EFEITO DE BMDC MODULADAS SOBRE A PROLIFERAÇÃO ANTÍGENO-

E PRODUÇÃO DE CITOCINAS EM CÉLULAS TCD4+ DE CAMUNDONGOS DO11.10

TRATADOS COM OVALBUMINA

Co-culturas de BMDCs moduladas por agentes pró e antiinflamatórios com células TCD4+ obtidas do LNM de camundongos transgênicos DO11.10 tratados com OVA foram conduzidas de forma idêntica à descrita acima para células TCD4+ isoladas de camundongos BALB/c. No caso particular das células TCD4+ _{dos camundongos DO11.10, apenas a} proliferação OVA323-339-específica das células dos transgênicos foi considerada para efeitos de ilustração dos resultados, uma vez que tais células podem e foram simultaneamente marcadas com o anticorpo monoclonal específico para o TCR clonotípico, [MARRACK et al., 1983]. A proliferação e produção de citocinas observadas nas co-culturas de células TCD4+ transgênicas com BMDCs estão resumidos na figura 6. A freqüência de células CD25+_Foxp3+ _{(Painel A) nas} co-culturas, bem como a expressão de CTLA-4 (Painel B) e CD28 (Painel C) nas células cultivadas estão ilustradas na figura 7.

Como é possível observar na Figura 6 (Painel A), uma intensa atividade proliferativa pode ser observada nas co-culturas conduzidas com células TCD4+ dos camundongos transgênicos e BMDCs pulsadas com OVA, moduladas ou não com LPS+TNF-α ou com IL- 10+TGF-β. Interessantemente, foi possível notar que a proliferação das células TCD4+ _TCR OVA+ foi mais reduzida na interação com BMDCs moduladas com LPS+TNF-α ou IL-10+TGF- β do que com as BMDCs não moduladas.

No que diz respeito à produção de citocinas, foi possível observar níveis mais elevados de IL-2 nas co-culturas em que as células TCD4+ provinham de camundongos DO11.10

imunizados com OVA por via i.p. e as BMDCs eram não moduladas (Figura 6, Painel B); nos demais grupos experimentais, no momento da coleta dos sobrenadantes, a IL-2 não estava presente em quantidades detectáveis pelo método (3pg/mL). As co-culturas realizadas com BMDCs não moduladas foram capazes de induzir alta produção de IFN-γ em células TCD4+ isoladas do LNM de camundongos DO11.10 naïve ou tratados com OVA pelas vias oral+i.p (Figura 6, Painel C). A produção de IFN-γ também foi elevada nas culturas em que as células TCD4+ eram provenientes dos transgênicos imunizados com OVA por via oral e as BMDCs foram moduladas por LPS+TNF-α. Todavia, não houve produção significativa das citocinas IL- 10 e IL-4 em qualquer das co-culturas de BMDCs com células TCD4+ dos camundongos DO11.10 (Figura 6, Painéis D e E).

Por outro lado, produção de IL-12 nas co-culturas de BMDCs com as células TCD4+ dos transgênicos foi significativamente mais reduzida quando as BMDCs foram moduladas com IL-10+TGF-β em comparação com os níveis encontrados nas culturas conduzidas com BMDCs não moduladas ou tratadas com LPS+TNFα (Figura 6, Painel F).

Antes de sua adição às culturas, a freqüência de células T reguladoras CD4+/CD25+/Foxp3+ era mais elevada no grupo de camundongos DO11.10 imunizados com OVA por via oral (Figura 7, Painel C). Ao término do cultivo com as BMDCs, células TCD4+/CD25+/Foxp3+ foram expandidas apenas nas culturas conduzidas com células TCD4+ obtidas de camundongos DO11.10 imunizado com OVA por via i.p; nos demais grupos experimentais a freqüência de células T regulatórias ou não variou (nas co-culturas com BMDC não moduladas) ou sofreu redução em comparação com o seu número inicial (nas co-culturas com BMDCs moduladas com LPS+TNF-α).

Antes do cultivo, a expressão de CD28 nos linfócitos TCD4+ encontrava-se mais elevada nos grupos de DO11.10 naïve e imunizados pelas via oral ou oral+i.p. Após o cultivo com quaisquer das BMDCs, moduladas ou não, a expressão de CD28 se elevou significativamente em linfócitos TCD4+ isolados de todos os grupos experimentais, inclusive nos do grupo imunizado com OVA por via i.p. (Figura 7, Painel C). Por outro lado, a expressão de CTLA-4 se elevou significativamente apenas nas células TCD4+CD25+ isoladas de camundongos DO11.10 naïve e imunizados pelas via oral ou oral+i.p, cultivadas com quaisquer das BMDCs empregadas, moduladas ou não (Figura 7, Painel B).

Figura 6 – Proliferação e produção de citocinas em co-culturas conduzidas com células TCD4+ isoladas de LNM de camundongos DO11.10 tratados com ovalbumina e BMDCs moduladas com estímulos pró e antiinflamatórios.

BMDCs previamente moduladas ou não com LPS+TNF-α ou IL-10+TGF-β foram pulsadas com OVA (50μg/mL) e incubadas com células TCD4+ _{isoladas do LNM de camundongos DO11.10 naïve, tratados com OVA por via}

oral e/ou i.p. Painel A: mostra a freqüência de células TCR-OVA+_/CD4+_/CSFE+ _{no início da cultura (}___{) e de}

daquelas que expandiram após quatro dias de co-cultivo com as BMDCs (CSFElow_{). Painéis B até F: representam}

os níveis das citocinas IL-2, IFN-γ, IL-10, IL-4 e IL-12p40, respectivamente, presentes nos sobrenadantes após quatro dias de cultivo. As comparações entre os grupos experimentais foram feitas pelo teste ANOVA seguido pelo teste a posteriori de Bonferroni. (*) representa valores de p<0,05 na comparação com o controle (grupo cultivado com BMDCs não moduladas).

Figura 7- Freqüência de células T reguladoras CD25+/Foxp3+ e avaliação da expressão de CD28 e CTLA-4 em

células TCD4+ isoladas do LNM de camundongos DO11.10 imunizados com OVA e cultivadas com BMDCs

moduladas ou não com estímulos pró- e anti-inflamatórios. BMDCs previamente moduladas com LPS+TNF-α ou

IL-10+TGF-β, ou ainda com BMDCs não moduladas, foram pulsadas com OVA (50μg/mL) e cultivadas com células TCD4+ _{de LNM isoladas de camundongos DO11.10 naïve ou tratados com OVA por via oral e/ou i.p.}

Painel A: representa a porcentagem de células CD25+_Foxp3+_{, após quatro dias de co-cultivo com as BMDCs; os}

quadrantes foram traçados utilizando como parâmetro a leitura dos controles isotípicos. Painéis B e C: histogramas ilustrando a expressão de CTLA-4 em células TCD4+ _CD25+ _{e CD28 em células TCD4}+ _{coletadas após três ou}

quatro dias de co-cultivo com BMDCs, respectivamente; (___{) indica a expressão de CLTA-4 e CD28 em células}

TCD4+ _{no início da cultura. A expressão de CTLA-4 e de CD28 foram calculadas com base na intensidade média}

4.6. EFEITOS DA TRANSFERÊNCIA ADOTIVA DE BMDCs MODULADAS IN VITRO SOBRE