Colorimetria e Espectrofotometria 2012

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Método que utiliza a intensidade da

Método que utiliza a intensidade da cor

cor

para

determinar a concentração de um analito

Método colorimétrico

A concentração é determinada pela

quantidade de luz absorvida

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Métodos colorimétricos

Reações

Reações colorimétricas

colorimétricas::

são aquelas em que os produtos finais têm são aquelas em que os produtos finais têm uma

uma cor cor e as intensidades das cores sãoe as intensidades das cores são medidas na

medidas na faixa visível do espectrofaixa visível do espectro (380nm(380nm - 680nm)

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Sensação fisiológica associada a um

comprimento de onda

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A luz se propaga em ondas cujo comprimento define a cor da luz, variando de 400nm a 700 nm a região do espectro

visível

Nossos olhos são capazes de distinguir as diferentes ondas de comprimento da luz visível como cores diferentes..

A onda mais longa que conseguimos ver é o vermelho, as mais curtas são azul e violeta.

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As diferentes cores que formam a luz branca podem ser vistas quando um raio de luz é refratado por um prisma.

O prisma reflete os comprimentos de onda em diferentes quantidades, e as dispersa em um espectro que pode ser visto. A refração é maior na luz vermelha e menor na

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As substâncias emitem cores diferentes daquelas que elas absorvem As cores absorvidas e refletidas são ditas complementares

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Se uma solução absorve energia luminosa de

comprimentos de onda situados entre 400nm e

480nm (azul) ela aparece com cor amarela ao

olho humano.

Portanto o amarelo é a cor complementar do

azul

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Tabela – Cores e cores complementares na zona visível do espectro

Comp. de Onda (nm) Cor Absorvida Cor Complementar (ou observada)

• 650 - 780 Vermelho Azul esverdeada • 595 - 650 Laranja Verde azulado • 560 - 595 Amarelo-verde Roxo

• 500 - 560 Verde Roxo-vermelho • 490 - 500 Verde azulado Vermelho

• 480 - 490 Azul esverdeado Laranja • 435 - 480 Azul Amarelo

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A maioria das análises bioquímicas

realizadas no laboratório clínico

baseia-se no princípio da quantidade

de luz absorvida ou refletida

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Espectrofotometria

Metodologia que utiliza a luz (radiação

eletromagnética) para medir a

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Espectrofotometria

Capacidade de uma substância ou

produto derivado de uma reação

bioquímica absorver ou emitir luz, em um

determinado

comprimento de onda, sob

condições

físico-químicas estabelecidas

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Leis de Lambert e Beer

Lei de Lambert:

Quando a concentração de um analito é constante, a absorção depende do comprimento do caminho óptico

Lei de Beer:

Quando o caminho óptico é constante e igual a 1, a concentração do analito é diretamente proporcional à quantidade de luz absorvida

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A absorção da luz é tanto maior quanto mais concentrada for a solução por ela atravessada:

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A absorbância é diretamente proporcional à A absorbância é diretamente proporcional à

concentração do composto na solução concentração do composto na solução

(17)

O

O dispositivo

dispositivo utilizado

utilizado para

para quantificar

quantificar aa

energia de luz absorvida ou transmitida é

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O ESPECTROFOTÔMETRO é um aparelho O ESPECTROFOTÔMETRO é um aparelho que faz passar um feixe de luz monocromática que faz passar um feixe de luz monocromática através de uma solução, e mede a quantidade de através de uma solução, e mede a quantidade de luz que foi absorvida por essa solução.

luz que foi absorvida por essa solução.

Usando um prisma o aparelho separa a luz Usando um prisma o aparelho separa a luz em feixes com diferentes comprimentos de onda em feixes com diferentes comprimentos de onda (tal como acontece no arco-íris com a separação (tal como acontece no arco-íris com a separação das cores da luz branca).

(19)

Mas

…

_{que luz monocromática é}

esta?

• A cor da luz absorvida é complementar à cor observada

Então …

Temos que escolher o comprimento de onda da cor complementar à cor observada no produto corado

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Escolha do Comprimento de onda

Uma solução VERMELHA absorve o VERDE com maior intensidade e portanto deve-se escolher o

comprimento de onda correspondente ao verde para medida da solução vermelha

Deve-se utilizar uma faixa no espectro na qual

a E

0

_{radiante seja absorvida ao máximo}

(21)

Tabela – Cores e cores complementares na zona visível do espectro

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Espectrofotômetro - Componentes

•

Selecionador de comprimento de onda

•

Cubeta para conter a solução a ser

analisada

•

Luz emitente ou fonte luminosa

•

Receptor ou sistema fotométrico

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Esquema dos principais componentes de um

espectrofotômetro

•

A amostra deve estar em um recipiente

(cubeta) de vidro por ter uma melhor

dispersão.

•

Os detectores devem ser altamente sensíveis.

Fonte de luz Monocromador

Compartimento para

amostra Detector e

dispositivo para leitura

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Esquema dos principais componentes de um

espectrofotômetro

(25)

•

Correspondem ao resultado da atuação

de um ou mais reagentes sobre o analito

para formar o produto corado.

Determinação da concentração de um analito

Reações colorimétricas:

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Exemplo: Dosagem de glicose

GLICOSE (soro) + Reagente de cor (KIT): tampão fosfato contendo p-Hidroxibenzoato, 4-Aminoantipirina (4-AAP),

Glicose Oxidase e Peroxidase.

Processam-se as seguintes reações:

• Glicose + O2 + H2O GOD Ácido Glucônico + H2O2 • 2H2O2 + 4AAP POD 4-Antipirilquinonimina + 4 H2O

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(28)

Mas …

•

Como a intensidade da cor vai me dar a

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Determinação da concentração de um analito

A determinação é feita à partir da comparação da cor obtida no teste com uma SOLUÇÃO PADRÃO (da mesma substância) de concentração conhecida

Padrão de glicose Conc: 100mg/dl

Teste

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Determinação da concentração de um analito

Características da solução padrão

• Ter estabilidade

• Poder ser dissolvida em água e dessecada • Composição definida

• Grau de pureza de 99% ou mais

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Tabela 2 – Cores e cores complementares na zona visível do espectro

• 380 - 435 Violeta Amarelo-verde

A cor avermelhada (do produto formado) é medida no

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Determinação da concentração de um analito

No espectrofotômetro eu obtenho a absorbância da solução padrão e do teste.

Abs Pa ---Concentração do Pa Abs Teste ---Concentração do Teste

Conc Teste = Abs Teste x Conc Pa Abs Pa

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Determinação da concentração de um analito

Cálculo do FATOR DE CALIBRAÇÃO (FC)

FC = concentração Pa

absorbância do Pa

Conc Teste = Abs Teste x Conc Pa Abs Pa

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Função do Fator de Calibração

•

Obtendo-se o fator de calibração, multiplica-se

seu valor pelas leituras de absorbâncias lidas

pelo espectrofotômetro de cada amostra,

chegando-se na medida em unidades ( mg/dL,

g/L) do analito em questão.

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EXEMPLO

DOSAGEM DE GLICOSE EM PLASMA SANGUÍNEO

PADRÃO: 100mg/dl

Absorbância do padrão: 0,210

FATOR DE CALIBRAÇÃO: 100/0,210 = 833

ABSORBÂNCIA (ABS) DA AMOSTRA = 0,095

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Dosagem de glicose

Passo a passo

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Material necessário

•

Espectrofotômetro

•

Pipetas

•

Tubos de vidro

•

Suporte

•

Kit de glicose

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Identificação dos tubos

•

Branco: usado para zerar o

espectrofotômetro - normalmente água

destilada ou o reagente puro (quando este

tem cor)

•

Padrão ou calibrador : substância de

valor conhecido e estável

•

Amostra teste: soro ou plasma do seu

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Leitura

•

A densidade ótica (DO) ou absorbância do

padrão da glicose cuja concentração é

100 mg/dL foi:

0,347

•

Esta leitura será usada para extrair o

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(81)

Leitura

•

A densidade ótica(DO) ou absorbância do

teste de concentração desconhecida foi:

0,341

•

Esta leitura será usada para calcular a

concentração da amostra teste a partir da

multiplicação pelo fator de calibração;

(82)

Cálculo

•

Fator de calibração= 100 mg/dl

Abs do padrão

•

Fator = 100 mg/dl

0,347

•

Fator = 288

(83)

Cálculo

•

Concentração do teste: 288 x 0,341=

98,2

Porém como o valor de referência da

glicose é: VR: 70 a 99 mg/dl

(84)

Automação

•

Múltiplos testes;

•

Pipetagem automática

•

Rapidez

•

Precisão

•

Exatidão

•

Controle de qualidade

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(86)

(87)

(88)

Colorimetria/Espectrofotometria

••

Utilização

Utilização nas

nas dosagens

dosagens bioquímicas:

bioquímicas:

Ex: glicose, uréia, creatinina, colesterol,

triglicérides, enzimas, ferro sérico, etc

••

Hematologia: dosagem de hemoglobina

(89)

Vantagens

•

Rapidez e facilidade das medidas

•

Adequadas sensibilidade e especificidade

•

Aparelhos de baixo custo

•

Boa adaptação para automação, com

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CAUSAS DE VARIAÇÕES DOS RESULTADOS

DOS EXAMES LABORATORIAIS

Interferentes:

Todo e qualquer fator que provoque ou favoreça

a ocorrência de alteração no resultado de um

exame qualquer (drogas, alimentos, exercício,

etc).

(91)

Ação dos Interferentes

Surgem alterações metabólicas cujo resultado é um aumento do analito doseado, podendo causar

consequentemente dúvidas em sua interpretação

Estresse Glicose;

Dieta rica em proteínas Uréia Exercício: Triglicérides

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Química

Alguns interferentes podem atuar sobre o reativo,

provocando uma alteração na reação de doseamento que aumente ou diminua a leitura espectrofotométrica, conduzindo a um resultado errôneo.

• Ingestão de ácido ascórbico: Glicose (GOD). • Ingestão etanol: triglicérides, colesterol

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Ação dos Interferentes

Física

Muitas vezes a turvação de um soro lipêmico pode induzir a leituras espectrofotométricas elevadas e por conseguinte, resultados elevados.

Pode-se contornar o problema usando-se um branco da amostra.

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Classificação dos interferentes

FASE PRÉ-ANALÍTICA FASE ANALÍTICA FASE PÓS-ANALÍTICA

•Paciente •Coleta da amostra •Separação •Armazenamento •Processamento da amostra •Leitura espectrofotométrica •Cálculos •Emissão de resultados •Avaliação de resultados •Elaboração do laudo •Entrega do laudo ao paciente

(95)

Fase pré-analítica

Interferentes relacionados com o paciente:

•

Gravidez

•

Atividade física

•

Postura

•

Dieta

•

Idade

•

Uso de drogas (terapêuticas ou de abuso)

•

Infusão de fármacos

(96)

Fase pré-analítica

Interferentes relacionados com a coleta

da amostra

•

Aplicação de torniquete

•

Anticoagulantes

•

Hemólise

•

Separação e preparo da amostra (trocas,

plasma em contato com hemácias, exposição

direta da luz, etc)

(97)

Coleta de sangue

A diferença entre soro e plasma é que o primeiro não contém

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Anticoagulantes

Substâncias que impedem a coagulação do sangue “in vitro “

• Anticoagulantes:

• EDTA (sequestra o Ca)

• Heparina ( atua impedindo a ação da trombina) • Oxalatos (removem o Ca)

• Citratos (captação de Ca)

(99)

(100)

Tubos á vácuo

•

Padronização da cor da tampa

– Vermelha nenhum anticoagulante – Púrpura clara EDTA-K₃

– Verde heparina

– Azul citrato de sódio – Cinza fluoreto de Na

(101)

Considerações

•

O exame de laboratório, apesar das

similaridades, não pode ser

considerado como um processo fabril

•