UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
INSTITUTO DE BIOLOGIA
LUCILENE LOPES DOS SANTOS
CARACTERIZAÇÃO BIOQUÍMICA, GENÉTICA E PATOGÊNICA DE
Burkholderia andropogonis
E REAVALIAÇÃO TAXONÔMICA DA ESPÉCIE
BIOCHEMICAL, GENETIC AND PATHOGENIC CHARACTERIZATION
OF Burkholderia andropogonis
AND TAXONOMIC REASSESSMENT OF THE SPECIES
Campinas 2015
LUCILENE LOPES DOS SANTOS
CARACTERIZAÇÃO BIOQUÍMICA, GENÉTICA E PATOGÊNICA DE
Burkholderia andropogonis
E REAVALIAÇÃO TAXONÔMICA DA ESPÉCIE
BIOCHEMICAL, GENETIC AND PATHOGENIC CHARACTERIZATION
OF Burkholderia andropogonis
AND TAXONOMIC POSITION REASSESSMENT OF THE SPECIES
Tese apresentada ao Instituto de Biologia da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para obtenção do Título de Doutora em Genética e Biologia molecular, na área de Genética de Microorganismos.
Campinas 2015
ESTE ARQUIVO DIGITAL CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA TESE DEFENDIDA PELA ALUNA LUCILENE LOPES DOS SANTOS E
ORIENTADA PELA SUZETE APARECIDA
Campinas, 11 de Dezembro de 2015
COMISSÃO EXAMINADORA
Profa. Dra. Suzéte Aparecida Lanza Destéfano
Profa. Dra. Fabiana Fantinatti-Garboggini
Profa. Dra. Valéria Maia Merzel
Prof. Dr. Ricardo Harakava
Prof. Dr. Ivan Paulo Bedendo
Os membros da Comissão Examinadora acima assinaram a Ata de Defesa, que se encontra no processo de vida acadêmica do aluno.
"O que for teu desejo, assim será tua vontade. O que for tua
vontade, assim serão teus atos.
O que forem teus atos, assim será teu destino."
DEDICATÓRIA
À minha mãe Lucia, meu refúgio e segurança, e ao meu marido Rodrigo, meu amor e companheiro.
AGRADECIMENTOS
Agradeço primeiramente ao meu maravilhoso Deus, que me protege, me ilumina me abençoa e que por muitas vezes, quando pensei perder minhas forças, me carregou no colo.
À minha Orientadora e amiga, Dra. Suzete Aparecida Lanza Destéfano, que de forma muito carinhosa me ensinou e me direcionou durante esses quatro anos. Obrigada por me aceitar em seu laboratório, por confiar no meu trabalho e dividir comigo seu conhecimento profissional e sua experiência de vida. Foi uma grande honra e prazer trabalhar com você. Que Deus abençoe sua vida e o seu dom de ensinar.
À agência financiadora Fundação de Apoio à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) pelo suporte financeiro do Projeto e concessão da bolsa de Doutorado (Processo: 2011/12222-2 e 2011/50813-2) e ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq).
Aos membros da banca examinadora Dra. Fabiana Fantinatti Garboggini, Dra. Valéria Maia Merzel, Dr. Ricardo Harakava e Dr. Ivan Paulo Bedendo, admiro muito o trabalho e a dedicação de vocês. Obrigada por estarem sempre dispostos a me ajudar e contribuir com sugestões e ensinamentos. Agradeço também aos membros suplentes da banca por aceitarem nosso convite, Dra. Alessandra Alves de Souza, Dr. Wanderley Dias da Silveira.
À Dra. Laura Maria Mariscal Ottoboni e em especial ao Ms. Daniel Bedo Assumpção Castro que me ajudaram nas análises genômicas e contribuíram muito com esse trabalho.
Aos pesquisadores Dr. Julio Rodrigues Neto, Dr. Luís Otávio Berian, Ms. Irene Maria Gatti de Almeida e nossa grande amiga Soninha. Obrigada por todo o aprendizado, carinho e companhia. Agradeço também todos os alunos que estavam ou passaram pelo laboratório (Mari T, Marina, Marcela, Alex, Daniele, Suzana, Pedro, Daysi, Denise, Karem, Lucas e Matheus) e dividiram comigo, experiências, bancada de trabalho, biblioteca, cafezinho e o almoço.
Às minhas grandes amigas, que conheci no laboratório e se tornaram parte de mim. Thais (Thatá), obrigada por dividir sua história e carinho comigo, nos tornamos mais unidas quando percebemos que poderíamos nos apoiar uma na outra e assim caminhar dividindo tristezas e alegrias.
Renata (Renatinha), obrigada por ser tão generosa, amável e companheira. Você me ajudou a conquistar esse título, de forma prática e emocional. Você dividiu a sua casa, a sua vida e o seu coração comigo e esteve ao meu lado todos os dias durante esses quatro anos. Obrigada por ser meu apoio, meu refúgio, minha amiga e minha irmã. Que Deus te abençoe grandemente.
Mariana (Mari), não tenho palavras para expressar toda minha gratidão e amor por você. Você me ensinou tudo que eu sei e apliquei nesse trabalho e mais do que isso, a sua dedicação, amor e confiança, me mostraram o verdadeiro sentido da palavra amizade. Obrigada por abrir as portas da sua casa e da sua vida. Obrigada por me permitir fazer parte da história da sua família e me deixar amar e conviver com seus filhos. E se hoje eu conquistei esse doutorado foi porque você esteve ao meu lado me ensinando, ouvindo, apoiando e me fazendo evoluir como profissional e como pessoa. Você é a irmã de alma que Deus, generosamente, me deu de presente, obrigada minha amiga.
Agradeço imensamente a minha família: Adenir, Lucia, Luciane, Tony, Davi, Luciano, Luciana, Letícia e Sofia. Com vocês aprendi a ser mais humana e a ser mais de Deus. Obrigada por cada oração, abraço e carinho, mesmo de longe. A nossa fé nos tornou mais fortes e o nosso amor nos tornou mais unidos.
À minha nova família: Wanderley, Lucrécia, Carol, André, Pedro, Gustavo, Fernanda e Antônio. Obrigada pelo carinho, cuidado e por se alegrarem com minhas conquistas.
Meu agradecimento mais especial vai para meu marido Rodrigo. Com você ao meu lado é possível aprender a cada dia e a evoluir com cada aprendizado. Com você a confiança é diária e a construção do nosso amor é eterna. Obrigada por acreditar que eu sou capaz, por me incentivar e me ajudar em cada etapa desse doutorado e da vida. Ter você ao meu lado é o melhor presente que Deus me deu e o que mais me alegra é saber que o melhor ainda está por vir. Somos família, amor e confiança, hoje e sempre.
Por Fim, agradeço a todos que de forma direta ou indireta me apoiaram e contribuíram com o desenvolvimento desse trabalho.
RESUMO
Burkholderia andropogonis, inicialmente descrita por Smith (1911) como Bacterium andropogonis, agente causal de doença em sorgo (Sorghum bicolor), causa sintomas como manchas e listras foliares em uma ampla gama de hospedeiros com extensa distribuição geográfica. Essa espécie bacteriana possui características únicas ausentes na maioria dos patógenos de planta, como a presença de um único flagelo polar do tipo embainhado e produção de metabólitos secundários do tipo rizobiotoxina. O objetivo desse estudo foi caracterizar a diversidade bioquímica, genética e patogênica de 42 linhagens de B. andropogonis e reavaliar a relação filogenética dessa espécie bacteriana dentro do gênero Burkholderia. Características bioquímicas e fisiológicas diferenciais não foram observadas entre as linhagens isoladas de diferentes hospedeiros e regiões geográficas, assim como não foi verificada especialização patogênica nos testes de patogenicidade em diferentes plantas hospedeiras. Na caracterização molecular, a técnica de rep-PCR mostrou-se um método sensível para medir a variação genética dentro desta espécie bacteriana, uma vez que a análise combinada utilizando REP-, ERIC- e BOX-PCR permitiu a separação das linhagens em grupos de acordo com seus hospedeiros específicos e/ou localização geográfica. Nas análises filogenéticas do gene RNA ribossomal 16S e de multilocus (MLSA) utilizando cinco genes housekeeping (gyrB, recA, lepA, atpD e gltB), B. andropogonis ficou separada das demais espécies do gênero, com baixas porcentagens de similaridade entre as sequências dos genes. O sequenciamento do genoma da linhagem Tipo de B. andropogonis também foi realizado nesse estudo e uma análise de multilocus utilizando 30 diferentes genes conservados mais uma vez mostrou que B. andropogonis permaneceu separada das demais espécies do gênero Burkholderia. Além disso, a identidade média de nucleotídeos (ANI), a frequência de tetranucleotídeos (TETRA) e o porcentual de proteínas conservadas (POCP) foram calculados e B. andropogonis apresentou valores mais baixos nas comparações aos pares com 12 diferentes espécies do gênero Burkholderia, reforçando a distância observada nas análises filogenéticas. Nossos resultados claramente colocaram B. andropogonis em um grupo distinto que pode representar um novo gênero.
ABSTRACT
Burkholderia andropogonis initially described by Smith (1911) as the causal agent of leaf stripe disease on sorghum (Sorghum bicolor), affects a wide range of host plants economically important with an extensive geographical distribution. This bacterial species has unique features absent in most plant pathogens such as a single polar sheathed flagellum and rhizobitoxine production. The aim of this study was to assess the genetic, biochemical and pathogenic diversity among Burkholderia andropogonis strains and to establish the phylogenetic relationship of this bacterial species within Burkholderia genus. Differential biochemical and physiological features were not observed among strains isolated from different host and different geographical origins, as well as host specialization was not observed in the pathogenicity tests on distinct plant species. In the molecular characterization the rep-PCR technique was a sensitive method to measure the genetic variation within this bacterial species once the combined analysis using REP, ERIC and BOX-PCR allowed separation of strains into clusters according to specific hosts and/or geographical location. . The phylogenetic analysis using 16S rRNA gene and multilocus sequence analysis (MLSA) using five housekeeping genes (gyrB, recA, lepA, atpD e gltB) allowed clear separation of B. andropogonis from the other species of the genus, with low percentages of similarity among the genes sequences. After the genome sequencing of B. andropogonis type strain a multilocus analysis using 30 different conserved genes was also performed and again, B. andropogonis remained separated from the species of the Burkholderia genus. In addition, the average nucleotide identity (ANI), tetranucleotide frequency signature (TETRA), and percentage of conserved proteins (POCP) analyses were also carried out, and B. andropogonis species showed lower values when compared to the other Burkholderia species, reinforcing the distance observed in the molecular analyses. Our findings clearly indicates that B. andropogonis belongs to a distinct group and may represent a new genus.
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Linhagens de B. andropogonis utilizadas nesse estudo. Tabela 2: Sequências dos primers utilizados na análise de MLSA.
Tabela 3. Lista dos genes conservados utilizados nas análises de MLSA e tamanho do fragmento
analisado.
Tabela 4. Características bioquímicas e fisiológicas das linhagens de B. andropogonis
Tabela 5. Comparações em pares da Identidade Média de Nucleotídeos (ANI) entre 17
genomas bacterianos.
Tabela 6. Comparações em pares da Frequência de Tetranucleotídeos (TETRA) entre 17 genomas bacterianos.
Tabela 7. Comparações em pares da Porcentagem de proteínas conservadas (POCP) entre 17 genomas bacterianos.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Reação de hipersensibilidade observada em folhas de fumo, induzida por meio da
infiltração de suspensão de células de linhagens de B. andropogonis.
Figura 2. Folhas de milho inoculadas com diferentes linhagens de B. andropogonis: (A)
IBSBF 165 isolada de café; (B) IBSBF 854 isolada de milho e (C) controle negativo (água destilada esterilizada).
Figura 3. Folhas de sorgo inoculadas com diferentes linhagens de B. andropogonis: (A)
IBSBF 398 isolada de cravo; (B) IBSBF 199 isolada de sorgo e (C) controle negativo (água destilada esterilizada).
Figura 4. Folhas de ruscus inoculadas com diferentes linhagens de B. andropogonis: (A) IBSBF 237 isolada de primavera; (B) IBSBF 2594 isolada de ruscus e (C) controle negativo (água destilada esterilizada).
Figura 5. Folhas de cravo inoculadas com diferentes linhagens de B. andropogonis: (A) IBSBF520 isolada de cravo; (B) IBSBF 1135 isolada de cravina e (C) controle negativo (água destilada esterilizada).
Figura 6. Folhas de café inoculadas com diferentes linhagens de B. andropogonis: (A) IBSBF
3126 isolada de Setcreasea pallida (B) IBSBF169 isolada de café e (C) controle negativo (água destilada esterilizada).
Figura 7. Exsudação bacteriana a partir de folhas inoculadas com B.andropogonis,
observação ao microscópio óptico.
Figura 8. Amplificação por PCR utilizando-se o par de primers espécie-específico para B. andropogonis.
Figura 9. Produtos da amplificação do DNA de linhagens de B. andropogonis utilizando-se o
par de primers REP R1 e REP 2.
Figura 10. Produtos da amplificação do DNA de linhagens de B. andropogonis utilizando-se
o par de primers ERIC R1 e ERIC 2.
Figura 11. Produtos da amplificação do DNA de linhagens de B. andropogonis utilizando-se
Figura 12. Dendrograma de similaridade gerado a partir dos perfis de amplificação das 28
linhagens de B.andropogonis utilizando os três iniciadores REP, ERIC e BOX-PCR, baseado no método de UPGMA utilizando-se o coeficiente de similaridade de Jacard (Sj).
Figura 13. Árvore filogenética construída a partir das sequências do gene ribossomal RNA
16S, utilizando-se o método Maximum Likelihood e modelo evolutivo para substituição de nucleotídeo GTR+G+I.
Figura 14. Árvore filogenética construída a partir das sequências dos genes atpD, gltB, gyrB, recA e lepA, utilizando-se o método Maximum Likelihood e modelo evolutivo para substituição de nucleotídeo GTR+G+I.
Figura 15. Porcentagem de identidade das sequências das proteínas, indicada apenas pela
coloração, nas comparações entre os genomas de B. andropogonis e B. cepacia e B. mallei e entre os genomas de B. cepacia e B. mallei
Figura 16. Árvore filogenética construída a partir das sequências concatenadas de 30 genes
conservados utilizando-se o método Maximum Likelihood e modelo evolutivo para substituição de nucleotídeo LG +G+I+F.
Figura 17. Correlação entre os valores de POCP e a porcentagem de similaridade das
sequêncas do gene ribosomal RNA 16S de genomas de espécies do gênero Burkholderia,
LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS 16S RNA ribossomal em procariotos
ANI Average nucleotide identity ATP adenosina trifosfato
atpD cadeia β da ATP sintase
BSA albumina sérica bovina
BOX Elementos Box
°C graus Celsius
DNA ácido desoxirribonucléico
dNTP desoxirribonucleotídeo trifosfatado
DO densidade óptica
EDTA ácido etilenodiamino tetracético
ERIC Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus sequence
g gramas
gltB glutamato sintase
GTR+G+I General Time Reversible plus Gamma distributed with Invariant sites
gyrB DNA girase subunidade B
h hora
IAC Instituto Agronômico de Campinas
IBSBF Coleção de Culturas de Fitobactérias do Instituto Biológico
ICMP International Collection of Micro-organisms from Plants, New Zealand
SJ Coeficiente de Jaccard
LG+G+I+F Le-Gascuel with frequencies plus Gamma distributed with Invariant sites LMG Laboratorium voor Microbiologie, Belgium
M molar
ML Maximum Likelihood
MEGA Molecular Evolutionary Genetics Analysis
mg miligrama
MgCl2 cloreto de magnésio
min minuto
mL mililitro
MLSA Multilocus Sequence Analysis
g micrograma
μL microlitro
M micromolar
NA Nutrient Ágar
NaCl cloreto de sódio
NCPPB National Collection of Plant Pathogenic Bacteria, United Kingdom
ng nanograma
NJ Neighbor-Joining O/F oxidação/fermentação
ORF open reading frame
pb pares de base
PCR Polymerase Chain Reaction pH potencial hidrogeniônico
POCP Percentage of Conserved Proteins
lepA Proteína de ligação GTP qsp quantidade suficiente para
recA recombinase A
REP Repetitive extragenic palindromic RNA ácido ribonucléico
rpm rotações por minuto
seg segundo
T
linhagem Tipo
TAE Tris - Acetato - EDTA
TE Tris – EDTA
TETRA Tetranucleotide Frequency
TN93+G+I Tamura-Nei plus Gamma distributed with Invariant sites Tris Tris (hidroximetil) aminometano
U Unidade
UFC unidades formadoras de colônias
UNICAMP Universidade Estadual de Campinas
Sumário
1. INTRODUÇÃO ... 17 2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ... 18 2.1 Gênero Burkholderia ... 18 2.2 Burkholderia andropogonis ... 19 2.3 Rep-PCR ... 202.4 Gene RNA ribossomal 16S ... 21
2.5 Análise de Multilocus (MLSA) ... 23
2.6 Média de identidade dos Nucleotídeos (ANI) ... 24
2.7 Frequências de tetranucleotídeos (TETRA) ... 25
2.8 Análise de proteínas conservadas (POCP) ... 26
3 OBJETIVO GERAL ... 29
3.1 Objetivos específicos... 29
4 MATERIAIS E MÉTODOS ... 30
4.1Linhagens ... 30
4.2Extração de DNA cromossômico ... 32
4.3 Autenticação das linhagens de B. andropogonis por amplificação com par o de primers espécie-específicos ... 32
4.3 Caracterização bioquímica e fisiológica ... 32
4.3.1 Produção de ácidos a partir de carboidratos ... 33
4.3.2 Utilização de sais sódicos a partir de ácidos orgânicos ... 33
4.3.3 Produção de urease ... 33
4.3.4 Determinação da produção de oxidase ... 34
4.3.5 Teste de oxidação e fermentação (O/F) ... 34
4.3.6 Teste de Arginina Dihidrolase ... 34
4.3.7 Liquefação de gelatina ... 34
4.4 Reação de hipersensibilidade (HR) em plantas de fumo ... 34
4.5 Variabilidade patogênica em diferentes plantas hospedeiras ... 35
4.6 Análise da diversidade genética por rep-PCR ... 36
4.6 Amplificação e sequenciamento do gene RNA ribossomal 16S ... 37
4.7 Análise filogenética do gene RNA ribossomal 16S ... 37
4.8 Desenho e síntese de primers para análise de MLSA ... 38
4.9 Amplificação e sequenciamento de parte dos genes gyrB, recA, lepA, atpD e gltB ... 39
4.10Análise de MLSA baseada nos genes gyrB, recA, lepA, atpD e gltB ... 40
4.12 Análise de MLSA baseada em 30 genes conservados ... 41
4.14 Números de acesso ... 44
5 RESULTADOS ... 45
5.1 Autenticação das linhagens de B. andropogonis por amplificação com o par de primers espécie-específicos ... 45
5.2Testes bioquímicos e fisiológicos ... 45
5.2.1Produção de ácidos a partir de carboidratos ... 45
5.2.2Utilização de sais a partir de ácidos orgânicos ... 45
5.2.3 Oxidase... 45
5.2.4. Produção de urease... 46
5.2.5 Teste de oxidação e fermentação (O/F) ... 46
5.2.6 Teste de arginina dihidrolase ... 46
5.2.7 Liquefação de gelatina ... 46
5.2 Reação de hipersensibilidade (HR) em plantas de fumo ... 47
5.3 Variabilidade patogênica em diferentes plantas hospedeiras ... 48
5.4 Análise da diversidade genética por rep-PCR ... 52
5.4.1 Análise Combinada de REP-, ERIC- e BOX-PCR ... 52
5.5 Análises filogenéticas do gene RNA ribossomal 16S ... 56
5.6 Análise de MLSA baseada nos genes gyrB, recA, lepA, atpD e gltB ... 58
5.7 Montagem do Genoma ... 60
5.8 Análise de MLSA baseado em 30 genes conservados ... 62
5.9 Análises genômicas comparativas ... 63
6. DISCUSSÃO ... 69
7 CONCLUSÕES ... 73
8. REFERENCIAS ... 75
9. APÊNDICES ... 89
17 1. INTRODUÇÃO
O gênero Burkholderia pertence à classe β-Proteobacteria e foi proposto por Yabuuchi e colaboradores (1992) para acomodar sete espécies que anteriormente faziam parte do Grupo II DNAr do gênero Pseudomonas (P. cepacia, P. caryophylli, P. gladioli, P. mallei, P. pseudomallei, P. solanaceraum, e P. picketti). Desde então, novas espécies foram descritas, muitas espécies foram adicionadas (GILLIS et al., 1995; VIALLARD et al., 1998), e algumas removidas do gênero (YABUUCHI et al., 1995). Atualmente, o gênero Burkholderia compreende mais de 90 espécies, com ampla distribuição no ambiente, ocorrendo comumente no solo, água, animais e principalmente associadas a plantas (EUZÉBY, 1997; http://www.bacterio.net).
A espécie [Bacterium] andropogonis foi descrita inicialmente por Smith (1911) como agente causal da doença em sorgo (Sorghum bicolor), mais tarde foi transferida para o gênero Pseudomonas (STEVENS, 1925) e com base em experimentos de hibridização DNA-RNAr, foi realocada no gênero Burkholderia (GILLIS et al., 1995).
B. andropogonis possui algumas características particulares, ausentes na maioria das bactérias fitopatogênicas, como a presença de um único flagelo polar do tipo embainhado (FUERST; HAYWARD, 1969) e produção de rizobiotoxina (MITCHELL, 1994; OKAZAKI et al., 2004; VIAL et al., 2007). Além disso, sua gama de hospedeiros é excepcionalmente grande, com vasta distribuição geográfica (África, Ásia, Oceânia, Europa e Américas) (EPPO, 2013).
Essa espécie bacteriana causa sintomas como manchas e listras foliares em plantas hospedeiras economicamente importantes como milho (ULLSTRUP, 1960), café (RODRIGUES NETO et al. 1981) e citrus (DUAN et al., 2009), assim como em plantas ornamentais como jojoba (COTHER et al., 2004), ruscus (ALMEIDA et al. 2009), primavera (LI; De BOER, 2005), cravina (GITAITIS; MILLER; WELLS, 1983), entre outras.
Linhagens de B. andropogonis são muito semelhantes com relação às características morfológicas e fisiológicas (MOFFETT; HAYWARD; FAHY, 1986), no entanto, variabilidade genética foi observada por meio da técnica de ribotipagem e RAPD (Random Amplified Polymorfic DNA) (BAGSIC-OPULENCIA; HAYWARD; FEGAN, 2011). Ainda, a incoerente posição taxonômica dessa espécie bacteriana, dentro do gênero Bukholderia, foi reportada por meio de análises filogenéticas do gene RNA ribossomal 16S (SUÁREZ-MORENO et al., 2012; ESTRADA-DE LOS SANTOS et al 2013).
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Com o objetivo de investigar a variabilidade infra-específica de linhagens de B.andropogonis isoladas de diferentes hospedeiros e origens geográficas, testes bioquímicos, fisiológicos e de patogenicidade foram realizados, assim como o estudo da diversidade genética utilizando a técnica de rep-PCR. Ainda, a fim de reavaliar a posição taxonômica desta espécie bacteriana dentro do gênero Burkholderia, análises filogenéticas do gene RNA ribossomal 16S, análise de multilocus (MLSA) e análises genômicas comparativas como: identidade média de nucleotídeos (ANI), frequência de tetranucleotídeos, e porcentual de proteínas conservadas (POCP), também foram realizadas.
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1 Gênero Burkholderia
O gênero Burkholderia é composto por bactérias Gram-negativas, aeróbicas, que pertencem à classe β-proteobacteria e à família Burkholderiaceae. Esse gênero foi proposto por Yabuuchi e colaboradores (1992) com objetivo de alocar as sete espécies que anteriormente faziam parte do Grupo II do gênero Pseudomonas (baseado na similaridade do DNAr): P. mallei, P. pseudomallei, P. cepacia, P. solanacearum, P. caryophylli, P. gladioli e P. pickettii. Desde então, novas espécies foram descritas, muitas espécies foram adicionadas (GILLIS et al., 1995; VIALLARD et al., 1998) e algumas removidas do gênero, como por exemplo Ralstonia solanacearum e R. pickettii (YABUUCHI et al., 1995). Atualmente, cerca de 90 espécies estão descritas no gênero Burkholderia, englobando micro-organismos com elevada diversidade fisiológica e genética. Essas espécies colonizam diferentes nichos como solo, água, plantas e animais, no entanto, os representantes patogênicos são os mais conhecidos e estudados (EUZÉBY, 1997; http://www.bacterio.net; BONTEMPS et al., 2010).
Algumas espécies são patogênicas para animais e humanos, como por exemplo, membros do complexo Burkholderia cepacia, espécie que foi originalmente descrita como agente causal de podridão em bulbos de cebola (BURKHOLDER, 1950) e atualmente é considerado patógeno oportunista, podendo causar severa infecção crônica em seres humanos afetados pela fibrose cística (ex. Burkholderia cenocepacia, genomovar III). O gênero Burkholderia abriga também algumas espécies saprófitas, com possibilidade de utilização na agricultura ou no ambiente como agentes de biocontrole (EL BANNA; WINKELMAN, 1998) e promotoras de crescimento vegetal, devido à capacidade de produção de hormônios vegetais e/ou solubilização de nutrientes (TRÂN VAN et al., 2000). Ainda, ocorrem espécies
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chamadas diazotróficas, que são organismos de solo que aparecem associadas a várias espécies de plantas em simbiose devido à sua capacidade em fixar nitrogênio atmosférico, como por exemplo: B. kururiensis, B. brasiliensis, B. graminis, B. tropica, B. unamae, B. xenovorans, entre outras. Há também espécies que atuam na biorremediação de solo, devido à capacidade de degradar compostos xenobióticos (COENYE; VANDAMME, 2003; WANG et al., 2006). Esta notável versatilidade do gênero Burkholderia reflete a sua habilidade em utilizar uma ampla gama de substâncias orgânicas como fontes de carbono, o que contribui para sua capacidade em colonizar e sobreviver nos mais variados ambientes (COYNE; VANDAMME, 2003).
2.2 Burkholderia andropogonis
A espécie bacteriana B. andropogonis foi primeiramente isolada a partir de lesões foliares em plantas de sorgo (Sorghum bicolor), nos E.U.A, e descrita como Bacterium andropogonis por Smith em 1911. Mais tarde foi classificada como Pseudomonas andropogonis por Stevens (1925) e com base em hibridações DNA-RNAr, foi realocada no gênero Burkholderia por Gillis e colaboradores (1995).
Burkholderia andropogonis provoca manchas, listras ou estrias foliares em uma gama de hospedeiros excepcionalmente ampla, incluindo plantas economicamente importantes como o milho e sorgo (ULLSTRUP, 1960), mucuna e trevo (BURKHOLDER, 1957), café (RODRIGUES NETO et al., 1981), citros (DUAN et al., 2009) e plantas ornamentais como orquídeas, cravo, cravina, estrelitzia, tulipa, primavera, lavanda-do-mar (MOFFETT; HAYWARD; FAHY, 1986; GOTO, 1992; ROBBS et al. 1995), pau-formiga (ROBBS et al., 1981), jojoba (COTHER et al., 2004), ruscus (ALMEIDA et al., 2009) entre outras. Além disso, possui uma extensa distribuição geográfica, sendo encontrada na África, Ásia, Oceania, Europa e Américas (EPPO, 2013).
As diferentes linhagens de B. andropogonis isoladas de diferentes hospedeiros e regiões geográficas são muito semelhantes nas características morfológicas e fisiológicas (MOFFETT; HAYWARD; FAHY, 1986). Ainda, possuem características únicas, ausentes na maioria das bactérias fitopatogênicas, como a presença de um único flagelo polar embainhado (FUERST; HAYWARD, 1969) e produção de metabólitos secundários do tipo rizobiotoxina.
A rizobiotoxina, também produzida pela espécie de Bradyrhizobium elkanii (Rhizobium japonicum) é uma molécula cuja estrutura foi descrita em 1972 como um enol-éter aminoácido capaz de inibir a ACC sintase (1-aminociclopropano-1-carboxilato) na rota
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de biossíntese do etileno (MITCHELL, 1994; OKAZAKI et al 2004; VIAL et al 2007). A síntese de etileno nas plantas, além de estimular amadurecimento de frutos, a senescência de flores e folhas e a abscisão de folhas e frutos, entre outras funções, também está envolvida em resposta de defesa a patógenos (TAIZ; ZEIGER, 2004). As plantas respondem a infecções com o aumento da biossíntese de etileno (ABELES; MORGAN; SALTVEIT, 1992), apresentando-se, assim, como uma importante ferramenta, de origem natural, no controle de doenças (KESSMANN et al., 1994).
2.3 Rep-PCR
A técnica de rep-PCR, que utiliza sequências repetitivas do DNA genômico, pode ser utilizada na identificação e diferenciação de fitobactérias (RAMUNDO; CLAFIN, 2005). A identificação de sequências consenso nesses elementos permitiu o desenho de primers específicos para as sequências REP (Repetitive extragenic palindromic) e ERIC (Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus sequence) e BOX (Box elements) (VERSALOVIC et al., 1991; MARTIN et al., 1992). Versalovic e colaboradoes (1991) demonstraram que sequências homólogas a REP e ERIC estão presentes em gêneros bastante diversos de bactérias, especialmente em Gram-negativas, e que os produtos de REP e ERIC-PCR geram padrões bastante característicos, constituindo um método potencial para fingerprint de genomas bacterianos.
Em 1992, de Bruijn demonstrou a aplicação de perfis de REP- e ERIC-PCR no estudo de bactérias isoladas de solo, incluindo os gêneros Rhizobium, Bradyrhizobium, Azorhizobium, Agrobacterium e membros do gênero Pseudomonas, confirmando os dados de Versalovic e colaboradores (1991) quanto à aplicação desse método em análises moleculares e taxonômicas de bactérias. de Bruijn (1992) demonstrou que até linhagens de Rhizobium altamente relacionadas puderam ser diferenciadas com base nesse tipo de análise. Este método foi amplamente aplicado por outros pesquisadores na microbiologia ambiental, incluindo fitobactérias Gram-negativas, Gram-positivas (RADEMAKER; JANSEN, 1994; LOUWS et al., 1997), e actinomicetos associados a plantas (CLARK et al., 1998).
Para o gênero Xanthomonas estas sequências têm sido muito utilizadas em estudos de diferenciação, identificação e relações filogenéticas entre as linhagens (LOUWS et al., 1994; LOUWS et al., 1995; OPGENORTH et al., 1996; BOUZAR et al., 1999; RADEMAKER et al., 2000). A combinação de BOX- e ERIC-PCR permitiu a clara separação
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de X. albilineans de outras bactérias do gênero, alocando esta espécie bacteriana em grupos distintos por localizações geográficas e sorovares (LOPES et al., 2001).
A mesma técnica também foi utilizada para analisar 41 linhagens de Ralstonia solanacearum isoladas de diferentes hospedeiros e/ou regiões geográficas, no entanto, nenhuma correlação quanto à raça, biovar ou origem geográfica foi observada (RODRIGUES et al. 2012).
Para o gênero Burkholderia, a diversidade genética de 25 linhagens de B. glumae, espécie patogênica ao arroz, foi analisada utilizando-se os iniciadores ERIC-, BOX- e REP-PCR. Os padrões das bandas observados em géis de agarose foram altamente semelhantes entre as linhagens de B. glumae e totalmente diferentes de outras espécies do gênero Burkholderia como: B. plantarii; B. andropogonis; B. cepacia e B. gladioli (SAYLER, 2006). Ainda, Ramundo e Claflin (2005) utilizaram sequências repetitivas geradas pelo elemento BOX, para identificar e diferenciar 30 linhagens de B. andropogonis isoladas a partir de lesões foliares em plantas de sorgo, de outras bactérias fitopatogênicas, também isoladas de sorgo, uma vez que este elemento gerou um perfil de fingerprint único para as linhagens B. andropogonis isoladas da mesma planta hospedeira.
2.4 Gene RNA ribossomal 16S
O gene RNA ribossomal 16S é considerado um marcador filogenético universal para procariotos e está presente nos diferentes grupos de seres vivos. Uma parte substancial desse gene é conservada em todos os gêneros bacterianos e sua variabilidade apresenta-se em menor parte, permitindo estimar distâncias genealógicas em estudos filogenéticos (LANE et al., 1985; HENZ et al., 2005).
A automação das técnicas de sequenciamento do DNA gerou grande impacto no uso de sequências do gene RNA ribossomal 16S como marcador molecular, resultando num alto número de sequências disponíveis em bases de dados para pesquisa de livre acesso, como GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) e RDP (Ribosomal Database Project, Wisconsin, USA) (http://www.cme.msu.edu/RDP/htmL/index.htmL) (GURTLER; STANISICH, 1996). Sendo assim, não existe nenhum outro gene que tenha sido tão bem caracterizado e estudado quanto o gene RNA ribossomal 16S e com o uso dessas sequências a reclassificação de muitos gêneros e espécies tem sido possível, assim como a descrição de novas espécies (WOO et al., 2008).
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Originalmente sugerido por Woese (1987), a compreensão sobre filogenia dos procariontes baseia-se no grau de similaridade das sequências desse gene (WEISBURG et al.,1991; STACKEBRANT; GOEBEL, 1994; TINDALL et al. 2010). Linhagens pertencentes à mesma espécie, geralmente, apresentam similaridade maior que 97% e espécies distintas, pertencentes ao mesmo gênero, geralmente, apresentam similaridade maior que 95% (STACKEBRANDT; GOEBEL, 1994; TINDALL et al., 2010). Segundo Yarza e colaboradores (2008) a média de compartilhamento das sequências do gene RNA ribossomal 16S entre espécies distintas dentro de um mesmo gênero é de 96,4%.
A análise do gene RNA ribossomal 16S tem sido muito utilizada em estudos taxonômicos do gênero Burkholderia (VIALLARD et al., 1998; VANLAERE et al., 2008; ESTRADA-DE LOS SANTOS et al., 2013). Vanlaere e colaboradores (2008) utilizaram a similaridade desse gene para descrever novas espécies dentro do complexo Burkholderia cepacia e reportaram que linhagens pertencentes à mesma espécie compartilharam níveis superiores a 98%. No trabalho desenvolvido por Estrada-de los Santos e colaboradores (2013), a árvore filogenética de espécies do gênero Burkholderia, gerada a partir do gene ribossomal RNA 16S, revelou a formação de dois agrupamentos principais com vários subgrupos, indicando grande diversidade entre as espécies. Nessa mesma análise, a espécie B. andropogonis permaneceu alocada em um ramo distinto, separada dos agrupamentos principais. A mesma observação já havia sido relatada por Viallard e colaboradores (1998) em estudo para descrever B. graminis, uma nova espécie dentro do gênero Burkholderia. Nesse estudo, a árvore filogenética do gene RNA ribossomal 16S revelou a formação de um grupo principal composto por todas as espécies de Burkholderia, no entanto a espécie B. andropogonis foi diferente o suficiente para ser alocada em um ramo separado das demais espécies.
A análise desse gene também foi utilizada por Duan e colaboradores (2009) para descrever uma nova doença em Citrus sp., causada por B. andropogonis. A árvore filogenética construída mostrou que as linhagens de B. andropogonis isoladas de Citrus sp. ficaram agrupadas com outras linhagens da espécie B. andropogonis, com 99% de similaridade entre as sequências, entretanto, essas linhagens permaneceram separadas das outras espécies do gênero Burkholderia.
23 2.5 Análise de Multilocus (MLSA)
Embora a comparação entre as sequências do gene RNA ribossomal 16S seja considerada útil para permitir a análise de relações filogenéticas entre micro-organismos e essa análise seja uma ferramenta integrante em estudos taxonômicos (WEISBURG et al., 1991; STACKEBRANT; GOEBEL , 1994 ), segundo dados de literatura, em alguns casos, a informação filogenética com base apenas nesta molécula pode não ser suficiente para distinguir espécies estreitamente relacionadas e elucidar suas relações evolutivas (HARAYAMA, 1998; DAHLLOF; BAILLIE; KJELLEBERG, 2000; PAYNE et al., 2005; YAMAMOTO). O uso de sequências de nucleotídeos de genes codificadores de proteínas, housekeeping, pode representar uma alternativa útil ou complementar para estudos de taxonomia (MAIDEN et al., 1998; PAYNE et al., 2005). O emprego de vários destes genes na taxonomia bacteriana tem se mostrado o método mais adequado para análises em nível de gênero e espécie, uma vez que integram as informações de diferentes relógios moleculares em todo cromossomo bacteriano (PALYS; NAKAMURA; COHAN, 1997; STACKEBRANDT et al., 2002; LERAT; DAUBIN; MORAN, 2003; ZEIGLER, 2003; VENTURA et al., 2004).
Os genes housekeeping (genes constitutivos estruturais ou de regulação celular) estão amplamente distribuídos nos genomas bacterianos e geralmente se apresentam em cópia única (PALYS; NAKAMURA; COHAN, 1997; ZEIGLER, 2003). Nas análises de multilocus (MLSA - Multilocus Sequence Analysis) as sequências desses genes são utilizadas em análises filogenéticas e na construção de matrizes de similaridade, sendo bastante eficiente na separação de espécies dentro de um gênero (CHRISTENSEN et al. 2007). Esta técnica consiste no sequenciamento e análises de 5 a 7 genes conservados, espaçados ao longo do genoma bacteriano com pelo menos 100 kilobases (Kb) de distância (ZEIGLER, 2003).
Estudos de MLSA têm sido realizados para diferenciação, classificação e identificação de diversos micro-organismos. Análises de MLSA do gênero Stenotrophomonas forneceram informações suficientes para a classificação adequada das espécies dentro do gênero (RAMOS et al., 2011). Young e colaboradores (2008) utilizaram sequências concatenadas de genes housekeeping de espécies do gênero Xanthomonas e diferenciaram claramente a maioria das espécies incluídas no estudo, indicando que esta técnica é uma ferramenta eficiente em investigações adicionais de classificação de espécies dentro do gênero Xanthomonas, tanto para a confirmação de espécies já determinadas como na identificação de novas espécies.
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Espécies do gênero Streptomyces também já foram avaliadas pela técnica de MLSA utilizando-se sequências de genes housekeeping (CORRÊA, 2015). No estudo, realizado por Corrêa (2015), foi possível a clara diferenciação das espécies Tipo do gênero e identificação de linhagens causadoras da sarna da batata no Brasil, confirmando a eficiência desta técnica para este gênero.
Um estudo filogenético por meio de análises de MLSA também foi realizado para o gênero Burkholderia. Nas análises das sequências concatenadas dos genes atpD, gltB, lepA, recA e 16S RNAr foi possível diferenciar espécies de Burkholderia de outras espécies do gênero Ralstonia e Cupriavidus, assim como verificar a grande diversidade genética existente entre as espécies desse gênero (ESTRADA-DE LOS SANTOS et al., 2013).
2.6 Média de identidade dos Nucleotídeos (ANI)
A hibridização DNA-DNA (DDH) amplamente utilizada por taxonomistas bacterianos desde a década de 1960, é uma das poucas técnicas universalmente disponíveis, que permite comparações globais de similaridade entre dois genomas antes do sequenciamento completo do genoma (McCARTHY; BOLTON, 1963; SCHILDKRAUT; MARMUR; DOTY, 1961). Essa técnica foi considerada o "padrão ouro" para a demarcação das espécies bacterianas, onde linhagens que exibem, sob condições controladas de ensaio, valores de hibridização DNA-DNA superiores a 70% em seus genomas são consideradas de mesma espécie (WAYNE et al., 1987; TINDALL et al., 2010). No entanto, além de ser uma técnica muito laboriosa, sua principal desvantagem é a impossibilidade de se construir um banco de dados a partir de seus resultados (GEVERS; COHAN; LAWRENCE, 2005).
Com a era da genômica e com o avanço de novas tecnologias, o sequenciamento de genomas completos tornou-se mais acessível e novas possibilidades de estudos genômicos vem sendo exploradas com grande potencial de se tornar um parâmetro taxonômico de rotina, que irá substituir a técnica de hibridização DNA-DNA (KIM; PARK; CHUN, 2014).
A média de identidade dos nucleotídeos (ANI- Average nucleotide identity) (KONSTANTIDINIS; RAMETTE; TIEDJE, 2006) tem sido muito utilizada como um possível “padrão ouro” de próxima geração para identificar e delimitar espécies bacterianas (GORIS et al., 2007; KONSTANTINIDIS; TIEDJE, 2005; RICHTER; ROSSELLÓ-MÓRA, 2009; HALEY et al., 2010; CHAN et al., 2012;. YI et al., 2012; GRIM et al., 2013). A análise de ANI representa uma média dos valores de identidade/similaridade entre regiões homólogas compartilhadas por dois genomas. Valores ANI de 95-96% equivalem a um valor de
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hibridização de 70% e pode ser utilizado como um limite para delimitar espécies. Os valores de ANI baseiam-se no alinhamento par a par de trechos do genoma e a confiabilidade de seus resultados está diretamente relacionada com a quantidade e qualidade dos fragmentos de DNA alinhados (GORIS et al., 2007; RICHTER; ROSSELLÓ-MÓRA, 2009).
Goris et. al., (2007) compararam valores de hibridização DNA-DNA com valores de ANI de 28 linhagens de 6 distintos grupos, representantes de patógenos oportunistas e espécies ambientais, Gram-positivas e Gram-negativas: Bacillus cereus, espécies de Burkholderia, Escherichia coli, espécies de Shigella e Pseudomonas, Shewanella e Streptococcus agalactiae. Uma boa correlação entre essas duas técnicas foi reportada, sendo que o valor de corte de 70% na hibridização para delimitação de espécies correspondeu ao valor de 95% de ANI. Os autores concluíram que considerando o custo cada vez menor com o sequenciamento do DNA, a técnica de ANI poderá, futuramente, substituir a hibridização DNA-DNA.
No estudo desenvolvido por Kim e colaboradores (2014), mais de um milhão comparações foram realizadas, utilizando 6.787 genomas de procariotos, pertencentes a 22 diferentes filos. Os autores compararam a técnica de ANI com a similaridade do gene RNA ribossomal 16S e concluíram que os valores de corte de 95-96% de ANI para delimitar novas espécies correspondem à porcentagem de similaridade de 98,6% das sequências do gene RNA ribossomal 16S , propondo a substituição do valor de corte de 97% (Stackebrandt e Goebel, 1994) pelo valor de 98,6%.
2.7 Frequências de tetranucleotídeos (TETRA)
As frequências dos tetranucleotídeos (TETRA- Tetranucleotide frequency) nas sequências genômicas exibem um padrão espécie-específico definindo a “assinatura do genoma” (KARLIN; CAMPBELL; MRÁZEK, 1998; KARLIN; LADUNGA; BLAISDELL, 1994; KARLIN; BURGE, 1995; NAKASHIMAET et al., 1998) e o uso desses padrões pode ser considerado um marcador filogenético bastante sólido (PRIDE et al., 2003).
A análise comparativa das frequências de tetranucleotídeos não necessita do alinhamento entre as sequências e foi considerado por alguns autores como um método adequado, de alto rendimento, que pode ajudar, principalmente, na identificação de fragmentos em estudos de metagenômica, podendo se utilizado como um indicador de parentesco entre as espécies analisadas (TEELING et al., 2004).
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No emprego dessa técnica, as frequências de todos os possíveis 256 tetranucleotídeos e suas correspondentes frequências esperadas são calculadas. As divergências entre os valores observados e os valores esperados são transformadas em z-scores para cada tetranucleotídeo e todas as sequências são comparadas aos pares pelo cálculo de Coeficiente de Correlação de Pearson Em resumo, se os dois fragmentos genômicos exibirem padrões semelhantes de tetranucleótidos, mais alto será seu coeficiente de correlação (TEELING et al., 2004).
Com objetivo de comparar a frequência de tetranucleótideos com a análise de conteúdo G+C, 9.054 fragmentos de genomas foram extensivamente avaliados por Teeling e colaboradores (2004) e os resultados mostraram que o poder discriminatório da análise de TETRA é superior aos conteúdos de G+C. Ainda, Dick e colaboradores (2009), analisaram dados de sequências de metagenômica de duas comunidades de biofilme compostas por genomas reconstruídos de nove archaeas, três bactérias e numerosos vírus e concluíram que apesar das restrições funcionais e ambientais, transferência lateral de genes e pressões impostas pela predação viral, as assinaturas do genoma podem ser utilizadas para diferenciar populações microbianas que coexistem. Pride e colaboradores (2003) analisaram 27 genomas inteiros, incluindo bactérias Gram-negativas, Gram-positivas e archaeas e observaram que existe semelhança entre a topologia da árvore filogenética gerada a partir das frequências de tetranucleotídeos com a topologia da árvore filogenética gerada a partir do gene RNA ribossomal 16S , e concluíram que a técnica de cálculo da frequência de tetranucleotídeos pode ser considerada uma alternativa complementar em estudos de filogenia.
2.8 Análise de proteínas conservadas (POCP)
A nomenclatura binominal (gênero e espécie) introduzida na classificação botânica por Linnaeus, aceita para eucariotos e procariotos, tem sido utilizada desde o século 18 (SANGSTER; POPE, 2000). Muitos trabalhos foram dedicados à classificação em nível de espécie e conceitos valiosos foram propostos, como os já descritos nos tópicos anteriores.
Na classificação em nível de gênero, o sequenciamento e análise do gene ribossomal 16S RNA, ainda desempenha um papel primordial em estudos de taxonomia e segundo Yarza e colaboradores (2008), um novo gênero tem, aproximadamente, 6% de divergência nas sequências do gene RNA ribossomal 16S com as espécies do seu gênero
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mais próximo. Além disso, linhagens pertencentes ao mesmo gênero, normalmente formam um ramo monofilético estreitamente relacionado na árvore filogenética.
De acordo com Qin e colaboradores (2014), características fenotípicas também podem ser consideradas. Embora possa não haver características únicas em comum para todas as espécies do mesmo gênero, características fenotípicas diferentes de gêneros relacionados podem auxiliar na indicação de um novo gênero. Geralmente, se uma linhagem formar um grupo monofilético na análise filogenética, mostrando cerca de 6% de divergência nas sequências do gene RNA ribossomal 16S dos seus gêneros mais intimamente relacionados, e possuir diferenças fenotípicas, exclusivas, pode-se propor que essa linhagem represente um novo gênero (QIN et al., 2014).
Com o rápido desenvolvimento do sequenciamento de genomas, a disponibilidade de sequências em banco de dados de livre acesso estão aumentando consideravelmente (SHENDURE; JI, 2008). As informações genômicas disponíveis estão sendo aplicadas para definição e classificação de espécies, no entanto, a contribuição das sequências do genoma para a classificação de gêneros tem sido menos explorada (QIN et al., 2014).
As proteínas são responsáveis pela execução dos processos funcionais das células, e todas as características morfológicas, fisiológicas e bioquímicas e de uma linhagem têm seu fundamento com base nas proteínas. A análise de proteínas conservadas (POCP- Percentage of conserved proteins) proposta por Qin e colaboradores (2014), baseia-se, no alinhamento de todas as sequências protéicas do “genoma consulta” com todas as sequências protéicas do genoma da linhagem analisada, utilizando-se o programa BLASTP (ALTSCHUL et al., 1997). Para cada comparação em pares, uma linhagem deve ser utilizada como “genoma consulta” e outra como “genoma analisado” e posteriormente a posição das linhagens deve ser trocada, resultando em comparações recíprocas. O número de proteínas conservadas pode ser levemente diferente quando se inverte a posição de cada linhagem devido à presença de genes duplicados.
Nessa técnica, as proteínas são consideradas conservadas quando apresentam mais de 50% de sequências alinhadas e mais de 40% de identidade entre as sequências das duas linhagens avaliadas. A porcentagem de proteínas conservadas é calculada conforme a fórmula: [(C1+C2)/(T1+T2)]x100%, sendo que C1 e C2 representam o número de proteínas encontradas nas comparações aos pares entre os dois genomas, e T1 e T2 representam o número total de proteínas dos genomas (QIN et al., 2004)
28
A análise de POCP foi avaliada como uma ferramenta que pode ser utilizada para a delimitação em nível de gênero e inferir sua relação genética e evolutiva. Com base na análise de POCP de 235 genomas de 8 diferentes filos, 12 ordens e 97 gêneros, Qin e colaboradores (2014) concluíram que gêneros bacterianos podem ser definidos como um grupo de espécies que apresentam mais que 50% de proteínas conservadas.
29 3 OBJETIVO GERAL
Caracterizar linhagens de Burkholderia andropogonis isoladas de diferentes hospedeiros por meio de testes bioquímicos, moleculares e de patogenicidade e reavaliar a posição taxonômica dessa espécie bacteriana por meio de análises filogenéticas e análises genômicas comparativas.
3.1 Objetivos específicos
Caracterização bioquímica e fisiológica de diferentes linhagens de B. andropogonis;
Avaliação da patogenicidade em diferentes plantas hospedeiras por meio de inoculações artificiais em casa de vegetação.
Análise da diversidade genética por meio da técnica de rep-PCR (BOX, ERIC E REP-PCR);
Análise filogenética do gene RNA ribossomal 16S ;
Análise filogenética por meio da técnica de multilocus (MLSA);
Análises genômicas comparativas por meio das técnicas: Identidade Média de Nucleotídeos (ANI), Frequência de Tetranucleotídeos (TETRA) e Porcentual de Proteínas Conservadas (POCP).
30 4 MATERIAIS E MÉTODOS
4.1 Linhagens
Foram utilizadas 42 linhagens de B. andropogonis cedidas pela Coleção de Culturas de Fitobactérias do Instituto Biológico (IBSBF), do Laboratório de Bacteriologia Vegetal do Centro Experimental do Instituto Biológico, Campinas, SP. (Tabela 1).
31 Tabela 1. Linhagens de B. andropogonis utilizadas nesse estudo.
IBSBF Hospedeiro Origem Outras Coleções
155* Triplaris filipensis Brasil
165 Coffea arabica Brasil
166 Coffea arabica Brasil
169* Coffea arabica Brasil
199T* Sorghum bicolor E.U.A. ATCC 23061
236* Mucuna deeringiana Zimbábue ATCC 2329
237* Bougainvillea sp. Zimbábue ICMP 3996
396* Sorghum bicolor Brasil ICMP 8039
398* Dianthus caryophyllus E.U.A. ATCC 19311
399* Dianthus caryophyllus Suécia ICMP 4003
406* Sorghum bicolor Brasil ICMP 8042
520* Dianthus caryophyllus Brasil NCPPB 3444
854* Zea mays E.U.A. ATCC 23062
1123 Bougainvillea sp. Brasil
1124 Bougainvillea sp. Brasil
1125* Bougainvillea sp. Brasil
1129 Bougainvillea sp. Brasil
1130 Bougainvillea sp. Brasil
1134* Vaccinium sp. Austrália Hayward 933b
1135* Ceratonia siliqua Austrália Hayward 1278
1136* Gypsophila sp. Austrália Hayward 1424
2594* Ruscus sp. Brasil
2595 Ruscus sp. Brasil
3092* Cicer arietinum Austrália ICMP 7076
3101* Trifolium repens E.U.A ICMP 3997
3102* Simmondsia chinensis Austrália ICMP 14568
3126* Setcreasea pallida E.U.A ICMP 8685
3127* Limonium sinuatum Austrália ICMP 11987 3196 Dianthus caryophyllus Nova Zelândia ICMP 7855 3197 Dianthus caryophyllus Nova Zelândia ICMP 7856 3199 Simmondsia chinensis Austrália ICMP 14567
3200 Coffea arabica Brasil ICMP 6779
3201 Triplaris filipensis Brasil ICMP 9905
3202 Vaccinium sp. Austrália ICMP 11986
3203 Sorghum sp. Austrália ICMP 11988
3204 Setcreasea pallida E.U.A ICMP 8665
3163 Sorghum bicolor Japão LMG 6874
3164 Dianthus caryophyllus Austrália LMG 6950
3165 Bougainvellea sp. Zimbábue LMG 6872
3166 Trifolium repens Austrália LMG2327
3167 Trifolium repens E.U.A LMG 6875
3168 Zea mays E.U.A LMG 2128
IBSBF (Coleção de Cultura de Fitobactérias do Instituto Biológico, São Paulo, Brasil); ATCC (American
Type Culture Collection, USA); ICMP (International Collection of Micro-organisms from Plants, New Zealand); NCPPB (National Collection of Plant Pathogenic Bacteria, United Kingdom), LMG (Laboratory of Microbiology Gent Bacteria Collection).*Linhagens selecionadas para os testes de patogenicidade em diferentes plantas hospedeiras; Hayward, C.(Centre for Bacterial Diversity and Identi¢cation, Department of
32 4.2 Extração de DNA cromossômico
A extração do DNA cromossômico das linhagens de B. andropogonis foi realizada de acordo com a metodologia descrita por Pitcher e colaboradores (1989). A pureza e quantificação dos DNAs das amostras foram realizadas através de eletroforese em gel de agarose 0,6% em tampão TAE 1X (0,04 M Tris-acetato/0,001 M EDTA). Os géis foram corados com brometo de etídeo (10 mg/mL), visualizados em transiluminador de luz ultra-violeta e fotografados em sistema digital Alpha Innotech 2200.
4.3 Autenticação das linhagens de B. andropogonis por amplificação com par o de
primers espécie-específicos
Testes preliminares foram realizados para confirmação da especificidade do par de primers espécie-específicos para B. andropogonis Pf (5’ AAG TCG AAC GGT AAC AGG GA 3’) e Pr (5’ AAA GGA TAT TAG CCC TCG CC 3’), descrito por Bagsic e colaboradores (1995). Para a autenticação das 42 linhagens de B. andropogonis as amplificações do DNA genômico foram realizadas em reações de 25 µL contendo 100 ng de DNA genômico; 2,0 U de enzima Taq polimerase (Fermentas); 1X de tampão da enzima Taq DNA polimerase (Fermentas); 200 µM do mix de dNTPs; e 0,4 μM de cada primer. O programa de amplificação das amostras consistiu de um ciclo de desnaturação inicial a 96 °C/5 min.; seguido de 25 ciclos a 94 °C/30 seg.; 62 °C/30 seg. e 72 °C/5 min; e um ciclo de extensão final a 72 °C/5 min. As amplificações foram realizadas em termociclador (Axygen MaxyGene, California, USA) e os produtos de amplificação foram submetidos à eletroforese em gel de agarose 1,5% em tampão TAE 1X e visualizados de acordo com o descrito no item anterior.
4.3 Caracterização bioquímica e fisiológica
A caracterização bioquímica e fisiológica foi realizada para as 42 linhagens de B. andropogonis, de acordo com Schaad e colaboradores (2001). As leituras dos ensaios foram realizadas após 2, 4, 7, 14 e 21 dias da inoculação e todos os testes foram efetuados em duplicata. Nos testes em que resultados negativos eram esperados, segundo a literatura, linhagens bacterianas sabidamente positivas para os referidos testes foram utilizadas como controle positivo. Como controle negativo utilizou-se o meio de cultivo sem a adição do inóculo bacteriano, apenas água destilada esterilizada.
33 4.3.1 Produção de ácidos a partir de carboidratos
Os testes foram realizadas em meio básico C (DYE, 1968) [NH4 H2 PO4 (0,5 g),
K2 HPO4 (0,5 g), Mg SO4. 7H2O (0,2 g) NaCl (0,5 g), extrato de levedo (1,0 g), ágar (12 g) e
água destilada (q.s.p. 1000 mL), pH 6,8], distribuído assepticamente em tubos de ensaio (2 mL) após autoclavagem a 121 °C/20 min./1 atm.
Todos os carboidratos foram esterilizados separadamente por filtração (membrana 0,22 µm) e adicionados ao meio básico para concentração final de 0,4%. Foram utilizadas as seguintes fontes: L(+)/L(-) arabinose; D(-) arabinose; frutose; galactose; manitol; D-sorbitol; celobiose; eritrol, maltose; sacarose e salicina. Após a adição dos carboidratos, 100 µL de suspensão de cada linhagem, na concentração de 108 UFC/mL (DO590 = 0,13), foram adicionados aos tubos separadamente.
4.3.2 Utilização de sais sódicos a partir de ácidos orgânicos
Os testes foram efetuados em meio básico OAA modificado (WILKIE; DYE, 1973) [NH4 H2 PO4 (1,0 g); KCl (0,2 g); Mg SO4. 7H2O (0,2 g); extrato levedo (0,8 g), azul de
bromotimol (BTB) 0,0016% e água destilada (q.s.p. 1000 mL), pH 6,8], distribuído assepticamente em tubos de ensaio (2 mL) após autoclavagem. Os sais de ácidos orgânicos foram esterilizados separadamente por filtração e adicionados ao meio básico para concentração final de 0,2%. Foram testados os seguintes ácidos: citrato; malonato; succinato; propianato e acetato. As suspensões de cada linhagem foram inoculadas separadamente de acordo com o descrito no item anterior.
4.3.3 Produção de urease
A atividade da urease foi avaliada pelo método descrito por Dye (1962) [NaCl (5,0 g), KH2PO4 (2,0 g), D-glucose (1,0 g), Ágar (15,0 g), vermelho fenol (0,0016%) e água
destilada (q.s.p. 1000 mL), pH 6,8 – 7,0], com adição de solução aquosa de uréia 20%, previamente esterilizada, resultando na concentração final de 2%. O meio basal sem a solução aquosa de uréia foi utilizado como controle. Ambos os meios foram inoculados com as suspensões de cada linhagem, como descrito no item 4.3.1.
34 4.3.4 Determinação da produção de oxidase
Para a determinação da enzima oxidase adotou-se o método de Kovacs (1956). Cerca de 10 µL de uma solução aquosa a 1% de N-N-dimetil-p-fenilenediamino (reagente fotossensível mantido no escuro) foram depositados em um pedaço de papel filtro. Com o auxílio de uma alça de platina, coletou-se uma quantidade da cultura bacteriana a ser testada, transferindo-a para o papel de filtro embebido com a solução. A leitura foi realizada em até 15 segundos após o contato da cultura com o reagente.
4.3.5 Teste de oxidação e fermentação (O/F)
O meio basal utilizado nessa análise foi o descrito por Hugh e Leifson (1953) [peptona (2,0 g), NaCl (5,0 g), K2HPO4 (0,3 g), ágar (3,0 g) BTB (solução aquosa 1%) e água destilada (q.s.p. 1000 mL), pH 7,1] com adição de 5 mL de glicose 40% previamente filtrada. O meio foi distribuído em tubos de ensaio (2 mL) e as linhagens bacterianas foram inoculadas com auxilio de uma alça de platina reta. As linhagens também foram inoculadas em tubos contendo óleo mineral esterilizado para promover um ambiente anaeróbio.
4.3.6 Teste de Arginina Dihidrolase
Os testes foram efetuados em meio básico 2A (THORNLEY, 1960) [peptona (1,0 g); NaCl (5,0 g); K2HPO4 (0,3 g); Ágar (3,0 g) vermelho fenol (0,01 g); L(+) arginina HCl
(10,0 g); água destilada (q.s.p. 1000 mL), pH 7,2]. O meio foi distribuído em tubos de ensaio (2 mL) e as linhagens bacterianas foram inoculadas com auxilio de uma alça de platina reta.
4.3.7 Liquefação de gelatina
Os testes foram efetuados em meio básico contendo: extrato de levedo (3,0 g); peptona (5,0 g); gelatina BDH (120 g); água destilada (q.s.p. 1000 mL). O meio foi distribuído em tubos de ensaio (2 mL). Cem microlitros de suspensão de cada linhagem, na concentração de 108 UFC/mL, foram adicionados aos tubos separadamente. Após o crescimento bacteriano (5 dias) os tubos foram incubados a 4 °C por 30 min antes da leitura.
4.4 Reação de hipersensibilidade (HR) em plantas de fumo
Suspensões bacterianas das 42 linhagens de B. andropogonis foram preparadas em água destilada esterilizada a partir de colônias de células em crescimento exponencial (48h/ 28 °C) em meio de cultivo Ágar Nutriente (NA), e ajustadas para concentração de 1 ×
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108 UFC/mL. As inoculações foram realizadas por infiltração nas nervuras da parte abaxial de cada folha. Como controle negativo, utilizou-se água destilada esterilizada, e as leituras foram realizadas com 24-48 horas após a inoculação.
4.5 Variabilidade patogênica em diferentes plantas hospedeiras
Vinte e uma linhagens de B. andropogonis, isoladas de diferentes plantas hospedeiras e diferentes países, foram selecionadas para os experimentos de casa de vegetação (apenas um representante de cada grupo). O inóculo foi preparado em solução salina (0,85%) esterilizada, a partir de colônias de células em crescimento exponencial (28 °C/48 h) em meio de cultivo NA, e ajustadas para concentração de 108 UFC/mL. Os experimentos foram conduzidos em casa de vegetação com variação de temperatura de 25 °C a 30 °C. Todas as linhagens foram inoculadas em plantas de milho (Zea mays), sorgo (Sorghum bicolor), ruscus (Ruscus sp.) café (Coffee arabica) e cravo (Dianthus caryophyllus).
Sementes de milho (Milho IAC Airan, obtido de hibrido comercial, 2012) e sorgo (Sorgo Granífero 2012) foram semeadas em vasos contendo 2 L de fertilizante orgânico composto classe B (Provaso), duas sementes por vaso. Após 20 dias da semeadura, as plantas foram inoculadas, em blocos casualizados, em três repetições cada, por meio da deposição de 0,5 mL de suspensão de células bacterianas no cartucho da planta, utilizando seringas de insulina esterilizadas. Após a inoculação, as plantas foram observadas diariamente e aos 30 dias, as linhagens foram avaliadas como não patogênicas (-) ou patogênicas (+), com base no aparecimento dos sintomas de estrias foliares.
Nos experimentos com café (mudas cedidas pelo Instituto Agronômico de Campinas - IAC), ruscus (Instituto Biológico – IB) e cravo (CEASA Campinas), mudas jovens (aproximadamente cinco meses) foram acondicionadas em sacos plásticos por 24 horas (câmara úmida) antes da inoculação. As plantas foram inoculadas, em blocos casualizados, em três repetições cada, por meio da pulverização manual em folhas previamente feridas com agulha hipodérmica esterilizada, e mantidas em câmara úmida por mais 48 horas. Após inoculação, as plantas foram observadas diariamente e aos 30 dias, as linhagens foram avaliadas como não patogênicas (-) ou patogênicas (+), com base no aparecimento de sintomas de manchas foliares.
Após a leitura dos experimentos, as folhas inoculadas, sintomáticas e assintomáticas, foram observadas ao microscópio óptico para visualização do fluxo
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bacteriano. O re-isolamento da bactéria foi realizado em meio de cultura NA e as placas foram mantidas em estufa por 28 °C/ 48 h. A confirmação da identidade dos isolados foi realizada por meio de amplificação por PCR utilizando-se o par de primers espécie-específicos para B. andropogonis Pr e Pf (BAGSIC et al., 1995), concluindo-se dessa forma, os Postulados de Koch. Os ensaios foram conduzidos em casa de vegetação no Instituto Biológico, nas dependências do Laboratório de Bacteriologia Vegetal (IB/APTA), em Campinas-SP.
4.6 Análise da diversidade genética por rep-PCR
Um grupo de 28 linhagens de B. andropogonis, isoladas de diferentes hospedeiros e origens distintas, foi selecionado para análise de rep-PCR e as amplificações foram realizadas utilizando-se os seguintes pares de primers: REP1R I (5’-III ICG ICG ICA TCI GGC- 3’) e REP2 I (5’-ICG ICT TAT CIG GCC TAC- 3’); ERIC1R (5’-ATG TAA GCT CCTGGG GAT TCA C-3’) e ERIC2 (5’-AAG TAA GTGACT GGG GTG AGC G-3’); BOX A1R (5’-CTA CGG CAA GGC GACGCT GAC G-3’) (LOUWS; RADEMAKER; de BRUIJN, 1999).
Cada reação de REP- e ERIC-PCR foi realizada em volume de 25 μL contendo 150 ng de DNA genômico; 2,5 U de enzima Taq polimerase (Fermentas); 1X de tampão da enzima Taq DNA polimerase (Fermentas); 200 µM do mix de dNTPs; 0,25 μM de cada primer e 3,0 mM de MgCl2. O programa de amplificação das amostras consistiu de um ciclo
de desnaturação inicial a 95 oC/6 min.; seguido de 30 ciclos a 94 oC/1 min.; 40 oC/1 min. e 65
o
C/8 min; e um ciclo de extensão final a 65 oC/16 min.
Cada reação de BOX-PCR foi realizada em volume de 25 μL contendo 150 ng de DNA genômico; 2,5 U de enzima Taq polimerase (Fermentas); 1X de tampão da enzima Taq DNA polimerase (Fermentas); 200 µM do mix de dNTPs; 0,5 μM do primer e 1,5 mM de MgCl2. O programa de amplificação das amostras consistiu de um ciclo de desnaturação
inicial a 95 oC/7 min.; seguido de 30 ciclos a 94 oC/1 min.; 53 oC/1 min. e 56 oC/8 min. e um ciclo de extensão final a 65 oC/16 min.
As amplificações foram realizadas em termociclador (Axygen MaxyGene), os produtos obtidos foram submetidos à eletroforese em gel de agarose 2,5% e visualizados de acordo com o descrito no item 4.2.
O tamanho dos fragmentos amplificados foi estimado por comparação com marcador molecular de 100 pb DNA Ladder (Fermentas), apenas bandas reprodutíveis
