EFEITOS DA TRANSFERÊNCIA ADOTIVA DE BMDCs MODULADAS IN VITRO

A seqüência de experimentos descrita a seguir foi elaborada para investigar o efeito da transferência adotiva de BMDCs moduladas in vitro sobre a resposta imune à OVA normalmente exibida por camundongos BALB/c.

As BMDCs geradas in vitro e moduladas com LPS+TNF-α ou com IL-10+TGF-β foram transferidas passivamente para camundongos BALB/c, por via endovenosa, antes ou após da administração de OVA por via oral e/ou i.p. Camundongos que não receberam as BMDCs foram empregados como controles de tolerância e de imunização nos experimentos. Após o último desafio intraperitoneal com o antígeno, todos os camundongos foram sangrados, para a determinação dos níveis séricos de anticorpos anti-OVA, e depois sacrificados para a coleta de baços empregados em ensaios de proliferação antígeno-específica e de produção de citocinas. Os resultados obtidos nesses experimentos estão sumarizados na Figura 8.

É possível observar que a transferência adotiva de BMDCs moduladas com TNF- α+LPS ou com IL-10+TGF-β para camundongos BALB/c elevou de modo significativo a produção de anticorpos específicos nos recipientes imunizados por via i.p, mas não alterou a resposta proliferativa das células esplênicas desses camundongos. No entanto, foi possível observar redução dos níveis de IL-2 nas culturas de células esplênicas dos camundongos BALB/c imunizados por via i.p. que receberam quaisquer dos tipos de BMDCs, bem como o aumento da secreção de IFN-γ e IL-10 nas culturas de células esplênicas provenientes dos animais tratados com as BMDCs não moduladas ou moduladas com IL-10+TGF-β.

A transferência adotiva de BMDCs, BMDC/TNF-α+LPS ou BMDC/IL-10+TGF-β não foi capaz de modificar a tolerância em BALB/c previamentes tratados com OVA oral, conforme medido pelos níveis de anticorpos séricos e de proliferação de células esplênicas. Porém, a produção de citocinas IL-4 e IFN-γ foi aumentada pela transferência adotiva de BMDCs não moduladas e a produção de IL-10 foi aumentada pela transferência adotiva de BMDCs não moduladas ou moduladas por IL-10+TGF-β.

Figura 8 - Efeito da transferência adotiva de BMDCs moduladas in vitro sobre a produção de anticorpos em

camundongos BALB/c e sobre a proliferação de seus linfócitos T esplênicos antígeno-específicos e a secreção de citocinas in vitro. Camundongos BALB/c naïve ou tratados com OVA foram injetados por via endovenosa com

três doses de 5x105 _{BMDCs em dias alternados moduladas com LPS+TNF-α ou com IL-10+TGF-β, ou com}

BMDCs cultivadas na ausência de estímulos. Camundongos do grupo controle foram injetados apenas com o veículo (solução salina). Antes da transferência adotiva, a metade dos camundongos de cada grupo foi tratado com OVA (4mg/mL) por via oral, por sete dias consecutivos, enquanto os demais receberam água livre de proteína. Sete dias após a interrupção do tratamento oral, todos os animais foram desafiados por via i.p. com duas doses de 10 μg/mL de OVA, no intervalo de quinze dias, a primeira das quais com 1 mg de Al(OH)3. Sete dias após a

última dose i.p. de antígeno, os soros de todos os camundongos foram coletados para determinação dos níveis de anticorpos (Painel A) e os baços foram removidos para ensaio de proliferação antígeno-específica (Painel B). Após 4 dias de cultivo, a proliferação foi determinada pelo método do MTT e os sobrenadantes foram coletados e os níveis de citocinas determinados por ensaio de ELISA (Painéis C a F). * p<0.05 na comparação com o respectivo grupo controle não tratado com as BMDCs determinado pelo teste a posteriori de Bonferoni.

4.7. EFEITOS DA TRANSFERÊNCIA ADOTIVA DE BMDCS MODULADAS IN VITRO NA RESPOSTA IMUNE DE CAMUNDONGOS DO11.10

As BMDCs geradas in vitro e moduladas com LPS+TNF-α ou com IL-10+TGF-β foram transferidas passivamente para camundongos DO11.10, por via endovenosa, antes da administração de OVA por via oral e/ou i.p. Camundongos transgênicos que não receberam as BMDCs foram empregados como controles. Os resultados desses experimentos estão ilustrados na Figura 9.

É possível observar que a transferência adotiva de BMDCs não moduladas ou de BMDC moduladas com IL-10+TGF-β para camundongos DO11.10 preveniu a resposta à OVA que normalmente é desencadeada pela administração i.p. do antígeno. A proliferação antígeno- específica de esplenócitos de DO11.10 imunizados por via i.p. foi mais elevada nos recipientes de BMDCs não moduladas ou moduladas com LPS+TNF, bem como a secreção de IL-2, IFN-γ e IL-4. A administração de BMDCs moduladas com IL-10+TGF-β antes da administração i.p. da OVA reduziu significativamente a proliferação antígeno-específica de esplenócitos nos recipientes.

Por outro lado, a transferência passiva de quaisquer das BMDCs não foi capaz de prevenir o priming pela administração oral de OVA nos transgênicos. A proliferação de esplenócitos de transgênicos imunizados por via oral+i.p. também foi mais elevada nos recipientes de BMDCs moduladas com LPS+TNF-α, bem como a secreção de IFN-γ e IL-10. Mas, a transferência de BMDCs não moduladas ou de BMDCs moduladas com IL-10+TGF-β reduziu a proliferação de linfócitos nos transgênicos que receberam OVA por via oral+i.p. bem como reduziu a secreção de IFN-γ e IL-4.

Figura 9 - Efeito da transferência adotiva de BMDCs moduladas in vitro sobre a produção de anticorpos em

camundongos DO11.10 e sobre a proliferação de seus linfócitos T esplênicos antígeno-específicos e a secreção de citocinas in vitro. Camundongos DO11.10 naïve foram injetados por via endovenosa com três doses em dias

alternados de 5x105 _{BMDCs moduladas com LPS+TNF-α ou com IL-10+TGF-β ou com BMDCs cultivadas na}

ausência de estímulos. Camundongos do grupo controle foram injetados apenas com o veículo (solução salina). Após a transferência adotiva, a metade dos camundongos de cada grupo foi tratado com OVA (4mg/mL) por via oral, por sete dias consecutivos, enquanto os demais receberam água livre de proteína. Sete dias após a interrupção do tratamento oral, todos os animais foram desafiados por via i.p. com duas doses de 10 μg/mL de OVA, no intervalo de quinze dias, a primeira das quais com 1 mg de Al(OH)3. Sete dias após a última dose de antígeno por

via i.p., os soros de todos os camundongos foram coletados para determinação dos níveis de anticorpos (Painel A) e os baços foram removidos para ensaio de proliferação antígeno-específica (Painel B). Após 4 dias de cultivo, a proliferação foi determinada pelo método do MTT e os sobrenadantes foram coletados e os níveis de citocinas determinados por ensaio de ELISA (Painéis C a F). * p<0.05 na comparação com o respectivo grupo controle não tratado com as BMDCs determinado pelo teste a posteriori de Bonferoni .