EFEITO DE BMDCS MODULADAS SOBRE A PROLIFERAÇÃO ANTÍGENO-

com agentes pró (LPS+TNF-α) e antiinflama

A figura 4 mostra as respostas proliferativas de linfócitos TCD4+, previamente marcadas c

ESPECÍFICA E PRODUÇÃO DE CITOCINAS EM CÉLULAS TCD4+ DE CAMUNDONGOS

BALB/C IMUNES OU TOLERANTES À OVALBUMINA

A capacidade de BMDCs moduladas

tórios (IL-10+TGF-β) modificarem a resposta proliferativa e de produção de citocinas de linfócitos TCD4+ isolados do LNM de camundongos BALB/c, tolerantes ou imunes à OVA, foi avaliada em co-culturas conduzidas na presença do antígeno específico. Após os cultivos, a expressão de moléculas co-estimuladoras com função ativadora (CD28) ou reguladora (CTLA-4) também foi avaliada na superfície nos linfócitos TCD4+, por citometria de fluxo. Co-culturas de BMDCs cultivadas na ausência de estímulos e pulsadas com o antígeno foram usadas como controles nos ensaios. Os resultados obtidos nesses experimentos estão resumidos nas figuras 4 e 5.

om CSFE, em co-culturas conduzidas na presença de CSFE (Painel A) e os níveis de citocinas medidos por ELISA nos sobrenadantes destas co-culturas após 96 horas de cultivo (Painéis B a F). É possível observar que as BMDCs geradas in vitro, tratadas ou não com LPS+TNF-α ou com IL-10+TGF-β, foram capazes de induzir proliferação de células TCD4+ em níveis significativos quando comparadas às culturas de células TCD4+ conduzidas na ausência de BMDCs. Nota-se também que nas culturas conduzidas na presença de BMDCs moduladas com IL-10+TGF-β, a proliferação de células TCD4+ _{foi significativamente menor do que nas culturas} realizadas na presença de BMDCs controles ou de BMDCs moduladas com LPS+TNF-α. Com relação à origem das células TCD4+, isto é, se provenientes de animais tratados com OVA por via

oral e/ou i.p., nota-se que a proliferação das células TCD4+ isoladas de camundongos tratados com OVA apenas por via oral foi significativamente menor do que a de células TCD4+ _obtidas dos demais grupos experimentais.

Da mesma foram, é possível observar que a produção IL-2 e IFN-γ por células TCD4+ de LNM f

todas as situações experimentais. Todavia, o nível desta

(Painel A) e a expressão dos marcadores

oram significativamente maior após sua interação com BMDCs moduladas com LPS+TNF-α do que nas demais co-culturas (Figura 4, Painéis B e C), exceto nas culturas em que os linfócitos TCD4+ foram provenientes de animais tratados com OVA por via oral e depois desafiados por via i.p. (grupo OVA Oral+i.p.). As citocinas IL-10 e IL-4 foram produzidas somente por células TCD4+ isoladas de camundongos imunizados com OVA por via i.p., particularmente em co-culturas conduzidas na presença de BMDCs moduladas com LPS+TNF-α (Figura 4, Painéis D e E). A modulação de BMDCs com IL-10+TGF-β também levou a uma produção mais reduzida de IL-4 e IL-10 nas co-culturas realizadas com linfócitos TCD4+ isoladas de camundongos BALB/c imunes à OVA.

A IL-12 foi produzida pelas BMDCs em

citocina foi mais elevado nas co-culturas em que as BMDCs foram moduladas com LPS+TNF-α e as células TCD4+ obtidas de camundongos que receberam tratamentos por via oral ou i.p. com OVA. De forma oposta, BMDCs moduladas com IL-10+TGF-β apresentaram uma produção reduzida desta citocina em todas as co-culturas, particularmente na interação com células TCD4+ isoladas de BALB/c tolerantes (Figura 4, Painel F).

A figura 5 mostra a freqüência de células CD25+Foxp3+

CTLA-4 na população CD25+ (Painel B) e de CD28 em linfócitos TCD4+ (Painel C) após o cultivo de linfócitos TCD4+ isolados de LNM de camundongos BALB/c tolerantes ou

imunizados com OVA na presença de BMDCs moduladas com LPS+TNF-α ou IL-10+TGF-β e pulsadas com o antígeno.

Para nosso controle, a freqüência de células CD25+Foxp3+ foi determinada em preparações

mento significativo na expressão de CD28 nas células TCD4+ isol

de linfócitos TCD4+ isolados de camundongos BALB/c dos diferentes grupos experimentais antes de sua adição às co-culturas. Como é possível observar no Painel A da figura 5, a freqüência de células CD25+Foxp3+ foi mais elevada nos camundongos tolerantes à OVA, inclusive nos animais tolerantes desafiados por via i.p. A interação dos linfócitos TCD4+ _{com as} BMDCs moduladas com LPS+TNF-α resultou em acentuada expansão da população CD25+Foxp3+ nas células TCD4+ isoladas de camundongos naïve (2,3 x) e dos que receberam a OVA por via oral +i.p. (1,8 x) ou apenas por i.p (7,2 x). A mesma tendência de expansão de células CD25+Foxp3+ foi observada quando se utilizou BMDCs não moduladas ou moduladas com IL-10+TGF-β nas co-culturas com células TCD4+ isoladas de camundongos dos grupo que receberam a OVA oral +i.p. e OVA i.p.

Foi possível observar um au

adas de todos os grupos experimentais e cultivadas na presença de BMDCs pulsadas com OVA, moduladas ou não in vitro. Da mesma forma, também foi possível observar um aumento na expressão de CTLA-4 em células CD25+ cultivadas na presença de BMDCs pulsadas com OVA, moduladas ou não in vitro, exceto quando os linfócitos TCD4+ eram provenientes de camundongos BALB/c tratados com OVA por via oral+i.p.

Figura 4 – Proliferação e produção de citocinas em co-culturas conduzidas com células TCD4+ isoladas de LNM de camundongos BALB/c tolerantes e imunizados com ovalbumina e com BMDCs moduladas com

estímulos pró- e anti-inflamatórios. BMDCs previamente moduladas ou não com LPS+TNF-α ou IL-10+TGF-β

foram pulsadas com OVA (50μg/mL) e incubadas com células TCD4+ _{isoladas do LNM de camundongos}

BALB/c naïve, tratados com OVA por via oral e/ou i.p. Painel A: mostra a freqüência de células TCD4+_/CSFE+

no início da cultura (___{) e de células TCD4}+ _{que expandiram após quatro dias de co-cultivo com as BMDCs}

(CSFElow_{). Painéis B até F: representam os níveis das citocinas IL-2, IFN-γ, IL-10, IL-4 e IL-12p40,}

respectivamente, presentes nos sobrenadantes após quatro dias de cultivo. As comparações entre os grupos experimentais foram feitas pelo teste ANOVA seguido pelo teste a posteriori de Bonferroni. (*) representa valores de p<0,05 na comparação com o controle (grupo cultivado com BMDCs não moduladas) .

4.5. EFEITO DE BMDCS MODULADAS COM AGENTES PRÓ- E ANTI-INFLAMATÓRIOS NA

Figura 5 - Freqüência de células T regulatórias CD25+/Foxp3+ e avaliação da expressão de CD28 e CTLA-4 em

células TCD4+ isoladas do LNM de camundongos BALB/c tolerantes ou imunizados com OVA e cultivadas com

BMDCs moduladas ou não com estímulos pró e antiinflamatórios. BMDCs previamente moduladas com

LPS+TNF-α ou IL-10+TGF-β, ou ainda com BMDCs não moduladas, foram pulsadas com OVA (50μg/mL) e cultivadas com células TCD4+ _{de LNM isoladas de camundongos BALB/c naïve ou tratados com OVA por via}

oral e/ou i.p. Painel A: representa a porcentagem de células CD25+_Foxp3+_{, após quatro dias de co-cultivo com as}

BMDCs; os quadrantes foram traçados utilizando como parâmetro a leitura dos controles isotípicos. Painéis B e C: histogramas ilustrando a expressão de CTLA-4 em células TCD4+ _CD25+ _{e CD28 em células TCD4}+ _coletadas

após três e quatro dias de co-cultivo com BMDCs, respectivamente; (__) indica a expressão de CLTA-4 e CD28 em células TCD4+ _{antes da cultura. A expressão de CTLA-4 e de CD28 foram calculadas com base na intensidade}