Diagnóstico ambiental da Lagoa da Conceição utilizando o berbigão Anomalocardia brasiliana (Gmelin, 1791) como bioindicador de poluição aquática

“Eu não lhe dei, Adão, nem um lugar predeterminado,

nem um aspecto particular, nem quaisquer

prerrogativas, a fim de que você possa tomá-los e

possuí-los através de sua própria escolha e de sua

própria decisão”.

“Se a prudência consiste no uso comedido das coisas, eu desejaria saber qual dos dois merece mais ser honrado com o título de prudente: O sábio, que parte por modéstia, parte por medo, nada realiza, ou o louco, que nem o pudor (pois não o conhece) nem o perigo (porque não o vê) podem demover de qualquer empreendimento. O sábio absorve-se no estudo dos autores antigos; mas que proveito tira ele dessa constante leitura? Raros conceitos espirituosos, alguns pensamentos requintados, algumas simples puerilidades – eis o fruto de sua fadiga. O louco, ao contrário, tomando a iniciativa de tudo, arrostando todos os perigos, parece-me alcançar a verdadeira prudência”

Erasmo Thomas More.

I - Introdução

Dentro da visão de mundo moderno, o Homem parece extrapolar os limites de tolerância quanto aos recursos disponíveis para saciar sua tremenda sede de tecnologia e conforto, submetendo toda uma estrutura natural, a um grande golpe de transformação brusca em sua matriz de existência e seu funcionamento. Neste processo avassalador, o Homem parece esquecer de que o planeta possui limites e que deve inserir-se na natureza como parte dela, e não somente como ser capaz da transformação de seus processos. São cada vez maiores as atrocidades ambientais cometidas com os rios, lagos, florestas, lagunas, oceanos e tantos outros ecossistemas, e cada vez maior o desrespeito do homem frente à importância dos ecossistemas do planeta, mesmo quando estes são devidamente estudados e explorados com o objetivo de obter subsídios para seu entendimento e diagnóstico. É extremamente desconfortável a visão do mundo que constrói-se frente a este modelo tecnozóico, submetendo qualquer ecossistema à mercê do bem estar e conforto do homem.

Os ecossistemas costeiros aparecem no contexto global sob uma forte pressão tecnozóica que atravessa décadas de destruição e contaminação e, talvez, o século XXI irá assistir ao maior de seus impactos devastadores, a fragilização, extinção e provável destruição destes ecossistemas. O crescente desenvolvimento na zona costeira, alavancada pela expectativa de melhor qualidade de vida, abriga em sua calda, uma dezena de milhares de produtos químicos, orgânicos e inorgânicos, tais como bifenilas policloradas, 2,3,7,8-dibenzotetracloro-p-dioxim (TCDD) e afins, dioxinas de hidrocarbonetos policíclicos aromáticos (PHAs), famílias FURAN, além de uma série de solventes orgânicos, metais-traço, tensoativos, pesticidas, além da sua própria devastação física. Várias evidências mostram que substâncias como metais-traço e substâncias orgânicas (DI GIULIO, 1995; BARRY, 1998; CANOVA et al., 1998) causam danos através da formação de radicais livres de oxigênio (RLO) (WINSTON, 1991), podendo ocasionar peroxidação lipídica e conduzir a processos patológicos diversos (PRAKASH, 1995; SOLE et al., 1996; VIARENGO et al., 1996; COSSU et al., 1997; DOYOTTE et. al, 1997; WALSH & O`HALLORAN, 1997, TORRES et al., 2002; SHULKIN et al., 2003; KIM et al., 2003; KAHLE & ZAUKE, 2003; BAGCHI et al., 2003).

Em particular, as lagunas costeiras vêm sofrendo diversos tipos de ações antrópicas como as especulações imobiliárias, transformando estes ecossistemas, que são verdadeiros santuários para várias espécies de invertebrados, além de peixes e aves, modificando, acima de tudo, a sua dinâmica natural. Este comportamento puramente tecnozóico vem trazendo uma série de conseqüências negativas a estes ecossistemas, que estão presentes em grande parte do território brasileiro e, particularmente, aqui no estado de Santa Catarina.

As lagunas costeiras representam importantes ambientes ecológicos e econômicos, principalmente como provedores de proteína, sob forma de peixes, e crustáceos (PANITZ, 1997) Os ambientes lagunares costeiros estão também associados ao contexto de berçário, por se tratar de um ambiente transicional de desova e desenvolvimento na fase juvenil para muitas espécies de invertebrados e vertebrados, e sofrem ameaças devido à deposição de um grande número de

poluentes inorgânicos, metais-traço e produtos orgânicos variados no sedimento, oriundos das indústrias e de ocupações urbanas, verdadeiros tensores antrópicos (LACERDA et al., 1988; MASUTTI, 1999).

Lagunas costeiras contribuem também para a ecologia da paisagem, pois, em geral, apresentam geomorfologia singular, exibindo beleza e tornando-a profundamente poética. No entanto, a combinação entre seres humanos e estes ambientes costeiros, têm freqüentemente sido negativa, resultando em grandes alterações na dinâmica natural, comprometendo a saúde do ecossistema por inteiro. Por apresentarem relativa tranqüilidade, são alvos de turistas que, principalmente nos períodos de temporada, aproveitam para executar os mais diversos tipos de atividades náuticas.

A Lagoa da Conceição, na verdade uma laguna costeira, situada na ilha de Santa Catarina, tem sido alvo nos últimos anos de uma grande especulação imobiliária que provoca um declínio acelerado no estado natural da Laguna, o que pode ser observado através de simples contraste visual. Estes desvios ambientais são conseqüências da ação antrópica provocada pelo desenvolvimento acelerado e desordenado, decorrente do processo de expansão urbana que o município de Florianópolis vem sofrendo nos últimos anos (ABES, 2000). No contexto de expansão urbana, a Lagoa da Conceição vem apresentando indicadores de degradação ambientais, intimamente relacionados com lançamentos de efluentes domésticos e metais-traço, processo erosivo do solo, com conseqüente assoreamento da Lagoa, que aumentam cada vez mais sua contribuição clástica, por ocupação desordenada do solo, comprometendo os corpos hídricos de toda a bacia hidrogáfica (MASUTTI, 1999).

Este quadro atual sugere estudos com organismos aquáticos, através de uma avaliação visando um diagnóstico ambiental, baseado em estudos bioquímicos. Os parâmetros bioquímicos recebem grande importância na toxicologia aquática através de estudos básicos dos processos fundamentais. Além de fornecerem uma sólida fundamentação teórica de conflitos ambientais na área em questão, os biomarcadores são utilizados em medições de índices sensitivos, ou sinais, que indicam indiretamente a degradação do ecossistema, causada por diferentes contaminantes. Mesmo não fornecendo diretamente informações sobre os efeitos dos poluentes, eles podem mostrar uma forte indicação de impacto biológico, auxiliando de uma forma mais preventiva e antes que

alterações fisiológicas e morfológicas mais acentuadas tenham ocorrido, permitindo uma avaliação antecipada do estado do ambiente estudado.

Os estudos congêneres existentes baseiam-se em medições dos sistemas de enzimas que metabolizam ou biotransformam uma série de contaminantes, respostas protetivas e tóxicas associadas com RLO; proteínas que têm importante papel na regulação de metais-traço, como a metalotioneína; um grupo de proteínas induzido por estressores ambientais como as chamadas proteínas estressoras, entre outros (RAND, 1995).

Dentre os organismos utilizados como bioindicadores de poluição, os moluscos bivalves ganham cada vez maior aceitação neste cenário, uma vez que podem modificar, entre outras respostas, suas defesas antioxidantes (DA) associadas com a geração de RLO, quando expostos a contaminantes (LIVINGSTONE, 2001; TORRES et al., 2002). A partir da década de 80, vários estudos surgiram envolvendo a participação de agentes contaminantes relacionados com a geração de RLO e suas conseqüências patológicas nos seres vivos. Desde o descobrimento da importância das reações oxidativas nos processos biológicos normais e nos mecanismos de toxicidade de uma série de compostos exógenos, isto é, xenobióticos, vem ocorrendo uma explosão de pesquisas dentro dos processos pró oxidantes e antioxidantes (HALLIWELL & GUTTERIDGE, 1999). O mais recente interesse tem consistido em evidenciar a produção de RLO estimulada por contaminantes, resultando em danos oxidativos, como um mecanismo de toxicidade em organismos aquáticos expostos à poluição (LIVINSGSTONE, 2001).

Os moluscos possuem uma capacidade bioacumulativa relacionada à sua condição de filtradores de alimento, e outras particularidades, como ampla distribuição geográfica e abundância, hábito séssil, resistência fisiológica, que os tornam ideais para este tipo de estudo (GOLBERG, 1975). Moluscos podem acumular metais-traço e outros xenobióticos em concentrações diretamente proporcionais ao seu desenvolvimento e às encontradas no sedimento adjacente, sendo o órgão digestor o local de metabolização e de principal acumulação destes xenobióticos (PHILLIPS & RAINBOW, 1989; RAINBOW, 1990; WILHELM FILHO et al., 2001a).

II – Objetivos

II.1 – Objetivos gerais

1 – Verificar o efeito da poluição aquática na Laguna da Conceição no período de verão/outono, por meio de defesas antioxidantes e outros biomarcadores de estresse oxidativo no orgasnismo Anomalocardia brasiliana, o berbigão.

2 - Identificar a concentração de metais-traço contidas no órgão digestor do berbigão no período de verão/outono.

3 - Avaliar o estado físico-químico e microbiológico da água nos sítios amostrais no momento da coleta dos organismos.

II.2 – Objetivos específicos

1 – Determinar as concentrações dos elementos-traço Cd, Cr, Pb, Ni e Zn em organismo berbigão em diferentes sítios da Laguna da Conceição e Pontal da Daniela, procurando contribuir para um melhor entendimento quanto a qualidade do ambiente lagunar.

2 – Diagnosticar indiretamente as condições ambientais da Laguna da Conceição, por meio de marcador biológico para estresse oxidativo no órgão digestor do Anomalocardia brasiliana.

3 - Verificar e comparar o grau de estresse oxidativo dos berbigões nos sítios da Lagoa da Conceição e no Pontal da Daniela (Sítio referência).

4 – Avaliar a possibilidade de utilizar o Anomalocardia brasiliana, o berbigão, como bioindicador de poluição aquática.

III - Revisão Bibliográfica III . 1 – Os ecossistemas costeiros

Os ecossistemas costeiros são ambientes que apresentam uma grande fragilidade, e, além de serem sensíveis, são muito vulneráveis, uma vez que possuem tendência a sofrer mudanças consideráveis sob efeito de ação antrópica (GARCIA, 1999; MASUTTI, 1999). Esta fragilidade tem sido observada principalmente nas últimas décadas, gerando um esforço global no sentido de políticas para estabelecer um Gerenciamento Costeiro, objetivando alternativas de um desenvolvimento sustentável para as populações da zona costeira, com benefício para gerações presentes e futuros.

Sabe-se que populações tradicionais que vivem da pesca e aquelas que de alguma forma utilizam os ecossistemas que recebem efluentes domésticos e outras formas de poluição, geralmente estão mais expostas aos riscos de toxicidade envolvida (GARCIA, 1999). Estes riscos tornam-se ainda maiores quando os ecossistemas não possuem uma forte hidrodinâmica, como é o caso da Laguna da Conceição, não permitindo uma renovação constante de suas águas, proporcionando o acúmulo de substâncias tóxicas nos compartimentos bióticos e abióticos do ecossistema inteiro (GARCIA, 1999). Isolada parcialmente do oceano por uma barreira arenosa múltipla apoiada no embasamento cristalino, contruída pela dinâmica costeira durante importantes eventos do mar do Quaternário, encontra-se hoje bastante ameaçada por um complexo de ações antrópicas negativas. Destacam-se ocupações desordenadas, a grande emissão de efluentes domésticos, desmatamentos em sua área de entorno, assoreamento acelerado, e a falta de um planejamento governamental que se adeqüe na manutenção da saúde do ecossistema como um todo (CARUZO GOMES JR., 1987).

III.2 - Biomarcadores de estresse oxidativo

Os marcadores biológicos ou biomarcadores, são utilizados para rastrear redes de contaminantes ou determinar as conseqüências da exposição, detectando os níveis iniciais e intermediários de processos patológicos, identificando os indivíduos sensíveis de uma população, de modo a intervir tanto, ao nível individual como ao nível ambiental (RAND, 1995). Os biomarcadores são capazes de marcar doses biológicas efetivas através de suas atividades enzimáticas, ácidos nucleicos e proteínas. Monitora-se o dano causado por agentes tóxicos monitorando-se doses de substâncias produzidas durante a entrada de um xenobiótico, que, ao se introduzir no organismo, produz diversos tipos de anomalias. Pode-se determinar indiretamente estas anomalias utilizando-se técnicas espectrofotométricas, que monitoram biomarcadores de estresse oxidativo como a catalase, superóxido dismutase, glutationa S-transferase, substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico, glutationa reduzida, glutationa peroxidase e glutationa redutase, e que podem indicar danos precoces aos organismos (WILHELM FILHO et al., 2001a,b). Organismos bivalves estão sujeitos à ação de RLO decorrentes da atividade aeróbica (WILHELM FILHO et al., 2001a), e também devido à exposição crônica em ambientes poluídos por agentes xenobiontes orgânicos e metais-traço (WILHELM FILHO et al., 2001b; TORRES et al., 2002).

Estima-se que 98% do oxigênio consumido por organismos aeróbicos seja reduzido da forma tetravalente até H2O (CHANCE et al., 1979), por meio da ação do citocromo c

oxidase mitocondrial, sem a simultaneidade de geração de RLO, permitindo que a principal via de transferência de elétrons e energia para a síntese da ATP participe apenas parcialmente da citotoxidade decorrente destas formas deletérias (FRIDOVICH, 1979). Entretanto, o principal sítio de formação do ânion superóxido (O2•−) radicalar, uma forma

intermediária, originada principalmente através da redução parcial do oxigênio durante os processos de oxidação metabólica (CHANCE et al., 1979), localiza-se na cadeia respiratória mitocondrial (BOVERIS & CHANCE, 1973), o que corresponde à cerca de 2% do oxigênio consumido (CHANCE et al., 1979; BOVERIS & CADENAS, 1982). Dentre

eles está o peróxido de hidrogênio (H2O2) que, a rigor, não pode

ser considerado como RLO, por não possuir elétrons não pareados. No entanto, o peróxido de hidrogênio, possui uma atividade oxidante, e sua capacidade de difusão o classifica como espécie reativa de oxigênio (HALLIWEL & GUTTERIDGE, 1999). Origina-se essencialmente nas mitocôndrias (20 a 35%) sendo que as mitocôndrias encontram-se em todas as células aeróbicas de organismos multicelulares, sendo portanto, fisiologicamente a fonte mais importante de peróxido de hidrogênio nos organismos (CHANCE et al, 1979).

Postulada por HABER-WEISS em 1934, a produção de radical hidroxil (•OH) intracelular a partir da reação entre o radical O2• − e o peróxido de hidrogênio (H2O2), ou

através da simples mistura de peróxido de hidrogênio com metais de transição como Fe e Cu (reação descrita por Fenton em 1894), possui grande significado biológico (Fig.1), devido à sua alta reatividade e nocividade (PRYOR, 1986; FRIDOVICH, 1986; YAMAZAKI, 1993; HALLIWELL & GUTTERIDGE, 1999). Apesar de concentrações intracelulares extremamente baixas, cerca de 10-18 M, e seu curtíssimo tempo de meia vida, em torno de 10-9s, o radical •OH possui uma grande reatividade que confere uma alta toxicidade aos organismos, sendo que as proteções enzimáticas correspondentes às moléculas geradoras de O2•− e de H2O2 ultrapassam várias vezes as concentrações

intracelulares estimadas para seu substrato (CHANCE et al., 1979). Desta forma, organismos aeróbicos necessitam adaptar-se à presença de RLO provenientes do próprio oxigênio presente na atmosfera, pois o gradativo aumento da pressão parcial do oxigênio na atmosfera terrestre há cerca de 3 bilhões de anos, deu início à ação deletéria causadas por espécies reativas sobre os organismos aeróbicos (GILBERT, 1995). Os efeitos dos RLO sobre as estruturas biológicas são processos contínuos (GERSHMAN et al., 1954) estando presentes mesmo em condições de normóxia em organismos aeróbios sadios e dotados de diferentes e especificas defesas antioxidantes (HALLIWELL & GUTTERIDGE, 1999).

Foi a partir da década de 80 que vários estudos surgiram envolvendo a participação de agentes poluidores orgânicos relacionados com a geração de RLO e suas conseqüências patológicas, onde se destacam os trabalhos realizados em peixes dulceaqüícolas

(GABRIELAK & KLEKOT, 1985; MATKOVICS et al., 1987; RADI & MATKOVICS, 1988; MALINS et al., 1988; WASHBURN & DI GIULIO, 1988; VIG & NEMCSOK, 1989; ROCHE & BOGÉ, 1993; LEMAIRE et al., 1993, 1994; WILHELM FILHO et al 2001b). Mais rencentemente, buscou-se evidenciar a produção de RLO, estimulada por contaminantes, resultando em danos oxidativos, como um mecanismo de toxidade em organismos aquáticos expostos à poluição (LIVINGSTONE, 2001). O dano celular associado ao extresse oxidativo pode ser induzido em organismos expostos a diferentes classes de substâncias químicas estranhas (xenobióticos), sejam elas orgânicas ou inorgânicas, conforme tem sido constatado por vários modelos experimentais (MITCHELL & JOLLOWS, 1975; SLATER, 1978; THURMAN et al., 1986; VAZ et al., 1989; VIDELA & GUERRI, 1990; DE GROOT et al., 1991; COMPORTI, 1989; WILHELM FILHO et al., 2001a,b; TORRES et al.,2002). Os xenobióticos podem ser de origem naturais ou produzidos pelo próprio homem (SIPES & GANDOLFI, 1991). A exposição constante dos organismos em seu ambiente, a um número crescente de xenobióticos, constitui atualmente uma das principais causas do estabelecimento de vários processos mutagênicos e carcinogênicos (DI GIULIO et al., 1989). Estima-se que diariamente são lançadas no mercado mundial centenas de substâncias sintéticas novas das mais variadas funções, desde medicamentos, corantes, conservantes, defensivos agrícolas, tintas, etc. Nos últimos 10 anos, a soma de novos compostos introduzidos ao meio ambiente, ocasionando uma série de problemas, principalmente para os corpos d’água, foi superior às nove décadas anteriores, e estima-se que cerca de 50000 novos compostos foram lançados ao meio ambiente neste período (RAND, 1995). HODGSON (1994) avalia a magnitude do problema, considerando a existência de 70000 aditivos químicos atualmente em uso, enquanto que JUAN LÓPEZ & CARMEM PUEYO (1997) estimam este número em torno de 100000 substâncias. Pode-se classificá-los de acordo com seus efeitos (ex. sistema imunológico – mutação e câncer); o uso (ex. pesticidas); estado físico (ex. líquido); químico (ex. hidrocarboneto); potencial toxicológico (extremamente tóxico, muito tóxico); ou impacto sobre o meio ambiente, sendo muito difícil adotar-se uma classificação única destes agentes, uma vez que são muito numerosos (RAND, 1995).

Compostos lipofílicos são geralmente facilmente absorvidos pelas vias de entrada de um organismo como o tegumento, mucosas, brânquias, etc. (KLAASSEN & ROZMEN, 1991), sendo que uma exposição constante ou intermitente às moléculas lipofílicas pode resultar em sua acumulação nos organismos, apesar dos diferentes mecanismos de eliminação das mesmas. A facilidade com que os compostos são eliminados irá depender do grau de sua solubilidade, e os organismos desenvolveram mecanismos bioquímicos que transformam os xenobióticos lipofílicos em metabólitos mais hidrofílicos, facilitando sua excreção (Fig.2). ROH Cit -Cit - ___R O 2H+ Cit - ___ R O2 Cit - ___R O2 -. H2O2 Cit - ___R O2 Cit - ___R O2 .-O2 .-Cit - ___R Cit - ___R NDPH-Cit P450-Red. NADPH LOOH LOO NADPH-Cit P450-Red. NADPH H2O Fe3+ Fe3+ Fe1+ _Fe2+ Fe2+ Fe3+ Fe3+ e -Fe2+ e

-Fig. 1 – Esquema simplificado, para a seqüência de eventos na monooxigenação catalisada pelo citocromo P450.

III.3 - Biotransformação de Xenobióticos

O conjunto de reações de absorção, acumulação e eliminação é denominado de biotransformação, sendo o tecido hepático, onde o orgão digestor tem função análoga ao fígado, o principal responsável por esta função (COMPORTI, 1989). Um dos sistemas de biotransformação mais estudados na atualidade, é constituído pelo citocromo P450 (CYP) e as monooxigenases associadas (Fig.3) (e.g. RATTNER et al., 1993; WALKER et al., 1996; COLLIER et al., 1998; LANGE et al., 1999; EGAAS et al., 1999; HUUSKONEN et al., 2000). O CYP compõe uma família de proteínas responsável pela biotransformação de compostos orgânicos.

A indução do CYP 450 1A1 (Fig. 5) pode ser detectada indiretamente através da atividade enzimática de uma P450 monooxigenase associada, a etoxiresorufina-O-deetilase (EROD) (KIRBY et al., 1999; ARCAND-HOY & METCALFE, 1999; GILLET & MONOD, 1998; AAS & KLUNGSOYR, 1998; BELIAEFF & BURGEOT, 1997; WILET et al., 1997; MURPHY & GOOCH, 1997; OTTO DIANA et al., 1994), o qual cataliza a 7-O-deetilação da etoxiresorufina à resorufina (PROUGH, 1978; STEGEMAN et al., 1991; 1992). Pode-se definir a biotransformação em duas fases distintas: Reação de Fase I, na qual o CYP 450 1A1 é um importante complexo enzimático, cuja função é a fixação de um grupo polar na molécula, aumentando desta forma, a hidrossolubilidade do xenobiótico (bioativação), que o transforma numa forma adequada para as reações de conjugação da Fase II (Fig. 4). A reação da Fase II é caracterizada pela reação com um substrato endógeno, produzindo compostos conjugados hidrossolúveis, que são mais facilmente excretados (HOGSON & LEVI, 1994). Uma das enzimas que irão executar esta função de conjugação e excreção é a glutationa S-transferase (GST) (Fig. 4) (EGAAS et al., 1999; JEDAMSKY-GRYMLAS et al., 1995; VIGANO et al., 1993; BOON et al., 1992), analisada no presente trabalho.

P 4 5 0 X E N O B IÓ T I C O H E M E + + + P 4 5 0 X E N O B IÓ T I C O H E M E + + + P 4 5 0 X E N O B IÓ T I C O X E N O B IÓ T I C O H E M E + + P 4 5 0 X E N O B IÓ T I C O H E M E + + + P 4 5 0 X E N O B IÓ T I C O H E M E+ + P 4 5 0 H H2O 2 H+ N A D H e -e -R E D U T A S E e -e -P 4 5 0 R E D U T A S E b R E D U T A S E N A D P H O2 O O2 N A D P H O2

Fig. 5 - Indução do Citocromo CYP 1A

A atividade da EROD apresenta uma alta correlação com os níveis de contaminação ambiental por compostos orgânicos (hidrocarbonetos policíclicos planares) (GOKSOYR & FÖRLIN, 1992). Por envolver técnicas bastante sensíveis, rápidas e de relativo baixo custo, os programas de monitoramento ambiental modernos estão utilizando estes parâmetros em uma fase inicial de avaliação dos locais para detectar, indiretamente, a presença de compostos do tipo HPAs, PCBs e dioxinas (GOKSOYR & FÖRLIN, 1992; RATTNER et al., 1993. STEINERT et al., 1998; HAHN, 1998; WU et al., 1999; 1999; AU et al., 2001; WILHELM FIHO et al., 2001b; TORRES et al., 2002; FOURNIER et al., 2002).

Alguns organismos aquáticos caracterizam-se por apresentarem uma acentuada sensibilidade às modificações dos parâmetros físicos e químicos ambientais (MARGALEF, 1982). Sendo assim, a exposição destes organismos a diversos tipos de poluentes e, conseqüentemente, biotransformação dos mesmos, pode levar a alterações no metabolismo basal celular, provocando estresse oxidativo (DI GIULIO et al., 1989; VIARENGO et al.,

1993; CHATTY & INDIRA, 1995; COSSU et al., 1997; DOYOTTE et al., 1997). Organismos aquáticos filtradores demonstram ser excelentes bioindicadores de poluição aquática (PANITZ et al., 1997; MASUTTI, 1999; LIVINGSTONE, 2001; TORRES et al., 2002).

III.4 - Estresse oxidativo

Os danos causados pelas RLO, bem como sua extensão, dependem tanto da quantidade como da natureza dos mesmos a que as células estão expostas e de suas defesas antioxidantes. Desvios no estado de equilíbrio dinâmico ou estado estacionário intracelular entre os RLO e as proteções antioxidantes, caracterizam o chamado estresse oxidativo, onde as primeiras podem estar aumentadas sem o concominante aumento das defesas; as proteções per se podem estar reduzidas, sem o aumento daquelas, ou ainda, a situação mais crítica, onde o aumento da concentração dos RLO vem acompanhado de uma redução paralela das defesas correspondentes (SIES, 1985; AMSTAD & CERUTTI, 1990).

III.5 - Espécies Reativas de Oxigênio

O oxigênio molecular (O2) é tratado como um composto benigno, essencial para os

organismos aeróbios. Na respiração mitocondrial o O2 é reduzido à água pelo processo de

fosforilação oxidativa, sendo a maior fonte de ATP em organismos aeróbios, necessitando 4 elétrons para a redução do O2.

O2 + e-→ O2• −

O2− + e-2H+→ H2O2

O2− + e- H+ →•OH + H2O ONDE: O2• − É O ÂNION SUPERÓXIDO E •OH É O RADICAL HIDROXIL

•_{OH + e}-_{→ H} 2O

____________________________

O2 + 4 e-→ 2 H2O

III.6 - Dano oxidativo

Os alvos dos radicais livres de O2 são, principalmente, as proteínas, os lipídios

insaturados e os ácidos nucléicos, compostos com os quais formam ligações covalentes irreversíveis. Estes fenômenos de oxidação podem levar à inativação ou destruição das enzimas, perturbações funcionais das membranas celulares, e alterações nas cadeias dos ácidos nucléicos (HALLIWELL & GUTTERIDGE, 1999).

III.7 - Mecanismos de Defesa Antioxidante

Os níveis e atividade dos antioxidantes são respostas imediatas das mudanças ambientais que afetam a produção celular dos RLO. Exemplos incluem flutuações dos níveis de O2 ambiente (O2 dissolvido), mudanças na irradiação ultravioleta solar (UV), e

exposição a poluentes redutores ativos. As defesas antioxidantes proporcionam uma adaptação fundamental de estressores naturais e antropogênicos que influenciam o fluxo de RLO em organismos aeróbios. Podem ser classificados como antioxidantes redutores

hidrossolúveis como a glutationa, o ácido úrico e o ascorbato (vitamina C), radicais seqüestradores lipossolúveis como o α-tocoferol (principal composto da vitamina E), β-caroteno (precursor da vitamina A), ou ainda enzimas antioxidantes, como a SOD (superóxido dismutase), CAT (catalase), GPx e AsPx (glutationa e ascorbato peroxidases), GR (glutadiona redutase), e DTD (DT-diaforase). A GSH (glutationa reduzida) possui um papel importante na detoxificação de contaminantes. A atividade da SOD desempenha-se por um grupo de metaloenzimas que catalizam a conversão de oxigênio radicalar (O2•−) em

peróxido de hidrogênio (H2O2), observado na reação:

2 O2• − + 2H+→ H2O2 + O2

A SOD (superóxido dismutase) é descrita como sendo uma das mais ativas das enzimas, sendo que numerosos estudos indicaram a indução da SOD, em muitos organismos, por fatores associados com um aumento da produção de RLO, como O2• −,

(hiperóxia) e exposição a contaminantes redutores ativos (DI GIULLIO et al., 1999), sendo que o produto da atividade da SOD, H2O2, pode ser removido pela atividade da CAT ou

peroxidases, como a GPx em animais e AsPx nas plantas (HALLIWELL & GUTTERIDGE, 1999), observadas nas reações:

2 H2O2 CAT→ 2 H2O + O2

III.8 - Injúria celular

Os efeitos deletérios celulares associados ao estresse oxidativo, como a peroxidação lipídica, metemoglobinemia, e oxidação do DNA, também têm sido investigados em animais aquáticos (RAND, 1995). Neste caso, a peroxidação lipídica recebe uma maior atenção, sendo que uma variedade muito grande de contaminantes tem acentuado a peroxidação lipídica em tecido de vários organismos. Estão incluídos compostos como metais, cádmio, cobre, ferro e mercúrio, substâncias orgânicas redutoras como o paraquat e acetaminofen, PCBs, e outros tantos compostos orgânicos como tetracloreto de carbono e dietilmaleato.

III.9 - Proteções antioxidantes

Antioxidantes são “qualquer substância que, quando presentes em baixas concentrações, comparadas às de um substrato oxidável, retardam ou inibem significativamente a oxidação deste substrato” (HALLIWELL & GUTTERIDGE, 1999). Esta definição compreende compostos de natureza enzimática e não enzimática (Tab.I). Por meio de diferentes mecanismos, os RLO são destruídos de forma a impedir reações posteriores de propagação (SIES, 1993).

Tabela I – Resumo das principais defesas antioxidantes nos sistemas biológicos (SIES, 1993).

SISTEMA FUNÇÃO NÃO ENZIMÁTICOS

α - Tocoferol Intercepta reações de lipoperoxidação

β - caroteno Quencher de 1O2

Licopeno Quencher de 1O2

Ubiquinol 10 Scavenger de radicais

Ácido ascórbico Inúmeras funções antioxidantes

Ácido úrico Scavenger de radicais

Glutationa Inúmeras funções antioxidantes

ENZIMÁTICOS

Superóxido Dismutase Reações de dismutação do O2• −

Catalase Catalisa a reação sobre H2O2

Glutationa Peroxidase Catalisa a reação sobre peróxidos

ENZIMÁTICOS AUXILIARES

Glutationa S-Trasferase Reação de conjugação de xenobiontes Glutationa Redutase Colabora no ciclo da GSH

III.10 - Antioxidantes enzimáticos

As enzimas antioxidantes estão presentes nos tecidos de todos os organismos aeróbicos e atuam na remoção dos RLO (HALLIWELL & GUTTERIDGE, 1999).

III.10.1 - Superóxido dismutase

A superóxido dismutase (SOD) (Fig.6), presente na quase totalidade dos organismos eucarióticos, catalisa a dismutação do radical O2•− em H2O2, (MCCORD & FRIDOVICH,

1969). Existem três formas conhecidas de SOD: A cobre-zinco (Cu, Zn-SOD) forma citosólica dos eucariontes, a manganês (Mn-SOD) em bactérias e mitocôndrias, e a ferro (Fe-SOD), encontrada apenas em bactérias.

H2O2 + H2O + GSH _GSSG NADPH GR GPx SOD 10-11 M (Tyler, 1975) Metabolismo: - Aeróbico - Biotransformação Fe+2 + H2O2 Peroxidação Lipídica Dano ao DNA Alteração Proteica . _OH 10-18 M (Chance et al., 1979) 10-9 s (Pryor, 1986) (Oshimo et al., 1979) 10-9M O2 + . OH

O

Fig. 6 - Esquema da integração das defesas antioxidantes. (Concentração para hepatócitos de ratos).

III.10.2 - Catalase

A Catalase (CAT), é amplamente difundida entre os seres aeróbicos (HALLIWEL & GUTTERIDGE, 1999). Esta enzima decompõe o H2O2 em H2O e O2 (FABER et al.,

1990). É uma enzima antioxidante responsável pela prevenção da formação de espécies reativas de oxigênio, pela inativação dos RLO e pelo reparo dos danos celulares causados. Ela atua na decomposição do peróxido de hidrogênio (H2O2), impedindo ou diminuindo a

formação do radical hidroxil. Com a ausência das enzimas antioxidantes (por exemplo, CAT e a SOD), as espécies reativas de oxigênio, como o ânion superóxido (O2•−), na

presença de peróxido de hidrogênio podem dar origem ao radical hidroxil, que vão causar danos na membrana, causando lipoperoxidação; danos ao DNA, quebrando a cadeia de DNA e, conseqüentemente, causando a ativação de oncogenes (HALLIWELL & GUTTERIDGE, 1999).

III.10.3 - Glutationas Peroxidases

São enzimas que utilizam doadores de elétrons para reduzir, por exemplo, H2O2 em

H2O (LITLE & O’BRIEN, 1968; CHRISTOPHERSEN, 1969). Talvez a mais importante

das peroxidases seja a glutationa peroxidase (GPx) (Fig. 7), enzima que usa selênio no sítio catalítico e utiliza o tripeptídeo tiólico glutationa reduzida (GSH) como doador de elétrons para a redução de H2O2, e de outros peróxidos orgânicos como os lipoperóxidos, que

provêm da lipoperoxidação lipídica (KELLING & SMITH, 1982). A ação combinada do trinômio ezimático (SOD, CAT e GPx), mantém a célula com concentrações reduzidas de O2• − e H2O2 (HALLIWELL & GUTTERIDGE, 1999).

III.10.4 - Glutationa Redutase

Existem enzimas acessórias que participam auxiliando na manutenção do poder redutor intracelular, tais como a glutationa redutase (GR). Essa enzima catalisa a redução (Fig. 7) da glutationa oxidada (GSSG) através da oxidação do NADPH, permitindo, assim, a contínua ação da GPx e regenerando os níveis de GSH (HALLIWEL & GUTTERIDGE, 1999; RICE-EVANS et al., 1995).

III.11 - Antioxidantes não enzimáticos

Completando a ação enzimática, as células ainda exibem um importante conjunto de substâncias antioxidantes não enzimáticas.

III.11.1 - Antioxidantes não enzimáticos citosólicos III.11.2 - Glutationa (γ -Glu-Cys-Gly)

O tripeptídeo glutationa reduzida (GSH) é um dos principais componentes antioxidantes não enzimáticos celulares, atuando como doador de hidrogênio em reações de redução de hidroperóxidos através da ação da GPx (WINTERBOURN, 1993). A GSH também é transferida pela GST para grupamentos bioativos, que resultam da ação da monooxigenase em biotransformação de xenobióticos (KETTERER, 1986; WARHOLM et al., 1983; HYES et al., 1990; MONKS et al., 1990; DEKANT & VANVAKAS, 1993). A contribuíção da GSH na reciclagem de dehidroascorbato à ascorbato, por uma via enzimática, onde a GSH-dehidroascorbato-redutase é preponderante, é importante nesse processo (COASSIN et al., 1991; MENDIRATTA et al., 1998a,b; MAY JAMES et al., 1996).

III.11.3 - Vitamina C (Ácido ascórbico)

Presente na forma de ascorbato (Fig. 8) na maioria dos organismos biológicos, a vitamina C é considerada o mais importante antioxidante dos fluídos extracelulares (STOCKER & FREI, 1991). O ascorbato tem se mostrado como um eficiente scavenger de O2• −, H2O2, •OH e radical peroxil (•OOL) (BENDICH et al., 1986; HALLIWELL et al.,

1987). O ascorbato também age de forma a proteger biomembranas contra lipoperoxidação perpetuando, dessa forma, a atividade de α-tocoferol, um antioxidante não enzimático que é lipossolúvel (Fig. 8). Estudos in vitro mostraram que o ascorbato reduz o radical tocoferoxil (PACKER et al., 1979), e, assim, restitui a capacidade de eliminador do α-tocoferol (NIKI et al., 1984;BARCLAY et al., 1985; DOBA et al., 1985; LAMBELET et al., 1985).

K ~ 106 Reação de Propagação α−Tocoferol _{α−Tocoferoxil} K ~ 106 K ~ 106 OH Ascorbil Ascorbato HO GSH GSSG HO L

LH

L

LOO

LOOH

III.11.4 - Antioxidantes não enzimáticos inseridos em membranas III.11.4.1 - Vitamina E (α-tocoferol)

A reatividade da vitamina E com o radical •OOL (Fig. 7), no processo de proteção da membrana lipídica contra ataques de RLO, ocorre devido à sua atividade antioxidante e, acredita-se, esta ser a sua mais importante função bioquímica in vivo (TAPPEL, 1982). Esta reatividade é de considerável importância, porque os tocoferóis reagem com o •OOL, produzindo um hiperóxido relativamente estável e um radical tocoferoxil, interrompendo a cadeia de propagação dos RLO (SIES et al., 1992).

III.11.4.2 - Licopeno (Lic) e β-Caroteno (β-Car)

Além de precursores da vitamina A, os carotenóides têm sido caracterizados por exibirem uma característica biológica adicional, atuando como eficientes scavengers de RLO (BURTON & INGOLD 1984;FOOTE & DENNY, 1968, KRINSKY, 1989; SIES, et al., 1992). Outros grupos de pesquisa tem descrito o β-caroteno, como sendo um agente inibidor de peroxidação lipídica (CHU et al., 1992; PALOZZA et al., 1992; VILE & WINTERBOURN, 1988). O β-caroteno é uma molécula protótipo de um outro carotenóide, o licopeno, de função antioxidante semelhante (KRINSKY, 1989). Um outro detalhe importante é que, tanto o β-caroteno como o licopeno, são excelentes escudeiro de RLO e da energia oriunda do oxigênio singlete (1O2) (BURTON & INGOLD, 1981; 1989;

KRINSKY, 1989; DI MASCIO et al., 1989; 1990; SIES et al., 1993). Em 1984, BURTON e INGOLD demonstraram que o carotenóide β-caroteno inibe a peroxidação lipídica “trapeando” •OOL, interrompendo, desta forma, a cadeia de propagação (Fig. 8).

β-Car LIC OOR LOO -O LO -EPÓXIDO LOO -LOO -LOO (HOMOL.) 2 (LO-₎ (HETER.) LOOL Aldeído Cetona

Fig. 8 – Ação varredora de carotenóides contra lipoperóxidos

O O

III.12 - Lipoperoxidação e adutos de DNA

Quando um átomo de hidrogênio é abstraído por um RLO, existe a possibilidade da formação de um radical no lipídeo que, pode reagir com o oxigênio formando um •OOL (HALLIWELL & GUTTERIDGE, 1999), que, por sua vez, pode abstrair um átomo de hidrogênio de um outro ácido graxo adjacente, estabelecendo assim, uma cadeia de reações autocatalíticas que oxida membranas lipídicas (HALLIWELL & GUTTERIDGE, 1999). A peroxidação lipídica tem sido descrita como sendo uma das maiores contribuidoras para a perda da função celular sob situações de estresse oxidativo (CHATTY et al., 1995, COSSU et al., 1997; DOYOTTE et al., 1997; VIARENGO et al., 1993). Além de causar dano às membranas, os •OOL derivados da lipoperoxidação lipídica, podem eventualmente ser metabolizados. Uma série de métodos tem sido descrita na literatura a fim de quantificar o dano causado pela peroxidação, incluindo a formação de dienos conjugados de vários produtos de decomposição, malondialdeído (MDA), alcenos,

entre outros (HALLIWEL & GUTTERIDGE, 1999). Esses produtos podem reagir com outras biomoléculas em pontos distantes da membrana, inclusive com os ácidos nucléicos, formando adutos de DNA (JAGADEESAN, 1999; BURCHAM, 1998; WANG et al., 1996; FANG & VACA, 1996; SOLE et al., 1996; CÃO et al., 1995; AHMAD, 1995; SEGERBÄCK, 1983; CUMMINGS et al., 1992). No entanto, a maioria dos estudos de adutos de DNA encontrados na literatura (Fig. 9) e propostos como biomarcadores, tratam de análises de adutos de DNA por produtos da biotransformação de xenobióticos (LIVINGSTONE, 1993; VAN DER OOS et al., 1994; 1996; 1997; QU & STACEY, 1996; HARVEY & PARRY, 1998; CANOVA et al., 1998; LAW et al., 1998).

Dentre os principais tipos de lesões oxidativas sofridas pelo DNA, estão incluídas quebras, danos às desoxirriboses e modificações nas bases de purina e pirimidina. Sendo assim, uma das mais adequadas técnicas para avaliar lesões oxidativas ao DNA, são dosagens de base modificadas, sendo a mais comum delas a dosagem de 8-oxo-7,8-dihidro-2’-deoxiguanosina (8-oxodGuo) (KASAI, 1997). Este tipo de biomarcador também tem apresentado resultados excelentes em moluscos locais coletados em ambientes poluídos (TORRES et al., 2002).

Espécies reativas como O2• − aparentemente não reagem com nenhuma das bases do

DNA. Entretanto, como é de se esperar, devido à alta reatividade do •OH, exposições de DNA a esse RLO pode gerar vários produtos, uma vez que esse radical sofre reação com açúcares, purinas e pirimidinas, em diversas posições. O radical •OH, por exemplo, pode reagir com uma 2’ desoxiguanosina nas posições 8 do anel purínico, produzindo desta forma, 8-oxod-Guo (HALLIWELL & GUTTERIDGE, 1999).

Evidências também indicam que animais aquáticos resistem mais à peroxidação lipídica do que os mamíferos. Grandes quantidades de vitamina E, o principal antioxidante lipossolúvel, são encontrados nos microssomos da truta. Essa diferença grande de concentração de vitamina E possui muita importância para a resistência dos microssomos da truta à peroxidação lipídica (DI GIULIO et al., 1995).

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 benzo[a]pireno e/ou monoxigenação hidrólise ou monooxigenação DD catecol

radical ânion semiquinona

ROS

bioalquilação

local de ataque de hidrólise e esterificação R:OSO2 OPO2OH OCOCH3 1 2 3 ₄

diolepóxidos quinonas _{cátions radicais}

íons carbenios benzílicos

O

OH OH

CH2+

(dano oxidativo, adição ao DNA, depurinação, quebra da sequênciação)

DD: dehidrogenase dihidrodiol; ROS = RLO "região da baía" 7,8-epóxido 7,8-diol oxidação de um elétron intermediário 6-metil oxidação de um elétron O O + Lesão ao DNA INICIAÇÃO DO TUMOR .

Fig. 9 - Possível caminho para ativação do B[a]P na condução de lesão ao DNA in vivo (Baseado em Stansbury et al., 1994; Cavalieri and Rogan, 1995; Flowers et al., 1996; and Devanesan et al., 1996).

III.13– Metais-traço

Os metais-traço estão presentes na litosfera, pedosfera, atmosfera e hidrosfera. Os processos naturais que controlam e modulam a transferência destes elementos entre os diferentes compartimentos vem interagindo ao longo do tempo. Entretanto, a atividade humana, principalmente exercida durante este século, tem alterado os ciclos biogeoquímicos que influem a transferência destes elementos. (SALOMONS & FÖRSTNER, 1984).

Os elementos-traço ocorrem e permanecem em forma natural, porém seu estado químico pode ser alterado por ações físico-químicas, biológicas ou antrópicas. Estas atividades podem modificar drasticamente a toxicidade destes elementos e suas formas químicas. Apesar de serem tóxicos, quando presentes em concentrações elevadas, possuem relativo valor para o ser humano, por seus usos na indústria, agricultura, medicina e farmacologia. Em alguns casos, são essenciais em funções bioquímicas e fisiológicas. No entanto, esses elementos podem causar danos a saúde do homem, por serem absorvidos e acumulados por meio da teia trófica e através da contaminação do ar e dos mananciais hídricos, muito prejudicados quando estão próximos às atividades de indústrias e mineração (SALGADO, 1996).

Alguns elementos são causadores de tumor maligno em seres humanos e animais. Os elementos arsênio (As), níquel (Ni), cloro (Cl) e seus componentes têm se mostrado cancerígenos, sendo que algumas pesquisas indicam o provável surgimento de câncer através de alguns elementos. O sistema nervoso central (SN) é geralmente o mais afetado pelos elementos tóxicos, como mercúrio (Hg) e outros compostos sob a forma de vapor de metil-mercúrio. Segundo LU (1996), compostos orgânicos de chumbo (Pb) são principalmente neurotóxicos e sua exposição a níveis elevados podem causar encefalopatia. Os rins atuam como organismos excretores do corpo e, desta forma, são alvos de alguns metais-traço. O cádmio (Cd) afeta diversas funções, causando excreção de pequenas moléculas, proteínas, aminoácidos e glicose por via urinária. Alguns componentes de Hg, Pb, Cr e Pt também podem afetar de maneira negativa o sistema renal. O sistema respiratório é o primeiro a sofrer conseqüências da exposição excessiva de metais, levando

a variados tipos de reações, como inflamação e irritação das vias respiratórias. O prolongado tempo de exposição de alumínio (Al) e ferro (Fe) pode ocasionar fibroses (HALLIWELL & GUTTERIDGE, 1999).

III.13.1 - Os efeitos do Pb

O chumbo (Pb) é um dos mais abundantes elementos tóxicos e está presente em vários lugares. Este elemento tem sofrido um acrécimo ambiental acentuado devido ao crescimento industrial que requer um aumento nas atividades de mineração. Normalmente os níveis de chumbo (Pb) no solo, são da ordem de 5 a 25 mg/Kg; no nível freático de 1 a 60 µ/L e valores baixos na superfície da água; no ar o nível é de cerca de 1 µ/m3_{, podendo}

estes níveis se elevarem nas áreas de tráfego intenso de veículos (LU, 1996). Trabalhos recentes (ENVIRONMENTAL HEALTH CRITERIA – EHC, 1995), alertam para evidências de que a exposição a baixos níveis de chumbo pode causar significativos efeitos na saúde, particularmente em bebês e jovens. A maior fonte de contaminação para adultos, está na alimentação, bebidas e água. O chumbo (Pb) pode ser retido em tecidos e ossos, principalmente quando as dietas são deficientes em cálcio (Ca), fosfato (PO4-2), selênio (Se)

e zinco (Zn) (EHC, 1995). O maior uso industrial talvez seja o de aditivo na gasolina, além de pigmentos para pinturas, que contribuem para aumentar os níveis de Pb no ambiente. Ainda que tenham sido gradualmente diminuídos, persistem em baterias e cabos condutores.

Segundo LU (1996), a toxicidade do Pb influi, principalmente, no sistema sanguíneo. A anemia é evidente quando uma exposição moderada de Pb ocorre, levando à concentração de 50µg/dl, sendo que outros efeitos podem ser observados com poucos níveis de exposição. O sistema nervoso também é vítima do Pb, sendo que altos níveis de exposição, em torno de 80µg/dl no sangue, podem desenvolver edema cerebral (LU, 1996).

Há mais de 4.000 anos o chumbo é utilizado sob várias formas, principalmente por ser uma fonte de prata. Antigamente, as minas de prata eram de galena (minério de chumbo), um metal dúctil, maleável, de cor prateada ou cinza-azulada, resistente à corrosão. Os principais usos estão relacionados às indústrias extrativa, petrolífera, de baterias, tintas e corantes, cerâmica, cabos, tubulações e munições.O chumbo pode ser incorporado ao cristal na fabricação de copos, jarras e outros utensílios, favorecendo o seu brilho e durabilidade. Assim, pode ser incorporado aos alimentos durante o processo de industrialização ou no preparo doméstico. Compostos de chumbo são absorvidos por via respiratória e cutânea (SALGADO, 1996). Os chumbos tetraetila e tetrametila também são absorvidos através da pele intacta, por serem lipossolúveis. O sistema nervoso, a medula óssea e os rins são considerados órgãos críticos para o chumbo, que interfere nos processos genéticos ou cromossômicos e produz alterações na estabilidade da cromatina em cobaias, inibindo reparo de DNA e agindo como promotor do câncer (ATSDR, 1997). A relação chumbo - síndrome associada ao sistema nervoso central depende do tempo e da especificidade das manifestações. Destaca-se a síndrome encéfalo-polineurítica (alterações sensoriais, perceptuais, e psicomotoras), síndrome astênica (fadiga, dor de cabeça, insônia, distúrbios durante o sono e dores musculares), síndrome hematológica (anemia hipocrômica moderada e aumento de pontuações basófilas nos eritrócitos), síndrome renal (nefropatia não específica, proteinúria, aminoacidúria, uricacidúria, diminuição da depuração da uréia e do ácido úrico), síndrome do trato gastro-intestinal (cólicas, anorexia, desconforto gástrico, constipação ou diarréia), síndrome cardiovascular (miocardite crônica, alterações no eletrocardiograma, hipotonia ou hipertonia, palidez facial ou retinal, arteriosclerose precoce com alterações cerebrovasculares e hipertensão) e síndrome hepática (interferência de biotransformação). Outra doença provocada pelo chumbo muito conhecida, é o saturnismo devido à exposição crônica de chumbo e seus compostos

III.13.2 - Efeitos do Cádmio (Cd)

O Cd ocorre na natureza principalmente nos núcleos de Pb e Zn. Possui aplicação em pigmentos (em cerâmica), eletrônica e na fabricação de baterias. Sua concentração no ar está na casa de ng/m3. Na água é bastante baixo (em torno de µg/L), exceto em ambientes contaminados. Muitos alimentos contêm o Cd como traço. Segundo LU (1996), grãos e cereais usualmente constituem a principal fonte de Cd. Os níveis de Cd encontrados em carnes, aves de curral e peixes tem relativos baixos níveis, sendo que o fígado, os rins e os moluscos, usualmente costumam acumular níveis mais elevados. Para os adeptos ao tabagismo, este constitui uma fonte importante de Cd, uma vez que uma carteira (contendo 20 cigarros) consumida por dia, pode dobrar o acúmulo de Cd. Os efeitos agudos da exposição ao Cd provocam forte irritação, sendo que após sua ingestão, as manifestações clínicas são náuseas, vômitos e dor abdominal; depois da inalação, as conseqüências clínicas incluem edema pulmonar e pneumonia química, bronquites crônicas, fibroses progressivas, entre outros efeitos. Possui uma vida média entre 15 a 30 anos, devido à sua lenta excreção. Segundo a EHC (1992), O Cd é potencialmente nocivo como poluente ambiental; em mamíferos e humanos os estudos têm comprovado que a inalação de Cd expõe as vias gastrointestinais, e que as altas concentrações são geralmente encontradas no córtex renal, sendo absorvido pelo fígado. Algumas espécies de peixes podem ter tolerância a certas concentrações de Cd, ainda que cause anomalias fisiológicas aos mesmos (EHC, 1992).

III.13.3 - Efeitos do níquel (Ni)

O elemento Ni aparece comumente em minerais e suas emissões são associadas às atividades industriais e fundições. Combustão de combustíveis fósseis tendem a incrementar os níveis ambientais. Usos industriais como armazenagem de baterias, contatos elétricos e similares, utilizam Ni. Seres humanos expostos constantemente a fumaças de níquel, podem sofrer câncer, sendo o câncer nasal o mais freqüente, bem como o de

pulmão, laringe, estômago e provavelmente nos rins; irritação de pele e olhos, também são manifestadas. O Ni é acusado de causar maior hipersensibilidade na pele das populações em geral. Estas reações usualmente seguem após o contato com objetos e jóias e moedas contendo Ni. Emissões de Ni estão fortemente associadas com atividades industriais, combustão de combustíveis fósseis, incineração de dejetos de moluscos e desperdícios animais, e lixo em geral (SALGADO, 1996).

III.13.4 - Efeitos do zinco (Zn)

O zinco está presente em muitos alimentos e é, sem dúvidas, um dos elementos mais comuns na crosta terrestre. Apesar de ser essencial para o organismo humano, em altas concentrações pode interferir de forma negativa. Suas principais vias de entrada como contaminante, são através da água contaminada e dos alimentos. O Zn é muito utilizado como componente em tintas como inibidor de corrosão, é amplamente utilizado em indústria de galvanoplastia química, em componentes eletrônicos diversos, células de baterias secas. Em muitos países é misturado com cobre para confecção de moedas (ex. EUA) e é misturado com outros metais (Fe e Cu) para confecção de liga metálica com propriedades anticorrosivas e maleáveis. Surge na forma de compostos no ambiente através de processos naturais, podendo ser induzidos através de atividades de queima de lixo, queima de carbono, mineração e produção de ferro. Alguns compostos de Zn podem ser introduzidos em lençóis freáticos e penetrarem em lagos, lagunas e rios e, em alguns casos, como conseqüência, os oceanos. Ele pode estar presente em peixes, mas não aparece nas plantas. Segundo ATSDR (1997), o Zn é essencial na dieta humana em pequenas quantidades, assim como seu excesso pode trazer problemas à saúde.

III.13.5 – Efeitos do Cromo (Cr)

O cromo é obtido do minério cromita, metal de cor cinza que reage com os ácidos clorídrico e sulfúrico. Além dos compostos divalentes, trivalentes e hexavalentes, o cromo metálico e ligas também são encontrados no ambiente de trabalho (SALGADO, 1996). Entre as inúmeras atividades industriais, destacam-se: galvanoplastia, soldagens, produção de ligas ferro-cromo, curtume, produção de cromatos, dicromatos, pigmentos e vernizes A absorção de cromo por via cutânea depende do tipo de composto, de sua concentração e do tempo de contato. O cromo absorvido permanece por longo tempo retido na junção dermo-epidérmica e no estrato superior da mesoderme. A maior parte do cromo é eliminada através da urina, sendo excretada após as primeiras horas de exposição. Os compostos de cromo produzem efeitos cutâneos, nasais, bronco-pulmonares, renais, gastro-intestinais e carcinogênicos. Os cutâneos são caracterizados por irritação no dorso das mãos e dos dedos, podendo transformar-se em úlceras. As lesões nasais iniciam-se com um quadro irritativo inflamatório, supuração e formação crostosa. Em níveis bronco-pulmonares e gastro-intestinais produzem irritação bronquial, alteração da função respiratória e úlceras gastroduodenais ( SALGADO, 1996).

III.13.6 - Riscos e benefícios de alguns elementos-traço.

Muitos elementos-traço como alguns descritos, podem oferecer certos riscos e benefícios ao ser humano, especialmente no uso industrial e medicinal. Existem três elementos que são mais valiosos: um grupo (elementos essenciais) é requerido em certas funções fisiológicas; um outro grupo é utilizado para ampla variedade medicinal; e um terceiro grupo, constitui aqueles, que, às vezes, oferecem riscos ou benefícios. De uma forma geral, os riscos para a população são através dos alimentos, tais como peixes e moluscos. Por exemplo, a fonte de metil-mercúrio em peixes como o peixe-espada e o

atum. São encontrados concentrações de 0,5 a 1,2 ppm (peixe-espada) e 0,2 a 0,5 ppm (atum), enquanto que o nível para outros peixes é de 0,1 ppm ou menos. Os níveis permissíveis de etil-mercúrio são em torno de 0,4 a 1,0 ppm (LU, 1996). Por outro lado, o elemento cádmio (Cd), aparece em grandes concentrações em cereais como o arroz, considerado como maior fonte deste elemento. Os níveis permitidos de Pb e de Cd em utensílios de cerâmica têm sido estabelecidos ao nível internacional em muitas nações (WHO, 1979 in LU, 1996). De acordo com a ATSDR (1997), o Zn pode afetar a saúde humana pois muito pouco ou em excesso, pode causar problemas à saúde do homem. A falta de Zn causa inapetência, perda de olfato e do sentido do tato, foliação de unhas e danos no sistema imunológico. Muita quantidade deste elemento na dieta pode ocasionar dores estomacais, náusea, vômito. Ingerido por muito tempo, causa anemia e danos ao pâncreas.

III.13.7 - Elementos essenciais

Segundo LU (1996), o selênio é um elemento tóxico típico quando ingerido em altos níveis; no entanto, também induz síndrome de deficiência, quando é consumido em baixos níveis. As principais manifestações clínicas incluem queda de cabelo, de unhas e dentes. Em animais, a superexposição induz efeitos mais severos como crescimento retardado, necrose do fígado, aumento do baço e do pâncreas, anemia e várias desordens nas funções reprodutivas. Deficiência de selênio (Se) resulta em distrofia muscular em animais como gado, aves de curral e necrose de fígado em ratos. O Se é um componente da glutationa peroxidase, a qual é responsável pela destruição de H2O2 e peróxidos de lipídeos.

Sua função é, portanto, altamente relacionada com a vitamina E, como antioxidante biológico, e somente na década de 70 foi considerado como elemento essencial para os seres humanos. Igualmente o cobalto, o cobre e o chumbo são elementos necessários no desenvolvimento de eritrócitos. O chumbo é um componente da hemoglobina e o cobre participa da enzima SOD, facilita a utilização do ferro na síntese da mesma e sua falta causa anemia. O cobalto é um componente da vitamina B12. Excesso de acumulação de Cu

Cu é acumulado no cérebro, fígado, rins e nas córneas. O Zn é co-fator na produção de metalo-enzimas como a própria SOD. Deficiências de Zn induzem a uma grande variedade de efeitos no sistema nervoso, no sistema sanguíneo, na pele, fígado e olhos, entre outros.

III.13.8 - Usos de elementos-traço na medicina

Um grande número de elementos-traço tem sido utilizado como terapêuticos na medicina. Alguns compostos de mercúrio (Hg) são usados como agentes diuréticos, porém, devido à sua alta toxicidade, seu uso vem sendo descontínuo. Outros elementos menos tóxicos como alumínio (Al) são utilizados como antiácidos; lítio (Li) para a depressão, platina (Pt) como agentes anti-tumores e o tálio (Tl) como depilador. Efeitos terapêuticos do rádio (Ra) são empregados em radiologia. O titânio (Ti) aparece em especial interesse, pois é inerte e resistente à corrosão e tem sido utilizado em transplantes cirúrgicos e dentários (LU, 1996). Com base nestas informações, pode-se afirmar que elementos-traço podem ser prejudiciais ou benéficos ao ser humano, mas causam danos quando estão em concentrações elevadas, principalmente em organismos marinhos, que podem passar para o homem por meio da cadeia trófica, através da bioacumulação.

IV - MATERIAIS E MÉTODOS

IV.1 - Área de Estudo: Bacia Hidrográfica da Lagoa da Conceição – Sítios Amostrais

A Lagoa da Conceição (27° 34’S - 48°34’W) está localizada na parte oriental da Ilha de Santa Catarina (Fig. 10) e estende-se em sentido Norte-Sul, atrás de depósitos arenosos, apresentando características de desenvolvimento de ilhas-barreira formados no Quaternário, na era do Pleistoceno ( CARUZO GOMES JR., 1987). Mesmo possuindo o nome de Lagoa, é na verdade uma laguna de água salobra, pois está conectada ao mar através de um canal que desemboca da praia da Barra da Lagoa (KLINGEBIEL & SIERRA DO LEDO, 1999; ABES/SC, 2000). Possui um comprimento total de aproximadamente 13,5Km, por 0,2Km de largura, perfazendo uma área de 19,2Km2, com um volume de, aproximadamente, 40.106m3. Sua profundidade média é de 1,74m e máxima de 8,70m na parte Nordeste, próximo à borda. Os registros mostram uma temperatura média de 18,89°C e uma salinidade média aproximada de 30,04%o (MUEHE & GOMES JR., 1989). É alimentada por uma série de pequenos córregos e rios, em especial o Rio João Gualberto, seu principal tributário. A Laguna possui um canal raso e estreito de comunicação, que se estende por 2km até o mar, sendo este canal permanente desde o ano de 1982, onde foram construídos molhes e realizado drenagens (SIERRA DO LEDO & SORIANO-SIERRA, 1999).

Nos últimos tempos, a combinação de turismo, especulação imobiliária e falta de um plano diretor que se adeqüe ao ecossistema como um todo, vem acarretando uma série de problemas na Lagoa da Conceição, comprometendo sua qualidade de vida. A falta de uma infra-estrutura adequada na Bacia Hidrográfica da Lagoa da Conceição, gera uma ação antrópica negativa por meio de despejos de efluentes domésticos, assoreamento em virtude do desmatamento, ocupação das margens, eliminação da vegetação de entorno e contaminação das mais variadas. Todos esses fatores associados inclinam-se em direção a um favorecimento da eutrofização precoce da Laguna, comprometendo todo o ecossistema e as espécies que nele habitam, principalmente diversas espécies aquáticas.

Dentre as comunidades bentônicas e epibentônicas, os integrantes mais representativos correspondem a moluscos e crustáceos. Os primeiros incluem as espécies Anomalocardia brasiliana (berbigão) e Brachidontes darwinianus, como as mais abundantes para as 11 famílias com 15 espécies registradas (SANTIN, 1987). Os Portunídeos são dominantes dentro dos Decápodos, com sete espécies, das quais Callinectes danae (siri-azul) é a mais abundante, representando 72,8% do total (BRANCO et al., 1990).

Estudos sobre densidade populacional de berbigão na Lagoa da Conceição (ROSA, 1989), constataram uma distribuição de maneira agrupada, sendo os locais com tipo de fundo arenoso-lodoso, com maior abundância destes organismos. Estes estudos revelaram a presença de berbigões em todas as regiões rasas da lagoa, exceto no lado oeste, área próxima ao complexo cristalino, uma vez que as areias provenientes deste complexo, são consideradas grossas, enquanto que aquelas localizadas na margem oposta são areias de textura mais fina. Este fato explicaria a preferência dos organismos pela porção leste da lagoa, uma vez que o fundo possui características tipo arenoso-lodoso.

Com base na literatura e em depoimentos de pessoas da comunidade local, buscou-se escolher sítios de amostragem (Fig. 11) que aprebuscou-sentasbuscou-sem abundância do material biológico (o berbigão), além da presença de algum tipo de contaminação antrópica, tais como despejos de efluentes domésticos, concentração de resíduos, resinas de Pinus sp., e algum tipo de contaminação por atividade pesqueira como, por exemplo, estaleiros de barcos, manutenção de motores automotivos. Os sítios também foram escolhidos por regiões diferenciadas dentro da própria laguna, que possui sub-divisões devido à sua geomorfologia.

IV.1.1 - Sítio 1 – Trapiche do Rio Vermelho:

Localizado dentro do Parque Florestal do Rio Vermelho, onde existe grande concentração de árvores da espécie Pinus sp., gminosperma exótica, muito utilizada em projetos de reflorestamento por possuir alto potencial de dispersão através do vento, germinação e crescimento rápidos. Esta espécie é responsável pela liberação de resinas

ácidas, contendo ácido abiético, primárico e dehidroabético, de alta toxicidade e com efeito acumulativo. Quando submetidas a condições de anaerobiose, estas resinas convertem-se em substâncias mais tóxicas que o substrato primário (SOARES, 2001). Estas resinas liberadas pelas espécies Pinus, são facilmente observadas através de inspeção visual, e por meio de escoamento superficial, chegam até a Laguna em forma de sulco. Neste ponto também se situa um trapiche de apoio aos barcos que navegam em direção à Costa da Lagoa, transportando pessoas e suprimentos diversos, e no verão sofrem grande incremento por parte dos turistas que buscam aquela região para descanso e lazer, dentre outras atividades.

IV.1.2 - Sítio 2 – Avenida Osni Ortiga:

Situado no início da Av. Osni Ortiga, este sítio é bem urbanizado, com constante movimento local, além de possuir uma pequena marina que abriga algumas embarcações dotadas de motores automotivos (lanchas e jetski). São percebidas também bocas de saídas de água de escoamento superficial com incremento de despejos domésticos.

IV.1.3 - Sítio 3 – Ponta das Almas

Situado na região do Canto dos Araçás, este sítio está localizado em meio a uma área residencial e um clube de recreação que lançam seus efluentes no corpo lagunar.

IV.1.4 - Sítio 4 – Praia do LIC

Situado no Canto da Lagoa em sua porção sul/oeste, este ponto possui densidade urbana elevada, além de abrigar um clube recreativo (Lagoa Iate Clube). Possui características em sua hidrodinâmica de baixa circulação, devido a um estrangulamento nesta porção da Lagoa (ponte), não sofrendo influência direta do mar em função da distância do canal que liga a Laguna ao oceano.

P1

P2 P4

P3

Fig. 10 - Lagoa da Conceição vista do espaço com os pontos de amostragem assinalados por: P1 – Rio Vermelho; P2 – Osni Ortiga; P3 – Pontal das Almas e P4 –

IV.1.5 - Pontal da Daniela – Sítio 5 (Sítio Controle)

O Pontal da Daniela (Fig. 11) foi escolhido como ponto referência, a fim de proporcionar comparações com os resultados obtidos nos sítios da Lagoa da Conceição, a partir das análises do estresse oxidativo, dos metais-traço, dos parâmetros físico-químicos e microbiológicos nos animais expostos às condições ambientais da Lagoa da Conceição.

No contexto global, as lagoas costeiras, principalmente as lagunas que possuem conecção com o oceano, sofrem algum tipo de impacto ambiental. Foram levados em consideração a semelhança entre os ecossistemas em questão, o grau de preservação do local, a viabilidade técnica das coletas e abundância do organismo bioindicador, o berbigão. Optou-se em ter o Pontal da Daniela como sítio controle, em virtude da dificuldade de encontrar ambiente semelhante ao da Lagoa da Conceição isenta de atividades antrópicas. O sítio controle está situado dentro dos limites da Estação Ecológica de Carijós, e, teoricamente, deveria apresentar um menor grau de impacto ambiental relativamente aos sítios amostrais da Lagoa da Conceição.

O Pontal do Daniela (Fig. 11) é um prolongamento de sedimentação recente da Praia da Daniela, situado na latitude 27°27’S e longitude 48°37’W. Está localizado na costa oeste da parte norte da Ilha de Santa Catarina, próximo à abertura do canal que separa esta do continente, e sua formação deu-se pela união de uma pequena ilha à área da Daniela. Atualmente esta área apresenta uma dinâmica de crescimento lento e contínuo provocado pela aposição de sedimentos provindos do transporte de correntes marinhas e do Rio Ratones (DUARTE, 1981). O Pontal faz parte de uma baía, também de formação recente, com bancos de areia e com áreas paludosas ocupadas por mangue (DUARTE, 1981). Sua vegetação básica na área próxima à extremidade e costa oeste é de restinga, ficando a parte mais ao interior da baía constituída de mangue em expansão, de grande importância ecológica. O estuário do Rio Ratones consiste em um dos estuários que sofre menor impacto pela ação antrópica na Ilha de Santa Catarina, mesmo com alguma interferência humana pontual (RIBEIRO et al., 2001). Ainda que recebendo contribuição de efluentes domésticos da população local, o ecossistema manguezal ali presente atua como

barreira geoquímica, impedindo-os de serem transportados diretamente ao oceano (SORIANO-SIERRA, com. pessoal, 2002). Ocupa uma área de aproximadamente 61,0Km2, em uma região com pouca influência direta da ação das ondas, sendo a enseada de Ratones delimitada pelo Pontal da Daniela (SILVA, 1990). O aporte de água salgada provém da baía norte, com predominância de baixa profundidade e circulação (RIBEIRO et al., 2001). Atualmente toda a área, incluindo o ecossistema manguezal de Ratones, faz parte da Estação Ecológica dos Carijós, unidade de conservação criada em 1987. Baseado nestas condições ambientais, caracterizadas por um menor impacto ambiental na região, o Pontal da Daniela foi escolhido como ponto controle (PC) neste trabalho.

PC

Fig. 11 - Pontal da Daniela e Ilhas Ratones Grande e Pequena vistos do espaço, situado na Baía Norte e o Norte da Ilha de Santa Catarina, com o sítio controle (PC) assinalado. (Fonte: WWW.EMBRAPA.GOV.BR).

IV.2 - Material Biológico

IV.2.1 - O Berbigão – Anomalocardia brasiliana

O molusco Anomalocardia brasiliana (Gmelin, 1791) (Mollusca, Veneridae) (Fig. 12) encontra-se amplamente distribuído ao longo da costa do Brasil, e é comumente conhecido como berbigão, papa-fumo, samanguaiá e maçunin, dentre outros nomes populares. Possui concha trigonal, com até aproximadamente 37mm de comprimento, 32mm de altura e 23mm de largura, em adultos. Tem brilho vítreo e coloração amarelada, apresentando freqüentemente manchas ou faixas sinuosas cinza-escuras, de interior porcelanoso, muitas vezes com manchas acinzentadas na região posterior. Vive próximo das zonas entre-marés, em praias abrigadas e de fundo lodoso, sendo encontrado enterrado a pequenas profundidades (BOFFI, 1979). O Anomalocardia brasiliana possui valor econômico e comercial, sendo utilizado como fonte de alimento e de renda para comunidades pesqueiras (ROSA, 1989), além de ser utilizado por muitos artesões como matéria-prima para objetos variados. Por ser um animal filtrador de alimento, possui capacidade bioacumulativa, podendo ser potencialmente utilizado como biomarcador de substâncias xenobióticas. O órgão digestor é o órgão de principal acumulação desses xenobióticos (WILHELM FILHO et al., 2001a), caracterizado como glândula exócrina e acinosa composta (MOURÃO et al., 1994). Os ácinos contêm células digestivas que passam por diversas modificações e funções fisiológicas: absorção, digestão intracelular, assimilação, secreção, fragmentação e restauração, além da elaboração de enzimas e estocagem de reservas energéticas (Fig. 13). Foram coletados organismos com comprimento na faixa entre 1,8 a 3,2 mm.

Figura 12 – Aspecto externo do berbigão

Fonte: www.maramar.com.br

ÓRGÃO DIGESTOR

IV.3 - Metodologia analítica bioquímica IV.3.1 - Coleta e preparação de amostras

Os organismos adultos foram coletados vivos, manualmente, em pontos devidamente selecionados na Lagoa da Conceição e no Pontal da Daniela, dentro de um período de 6 semanas durante os meses de março e abril de 2002, com seu armazenamento em recipientes contendo água do próprio ambiente de coleta e seu sedimento, e transportados imediatamente para o Laboratório de Ecofisiologia Respiratória, CCB/UFSC. Utilizou-se um total de 60 indivíduos adultos jovens como amostragem para cada sítio de coleta.

Em seguida, os organismos foram submetidos à dissecação e retirados seus órgãos digestores, os quais foram pesados em balança analítica marca Ohaus. Os órgãos digestores, devido a seus reduzidos volumes, foram analisados em processo de “pool”, cada três indivíduos constituindo um “pool”, e homogenizados (homogeinizador Potter-Elvehjem), em solução-tampão fosfato de sódio 20mM, diluição de 20 vezes, com pH estabelecido de 7,4, contendo 0,1% de TritonX-100 e 0,15M de cloreto de sódio, constantemente mantidos em gelo. Os homogenatos foram então centrifugados (10000g) por 10 minutos e a 4° C. Os procedimentos acima descritos foram realizados no Laboratório de Ecofisiologia Respiratória do Departamento de Ecologia e Zoologia do Centro de Ciências Biológicas da Universidade Federal de Santa Catarina.

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IV.3.2 – Análise de antioxidantes e marcadores de estresse oxidativo (TBARS e GSSG)

Utilizando-se técnica de espectrofotometria, os homogenatos foram analisados para a avaliação das atividades enzimas e biomarcadores de estresse oxidativo, com os seguintes procedimentos: A SOD (superóxido dismutase) por meio da xantina/xantina oxidase, envolvendo a redução do citocromo P450 (FLOHÉ & ÖTTING, 1984); a CAT (catalase)