DISCUSSÃO

Neste trabalho, investigamos a influência de BMDCs imaturas, imunogênicas (ativadas com LPS+TNF-α), ou tolerogênicas (ativadas com IL-10+TGF-β) sobre as respostas in

vitro de células TCD4+ de camundongos BALB/c e DO11.10 naïve ou imunizados com OVA por

via oral e/ou parenteral. Investigamos também o efeito da transferência adotiva das BMDCs imaturas e moduladas sobre as respostas imunes de camundongos BALB/c e DO11.10 imunizados com OVA por via oral e/ou parenteral.

Inicialmente, as BMDCs imaturas bem como as moduladas foram avaliadas quanto à expressão dos marcadores de ativação CD80, CD86 e CD40. Corroborando dados de literatura [TRINCHIERI, 2003; ADORINI, 2003], nossos resultados mostraram que as BMDCs tratadas com ambos estímulos pró- (LPS+TNF-α) e anti-inflamatórios (IL-10+TGF-β) exibiram um aumento significativo da expressão de todos os marcadores de ativação analisados, tanto nas populações de BMDCs CD11c+ quanto CD11c- quando comparadas às BMDCs não moduladas; muito embora a expressão de CD80, CD86 e CD40 tenha sido significativamente mais elevada nas BMDC tratadas com LPS+TNF-α.

O cultivo de células TCD4+ de ambos os camundongos BALB/c e DO11.10 com BMDCs imaturas ou moduladas com LPS+TNF-α ou IL-10+TGF-β, na presença de OVA, resultou em significativa proliferação linfocitária in vitro. Devido ao fato de aproximadamente 80% células T do camundongo DO11.10 portarem linfócitos T com TCR específico para o peptídeo OVA323-339 [MURPHY et al., 1990], a proliferação na presença de OVA nativa foi bem inferior à observada nas culturas de linfócitos de camundongos BALB/c que possue um repertório mais amplo de especificidades para a OVA.

Nossos resultados mostram ainda que células TCD4+ obtidas tanto de camundongos BALB/c como DO11.10 que receberam OVA por via oral foram refratárias à proliferação, mesmo após a interação com BMDCs, fossem elas moduladas ou não. Outros autores também mostraram que a administração de altas doses do antígeno por via oral leva a uma inibição das respostas de células TCD4+ , isto é, proliferação reduzida acompanhada de baixa produção das citocinas IL-2, IL-4 e IFN-γ, provavelmente associadas com uma deficiência na translocação para o núcleo do fator nuclear de ativação de células T (NFAT) e com a degradação de P27kip1_{, um} inibidor de ciclina dependente de quinase [ASAI et al., 2002].

Observamos ainda que BMDCs moduladas com LPS+TNF-α polarizaram células TCD4+ para um padrão de células efetoras TH1. Da mesma forma, células T esplênicas de camundongos receptores dessas BMDCs também apresentaram o mesmo padrão de produção de citocinas em ensaios ex-vivo, exibindo altos níveis de IFN-γ nos sobrenadantes, acompanhado por aumento na produção de IL-12 nas culturas. Nesse sentido, KAPSEMBERG [2003] propôs que a estimulação de DCs imaturas via receptores de reconhecimento de padrões moleculares (PRRs), ou de receptores endógenos como TNFR, se diferenciam em diferentes populações funcionais que seletivamente promovem a polarização de células TCD4+ em populações efetoras TH1, TH2 ou em populações de células T reguladoras. O LPS e TNF-α são potentes indutores da produção de IL-12 em DCs, que constitui um dos principais fatores da indução de perfil TH1 em linfócítos T naïve [TRINCHIERI, 2003]. Como observado neste trabalho e em dados da literatura, a estimulação por LPS promove diversas alterações em DCs como, por exemplo, aumento na expressão de moléculas co-estimulatórias CD80, CD86 e CD40, de moléculas do MHCII [BOES

et al., 2002], de receptores de quimiocinas como CXCR4 [WANG et al., 2009] e no padrão de

citocinas e fatores pró-inflamatórios produzidos por estas células.

Outro aspecto observado neste trabalho foi a alta produção de citocinas do perfil TH2, isto é, IL-10 e IL-4, por células TCD4+ de comundongos BALB/c imunizados por via parenteral, após a estimulação com BMDCs imaturas ou moduladas, particularmente com BMDCs moduladas com LPS+TNF-α. Contudo, foram as células esplênicas de camundongos BALB/c receptores de BMDCs imaturas ou moduladas com IL-10+TGF-β e subseqüentemente imunizados com OVA, que apresentaram os níveis mais altos de IL-4 em culturas realizadas na presença do antígeno. Por outro lado, as células TCD4+ de camundongos DO11.10, em co-cultura com BMDCs imaturas ou moduladas, não mostraram produção significativa de IL-10 e IL-4. Entretanto, as células T esplênicas dos trangênicos receptores de BMDCs imaturas e subseqüentemente imunizados com OVA, reverteram a tendência original, mostrando alta produção de IL-4 no sistema ex-vivo.

Em conjunto estes resultados indicam que BMDCs moduladas são capazes de desenvolver também células efetoras TH2, principalmente em células T previamente ativadas obtidas de camundongos imunizados. Colaborando com estes resultados um trabalho prévio do nosso laboratório demonstrou que o protocolo de imunização utilizado neste trabalho levou em camundongos BALB/c uma resposta humoral dependente de estimulação de células TH2, enquanto que em camundongos transgênicos este protocolo induziu uma resposta de anticorpos dependente tanto de células TH1 quanto de TH2 [SIMIONI et al., 2004]. Além disso, trabalhos prévios demonstraram que DCs moduladas com estímulos como LPS ou TNF-α são capazes de expandir e diferenciar células TH2 efetoras [AHRENS et al., 2009, KIKUCHI et al., 2003].

AHRENS et al. [2009] demonstraram que, DCs estimuladas com LPS e na presença do antígeno foram capazes de diferenciar e expandir populações TH2 produtoras de IL-10, da mesma maneira KIKUCHI et al. [2003] demonstraram que a modulação de DCs murinas com TNF-α preferencialmente polarizam células TCD4+TCR-OVA+ naïve em células TH2.

Trabalhos anteriores demonstraram que BMDCs tolerogênicas podem ser geradas in

vitro após a estimulação com diferentes fatores [Revisto por RUTELLA et al., 2006]. Dentre eles

a modulação com as citocinas IL-10 [STEINBRINK et al., 1997, MÜLLER et al., 2002] e TGF-β [LUO et al., 2007] vêm sendo aplicadas na diferenciação in vitro de DCs tolerogênicas. Neste trabalho nós demonstramos que, BMDCs moduladas com IL-10+TGF-β tiveram uma capacidade mais reduzida de estimular a proliferação de células TCD4+ do que BMDCs não moduladas ou moduladas com LPS+TNF-α, isto também foi acompanhado de níveis reduzidos de IFN-γ e IL- 12. Colaborando com estes resultados observamos também que BMDCs moduladas com IL- 10+TGF-β quando transferidas para camundongos DO11.10 naive que foram posteriormente imunizados pela via i.p. ou foram tratados pela via oral e imunizados com o antígeno apresentaram uma redução na produção de anticorpos anti-OVA específicos, acompanhado de uma redução na proliferação de células T e da produção de IFN-γ e IL-4 na linfoproliferação de células esplênicas estimuladas com o antígeno. Estes dados são apoiados por dados da literatura que demonstraram a capacidade tolerogênica de BMDCs previamente tratadas com IL-10 [STEINBRINK et al., 1997, MÜLLER et al., 2002] e TGF-β [LUO et al., 2007]. MÜLLER et

al., [2002] demonstraram que BMDCs pré-tratadas com IL-10 apresentaram uma capacidade

imunizados com OVA, neste trabalho foi demonstrado que estas DCs também foram capazes de inibir respostas de hipersensibilidade tardia (DTH) específica para OVA in vivo.

Nesse sentido também, um trabalho recente utilizando BMDCs obtidas, estimulados por oito dias com as citocinas inibitórias IL-10 e TGF-β demonstrou que essas células tiveram efeito protetor contra endotoxemia experimental e de peritonite bacteriana, podendo estar envolvidas na supressão de células TCD4+ funcionais localizadas nos tecidos linfóides secundários [FUJITA et al., 2006]. Da mesma maneira, dados da literatura demonstraram que DCs maturadas in vitro e estimuladas com IL-10 apresentam expressão diferenciada nas vias de sinalização do NFκ-B, sendo que a IL-10 atua na ativação das proteínas inibidoras IKK em DCs imaturas [BHATTACHARYA et al., 2004].

Dentre os mecanismos de tolerância periférica, exercidos por DCs, a geração de populações de células T reguladoras antígeno-específicas na periferia, vem sem do apontadas como um dos principais mecanismos de inibição de respostas imunes danosas na periferia [STEINMAN & NUSSENSZWEIG, 2003; RUTELLA et al., 2006; ADORINI, 2003]. Neste trabalho, nós demonstramos que BMDCs previamente moduladas com LPS+TNF-α foram capazes de expandir in vitro a população de células reguladoras CD25+_Foxp3+ _{em células TCD4}+ obtidas de camundongos BALB/c, independentemente do tratamento prévio com o antígeno que estes camundongos receberam. Nesse sentido, observamos também que BMDCs não moduladas ou moduladas com IL10+TGF-β também foram capazes de induzir a expansão de células T reguladoras em células TCD4+, obtidas de camundongos que foram imunizados com o antígeno. Entretanto, nas células TCD4+ obtidas de camundongos DO11.10 a expansão de células T reguladoras foi menos evidente.

Os dados relatados acima corroboram com dados da literatura, os quais demonstram a capacidade de BMDCs em expandir populações de células T reguladoras CD4+ _CD25+_Foxp3+ [MARGUTI et al., 2009]. A capacidade que BMDCs moduladas com estímulos pró- inflamatórios como, LPS e TNF-α, possuem de expandir populações de células T reguladoras indica que estas células também podem exercer funções tolerogênicas. Nesse sentido, MENGES

et al. [2002] demonstraram que a transferência de BMDCs moduladas com TNF-α apresentou

uma função protetora em camundongos que foram submetidos a indução de encefalomielite auto- imune experimental (EAE), além disso, neste mesmo modelo experimental foi demonstrado DCs, obtidas de camundongos que foram tratados com LPS nas fases iniciais da vida, apresentaram uma capacidade mais elevada em expandir células T CD4+Foxp3+ do que DCs obtidas de camundongos não tratados com LPS. Ainda com relação ao efeito do LPS, LUTZ et al., [2000] demonstraram que BMDCs diferenciadas na presença de altas doses de LPS, geraram células com um perfil imaturo, as quais foram capazes de induzir anergia em células T CD4+ aloantígeno específicas.

Os mecanismos pelos quais BMDCs tolerogênicas exercem para induzir a expansão de células T reguladoras ainda não estão completamente esclarecidos. Entretanto, diversos mecanismos vêm sendo propostos, dentre eles, a ativação de vias de sinalização das moléculas co-estimulatórias de células T após a interação com moléculas co-estimulatórias ou receptores presentes em DCs, como, CD80/CD86, ou como descrito recentemente, com receptores PD-L e ILT-3/ILT-4. [BOUR-JORDAN & BLUESTONE, 2009]. Neste sentido, demonstramos que independentemente da origem das células T CD4+_{, a interação com BMDCs moduladas ou não} levou a um aumento na expressão de CD28 nestas células e na expressão de CTLA-4 na

população de células CD25+. Dados recentes da literatura vêm demonstrando a importância das vias co-estimulatórias das moléculas CD28 e CTLA-4 para o desenvolvimento de células T reguladoras CD4+CD25+Foxp3+. Com relação ao CD28, estudos in vitro, demonstraram que a proliferação desta população de células T reguladoras, induzidas por DCs, foi dependente da presença de moléculas da família B7 nas DCs; já com relação ao CTLA-4, diversos estudos demonstraram a relação desta molécula com as funções das células T reguladoras, embora a influencia desta na expansão e diferenciação ainda é desconhecido [Revisto por BOUR-JORDAN & BLUESTONE, 2009].

Em conjunto, os resultados deste trabalho mostraram que BMDCs moduladas in vitro são capazes de estimular células TCD4+ in vitro em padrões de células TH1 e TH2 efetoras ou em células T reguladoras CD25+Foxp3+. Todavia, notamos que apenas BMDCs moduladas com IL-10+TGF-β apresentaram funções tolerogênicas in vivo. Nesse sentido, tais resultados indicam que devem ser conduzidos estudos mais aprofundados sobre o papel que DCs tolerogênicas geradas in vitro exercem em modelos experimentais in vivo. Tais abordagens serão de grande valia para o desenvolvimento de melhores estratégias para imunoterapias baseadas no uso de DCs tolerogênicas.