INTRODUÇÃO

As células dendríticas (DCs) constituem população heterogênea de células apresentadoras de antígeno (APCs), que desempenha um papel fundamental na ativação de linfócitos T naïve [BANCHEREAU & STEINMAN, 1998; STEINMAN, 2003], estando intrinsecamente relacionadas com a polarização TH1/TH2 de células T efetoras [LANGENKAMP et al., 2000] e, como recentemente demonstrado, na geração de células TH17 [MUCIDA et al., 2007]. Além de participar da diferenciação de células T efetoras, diversos trabalhos mostram um importante papel das DCs na indução e manutenção de respostas tolerogênicas, particularmente na geração das chamadas células T reguladoras [RUTELLA et al., BILSBOROUGH, et al, 2003; YAMAZAKI et al., 2008].

Células dendríticas podem ser isoladas de órgãos linfóides secundários, como o baço e linfonodos, empregando-se protocolos experimentais que fazem uso de diferentes características dessas células, tais como a sua propriedade de aderir e depois descolar de superfícies plásticas ou a presença de determinados marcadores de superfície que permitem a separação das células dendríticas por esferas magnéticas recobertas com anticorpos específicos ou por citometria de fluxo [INABA et al., 2009]. Esses métodos, no entanto, liberam quantidades extremamente reduzidas de DCs, porque sua distribuição nos órgão linfóides secundários é proporcionalmente mais reduzida do que a de outros leucócitos ali presentes. Devido a essa dificuldade, diversos protocolos de geração de células dendríticas in vitro, a partir de células precursoras hematopoiéticas ou do sangue vêm sendo utilizados como uma maneira alternativa para a obtenção dessas células [INABA et al., 1992, LUTZ et al., 1999, SON et al., 2002]. Tais protocolos estão proporcionando importantes avanços na compreensão da biologia destas células, bem como, permitindo a proposição de imunoterapias contra tumores baseadas em DCs [Revisto

por STEINMAN & BANCHEREAU, 2007]. Precursores hematopoiéticos da medula óssea dos

camundongos vêm sendo utilizados como fontes de células dendríticas, após sua diferenciação na presença do fator de estimulação de colônias de granulócitos/macrófagos (GM-CSF) [INABA et

al., 1992, LUTZ et al., 1999, SON et al., 2002]. Nesse sentido, LUTZ et al. [1999] mostraram

que o cultivo celular em baixa densidade de células obtidas da medula óssea de camundongos, estimuladas com GM-CSF recombinante, durante 10 dias, foi capaz de gerar células DCs mielóides, expressando os marcadores de superfície CD11c e MHCII. Em humanos, células precursoras presentes no sangue periférico também podem ser induzidas a se tornarem DCs capazes de sustentar a proliferação e diferenciação de linfócitos T pelo cultivo com GM-CSF e IL-4 [SALLUSTO & LANZAVECHIA, 1994]

Dados da literatura mostram também que é possível modular o estado de ativação e, em alguns casos, as propriedades funcionais de células dendríticas derivadas da medula óssea (BMDCs) [BOES et al., 2002; PASARE et al., 2003; KIKUCHI et al., 2003; PARK et al., 2004; STEINBRINK et al., 2004, MÜLLER et al., 2002; FAUNCE et al., 2004]. Nesse sentido, o tratamento de BMDCs com estímulos pró-inflamatórios, tanto os de origem exógena, como LPS microbiano [BOES et al., 2002] e oligonucleotídeos CpG [PASARE et al., 2003], quanto os de origem endógena, como as citocinas TNF-α [KIKUCHI et al., 2003], IL-6 [PARK et al., 2004] e IL-15 [PULENDRAN et al., 2004], levou à geração de BMDCs apresentando um perfil maduro, associado à capacidade de estimular respostas imunes. Por outro lado, também há relatos de que estímulos supressores, como os propiciados pelas citocinas IL-10 [STEINBRINK et al., 2004, MÜLLER et al., 2002] e TGF-β , sozinhas [FAUNCE et al., 2004] ou combinadas [SATO et al., 2003], ou ainda o tratamento com drogas antiinflamatórias [HACKSTEIN & ANGUS, 2004],

leva à geração de DCs com um perfil imaturo, muitas vezes associados à indução e manutenção de tolerância imunológica.

Dados recentes da literatura evidenciam que o estado de maturação das BMDCs não se relaciona necessariamente com o fenótipo funcional dessas células [Revisto por REIS & SOUZA, 2006]. Nesse sentido, LUTZ et al., [2000] mostraram que a estimulação com altas doses de LPS também foi capaz de gerar BMDCs com capacidade de induzir anergia in vitro em linfócitos TCD4+ _{estimulados por aloantígenos. Corroborando SALAZAR et al. [2007]} demonstraram que BMDCs tolerogênicas, geradas pela estimulação por um curto período com LPS adquiriram um perfil tolerogênico principalmente através de uma alta produção de IL-10 e TGF-β1. Todavia, em modelo murino de alergia das vias respiratórias induzida por antígeno, AHRENS et al. [2009] mostraram que BMDCs moduladas por LPS não foram capazes de induzir a melhoria do quadro alérgico, apesar de induzirem a produção de IL-10 pelas células T. Por outro lado, MENGES et al. [2002] mostraram que DCs moduladas in vitro com TNF-α induziram uma proteção antígeno-específica contra a encefalomielite experimental autoimune (EAE) em camundongos. Outros relatos mostram ainda que BMDCs previamente moduladas por TNF-α também são capazes de inibir a instalação do quadro de artrite induzida por colágeno em modelo murino [DUIVENVOORDE et al., 2007].

Em um trabalho anterior do nosso laboratório mostramos que DCs esplênicas obtidas de camundongos BALB/c, tolerantes à OVA pela administração oral do antígeno, foram capazes de direcionar células T naïve de BALB/c e do transgênico DO11.10 para o padrão TH3, produtoras de TGF-β [SIMIONI et al., 2004]. Todavia, DCs isoladas de camundongos DO11.10, nos quais não foi possível induzir tolerância à OVA, direcionaram as células T naïve de BALB/c

e do próprio DO11.10 para um padrão efetor TH1 e TH2. Em conjunto, esses dados reforçam o papel dual das DCs geradas no decorrer de uma resposta imune que, sob sua ação, pode assumir um caráter de imunidade ou tolerância. No entanto, a literatura ainda é escassa no que diz respeito às funções de DCs como moduladora de uma resposta imune já estabelecida, seja de tolerância ou imunidade.

Desta forma, o objetivo do presente trabalho foi investigar o papel de BMDCs previamente moduladas com citocinas e/ou LPS na estimulação in vitro de células TCD4+ _de camundongos naïve, imunizados ou tolerizados com OVA, bem como de avaliar os efeitos da transferência adotiva dessas células sobre a resposta imune de camundongos BALB/c e transgênicos DO11.10, no contexto da imunidade ou tolerância à OVA.

2. OBJETIVO

Neste capítulo, tínhamos por objetivo investigar as propriedades funcionais de BMDCs geradas e moduladas in vitro com agentes pró e antiinflamatórios sobre a resposta proliferativa in vitro de linfócitos TCD4+ de camundongos BALB/c e DO11.10, tolerantes ou imunes à ovalbumina, bem como o efeito da transferência adotiva das BMDCs moduladas sobre as respostas imune e de tolerância nesses camundongos, em sistemas in vivo e ex-vivo.