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Apostila Prática de
Técnicas de Microcultivo
2 NORMAS EM UM LABORATÓRIO DE MICROBIOLOGIA
As aulas práticas visam ensinar aos alunos as metodologias utilizadas num laboratório de Microbiologia. Nessas aulas serão utilizados vários grupos de microrganismos, bactérias e fungos, alguns dos quais poderão ser patogênicos pelo que os alunos devem seguir um conjunto de regras de modo a evitar qualquer tipo de contaminações.
1- Não fumar nem comer no laboratório. Não levar à boca qualquer objeto nomeadamente lápis, canetas, etc.
2 - Antes de iniciar qualquer trabalho bem como ao terminá-lo lavar e desinfectar as mãos;
3 - Desinfectar a superfície da bancada que irá utilizar com álcool a 70%, antes e após a execução do trabalho;
4 - Evitar que objetos ou produtos inflamáveis fiquem próximos da chama;
5 - Todo o material usado (pipetas, lâminas, lamelas, etc...) deve ser colocado dentro do recipiente com desinfetante colocado na bancada para o efeito. As placas de Petri serão colocadas dentro do balde para posterior inativação;
6 - O estudante com cabelos longos deve prendê-los, sobretudo quando o trabalho exige a utilização do bico de Bunsen, de forma a não os queimar.
7- Comunicar imediatamente ao professor caso entorne alguma cultura ou quebre algum material; 8 - Comunicar imediatamente qualquer acidente como corte, queimadura, etc.
9- Antes de utilizar qualquer aparelho deve ler as normas de utilização; 10 - O microscópio deve ser manuseado com cuidado:
a) Guardar a capa debaixo da bancada e voltar a colocá-la no final;
b) Nunca deixar a lente de imersão suja de óleo, limpando-a com o lenço de papel seco. 11 - Não misturar material contaminado com o material esterilizado.
12 - Durante os trabalhos práticos evitar falar e deslocar-se desnecessariamente.
3 NOÇÕES BÁSICAS DE ASSEPSIA
Alguns cuidados devem ser tomados para se evitar a contaminação do manipulador como também dos meios de cultura empregados e das culturas microbianas.
1. Flambagem da alça ou fio de platina:
Tanto a alça quanto o fio de platina devem ser flambados antes e depois de qualquer operação de semeadura. Para tanto devem ser aquecidos e a parte inferior do cabo deve ser passada na chama por 2 a 3 vezes. A posição correta para a flambagem da alça é que a mesma faça um ângulo de 45o em relação à mesa de trabalho. Deve ser utilizado o cone interno da chama do bico de Bunsen. Para retirar o material, seja para fazer um esfregaço ou para uma semeadura, esfriar previamente a alça. Esta deverá ser esfriada na parte interna do tubo de ensaio ou na tampa da placa de petri;
Posição correta para a flambagem da alça
2. Toda vez que fizer uma semeadura utilizando tubos de ensaio, deve-se flambar a boca dos mesmos imediatamente após a retirada da tampa (ou tampão de algodão). Esta deverá ser mantida segura pelo dedo mínimo, da mão que está segurando a alça. Após a retirada do material com a alça, flambar novamente a boca do tubo e colocar a tampa. Não colocar os tampões sobre a bancada!!! Flambar a alça após o uso;
4 Removendo o tampão de algodão
3. As pipetas utilizadas em microbiologia são previamente esterilizadas, são oferecidas embrulhadas em papel (às vezes, dentro de um cilindro metálico). Para uso, torcer o papel na região central da pipeta, retirar primeiramente o papel da parte superior e depois a parte inferior (correspondente à ponta da pipeta). Esta seqüência evite que a pipeta seja contaminada pelas mãos do operador. Uma vez utilizada, a pipeta deve ser colocada dentro de uma cuba contendo solução desinfetante.
4. As placas de Petri deverão ser abertas próximo ao bico de Bunsen para evitar contaminação com germes do ar. Uma vez semeadas as placas devem ser incubadas em estufas com a tampa voltada para baixo.
5. Na semeadura usando placas de Petri, após flambar a alça até o rubro, e introduzi-la na cultura de bactéria, semear na placa de Petri .
Semeadura em placa: primeiro conjunto de estrias
6. Após a primeira estria, flambar novamente a alça, girar a placa cerca de 30˚ e puxar nova estria. Repetir esse passo pelo menos mais 2 vezes Essa técnica é conhecida também por esgotamento.
5 7. As placas serão incubadas a 37˚C por 24h, e depois guardadas a 4˚C até a próxima aula.
Semedura em placa: segundo e terceiro conjunto de estrias = eficiência no isolamento de colônias
Não esqueça!!!!!!
Sempre resfrie a alça (nas paredes do tubo de ensaio quando usar o mesmo, ou num pedaço do ágar sem cultura), antes de colocar a alça em contato com a cultura, lembre-se: ela está muito QUENTE!!!
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PRÁTICA 01
TÍTULO: Meio de Cultura
OBJETIVO: Utilização de meio seletivo-diferencial para identificação bacteriana
MATERIAIS:
2 placas de petri com meio Mac Conkey
alça de platina
1 tubo de cultura de Staphylococcus aureus
1 tubo de cultura de E. coli
PROCEDIMENTO:
1- Identificar cada placa de petri com o nome de um microrganismo.
2- Com a alça de platina flambada e resfriada, coletar uma pequena porção de E. coli e estriá-la na placa de petri.
3- Repetir o procedimento, utilizando a cultura de S. aureus.
4- Incubar as placas à 36 graus por 48 horas.
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PRÁTICA 02
TÍTULO: Meio de cultura
OBJETIVO: Utilização de meio diferencial (Baird Parker) para observação e isolamento de
Staphylococcus aureus
MATERIAIS:
2 placas de petri contendo meio Baird Parker (obs: a suplementação com gema de ovo deverá ser feita na hora do plaqueamento).
1 tubo de cultura de Staphylococcus aureus em caldo BHI
alça de platina
PROCEDIMENTO:
1- Esperar o resfriamento do meio de cultura após o plaqueamento.
2- Com a alça de platina flambada e resfriada, coletar uma amostra da cultura do microrganismo e estriá-la sobre a superfície do ágar, conforme ilustração da lousa.
3- Incubar as placas na posição invertidas a 36 graus por 48 horas.
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PRÁTICA 03
TÍTULO: Nutrição e metabolismo bacteriano
OBJETIVO: Observar os diferentes metabolismos apresentados pelas bactérias com utilização de diversos meios de cultura.
MATERIAIS:
2 tubos contendo 5 ml de caldo lactosado com tubo de Durhan
2 tubos contendo 5 ml de caldo uréia
2 tubos contendo 2 ml de caldo BHI
2 tubos contendo 5ml de ágar TSI ( inclinado)
2 tubos de meio citrato Simmons (Agar inclinado )
Culturas diversas de microrganismos a serem estudados.
Alça de platina
Agulha de platina
Pipetas de 1 ou 2 ml esterilizadas PROCEDIMENTO:
1- Identificar cada meio de cultura com o respectivo microrganismo a ser inoculado.
2- Observar o tipo de inoculação, com alça, agulha de platina ou pipeta.
3- Incubar todos os testes à 36 graus por 48 horas.
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PRÁTICA 04
TÍTULO: Nutrição Bacteriana
OBJETIVO: Utilização de fonte de carbono MATERIAIS:
1 tubo de cultura de Pseudomonas aeruginosa
1 tubo de cultura de E.coli
2 tubos do meio citrato Simmons
Alça de platina
PROCEDIMENTO:
1-Identificar cada tubo de ensaio de meio de cultura com o microrganismo a ser inoculado;
2-Com a alça de platina flambada e resfriada, inocular uma porção do microrganismo a ser inoculado
3-Incubar as placas à 36 graus por no mínimo 48 horas.
4-Observar e concluir.
PRÁTICA 05
TÍTULO: Cultivo de Fungos
OBJETIVO: Utilização de meio seletivo para fungos filamentosos
MATERIAIS:
1 placa de petri com meio Saboraud ou PDA
PROCEDIMENTO:
1-Verter o meio específico na placa
2-Abriicar a placa com meio por 5 minutos em qualquer ambiente da ETECAP.
3-Incubar as placas a 22 graus por no mínimo 72 horas.
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PRÁTICA 06
TÍTULO: Cultura Pura
OBJETIVO: Aprender técnicas de isolamento de microrganismos(Esgotamento)
PARTE A - Estriamento sobre superfície do ágar, empregando alça de platina
MATERIAIS:
2 placas de petri com meio PCA
alça de platina
1 tubo de cultura de E.coli /S.aureus em meio líquido, incubado por 24 horas.
PROCEDIMENTO:
1- Com a alça de platina flambada e resfriada, coletar uma alíquota do microrganismo e estriá-lo sobre o meio de cultura.
2- Após a primeira estria, flambar novamente a alça, girar a placa cerca de 30˚ e puxar nova estria. Repetir esse passo pelo menos mais 2 vezes .
3- As placas serão incubadas a 37˚C por 24h, e depois guardadas a 4˚C até a próxima aula.
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PRÁTICA 07
TÍTULO: Contagem padrão de bactérias mesófilas aeróbias estritas e facultativas viáveis facultativas (Pour-Plate e Spread Plate)
OBJETIVO: Emitir o resultado da contagem de células presentes em uma amostra de suspensão de bactérias através da técnica pour-plate.
MATERIAIS:
1 tubo contendo suspensão de microrganismo
5 tubos contendo 9,0 ml de água peptonada à 0,1%
4 placas de petri vazias e esterilizadas
8 pipetas de 1,0 ml esterilizadas
erlenmayer com 200 ml de meio PCA fundido
alça de Drigaslki
PROCEDIMENTO (Pour Plate):
1- Pipetar 1,0 ml da suspensão do microrganismo e transferir para o primeiro tubo de diluição. 2- Homogeneizar o tubo, retirar 1,0 ml e transferir para o segundo tubo de diluição.
3- Repetir o processo de diluição até o 5° tubo OBS: A técnica será explicada na lousa.
4- Retirar 1 ml das últimas diluições ,transferindo-as para as placas estéreis 5- Em seguida, verter de 15 a 20 ml de ágar fundido (temperatura ambiente)
6- Homogeneizar lentamente com movimentos rotatórios (em forma de oito) e deixar solidificar sobre a bancada.
7- Incubar as placas a 36 graus por 24 horas. 8- Fazer a leitura das placas e concluir a aula.
PROCEDIMENTO (Spread Plate):
1- Utilizar as diluições do procedimento anterior; 2- Verter o meio de cultura nas placas estéreis,
3-Retirar 0,1 das ultimas diluições e transferir para as placas com ágar solidificado;
4-Com a alça de Drigalski esterilizada, espalhar os inócuos nas superfícies dos meios de cultura,começando do mais diluído para o menos diluído,
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PRÁTICA 08
TÍTULO: Utilização de agentes químicos na assepsia
OBJETIVO: Utilização de agentes químicos e verificar a eficiência de cada um . MATERIAIS: 1 placa de petri gaze estéril Álcool 70% Álcool iodado PROCEDIMENTO:
1-dividir uma placa de Petri com Agar em 4 quadrantes 2- semear os 4 quadrantes da seguinte forma:
- 1º quadrante: um aluno deve encostar o dedo suavemente no Agar
- 2º quadrante: outro aluno deve lavar o dedo com água e sabão por 1 minuto, secar com gaze estéril e fazer a impressão do dedo
- 3º quadrante: outro aluno deve fazer a antissepsia de seu dedo com gaze embebida em álcool 70% e realizar impressão do dedo
- 4º quadrante: outro aluno deve fazer a antissepsia de seu dedo com gaze embebida em álcool Iodado e secar com gaze estéril e fazer a impressão do dedo
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PRÁTICA 09
TÍTULO: Antibiograma
OBJETIVO: Testar diferentes antibiogramas em uma cultura bacteriana MATERIAIS:
Cultura bacteriana (E.coli,S.aureus e B.cereus)
3 placas de petri com Agar Mueller-Hinton
Swab estéril
Pipeta estéril
4 discos de antibióticos diferentes
Pinça estéril PROCEDIMENTO:
1- Embeber o swab na suspensão bacteriana padronizada e inocular na placa de Mueller-Hinton de modo a obter um crescimento confluente (estriar em pelo menos 3 direções)
2- Aguardar um tempo para que o Agar absorva o inóculo (mais ou menos 10 minutos) e, com o auxílio de uma pinça estéril, colocar os discos de antibióticos sobre o Agar, pressionando levemente cada disco para que este fique aderido ao meio.
3-Incubar a placa a 36 oC por 24hs
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PRÁTICA 10
TÍTULO: Pesquisa de produtos naturais antibacterianos.
OBJETIVO: Verificar a eficácia de compostos antimicrobianos em vegetais nas culturas bacterianas
MATERIAIS:
Placas de ágar PCA ou NA
Alho e cebola;
Swab;
Placa de petri e pistilo;
Discos de papel de filtro;
Culturas: Staphylococcus sp e E. coli.
PROCEDIMENTO
1. Mergulhar o swab na suspensão do microrganismo;
2. Espalhar sobre a superfície do meio com swab embebido na cultura; 3. Macerar o alho e a cebola, separadamente, em uma placa de petri,
4. Embeber os discos de papel de filtro no macerado e colocá-los sobre a superfície do meio semeado;
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PRÁTICA 11
TÍTULO: Microbiologia da água
OBJETIVO: Determinar a contagem padrão de microrganismos aeróbios mesófilos estritos e facultativos viáveis
MATERIAIS
amostra de água
100 ml de PCA fundido
3 placas de petri esterilizadas
3 pipetas de 1,0 ml esterilizadas
5 tubos contendo 9,0 ml de solução salina estéril Procedimento
1-Realizar a diluição seriada da amostra diluindo 1 ml no primeiro tubo e transferindo 1 ml para o tubo correspondente, e realizar esta diluição até o último tubo;
2-Retirar 1,0 ml das 2 ultimas diluições ( 10-4 e 10-5) e transferir para a placa de petri; 3-Verter 15,0 ml de PCA do meio liquefeito em cada placa;
4-Homogeneizar as placas e deixar solidificar na bancada 5-Incubar as placas a 36o C pó 48 hs
6-Fazer a contagem
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PRÁTICA 12
TÍTULO: Microbiologia da água
OBJETIVO: Determinar o NMP de coliformes totais e fecais na água Parte A: Teste presuntivo para coliformes fecais
MATERIAIS:
amostra de água
2 tubos com 10,0 ml de caldo lactosado (com concentração dupla) com tubo de duhran
2tubos com 5,0 ml de caldo lactosado (com concentração simples) com tubo de duhran
1 pipeta de 10 ml esterilizada
2 pipetas de 5,0 ml esterilizadas PROCEDIMENTO
1- Realizar a diluição seriada da amostra diluindo 1 ml no primeiro tubo e transferindo 1 ml para o tubo correspondente, e realizar esta diluição até o último tubo;
2-Retirar 1,0 ml das 2 ultimas diluições ( 10-4 e 10-5) e inocular nos tubos com caldo lactosado (com concentração dupla);
3- Retirar 1,0 ml das 2 ultimas diluições ( 10-4 e 10-5) e inocular nos tubos com caldo lactosado (com concentração simples);
4-Incubar todos os tubos a 36oC por 48hs 5-Observar a presença de gás nos tubos e anotar.
Parte B: Teste Confirmativo para coliformes fecais MATERIAIS:
tubos positivos do teste anterior;
tubos contendo 5,0 ml de caldo lactosado bili verde brilhante (CLBVB) com tubo de duhran. A quantidade de tubo utilizada será igual o número de tubos positivos;
pipetas esterilizadas PROCEDIMENTO
1-Transferir 1 a 2 gotas de cada tubo positivo do teste anterior para CLBVB 2-Incubar todos os tubos a 36oC por 48hs
3-Observar a presença de gás nos tubos e anotar. 4-Guardar os tubos para a próxima etapa.
17 Parte C: Determinação de coliformes fecais
MATERIAIS:
tubos positivos do teste anterior;
tubos contendo 5,0 ml de caldo EC com tubo de duhran
banho Maria de 45,5 graus
pipetas esterilizadas PROCEDIMENTO
1-Transferir 1 a 2 gotas de cada tubo positivo do teste anterior para caldo EC 2-Incubar todos os tubos em banho maria sob agitação de 48hs
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PRÁTICA 13
TÍTULO: Microbiologia de alimentos
OBJETIVO: Verificar a presença de microrganismos em alimentos
MATERIAIS:
5 Tubos de ensaio com solução salina estéril
Meios de Cultura: PCA ou NA
2 Placas de Petri
alça de Drigalski
PROCEDIMENTO:
Isolamento de micro-organismos do queijo: homogeneização e diluição seriada
1-Junto à chama do bico de Bunsen transfira 1,0 g da amostra triturada para um tubo contendo 9,0 ml de solução salina esterilizada;
2-Agite vigorosamente a suspensão preparada no passo anterior e deixe por 10 minutos sob agitação de 150 rpm, de modo a obter uma suspensão homogênea da amostra, facilitando a suspensão da maior parte das células dos micro-organismos adsorvidas nas partículas da amostra;
3-Junto à chama do bico de Bunsen, transfira 1,0 mL da suspensão original (preparada acima – diluição 10-1) para tubos de ensaio contendo 9,0 ml de solução salina estéril, de modo a obter a diluição 10-2. Faça diluições sucessivas até 10-5. Não se esqueça de homogeneizar a amostra em suspenção em cada nova diluição a ser realizada;
4-Faça a semeadura em placas de Petri, pipetando 0,1 mL das ultimas diluições , espalhando o inoculo com alça de Drigalski (plaqueamento em superfície) em placa de Petri contendo meio PCA ou NA;
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PRÁTICA14
TÍTULO: Microbiologia do Ar
OBJETIVO: Após a realização da atividade prática você deverá ser capaz de constatar a presença de bactérias no ambiente; compreender a importância dos critérios básicos de higiene na produção e manipulação de alimentos, visando evitar a contaminação dos mesmos por bactérias ambientais
MATERIAIS:
01 placa com Agar NA ou PCA divididas em 4 quadrantes
-04 placa com Agar NA ou PCA
01 swab estéril PROCEDIMENTO
1- Inocular em cada quadrante, respectivamente: - a impressão do dedo polegar
- um “carimbo” do tecido do jaleco - alguns fios de cabelo
- um swab previamente passado sobre a bancada de trabalho 2-Incubar a 37o C por 24 horas
3-Analisar o crescimento obtido
2- Abrir as placas, fora da área de segurança, deixando cada uma por 5’, 10’, 15’ e 20’, fechando quando atingido o tempo respectivo. Incubar a 37o C por 24 horas e analisar o crescimento obtido.
