 June 2012 ÓSpringer Science+Business Media B.V. 2012
Abstract Growth hormone (GH) transgenic fish are at a critical step for possible approval for commer- cialization. Since this hormone is related to salinity tolerance in fish, our main goal was to verify whether the osmoregulatory capacity of the stenohaline zebra- fish (Danio rerio) would be modified by GH-trans- genesis. For this, we transferred GH-transgenic zebrafish (T) from freshwater to 11 ppt salinity and analyzed survival as well as relative changes in gene expression. Results show an increased mortality in T versus non-transgenic (NT) fish, suggesting an impaired mechanism of osmotic acclimation in T.
The salinity effect on expression of genes related to osmoregulation, the somatotropic axis and energy metabolism was evaluated in gills and liver of T and NT. Genes coding for Na?, K?-ATPase, H?-ATPase,
plasma carbonic anhydrase and cytosolic carbonic anhydrase were up-regulated in gills of transgenics in freshwater. The growth hormone receptor gene was down-regulated in gills and liver of both NT and T exposed to 11 ppt salinity, while insulin-like growth factor-1 was down-regulated in liver of NT and in gills of T exposed to 11 ppt salinity. In transgenics, all osmoregulation-related genes and the citrate synthase gene were down-regulated in gills of fish exposed to 11 ppt salinity, while lactate dehydrogenase expres- sion was up-regulated in liver. Na?, K?-ATPase activity was higher in gills of T exposed to 11 ppt salinity as well as the whole body content of Na?. Increased ATP content was observed in gills of both NT and T exposed to 11 ppt salinity, being statistically higher in T than NT. Taking altogether, these findings support the hypothesis that GH-transgenesis increases Na?import capacity and energetic demand, promot- ing an unfavorable osmotic and energetic physiolog- ical status and making this transgenic fish intolerant of hyperosmotic environments.
Keywords Energy metabolismGene expression Growth hormoneSomatrotopic axisSalinity Transgenic zebrafish
Introduction
Advances in biotechnological methods, especially fish transgenesis, are potentially important for increasing D. V. AlmeidaC. de Martinez Gaspar Martins
A. BianchiniL. F. Marins (&)
Programa de Po´s Graduac¸a˜o em Cieˆncias Fisiolo´gicas:
Fisiologia Animal Comparada, Instituto de Cieˆncias Biolo´gicas, Universidade Federal do Rio Grande, FURG, Rio Grande, Av. Ita´lia, Km 8, Rio Grande, RS 96201-900, Brazil
e-mail: lfmarins@pq.cnpq.br
M. de Azevedo FigueiredoL. F. Marins
Programa de Po´s-Graduac¸a˜o em Aquicultura, Instituto de Oceanografia, Universidade Federal do Rio Grande, FURG, Rio Grande, RS, Brazil
C. F. C. Lanes
Norway Faculty of Biosciences and Aquaculture, University of Nordland, Bodø, Norway
123
Transgenic Res (2013) 22:75–88 DOI 10.1007/s11248-012-9627-x
