Trabalho realizado no Laboratório de Imunologia Celular e Inflamação do Departamento de Microbiologia e Imunologia do Instituto de Biologia da Universidade Estadual de Campinas, contando com financiamento da FAPESP e CNPq e uma bolsa de doutoramento do CNPq
confiança e compreensão nos momentos difíceis.
- A todos os professores que passaram em minha vida, que de uma maneira direta ou indireta contribuíram para a minha formação tendo, portanto, um papel fundamental na elaboração desta tese.
AGRADECIMENTOS
- Aos órgãos de fomento à pesquisa, CNPq e FAPESP, pelo apoio financeiro concedido ao desenvolvimento deste trabalho, através de concessão de bolsa de doutoramento e auxílio à pesquisa;
- À Profa. Dra. Wirla M. S. C. Tamashiro, mais do que orientadora, uma grande professora que teve um papel fundamental durante toda minha formação acadêmica;
- À Dirce Lima Gabriel, pelo apoio e auxílio nos experimentos;
- À Dra. Patrícia Ucelli Simioni, por toda ajuda e companheirismo; por quem tenho grande estima e gratidão;
- Aos funcionários do Biotério do DMI, em especial ao Marcos César Meneghetti, que souberam colaborar com o andamento das pesquisas;
- Aos funcionários do Hemocentro, em particular à Fernanda Gonçalves Pereira, pelo auxílio durante ensaios de citometria de fluxo;
- Aos professores e funcionários do DMI;
- Às professoras, Dra. Liana Maria Cardoso Verinaud, Dra. Maria Marluce dos Santos Vilela, pela cuidadosa análise prévia desse trabalho;
- Às minhas irmãs, Lauren e Flaviane, por estarem sempre ao meu lado, em especial à Flaviane que sempre serviu de exemplo e me incentivou a seguir a carreira docente;
SUMÁRIO página ABREVIATURAS ... xii RESUMO ... xiv ABSTRACT ...…... xvi I- REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ... 1
• AS CÉLULAS DENDRÍTICAS E SUA IMPORTÂNCIA NA REGULAÇÃO DAS RESPOSTAS IMUNOLÓGICAS ... 2
• BIOLOGIA DAS CÉLULAS DENDRÍTICAS ... 6
• TOLERÂNCIA ORAL ... 10
• CÉLULAS DENDRÍTICAS E A TOLERÂNCIA ORAL ... 16
• O METABOLISMO DA L-ARGININA E SUA IMPORTÂNCIA NAS RESPOSTAS IMUNES ... 21
II- OBJETIVO ... 25
III- MATERIAL E MÉTODOS ... 27
1. ANIMAIS... 28
2. REAGENTES... 28
3. GRUPOS EXPERIMENTAIS ... 29
3.1. INDUÇÃO DE TOLERÂNCIA ORAL ... 29
3.2. TRATAMENTOS COM NOHA E L-NAME ... 30
4. DETECÇÃO DE ANTICORPOS SÉRICOS ANTI-OVALBUMINA ... 31
5. DIFERENCIAÇÃO IN VITRO DE CÉLULAS DENDRÍTICAS ... 32
6. MODULAÇÃO DE BMDCS ... 33
6.1. MODULAÇÃO COM CITOCINAS ... 33
6.2. MODULAÇÃO COM NOHA E L-NAME ... 33
7. CITOMETRIA DE FLUXO ... 34
8. WESTERN BLOTTING ... 35
8.1 PREPARO DAS AMOSTRAS ... 35
8.2. ELETROFORESE ... 36
8.3. DETECÇÃO DAS ENZIMAS... 36
. 9. DOSAGEM DE ÓXIDO NÍTRICO ... 37
11. ENSAIOS DE APRESENTAÇÃO ANTIGÊNICA ... 39
11.1. OBTENÇÃO DE LINFÓCITOS TCD4+ DE LINFONODOS MESENTÉRICOS ... 39
11.2 CO-CULTURAS DE CÉLULAS TCD4+ E BMDCs ... 40
12. TRANSFERÊNCIA ADOTIVA DE BMDCs ... 41
13. PROLIFERAÇÃO ANTÍGENO-ESPECÍFICA DE ESPLENÓCITOS E CÉLULAS DE LINFONODOS MESENTÉRICOS APÓS TRANSFERÊNCIA ADOTIVA DE BMDCs ... 42
14. DETECÇÃO DE CITOCINAS POR ELISA ... 43
15. ANÁLISES DOS RESULTADOS ... 43
IV- CAPÍTULO 1 ... 44
1. INTRODUÇÃO ... 45
2. OBJETIVO ... 48
3. ESTRATÉGIA EXPERIMENTAL ... 48
4. RESULTADOS ... 49
4.1. GERAÇÃO DE CÉLULAS DENDRÍTICAS MURINAS IN VITRO E AVALIAÇÃO DE SUAS CARACTERÍSTICAS FENOTÍPICAS... 49
4.2. MODULAÇÃO DE BMDCS IN VITRO COM AGENTES PRO- E ANTI-INFLAMATÓRIOS E AVALIAÇÃO DE SUAS CARACTERÍSTICAS FENOTÍPICAS... 51
4.3. RESPOSTA IMUNE DE CAMUNDONGOS BALB/C E DO11.10 À OVLBUMINA ... 52
4.4. EFEITO DE BMDCS MODULADAS SOBRE A PROLIFERAÇÃO ANTÍGENO-ESPECÍFICA E PRODUÇÃO DE CITOCINAS EM CÉLULAS TCD4+ DE CAMUNDONGOS BALB/C IMUNES OU TOLERANTES À OVALBUMINA... 54
4.5. EFEITO DE BMDC MODULADAS SOBRE A PROLIFERAÇÃO ANTÍGENO-ESPECÍFICA E PRODUÇÃO DE CITOCINAS EM CÉLULAS TCD4+ DE CAMUNDONGOS DO11.10 TRATADOS COM OVALBUMINA ... 59
4.6. EFEITOS DA TRANSFERÊNCIA ADOTIVA DE BMDCs MODULADAS IN VITRO SOBRE A RESPOSTA IMUNE DE CAMUNDONGOS BALB/C ... 64
4.7. EFEITOS DA TRANSFERÊNCIA ADOTIVA DE BMDCs MODULADAS IN VITRO SOBRE A RESPOSTA IMUNE DE CAMUNDONGOS DO11.10 ... 67
5. DISCUSSÃO ... 69
6. CONCLUSÕES ... 75
1. INTRODUÇÃO ... 78
2. OBJETIVO ... 81
3. ESTRATÉGIA EXPERIMENTAL ... 81
4. RESULTADOS ... 82
4.1. EFEITOS DA INIBIÇÃO DE INOS E ARGINASE SOBRE EXPRESSÃO DE MOLÉCULAS CO-ESTIMULATÓRIAS EM BMDCS ... 82
4.2. PROLIFERAÇÃO ANTÍGENO ESPECÍFICA E PERFIL FENOTÍPICO DE CÉLULAS TCD4+ CULTIVADAS COM BMDCS MODULADAS COM L-NAME E NOHA ... 85
4.3. EFEITO DA TRANSFERÊNCIA ADOTIVA DE BMDCS MODULADAS COM L- NAME E NOHA SOBRE A RESPOSTA IMUNE DE CAMUNDONGOS BALB/C E DO11.10 ... 93 5. DISCUSSÃO ... 98 6. CONCLUSÕES ... 103 VI- CAPÍTULO 3 ... 105 1. INTRODUÇÃO ... 106 2. OBJETIVO ... 109 3. ESTRATÉGIA EXPERIMENTAL ... 109 4. RESULTADOS ... 110
4.1. EFEITO DA INIBIÇÃO DE INOS E ARGINASE SOBRE AS RESPOSTAS IMUNES DE CAMUNDONGOS BALB/C E DO11.10 ... 110
4.2. EFEITO DO TRATAMENTO DE CAMUNDONGOS BALB/C E DO11.10 COM L-NAME E NOHA SOBRE O FENÓTIPO DE DCS ESPLÊNICAS ... 115
5. DISCUSSÃO ... 117
6. CONCLUSÕES ... 123
VII- REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 125
ABREVIATURAS
AL(OH)3 - Hidróxido de alumínio APC- Aloficocianina
APCs- Células apresentadoras de antígeno ARG- Arginase
BMDC – Células dendríticas derivadas da medula óssea BSA - Soro albumina bovina
CD - Cluster of differentiation
CpG - Seqüência citidina-guanina não metilada de DNA bacteriano CSFE - 5(6)carboxifluoresceina diacetato, succinimidil éster CTLA-4 - Proteína associada à linfócitos T citotóxicos 4 DCs - Células dendríticas
DMSO - Dimetilsulfoxido
ELISA - Enzyme linked immunoabsorbant assay FBS - Soro fetal bovino
FITC - Isotiocinato de fluoresceína
FLT3-L - FMS-like tyrosine kinase 3 ligand Foxp3 – forkhead box P3
GITR - glucocorticoid-induced TNF receptor-related protein GM - CSF - Fator estimulador de colônia de granulócito/ macrófago H3PO4 – Ácido fosfórico
H2SO4 - Ácido sulfúrico
HBSS - Solução salina balanceada de Hank’s
HEPES - N-[2-hidroxietil] piperazina N’[2-ácido etanesulfóico] HRPO – Peroxidase
IBD – Infection bowel disease iNOS- óxido nítrico sintase induzível I.p. - Intraperitoneal
IFN-γ - Interferon gamma Ig - Imunoglubilina IL- Interleucina
ILT – Immunoglobulin like trasnscript L-NAME - N-Omeganitro-L-Arginina LNM – Linfonodo mesentérico
LPS - Lipopolissacarídio
MHC - Complexo de histocompatibilidade principal MnCl2 – Cloreto de manganês
mTOR - Mammalian target of rapamycin
MTT - 3-[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5 bromidio difeniltetrazolio NaCl – Cloreto de sódio
NFAT – Fator nuclear de ativação de células T NFκB – Fator nuclear de ativação kapa B NK - Natural Killer NO – Óxido nítrico NOHA - NG-Hidroxi-L-arginina OPD - Ortofenilenodiamina OVA - Ovalbumina PBS - Salina tamponada
PD-L – Programmed death ligand PE – Ficoeritrina
PerCP – Proteína peridinina Clorofila-a Runx - Runt-related transcription factor SDS - Dodecilsulfato de sódio
STAT – sinal de transdução e ativador da transcrição TCR - Receptor de células T
TGF - Fator transformador de crescimento TH1 - Linfócitos T helper tipo 1
TH2 - Linfócitos T helper tipo 2 TLR - Receptor do tipo toll TNF - Fator de necrose tumoral Tregs – Células T reguladoras
RESUMO
As células dendríticas (DCs) desempenham um papel central na iniciação de respostas de células T. Neste trabalho, investigamos os efeitos de células dendríticas derivadas da medula óssea (BMDC) sobre a resposta imune de camundongos BALB/c e DO11.10. Observou-se que a modulação de BMDCs com LPS+TNF-α elevou a expressão de CD80, CD86 e CD40 e com IL-10+TGF-β aumentou a expressão de CD86 e CD40. BMDCs moduladas com LPS+TNF-α induziram a produção de citocinas TH1 e TH2 em TCD4+ de linfonodos mesentéricos (LNM) de todos os grupos de BALB/c e DO11.10, bem como de células T reguladoras CD25+Foxp3+ (Tregs) em DO11.10 e BALB/c imunizados por via i.p. A transferência adotiva de BMDCs moduladas com LPS+TNF-α aumentou a produção de anticorpos em camundongos BALB/c, bem como a proliferação e produção de IFN-γ por células TCD4+ de DO11.10. BMDCs moduladas com IL-10+TGF-β elevaram a proliferação, bem como a expansão de Tregs, em células TCD4+ de DO11.10 e BALB/c imunizados, mas reduziu significativamente a produção de citocinas TH1 e TH2. A transferência adotiva de BMDCs moduladas com IL-10+TGF-β para camundongos BALB/c elevou a níveis de anti-OVA, mas não teve efeito sobre a proliferação de células TCD4+ de camundongos tolerizados ou imunizados. Em DO11.10, a transferência de BMDCs moduladas com IL-10+TGF-β não alterou os níveis de anticorpos, mas reduziu a proliferação de células T esplênicas dos transgênicos imunizados, bem como a produção de IL-2 e INF-γ nessas culturas. O tratamento de BMDCs com L-NAME elevou a expressão de CD80 e reduziu a de CD40, enquanto a NOHA elevou a expressão CD80 e CD86, mas reduziu CD40. BMDCs tratadas com L-NAME não alteraram a proliferação de células TCD4+ de BALB/c e DO11.10, mas as BMDCs tratadas com NOHA reduziram a proliferação e produção de citocinas
por células TCD4 de ambas as linhagens. A expressão CD28 e CTLA-4 não se modificou em células TCD4+ de BALB/c e DO11.10 co-cultivados com BMDCs moduladas com os inibidores. A freqüência de Tregs aumentou pelo cultivo de células TCD4+ de BALB/c imunizados com BMDCs moduladas ou não. A freqüência de Tregs foi mais elevada quando as células TCD4+ de camundongos DO11.10 foram co-cultivadas com BMDCs não moduladas. A transferência adotiva de BMDCs moduladas com L-NAME para camundongos BALB/c elevou os níveis de anticorpos séricos, enquanto a de BMDCs moduladas com NOHA diminuiu a resposta proliferativa das células T esplênicas, mas não afetou a proliferação de células TCD4+ de LNM e nem a produção de citocinas TH1 e TH2. Em DO11.10, a transferência adotiva de BMDCs modulada com os inibidores não teve efeito sobre os níveis de anticorpos, bem como sobre a proliferação e produção de citocinas in vitro por células T esplênicas e de LNM. Embora a administração de L-NAME e NOHA não tenha resultado em nenhuma alteração na expressão de CD80, CD86 e CD40 nas DCs esplênicas de ambos BALB/c e DO11.10, notamos uma redução significativa da produção de anticorpos nesses animais, mas teve menos efeitos in vitro sobre a resposta proliferativa e produção de citocinas por células T esplênicas.
ABSTRACT
Dendritic cells (DCs) play a central role in the initiation of T cell responses. In this study, we investigated the effects of dendritic cells derived from bone marrow (BMDC) on the immune response of BALB/c and DO11.10. It was observed that the modulation of BMDCs with LPS+TNF-α increased the expression of CD80, CD86 and CD40 and IL-10 +TGF-β increased the expression of CD86 and CD40. BMDCs modulated with LPS+ TNF-α induced the production of TH1 and TH2 cytokines in CD4+ T cells of mesenteric lymph nodes (LNM) of all groups of BALB/c and DO11.10, as well as regulatory T cells CD25+Foxp3+ (Tregs) in DO11.10 and BALB/c mice immunized by i.p. route. The adoptive transfer of BMDCs modulated with LPS+TNF-α increased the production of antibodies in BALB/c, as well as the proliferation and IFN-γ production by T CD4+ cells from DO11.10. BMDCs modulated with IL-10+TGF-β increased the proliferation and expansion of Tregs in TCD4+ cells from DO11.10 and BALB/c mice immunized, but significantly reduced the production of TH1 and TH2 cytokines. The adoptive transfer of BMDCs modulated IL-10+TGF-β to BALB/c mice increased the levels of anti-OVA, but had no effect on the proliferation of TCD4+cells from mice tolerized or immunized. In DO11.10, the adoptive transfer of BMDCs modulated IL-10+TGF-β did not alter the levels of antibodies, but reduced the proliferation of splenic T cells of immunized transgenic mice, as well as the production of I2 and INF-γ in these cultures. Treatment of BMDCs with L-NAME increased the expression of CD80 and reduced CD40, while treatment with NOHA increased the expression of CD80 and CD86, but reduced CD40. BMDCs treated with L-NAME did not alter the proliferation of TCD4+ cells from BALB/c and DO11.10, but BMDCs treated with NOHA reduced proliferation and cytokine production by TCD4+ cells from both strains. The expression CD28 and CTLA-4 did not change in TCD4+ cells from BALB/c and DO11.10
co-cultured with BMDCs modulated with inhibitors. The frequency of Tregs increased by the cultivation of TCD4+ cells from immunized BALB/c mice with BMDCs modulated or not. The frequency of Tregs was higher when the TCD4+ cells from DO11.10 mice were co-cultured with BMDCs non modulated. The adoptive transfer of BMDCs modulated with L-NAME to BALB/c mice increased the serum antibody levels, whereas the BMDCs modulated with NOHA decreased the proliferative response of splenic T cells but did not affect the proliferation of TCD4+ cells of LNM and neither production of TH1 and TH2 cytokines. In DO11.10, the adoptive transfer of BMDCs modulated with the inhibitors had no effect on antibody levels, as well as on the proliferation and cytokine production in vitro by T cells from spleen and LNM. Although the administration of L-NAME and NOHA has not resulted in change in the expression of CD80, CD86 and CD40 on splenic DCs from both BALB/c DO11.10 led to a significant reduction in the production of antibodies in these animals, but had less effects in vitro on the proliferative response and cytokine production by splenic T cells.
AS CÉLULAS DENDRÍTICAS E SUA IMPORTÂNCIA NA REGULAÇÃO DAS RESPOSTAS IMUNOLÓGICAS
As DCs constituem uma população heterogênea de células apresentadoras de antígeno profissionais, derivadas de precursoras da medula óssea que migram dos vasos sanguíneos para os tecidos periféricos, onde se apresentam em diferentes estágios de desenvolvimento, ativação e maturação [MORELLI & THOMSON, 2007]. O processo de maturação de DCs foi inicialmente descrito por BANCHERAU & STEINMAN [1998]. Seus estudos mostraram que, na periferia, as DCs imaturas capturam antígenos e recebem sinais via receptores de superfície, tornando-se ativadas e capazes de induzir a diferenciação de células T naïve em células T efetoras. Entre as estruturas de reconhecimento de antígenos presentes em DCs destacam-se os receptores de reconhecimento de padrões moleculares (PRRs), particularmente os toll-like receptors (TLR). Nesse sentido, JOFFRE e colaboradores [2009] ressaltam o papel crucial da ativação via PRRs para que as DCs se tornem efetivamente capazes de ativar células T naïve em células T efetoras, uma vez que sinais pró-inflamatórios vindos do ambiente não são capazes de garantir a completa ativação destas células. Por outro lado, DCs podem atuar de maneira a inibir as repostas a certos antígenos, estimulando a expansão e diferenciação de células T reguladoras e levando à chamada tolerância periférica [Revisto por RUTELLA et al., 2006]. Contudo, ainda não há consenso na literatura sobre se as diferentes funções de DCs se correlacionam com fenótipos distintos, embora alguns autores tenham tentado associar os diferentes papéis das DCs nas respostas imunes quanto à expressão de moléculas co-estimulatórias e outros antígenos de superfície exibidos em decorrência da interação com estímulos pró ou antiinflamatórios [Revisto por REIS E SOUSA, 2006]. Nesse sentido, há relatos mostrando que DCs estimuladas com LPS [LUTZ et al., 2000] ou TNF-α [MENGES et al.,
2002], embora expressem altos níveis de CD80, CD86, CD83 e CD40, são capazes de gerar respostas tolerogênicas. Da mesma forma, há relatos mostrando que DCs ativadas com estímulos pró-inflamatórios são capazes de induzir anergia em células T efetoras [QUARATINO et al., 2000], bem como gerar células T reguladoras CD4+CD25+ na periferia [YAMAZAKI et al., 2003]. Recentemente, foi demonstrado que DCs esplênicas e de linfonodos mesentéricos, mesmo em presença de TGF-β mas na ausência de ácido retinóico, são capazes de originar a diferenciação de células TH17 [MUCIDA et al., 2007].
DAKIK e colaboradores [2003] mostraram que o desenvolvimento completo de DCs em camundongos só ocorre 5 semanas após o nascimento, apesar de já se encontrar células CD11c+ e pré-DCs plasmocitóides CD45RA+ no timo, baço e órgãos linfóides em camundongos neonatos (1 semana de idade). Comparadas às células de camundongos jovens (5 semanas de idade), as DCs de neonatos estão presentes em menor número nos tecidos, a proporção de DCs CD4−CD8α+ e CD4+CD8α− no baço encontra-se alterada e, funcionalmente, diferem na produção de IL-12p70 e INF-γ e na capacidade de apresentar antígeno.
YAMAZAKI e colaboradores [2008] demonstraram em murinos que DCs CD8+CD205+ são as principais responsáveis pela geração de células T reguladoras na periferia. Até recentemente, a atividade tolerogênica de DCs vinha sendo atribuída à ação de células em estágios intermediários de maturação. No entanto, é cada vez mais evidente que diferentes populações de DCs podem atuar tanto na indução de respostas imunogênicas quanto tolerogênicas a depender dos sinais provocados por antígenos próprios ou exógenos, os quais influenciarão tanto a maturação celular como a expressão de moléculas de superfície envolvidas com tolerância, tais como a molécula immunoglobulin-like transcript 3 (ILT-3) [MANAVALAN,
et al. 2003] , PD-L1 [WANG et al., 2009]. Além disso, citocinas e metabólitos produzidos por
DCs também desempenham papel importante no efeito tolerogênico exercido por estas células. Nesse sentido, destacam-se a IL-10 [HENRY et al., 2008] e os produtos oriundos do metabolismo de aminoácidos, tais como os do triptofano pela ação da idoleamina 2,3-dioxigenase (IDO) [MELLOR & MUNN, 2004] e da L-arginina pela ação das enzimas iNOS e arginases [BRONTE
et al., 2003]. Embora o papel dos produtos de metabolismo em DCs não esteja completamente
esclarecido, alguns estudos apontam seu envolvimento no desenvolvimento de células T reguladoras na periferia [RUTELLA et al., 2006].
Diversos trabalhos relatam que a inibição da expressão de moléculas co-estimulatórias CD80, CD86, CD40 e moléculas do MHCII são importantes para a caracterização de DCs com atividades tolerogênicas [STEINBRIK et al, 1997; STEINMAN & NUSSENSZWEIG, 2003]. Entretanto, dados recentes da literatura [RUTELLA et al., 2006; JOFFRE et al., 2009] revelam que outros mecanismos além da baixa co-estimulação de células T devem estar envolvidos na imunoregulação exercida pelas DCs. Também nesse sentido, CHUNG e colaboradores [2005] mostraram que a ativação de CD40 por anticorpos agonísticos não foi capaz de interferir na geração de células TCD4+ tolerantes que acompanhou a indução de tolerância por via oral. A inibição da geração células T tolerantes só foi observada quando, juntamente com a administração dos anticorpos agonistas de CD40, utilizou-se também anticorpos bloqueadores de TGF-β. Por outro lado, MANAVALAN e colaboradores [2003] observaram que DCs tolerogênicas geradas in vitro a partir da modulação com IL-10 apresentavam expressão mais elevada de ILT3 e ILT4 (LIR-2) na sua superfície do que DCs imaturas ou ativadas com estímulos pró-inflamatórios e que o bloqueio desses inibidores por
anticorpos específicos acarretou a perda da capacidade da DCs moduladas com IL-10 gerarem células T anérgicas.
Como destacado acima, um papel importante vem sendo atribuído às enzimas envolvidas no metabolismo de triptofano [MELLOR & MUNN, 2004] e L-arginina [BRONTE et
al., 2003] na função tolerogênica de DCs. A expressão de IDO por DCs parece ser importante
para a supressão de respostas imunes em diversas situações críticas tais como na tolerância materno fetal, doenças autoimunes e doenças inflamatórias crônicas [Revisto por MELLOR & MUNN, 2004]. Embora o mecanismo pelo qual as DCs IDO+ exercem a imunoregulação não esteja completamente esclarecido, tem sido observado que a depleção de triptofano bem como da geração de metabólitos, principalmente de queruneínas, levam à supressão da ativação das células T efetoras. Mais recentemente, também vem sendo atribuído às DCs IDO+ um papel importante na expansão de células T reguladoras na periferia [RUTELLA et al., 2006].
Células dendríticas e macrófagos utilizam a L-arginina para síntese de óxido nítrico (NO) e de poliaminas pela atividade da sintase induzível de NO (iNOS) e de arginases, respectivamente. Na presença de IL-4 e IL-13, a isoforma 1 da arginase (ARG-1) e um transportador de L-arginina são expressos concomitantemente por células mielóides, resultando em extensa depleção de L-arginina do meio extracelular. A degradação de L-arginina, por sua vez, se correlaciona com a redução da síntese das cadeias ζ da molécula de CD3 com conseqüente inibição da via de sinalização dependente do complexo TCR/CD3. Na vigência de níveis reduzidos de L-arginina, a porção redutase da iNOS é ativada levando à geração de espécies reativas de O2_ que em baixas concentrações de NO formam peroxinitritos, os quais atuam como potentes indutores de apoptose em células T. Por outro lado, tem sido observado que
a produção de níveis elevados de NO em condições de expressão exclusiva de iNOS leva a potente supressão da ativação de células T efetoras por inibir a sinalização via receptores de IL-2 [Revisto por BRONTE et al., 2003]. Recentemente, as atividades de ambas iNOS e ARG-1 também vem sendo correlacionadas com a capacidade das DCs de expandir e diferenciar populações de células T reguladoras na periferia [FENG et al., 2008; SERAFINI et al., 2008].
Por todas essas evidências, é consenso entre os pesquisadores que abordar a imunoregulação exercida por DCs representa tarefa de grande complexidade, devido não apenas à heterogeneidade fenotípica, mas também funcional dessas células, em particular as localizadas nas mucosas do trato gastrointestinal, que constitui importante via de acesso de antígenos ao sistema imune dos organismos superiores [Revisto por WALLET et al., 2005].
BIOLOGIA DAS CÉLULAS DENDRÍTICAS
As DCs são peças chave tanto na indução de respostas imunes efetoras quanto de tolerância imunológica [STEINMAN & NUSSENSZWEIG, 2003, RUTELLA et al., 2006]. Mas, a avaliação de suas propriedades biológicas in natura é bastante dificultada em função do número reduzido de DCs em órgãos linfóides periféricos. No intuito de obter quantidades suficientes de DCs para estudos de sua biologia, alguns protocolos foram estabelecidos para a sua produção in
vitro [SALLUSTO & LANZAVECCHIA, 1994; INABA et al., 1992]. O sucesso alcançado
nesses trabalhos vem permitindo estudos mais aprofundadados da biologia das DCs bem como o desenvolvimento de imunoterapias baseadas em DCs, que visam potencializar respostas contra tumores ou micróbios ou ainda suprimir repostas auto-imunes ou alérgicas de maneira específica [Revisto por STEINMAN & BANCHEREAU, 2007].
Em 1994, SALLUSTO & LANZAVECCHIA demonstraram ser possível gerar DCs humanas a partir de monócitos do sangue periférico estimulados com GM-CSF e IL-4. Sob condições adequadas, também foi possível desenvolver DCs a partir de precursores mielóides e linfóides de medula óssea humana [WU & GALY, 2001]. Células de cordão umbilical constituem outra fonte de precursores bastante utilizadas para a produção in vitro de DCs. Nesse caso, quando células CD34+ são isoladas de cordão umbilical e cultivadas na presença de GM-CSF e de diferentes concentrações de TNF-α observa-se a produção de DCs in vitro, sendo que em doses mais altas de TNF-α geralmente leva a um aumento no número de DCs, mas não à maturação dessas células [MORRISON III et al.; 2003]. Uma vez que a principal fonte de células CD34+ é a medula óssea, suspensões celulares desse tecido são as mais utilizadas para a diferenciação de DCs [LIEBLER et al., 2008].
Em modelo murino, a maioria dos protocolos de diferenciação de DCs utiliza células precursoras da medula óssea e estimulação com GM-CSF [INABA et al., 1992, LUTZ et al. 1999, SON et al. 2002]. INABA e colaboradores [1992] estão entre os primeiros a mostrar que era possível obter grandes quantidades de células com morfologia característica de DCs, que expressavam altos níveis de moléculas de classe II do MHC, capazes de migrar para regiões ricas em linfócitos T em linfonodos, bem como estimular esses linfócitos. Variações desse protocolo foram realizadas por diferentes grupos de pesquisa. Dentre eles, LUTZ e colaboradores [1999] demonstraram que a cultura prolongada de precursores de medula óssea com baixas concentrações de GM-CSF levava à geração de DCs com elevado grau de pureza. Por outro lado, SON e colegas [2002] mostraram que a utilização de suspensões totais de células da medula óssea, estimuladas com GM-CSF e IL-4, geravam maior quantidade de DCs com capacidade
mais elevada de estimular células T antígeno-específicas, quando comparadas com DCs geradas a partir de suspensões de medula óssea nas quais células T e B haviam sido depletadas. Por sua vez, NIKOLIC e colaboradores [2003] relataram que DCs mielóides murinas podiam ser originadas in vitro a partir de precursores da medula óssea em três estágios distintos: células CD31hi/Ly-6C- (blastos primários), células CD31+/Ly-6C+ (blastos mielóides) e células CD31-/ Ly-6Chi (monócitos), que representariam os estágios sucessivos de maturação in vivo dos precursores mielóides das DCs.
A estimulação in vitro de precursores hematopoiéticos tanto humanos quanto murinos com GM-CSF e IL-4 propicia a sua diferenciação em células dendríticas mielóides CD11b+CD11c+MHCII+ [LUTZ et al., 1999]. Por outro lado, a Flt3L em combinação com outras citocinas parece favorecer a diferenciação dos precursores hematopoiéticos em células dendríticas plasmocitóides (pDCs), tendo em vista que a administração de Flt3L à voluntários humanos levou a um aumento de pDCs no sangue periférico e que camundongos transgênicos que superexpressam Flt3L possuem mais pDCs e camundongos deficientes nessa citocina possuem poucas pDCs [Revisto por COLONNA et al., 2004].
Diversos estudos demonstraram que é possível modular DCs geradas in vitro para um perfil de DCs maduras expressando altos níveis de moléculas co-estimulatórias e MHCII através da utilização de diferentes fatores modulatórios como IL-15 [PULENDRAN et al., 2004 ], TNF-α [KIKUCHI et al., 2003], LPS [BOES et al., 2002], CPGs [PASARE et al., 2003]. Estes fatores têm sido associados à geração de DCs com uma alta capacidade de ativar células T antígeno específicas.
Por outro lado, a modulação com IL-10 [STEINBRINK et al., 2004], TGF-β [FAUNCE et al., 2004] e IL-6 [PARK et al., 2004] tem sido associada com a geração de DCs tolerogênicas. Nesse sentido, STEINBRINK e colaboradores [2004] mostraram que DCs diferenciadas in vitro a partir de células da medula óssea cultivadas na presença de GM-CSF e IL-4 e a seguir tratadas com IL-10 originam DCs com perfil tolerogênico, sendo defectivas na apresentação de antígenos às células T. PARK e colaboradores [2004] mostraram que a IL-6 também é importante para a manutenção de DCs em estado tolerogênico, uma vez que DCs originadas de células da medula óssea pelo cultivo com GM-CSF e posteriormente estimuladas com IL-6 tornam-se resistentes à indução de maturação por LPS. Esses autores mostraram ainda que a ativação de células T em camundongos nocautes para a IL-6 era maior do que em camundongos do tipo selvagem e do que naqueles em que o STAT 3 - principal molécula ativadora intracelular do estímulo gerado pela IL-6 na ligação com seu receptor - era funcional. Da mesma forma, a ativação de linfócios T foi maior em camundongos nocautes para IL-6 do que em camundongos defectivos para IL-6 transfectados com o gene para a citocina em seu estado ativado.
Estudos recentes, no entanto, vêm mostrando que estímulos conhecidamente pró-inflamatórios como LPS [LUTZ et al., 2000] e TNF-α [MENGES et al., 2002] também podem modular DCs geradas in vitro para um perfil tolerogênico. Tais estudos sugerem que DCs maduras podem participar de respostas imunes específicas que levam tanto à eliminação do antígeno como à tolerância, neste último caso provavelmente por induzir células T reguladoras na periferia [Revisto por RUTELLA et al., 2006]. Por essa razão, REIS E SOUSA [2006] sugere que o estado de maturação de DCs não deve ser utilizado para descrever o papel funcional de DCs,
propondo uma nomenclatura baseada mais nas características funcionais do que fenotípicas dessas células.
Em resumo, dada a complexidade das DCs, estudos mais aprofundados sobre suas características fenotípicas e funcionais ainda se fazem necessários para a melhor compreensão de seu papel nas respostas imunes, tanto no estado de equlibrio como nas doenças.
TOLERÂNCIA ORAL
O fenômeno da tolerância imunológica era até bem pouco tempo definido como uma ausência de resposta ao próprio. Em conceito mais atual, a tolerância imunológica inclui os mecanismos pelos quais respostas imunes potencialmente danosas são evitadas, suprimidas ou alteradas para um tipo de resposta não prejudicial ao organismo. Sob este ponto de vista, a tolerância oral apresenta-se como um fenômeno de extrema importância, já que constitui um mecanismo natural e contínuo que garante resposta imunológica sistêmica adequada a antígenos exógenos vitais para a sobrevivência [FARIA & WEINER, 2006]. Além da via oral ser importante para o estabelecimento da tolerância a antígenos exógenos, diversos trabalhos demonstram que essa via também pode ser empregada para a indução de tolerância a antígenos endógenos; por exemplo, a ingestão de proteína básica de mielina acarretou uma melhora significativa do quadro clínico da encefalomielite autoimune experimental murina [Revisto por MAYER & SHAO, 2004].
Conhecido como o mais antigo modelo de indução de tolerância periférica, a tolerância oral foi inicialmente descrita nos estudos de sensibilização anafilática conduzidos por BESREDKA em 1909 e abordado mais amplamente por WELLS e OSBOURNE em 1911 [appud, MOWAT et al., 2004]. Novos indícios a respeito deste fenômeno foram obtidos em 1946
por CHASE que demonstrou que a administração prévia de 2,4-dinitroclorobenzeno por via oral prevenia a reação cutânea ao alérgeno que normalmente se seguia ao desafio subcutâneo com este hapteno [Revisto por MAYER & SHAO, 2004]. Após um período no qual, foram realizados poucos estudos sobre o assunto, várias pesquisas realizadas na década de 70 mostraram que a exposição a doses moderadas de proteína pela via digestiva levava ao desenvolvimento de um estado tolerante específico e de longa duração, que podia ser transferido adotivamente de animal tolerante para animal normal ou irradiado pela inoculação de células esplênicas totais ou purificadas por lã de nylon. Esse estado podia ser abolido pelo tratamento com soro anti-linfócitos e complemento. Esses trabalhos pioneiros mostraram ainda que a administração de proteína pela via entérica resultava em supressão da proliferação de linfócitos T de linfonodos, atribuída a um tipo particular de célula supressora não identificada [Appud SIMIONI, 2004].
Um aspecto importante a ser considerado com relação à tolerância oral se refere à organização e aos eventos imunológicos peculiares que ocorrem nos tecidos linfóides associados às mucosas digestivas (GALT) [MOWAT, 2003]. Nesse sentido, WORBS e colaboradores [2006] sugerem que os linfonodos mesentéricos constituem o principal local do GALT onde as respostas tolerogênicas sistêmicas a antígenos exógenos são induzidas. Esses autores demonstraram que a remoção cirúrgica dos linfonodos mesentéricos de camundongos ou a obstrução dos vasos linfáticos aferentes desses órgãos foram capazes de impedir o estabelecimento de uma resposta tolerôgenica sistêmica a antígeno administrado por via oral. Esses autores propuseram que o antígeno relevante para a indução de tolerância é transportado ao linfonodo mesentérico no interior de células dendríticas, já que em camundongos CCR7-/-, nos quais a migração dessas células encontra-se bloqueada não se observa o fenômeno da tolerância oral.
No entanto, ainda há muita discussão a respeito do local em que a tolerância sistêmica, iniciada pela ingestão de antígenos exógenos, efetivamente se estabelece. Alguns trabalhos vêm mostrando a importância do fígado na indução de tolerância a antígenos adminisrados por via oral. A drenagem de antígenos do intestino para o fígado [YANG et al., 1994] e a presença de populações de células T regulatórias e céulas dendríticas (DCs) tolerogênicas no fígado parecem indicar que este talvez este seja um sítio importante para os processos de imunoregulação que ocorrem na tolerância oral [THOMSON et al., 2002; MEHAL
et al., 2001].
De qualquer forma, é consenso na literatura que tanto no GALT quanto em outros órgãos linfóides secundários, como baço e linfonodos, e até no fígado, os mecanismos de imunoregulação envolvem a participação de DCs tolerogênicas e células T reguladoras [FARIA & WEINER, 2006; MAYER & SHAO, 2004; MOWAT et al., 2004; NORIKO & AKEMI, 2008]. Porém, outros tipos celulares como as células NKTs também estão sendo relacionadas a esses mecanismos [KIM et al., 2006].
Com relação ao papel das células T na manutenção da tolerância periférica a antígenos próprios e não próprios, a literatura vem mostrando que este fenômeno pode ser atribuído a um grupo bastante heterogêneo de células, que coletivamente são denominadas células T reguladoras (Tregs) ou supressoras. Vários estudos recentes vêm permitindo uma melhor compreensão da biologia e dos mecanismos de supressão exercidos por essas células. A identificação do fator de transcrição “forkhead box p3” (Foxp3), expresso especificamente por células Tregs, bem como dos mutantes dessa proteína, foram fundamentais para identificação da população de linfócitos T reguladores e para a própria compreensão da sua função na imunoregulação, uma vez mutações no gene que codifica para Foxp3 resultam em
comprometimento do desenvolvimento de células Tregs naturais CD4+CD25+, tanto em camundongos como em humanos [Revisto por SAKAGUSHI & POWRIE, 2007].
Uma questão chave ainda sob investigação é como o fator de transcrição Foxp3 regula os programas celulares e moleculares envolvidos na função das células em que ocorre. Nesse sentido, estudos recentes mostraram que Foxp3 se liga a outros fatores de transcrição como NFAT (fator nuclear de ativação de células T), Runx1 (“runt-related transcripitional factor 1”) e ao fator nuclear-kappa B (NF-κB). Esse conjunto de fatores de transcrição, juntamente com outras proteínas co-ativadoras e supressoras, são responsáveis pela ativação ou repressão de genes que conferem as características fenotípicas e funcionais das células Tregs. Dentre suas atividades destacam-se a supressão da produção de IL-2, a ativação de genes para expressão de CD25, CTLA-4 e GITR [Revisto por SAKAGUSHI & POWRIE, 2007], a inibição da sinalização via complexo TCR/CD3/CD28, ao ligarem-se aos fatores NFAT e NF-κB, ou ativação de genes que sintetizam proteínas repressoras dessas vias de sinalização [CAMPBELL & ZIEGLER, 2007]. Também nesse sentido, CAMPBELL & ZIEGLER [2007] propõem que o Foxp3 possa afetar o padrão de expressão de moléculas envolvidas na migração das células Tregs para os tecidos da periferia, onde estas células estariam atuando na supressão das respostas imunes locais. Vários estudos apontam o papel crucial de células T reguladoras na indução e manutenção da tolerância oral [Revisto por NORIKO & AKEMI, 2008]. Nesse sentido, OIDA e colaboradores [2003] mostraram que células TCD4+ (CD25+ ou CD25-) que expressam TGF-β1 em sua membrana juntamente com o peptídeo latente associado (LAP), denominadas células LAP+, desempenham papel imunoregulatório importante na tolerância oral. Contudo, MUCIDA e colaboradores [2005] mostraram em camundongos transgênicos monoclonais para TCR e BCR
específicos para ovalbumina que a tolerância oral podia ser induzida na ausência de células Tregs naturais TCD4+TCD25+ Foxp3+. Neste caso, a administração do antígeno por via oral favorecia a geração de células TCD4+TCD25− Foxp3+ CD45RB anérgicas, com atividades supressoras in
vivo. Entretanto, outros tipos de células podem estar envolvidas na tolerância oral. Nesse sentido,
FARIA & WEINER [2006] sugerem que populações de células T secretoras de TGF-β, denominadas TH3, ou que apresentam a forma latente de membrana desta citocina (células TCD4+LAP+) são fundamentais para o processo de indução e manutenção da tolerância oral.
As células Tγδ também têm sido descritas como importantes para a indução e a manutenção da tolerância oral [Revisto por FARIA & WEINER 2006]. Há relatos na literatura mostrando que camundongos deficientes em células Tγδ não se tornaram tolerantes a antígenos protéicos administrado pela via oral e que a transferência adotiva dessas células é capaz de restaurar essa capacidade [Revisto por MOWAT et al., 2004]. Todavia, os mecanismos pelos quais as células Tγδ atuam na tolerância oral ainda não estão completamente esclarecidos.
Outro tipo celular que vem sendo relacionado com o fenômeno da tolerância oral são as células NKTs [ISHIMITSU et al., 2003; KIM et al., 2006]. As células NKTs são um conjunto distinto de células T αβ convencionais que se caracterizam por co-expressarem em sua superfície marcadores tanto de células T αβ como de células NK 1.1+ [TANIGUSHI et al., 2003]. KIM e colaboradores [2006] relataram que células NKTs estão relacionadas com o processo de indução de tolerância oral induzindo células T regulatórias CD4+CD25+ a produzirem IL-10 e TGF-β, que atuam suprimindo células T efetoras. Além disso, o grupo relata que as células NKTs também podem atuar na deleção clonal de células T efetoras antígeno-específicas. Em contrapartida, ISHIMITSU e colaboradores [2003] mostraram que células NKTs são dispensáveis para a
indução de tolerância, sendo, na verdade, necessárias no processo da quebra da tolerância previamente estabelecida após a administração de prostaglandina E. Desta forma, o papel das células NKTs no processo de tolerância oral ainda não está esclarecido, necessitando estudos adicionais, já que os dados de literatura são controversos e de difícil comparação, principalmente devido à diferenças nos modelos experimentais.
Estudos recentes vêm atribuindo às células B [SUN et al., 2008], particularmente à subpopulação de células B1 [DE-GENARO et al., 2009], um papel regulador importante na tolerância oral. Nesse sentido, SUN e colaboradores [2008] mostraram que camundongos μMT-/-, deficientes em linfócitos B, que receberam inoculação sublingual de baixas doses do antígeno associado a subunidade B da toxina colérica, apresentaram um número mais reduzido de células T reguladoras CD4+CD25+Foxp3+ do que camundongos selvagens. A transferência adotiva de linfócitos B para os camundongos μMT-/- restaurou a capacidade de gerar células Treg e a tolerância oral nesses animais. Contudo, camundongos μMT-/- imunizados por via parenteral apresentaram acentuada supressão da resposta imunes e um número aumentado de células TCD4+ reguladoras expressando LAP/TGF-β. DE-GENARO e colaboradores [2009], no entanto, mostraram que camundongos BALB/Xid, deficientes em células B1, não foram susceptíveis à indução de tolerância oral; após o desafio parenteral, os camundongos BALB/Xid pré-tratados com o antígeno por via oral, apresentaram intensa resposta proliferativa e de hipersensibilidade tardia antígeno-específica (DTH). De qualquer forma, os mecanismos pelos quais as células B exercem seu efeito regulador ainda não estão esclarecidos.
CÉLULAS DENDRÍTICAS E A TOLERÂNCIA ORAL
A imunidade das mucosas é baseada em um delicado balanço entre respostas imunogênicas e tolerogênicas desencadeadas contra uma diversa gama de antígenos presentes nestes tecidos e é sustentado por uma rede integrada de células linfóides e não linfóides e moléculas efetoras como, anticorpos, citocinas e quimiocinas [NEURATH et al., 2003]. Dentre os elementos celulares, as células dendríticas (DCs) e as células T reguladoras vêm sendo apontados como peças chaves na geração, manutenção e regulação das respostas imunes na mucosa. [KELSALL & LEON, 2003; O’NEILL et a.l, 2004]. Entretanto, os mecanismos envolvidos no controle das respostas imunes na mucosa ainda não estão completamente esclarecidos. Na verdade, ainda é necessário compreender o próprio desenvolvimento e as funções biológicas das diferentes sub-populações de DCs e de células T reguladoras.
As DCs presentes no trato gastrointestinal constituem populações celulares extremamente heterogêneas, que diferem entre si quanto ao fenótipo, localização e função. Embora as funções das DCs ainda não estejam completamente esclarecidas, diversos estudos vêm sendo realizados no sentido de caracterizar funcionalmente subpopulações de DCs envolvidas tanto em estados de imunidade [ANJUÈRE et al., 2004; EFRON et al., 2004], quanto tolerogênicos [VINEY & BILSBOROUGH, 2004; BILSBOROUGH et al., 2003]. Tem sido proposto que os locais mais importantes para a origem de respostas imunes no trato gastrintetinal são os linfonodos mesentéricos e não as placas de Peyer, como se pensava anteriormente [MOWAT, 2003]. Alguns estudos mostraram que DCs localizadas nesses órgãos expressam CD11c, CD11b e CD8α [ANJUÈRE et al., 2004; EFRON et al., 2004, BILSBOROUGH et al.,
2003]; também é possível encontrar nesse local populações mais raras de DCs apresentando marcadores CD4 e DEC-205 [VINEY & BILSBOROUGH, 2004].
Com relação ao aspecto funcional, somente as DCs plasmacitóides CD8α+ dos linfonodos mesentéricos murinos, mas não as esplênicas, que sofreram maturação por exposição a oligonucleotídeos contendo motivos CpGs foram capazes de diferenciar células T naïve em células T com propriedades reguladoras, além de propiciarem um aumento na eficácia da atividade supressora de células T CD4+ CD25+ [BILSBOROUGH et al., 2003]. Em contrapartida, em modelo murino de sepsis [EFRON et al., 2004], bem com de imunização oral com toxina colérica [VINEY & BILSBOROUGH, 2004], certas populações de DCs locais se mostraram importantes para a geração de respostas imunes extremamente potentes. ANJUÈRE e colaboradores [2004] relataram que DCs CD11c+CD8-, bem como as DCs exclusivas de linfonodos mesentéticos CD11c+CD8int, são capazes de induzir a ativação de células T naïve que se diferenciam em células T efetoras TH2. Estudos adicionais mostratam que essas populações apresentavam altos níveis de moléculas co-estimulatórias e sua transferência adotiva induziu forte resposta a antígenos associados à toxina colérica, administrados por via oral [VINEY & BILSBOROUGH, 2004]. Por outro lado, EFRON e colaboradores [2004] mostraram que após a indução de sepsis em murinos ocorre uma perda significativa de DCs nos linfonodos mesentéricos, principalmente de populações de DCs CD8+, o que pode de certa forma, contribuir para as alterações no sistema imune que freqüentemente acompanham a sepsis. Embora os dados de literatura sugiram uma participação de DCs CD8- na ativação de imunidade e de DCs CD8+ em respostas tolerogênicas, este pressuposto não pode ser adotado como regra, uma vez que o sistema imune das mucosas está sob influência de inúmeros outros fatores, tais como a própria
dose do antígeno, as interações com patógenos, citocinas e metabólitos produzidos por diversas células presentes no trato gastrointestinal, que podem atuar sobre as diferentes populações de DCs, alterando sua função [VINEY & BILSBOROUGH, 2004].
Diversos pesquisadores estão de acordo em que tanto a imunidade quanto a tolerância que se desenvolvem na região das mucosas intestinais dependem, em última análise, da interação entre DCs e células T naïve que ocorrem principalmente nos linfonodos mesentéricos [MOWAT, 2003; JOHANSSON-LINDBOM et al., 2003; MARTIN-FONTECHA et al., 2004]. Vários desses estudos tiveram por objetivo investigar a dinâmica da migração e das interações entre diferentes populações de células T e DCs que ocorrem nesses órgãos [ANJUÈRE et al., 2004; LINDBOM et al., 2003, HUGUES et al., 2004]. Nesse sentido, JOHANSSON-LINDBOM et al. [2003] relatam que as DCs presentes nos linfonodos mesentéricos são fundamentais para o tropismo de células T CD8+ para a região das mucosas intestinais, por induzirem em células T a expressão de receptores de quimiocinas, como o CCR9, e de integrinas, como α4β7, as quais são de fundamental importância para a permanência dessas células na região. MARTIN-FONTECHA e colaboradores [2004] mostraram ainda que DCs maduras são responsáveis pela indução dos receptores de quimiocinas CXCR-3 nas células NK e seu conseqüente recrutamento para os linfonodos, onde atuarão na polarização de células T naive a células TH1 pela secreção de IFN-γ.
Um dos principais mecanismos de imunoregulação exercido pelas DCs das regiões das mucosas parece ser o de induzir a geração de células T regulatórias nesses locais [JOHANSSON & KELSALL, 2005; NORIKO & AKEMI, 2008]. Em seu estudo, JOHANSSON & KELSALL [2005] sugerem inclusive que a indução de células regulatórias deve envolver mais
de uma população de DCs. Esses autores relataram que DCs CD11b+ murinas, após capturarem e processarem o antígeno, passam a secretar IL-10 e a induzir a expansão de linfócitos T secretores de IL-4, IL-10 e TGF-β. Os mesmo autores relatam que DCs plasmacitóides (pDCs), principalmente pDCs CD8α+B220+, também são importantes para a geração de células T reguladoras secretoras de IL-10 e que fatores produzidos por células do estroma intestinal, como a prostaglandina E2 e o TGF-β, promoveriam um microambiente supressivo que influencia as DCs a gerarem células T regulatórias.
Recentemente, uma população de DCs associadas ao GALT que expressa o marcador CD103 foi apontada como uma das principais responsáveis pela migração e polarização de células T antígeno-específicas para células T reguladoras Foxp3+ [COOMBES et al., 2007; SUN et al., 2007; BENSON et al., 2007]. O mecanismo pelo qual essas DCs exercem tal função parece ser dependente da conversão de vitamina A presente na região das mucosas pelas retinol desidrogenases expressas pelas DCs, bem como da produção de TGF-β por estas células [COOMBES et al., 2007; SUN et al., 2007]. Embora os mecanismos pelos quais o ácido retinóico e o TGF-β atuam no processo de geração de células T reguladoras Foxp3+ ainda não estejam completamente esclarecidos, a literatura mostra que a sinalização via TGF-β é crucial para induzir a expressão do fator de transcrição Foxp3 em células T e que o ácido retinóico inibe a proteína ativadora 1 (AP-1), cuja ativação é desencadeada via interação entre moléculas co-estimulatorias, que interfere na ativação de Foxp3 [BOEHMER, 2007]. Além disso, BENSON e colaboradores [2007] demonstraram que o ácido retinóico induz uma alta expressão da integrina α4β7 e do receptor de quimiocina CCR9 permitindo que as células T reguladoras formadas se acumulem e permaneçam preferencialmente no GALT.
Outro mecanismo pelo qual DCs presentes no GALT são capazes de induzir a geração de células T reguladoras locais é através da expressão da enzima idoleamina 2,3-dioxigenase (IDO), envolvida no metabolismo do aminoácido triptofano [MELLOR & MUNN, 2004; RUTELLA et al., 2006; PARK et al., 2008;]. Nesse sentido, PARK e colaboradores [2008] mostraram que a administração de colágeno tipo II por via oral levou a um aumento DCs CD11c+ expressando IDO nas placas de Peyer, as quais foram capazes de induzir a diferenciação in vitro de células TCD4+CD25+Foxp3+.
Por outro lado, vários estudos, entre os quais os realizados em nosso laboratório [SIMIONI et al., 2004] mostram que a administração de proteína por via oral leva à geração de DCs tolerogênicas não apenas na região das mucosas, mas também em órgãos linfóides secundários como o baço. Naquele estudo, mostramos que DCs esplênicas de camundongos BALB/c tolerantes à OVA co-cultivadas com células T naïve obtidas tanto de camundongos BALB/c selvagens como do transgênico DO11.10 (TCR anti-OVA) polarizaram preferencialmente estas células para um padrão de células TH3 produtoras de TGF-β.
Em conjunto, os dados de literatura mostram que populações de DCs presentes no GALT apresentam um papel fundamental na indução da tolerância oral, por serem cruciais para a geração de células T reguladoras na região. Além disso, DCs tolerogênicas induzidas sistemicamente no processo de tolerância oral podem constituir um importante mecanismo para a manutenção de tolerância sistêmica antígeno específica.
O METABOLISMO DA L-ARGININA E SUA IMPORTÂNCIA NAS RESPOSTAS IMUNES
A arginina, um aminoácido semi-essencial, tem sido indicado como suplemento nutricional importante em situações pós-cirúrgicas ou de estresse, principalmente por estar relacionado com uma melhoria das respostas imunes [PETAR et al. 2007]. Nesse sentido, DE JONGE e colaboradores [2002] mostraram no modelo murino transgênico F/A-2+/+, que super-expressa a arginase-1 em eritrócitos, uma redução significativa de arginina nos tecidos. Tal redução de arginina levou a uma deficiência no desenvolvimento de células B, devido ao bloqueio na transição dos estágios de células pró-B para pré-B na medula óssea destes camundongos, com redução significativa no número de células B nos órgãos linfóides periféricos e dos níveis séricos de IgM. Embora não tenha sido observado o comprometimento no desenvolvimento de células T nestes camundongos, a literatura relata que a arginina é essencial para funções biológicas das células T, tais como, a proliferação, síntese das cadeias ζ da molécula de CD3, e consequentemente para a transdução de sinais via TCR, e a diferenciação de células T de memória [Revisto por PETAR et al. 2007].
A L-arginina é um substrato comum para dois tipos de enzimas, as arginases e as sintases do óxido nítrico (NOS). As sintases do óxido nítrico, convertem a L-arginina produzindo óxido nítrico (NO) e L-citrulina. Essas enzimas ocorrem como 3 isoformas distintas que se diferenciam em vários aspectos, tais como, a localização intracelular, atividade catalítica, sensibilidade a inibidores, e principalmente com relação ao tecido em que são expressas. A NOS1 conhecida também como nNOS é expressa preferencialmente no tecido nervoso. A NOS 2, conhecida também como iNOS, é a forma induzida expressa principalmente em células do
sistema imunológico. A NOS3, ou eNOS, é expressa em células endoteliais [Revisto por BRONTE & ZANOVELLO, 2009]. O óxido nítrico gerado pela eNOS é um mediador de suma importância para o sistema cardiovascular, exercendo funções regulatórias importantes como o controle da hemostasia, fibrinólise, interação de leucócitos e plaquetas com as paredes das artérias, regulação do tônus vascular e homeostasia da pressão arterial, e proliferação das células da musculatura lisa dos vasos [Revisto por NAPOLI & INGNARO, 2007]. Contudo, no sistema nervoso central o óxido nítrico apresenta um papel dúbio, dependendo principalmente da concentração desta molécula. Enquanto que quantidades fisiológicas deste gás são neuroprotetoras e fundamentais na regulação de funções como a plasticidade sináptica, o ciclo circadiano e a secreção de hormônios, uma exacerbação da concentração de NO é conhecidamente neurotóxica [CALABRESE et al., 2007].
Como mencionado anteriormente, células do sistema imune expressam de maneira induzível tanto a iNOS quanto ARG-1, sendo que em células mielóides estas enzimas são controladas principalmente pelo balanço TH1/TH2 [MUNDER et al., 1999]. Estes autores demonstraram em macrófagos e DCs que expressão da iNOS é induzida principalmente por citocinas TH1, que inibem a expressão da ARG-1, enquanto que citocinas TH2 levam a um aumento da expressão da ARG-1 e inibição da iNOS.
A via metabólica das arginases converte L-arginina em L-ornitina e uréia, sendo que as células de mamíferos expressam duas isoformas da enzima: arginase I, uma forma induzida principalmente por citocinas TH2 e expressa principalmente em células de origem mielóide e a arginase II, constitutivamente expressa principalmente em hepatócitos, mas também em macrófagos [MUNDER, 2009; JENKINSON et al., 1996]. As arginases desempenham papéis fisiológicos importantes; a deficiência de arginase hepática em humanos leva a hiperargininemia,
uma desordem caracterizada por deficiências mental e no crescimento e episódios pontuais e às vezes fatais de hiperamonemia. Camundongos nocautes para arginase hepática morreram 10 a 14 dias após o nascimento por quadros de hiperamonemia [IYER et al., 2002]. A L-ornitina derivada da atividade das arginases é uma precursora para a síntese de poliaminas, as quais apresentam um importante papel na proliferação celular, além de ser precursora de colágeno, uma proteína estrutural envolvida no remodelamento tecidual [Revisto por MUNDER, 2009].
O NO gerado pela ação da iNOS está principalmente relacionado com a defesa contra patógenos, constituindo mediador crucial da via efetora de resposta de macrófagos em sítios inflamatórios [MACMICKING et al., 1997]. Todavia, alguns trabalhos vêm mostrando que o NO também apresenta um importante papel na supressão da proliferação de células T [BINGISSER et
al., 1998, BRONTE et al., 2003], por inibir a sinalização intracelular do receptor da IL-2
[BINGISSER et al., 1998]. Corroborando com estes achados, RÖSSNER e colaboradores [2005] mostraram que precursores de DCs são capazes de suprimir respostas de células TCD4+ ou TCD8+ in vitro por mecanismos dependentes de contato celular direto e pela produção de NO.
Já a ARG-1 vem sendo relacionada com a cronificação de respostas TH2 [MAARSINGH et al., 2008; HESSE et al., 2001]. Em doenças inflamatórias crônicas das vias respiratórias, como a asma, o aumento da ARG-1 está relacionada com a obstrução e hipereatividade brônquica, com a inibição do efeito broquiodilatador do NO e do remodelamento tecidual gerado no processo inflamatório, por competir com o mesmo substrato das NOS [MAARSINGH et al., 2008]. HESSE e colaboradores [2001] mostraram que camundongos infectados com Schistosoma mansoni, que desenvolvem uma resposta tipicamente TH2 com aumento da expressão da ARG1, apresentaram uma correlação direta com a formação de granulomas nos camundongos infectados. A atividade da ARG-1 também vem sendo apontada
como um importante mecanismo imunosupressor de células de origem mielóides, provavelmente por estar envolvida com a inibição da proliferação de células T e, conseqüentemente, com inibição da geração de citocinas ativadoras de monócitos/macrófagos [BRONTE & ZANOVELLO, 2009, MUNDER, 2009, BRONTE et al., 2003]. Da mesma forma, a atividade de ARG-1 em células de origem mielóide também constitui importante mecanismo para a geração de células T reguladoras na periferia [SERAFINI et al. 2008; COBBOLD et al., 2009]. Nesse sentido, SERAFINI e colaboradores [2008] mostraram que células mielóides supressoras foram capazes de induzir células T reguladoras por um mecanismo dependente da atividade de arginase e independente de TGF-β. Corroborando com estes achados, COBBOLD e colaboradores [2009] mostraram que a ativação de vias de depleção de aminoácidos essenciais, dentre eles a L-arginina, levou à inibição da ativação da molécula sinalizadora mTOR em células T naïve, com a consequente ativação da expressão de Foxp3 e diferenciação em células T reguladoras. Trabalho recente mostrou que a depleção da L-arginina pela atividade da ARG-1 também se relaciona com a diminuição da atividade e da proliferação de células NK [OBERLIES et al., 2009].
O envolvimento da iNOS e da arginase na resposta microbicida de macrófagos já é conhecido de longa data [GREEN et al., 1991; MACMICKING et al., 1997]. Porém, só mais recentemente foi reportado o papel dessas enzimas na função de DCs [MUNDER et al., 1999; FERNÁNDEZ-RUIZ et al., 2005]. Esses trabalhos mostraram que DCs também podem ser moduladas por citocinas capazes de ativar o metabolismo da L-arginina, criando um ambiente redutor na região das sinapses imunológicas, que parece interferir com a apresentação antigênica para os linfócitos T [LU et al, 1996, HOFFMAN et al, 2002, KAHN et al, 2000].
O presente trabalho teve por objetivo avaliar a influência de DCs murinas diferenciadas e moduladas in vitro (BMDCs) sobre a resposta imune de camundongos no contexto da tolerância e imunidade a OVA.
1. ANIMAIS
As matrizes de camundongos isogênicos BALB/c e de transgênicos DO11.10 - animais com background genético de BALB/c, cujos linfócitos T portam o TCR específico para OVA de camundongos C57BL/6 [MURPHY et al., 1990] - foram obtidas do Laboratório Jackson (Bar Harbor, Maine, EUA) e reproduzidos no Centro de Investigações Biológicas da UNICAMP, Campinas, SP (CEMIB), livres de patógenos específicos (specific pathogen free, SPF). Após adaptação à dieta sólida, isto é, com quatro semanas de idade, esses camundongos passaram a ser mantidos no Biotério do Departamento de Microbiologia e Imunologia, Instituto de Biologia, UNICAMP, em ambiente com temperatura e fotoperíodo controlados, com água e ração autoclavados em livre demanda, até atingirem a idade de 8 a 12 semanas para a realização dos ensaios. Nos estudos, foram utilizados grupos (ou sub-grupos) de cinco camundongos, separados em gaiolas específicas. Esse trabalho foi aprovado pela Comissão de Ética em Experimentação animal (CEEA) sob o Protocolo no. 665-2 (em anexo) e pela Comissão Interna de Biossegurança do IB/UNICAMP (CIBio-IB) sob o Protocolo No. 2004/03 (em anexo).
2. REAGENTES
Ovalbumina (OVA) para a indução de tolerância oral foi obtida comercialmente (Comércio e Indústria Rhoster Ltda, Vargem Grande Paulista, SP, Brasil). Os anticorpos de coelho anti-camundongo foram preparados e conjugados em nosso laboratório, usando a peroxidase tipo IV (HRPO, Sigma, USA). Anticorpos monoclonais para antígenos de superfície celular marcados com fluorocromos foram adquiridos da BD-Pharmingen (USA). A Conalbumina (OVA), o LPS e as drogas N-Omeganitro-L-Arginina (L-NAME) e NG -Hidroxi-L-arginina (NOHA) foram obtidos da Sigma (USA). Exceto a mrGM-CSF (obtida da
Biosource, USA) e o TNF-α (obtida da R&D Systems, USA), as demais citocinas recombinantes utilizadas foram adquiridas da BD-Pharmingen (USA). Os kits para quantificação das citocinas (OptEIA set- 20 plates) foram obtidos da BD-Pharmingen (USA). As esferas imunomagnéticas para separação celular (MACs- CD4+ T cell isolation kit.) foram adquiridas da Miltenyi Biotecnologies Inc. (Alemanha). A sonda 5(6)carboxifluoresceina diacetato, succinimidil éster (5(6)CFDA, SE; CFSE)foi obtida da Molecular Probes (USA).
3. GRUPOS EXPERIMENTAIS
3.1. INDUÇÃO DE TOLERÂNCIA ORAL
A tolerância oral à OVA foi induzida em camundongos empregando-se protocolo previamente estabelecido em nosso laboratório [SIMIONI et al., 2004]. Brevemente, uma solução aquosa contendo 4mg/mL OVA (Rhoster) foi oferecida durante 7 dias consecutivos como única fonte de água de beber a camundongos BALB/c e DO11.10. Sete dias após a interrupção do tratamento oral, uma parte desses animais recebeu desafio constituído por injeção intraperitoneal (i.p.) de 10 μg OVA, emulsionada em 1 mg/mL de Al(OH)3 em solução salina (NaCl 0,15M). Quatorze dias após a administração da primeira dose i.p. de OVA, os camundongos receberam um reforço constituído por 10μg do antígeno em solução salina, pela mesma via. Para cada linhagem, foram incluídos mais dois grupos controles: camundongos naïve, isto é, não tratados com OVA por qualquer via, e camundongos tratados com OVA apenas pela via i.p.. Sete dias após a segunda dose i.p. do antígeno, os camundongos de todos os grupos, incluindo os controles, foram sangrados pelo plexo retro-orbital para a obtenção de soros que foram ensaiados por ELISA indireto para a detecção de anticorpos específicos para OVA, como descrito adiante.
3.2.TRATAMENTOS COM NOHA E L-NAME
Parte dos camundongos BALB/c e DO11.10 empregados nas imunizações por via oral e/ou i.p. foram previamente tratados com as drogas NG-Nitro- L- arginina-metil ester (L-NAME) ou Nω-hidroxil-L-arginina (NOHA), para a inibição das enzimas iNOS e ARG-1, respectivamente, e depois submetidos aos mesmos tratamentos com OVA por via oral e/ou ip descritos acima. Brevemente, os camundongos foram tratados diariamente, por sete dias consecutivos e depois a cada dois dias por mais uma semana, com 1 mg de L-NAME ou 42,6μg de NOHA diluídos em 250μL de água, e introduzidas diretamente no estômago dos animais por gavagem. No oitavo dia após o início da gavagem com as drogas, uma parte dos animais de cada linhagem foi submetida ao protocolo de ingestão de OVA para tolerância oral, conforme descrito acima. Outra parte recebeu apenas os desafios i.p. e um terceiro grupo recebeu somente as drogas na ausência de inoculações subseqüentes de antígeno. Um grupo naïve, isto é, sem qualquer tratamento com drogas ou antígenos, foi também incluído. Sete dias após a última dose de antígeno i.p., os camundongos de todos os grupos, mesmo os que não receberam qualquer tratamento com drogas ou antígeno, foram sangrados pelo plexo retro-orbital para a obtenção de soros, que foram ensaiados por ELISA indireto para a investigação de anticorpos específicos para OVA.
Sete dias após a sangria, todos os animais foram sacrificados para coleta de baço e linfonodos mesentéricos, cujas células foram empregadas em ensaios de proliferação antígeno-específica e investigação da produção de citocinas. Parte da suspensão de células esplênicas foi utilizada em ensaios de citometria de fluxo para avaliação da freqüência de células portadoras de marcadores específicos de DCs, bem como de seus níveis de expressão, conforme descrito
abaixo. Em alguns experimentos, as avaliações dos marcadores de DCs foram realizadas em suspensões esplênicas enriquecidas em DCs pelo emprego de protocolo de separação por gradiente de BSA, seguido de cultivo para aderência e descolamento ao plástico, conforme descrito anteriormente [SIMIONI et al., 2004].
4. DETECÇÃO DE ANTICORPOS SÉRICOS ANTI-OVALBUMINA
Os níveis de anticoros séricos anti-OVA foram determinados por ELISA indireto, conforme descrito anteriormente [SIMIONI et al., 2004]. Brevemente, placas de 96 poços de fundo chato (Falcon, Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA) foram recobertas com OVA pela adição de 50μL de uma solução da proteína a 20μg/mL em tampão carbonato/ bicarbonato, pH 9,6 e incubadas 1 hora a 37ºC. As placas foram lavadas três vezes com solução salina tamponada com solução a 0,05M de fosfatos (PBS) contendo 0,05% de Tween 20 (PBS-T) e, a seguir, incubadas com uma solução de leite Molico (Nestlé) a 5%, por 1 hora a 37ºC. Após novo ciclo de lavagem com PBS-T, 50μl de amostras de soros diluídos de 1:100 a 1:12.800 em solução de PBS-Molico a 2% foram adicionados em duplicata a poços das placas de reação, que foram novamente incubadas por 1 hora a 37ºC. Após lavagens, adicionou-se a cada poço 50μl do conjugado IgG de coelho anti-IgG de camundongo/peroxidase (HRPO) diluído apropriadamente (1/2000) em solução de PBS-Molico a 2% e as placas foram incubadas por 1 hora a 37ºC. Após novo ciclo de lavagem com PBS-T, adicionou-se a cada poço de reação 50μL de uma solução contendo o substrato/cromógeno (10 mL de solução tampão de citrato/fosfato de sódio, pH 5,0, contendo 20μL de H2O2 a 3% e 2mg de OPD). Após a incubação das placas por 30 minutos, ao abrigo da luz, a reação foi interrompida pela adição de 25μL de H2SO4 4N a cada poço. A leitura
foi feita no leitor de ELISA Multiskan II MS (Labsystem, Helsinki, Finlândia). Os resultados foram apresentados como médias ± E.P.M. da somatória das densidades ópticas obtidas nas diluições dos soros de 1:100 até 1:12800.
5. DIFERENCIAÇÃO IN VITRO DE CÉLULAS DENDRÍTICAS
Células dendríticas foram diferenciadas da medula óssea de camundongos BALB/c utilizando-se a técnica descrita por LUTZ et al. [1999] com algumas modificações. Resumidamente, os precursores foram coletados dos fêmures de camundongos injetando-se cerca de 1 mL de meio de cultura no interior das peças cortadas nas duas extremidades. A suspensão de células da medula foi ajustada para a concentração de 1,5 x 106 células/mL de meio de cultura DMEM (Sigma) contendo 10% SFB e 50μg/mL de gentamicina (USB), suplementado com 20ng/mL de mrGM-CSF. Alíquotas de 2 mL desta suspensão foram semeadas em placas de seis poços (Corning), que foram incubadas por oito dias à 37ºC, em estufa com 5% de CO2 . A cada três dias, foram realizadas trocas de 50% do conteúdo dos poços por meio fresco.
O processo de diferenciação foi acompanhado por citometria em células marcadas com anticorpos anti-CD11c e anti-MHCII, empregando citômetro de fluxo (FACS-ARIA, Becton-Dickinson) localizado no Hemocentro da UNICAMP, conforme descrito no item 7.
6. MODULAÇÃO DE BMDCs
6.1. MODULAÇÃO COM TNF-α + LPS OU IL-10+TGF-β
Para modulação de sua atividade funcional, as BMDC diferenciadas in vitro foram retiradas das placas de cultura no oitavo dia de cultivo, lavadas por centrifugação. As células foram então semeadas em novas placas de seis poços (Corning) na densidade de 1x107 células/poço, na presença de 20 ng/ml de mrTNF-α + 1μg/mL de LPS (Sigma) ou 20ng/mL hrTGF-β + 20ng/mL de mrIL-10, ou ainda na ausência de qualquer estímulo, e incubadas a 37oC, por 48 horas, em estufa contendo 5% de CO2 e 90% de umidade. Após a incubação, alíquotas dessas essas células foram coletadas das culturas para avaliação de seus marcadores de superfície por citometria de fluxo. As células restantes foram utilizadas em ensaios de proliferação antígeno-específica de células TCD4+ e de transferência adotiva para camundongos BALB/c e DO11.10, conforme descrito adiante.
6.2. MODULAÇÃO COM NOHA E L-NAME
Suspensões contendo BMDC foram inicialmente semeadas na densidade de 107 células em placas de seis cavidades, na presença de 1mM de NG-Nitro- L- arginina-metil ester (L-NAME; inibidor da iNOS), ou de 750μM de Nω-hidroxil-L-arginina (NOHA; inibidor da ARG), ou ainda na ausência das drogas, e cultivadas por 24h a 37oC e 5% de CO2. A seguir, as BMDCs foram coletadas e redistribuídas em placas de 96 poços (Corning), na densidade de 2 x 104/ poço, para ensaios de apresentação antigênica, ou em placas de 6 poços, na densidade de 5x106/poço, para os ensaios de detecção da enzima iNOS por Western Blot, ou na densidade de 2x105/poço em placas de 96 poços para a detecção de atividade arginase nos extratos celulares pela conversão
de L-argina em uréia, de atividade da iNOS pela detecção de nitrito nos sobrenadantes de cultura e para avaliações fenotípicas por citometria de fluxo, como descrito mais adiante. Para os ensaios de detecção da expressão da iNOS, as BMDCs tratadas ou não com as drogas foram incubadas por 12h na presença de 1μg/mL de LPS + 50UI/mL de mrIFN-γ. Para a detecção da produção de nitrito nos sobrenadantes de cultura, a incubação das BMDCs com esses estímulos se estendeu por 48h. Para os ensaios de detecção da atividade da enzima ARG-1 nos extratos celulares, as BMDCs foram cultivadas por 48h na presença de 40ng/mL de mrIL-4. As descrições desses ensaios vêm a seguir.
7. CITOMETRIA DE FLUXO
BMDCs moduladas com estímulos pró ou antiinflamatórios ou com L-NAME e NOHA, bem como as DCs esplênicas obtidas de camundongos tratados com as drogas inibidoras, foram analisadas quanto a expressão de marcadores de superfície CD80, CD86, CD40 por citometria de fluxo. Brevemente, BMDCs e DCs esplênicas moduladas, bem como as respectivas células controles não moduladas, foram previamente tratadas com anticorpos bloqueadores de receptores Fcγ obtidos de sobrenadantes de cultura das células da linhagem 2.4G2. Após 20 minutos de incubação a 4oC, as células foram lavadas com PBS e posteriormente incubadas por 30 minutos a 4oC com os seguintes anticorpos diluídos em tampão de marcação (PBS – 0,01% BSA – 0,1% Azida Sódica), em concentrações previamente estabelecidas em nosso laboratório: anti-mouse-CD11cαchain (Pharmingen, clone HL-3, conjugado à APC) associados a aloficocianina em combinação com anti-mouse-MHCII (clone TIB-209 conjugado a PE – Miltenyi Biotec) e com anti-mouse-CD80 (clone 16-10A1, conjugado à FITC – Pharmingen) ou anti-mouse-CD86
