UNIVERSIDADE ESTADUAL DE SANTA CRUZ
PRÓ-REITORIA DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA E
BIOLOGIA MOLECULAR
TRANSFERABILIDADE E MAPEAMENTO DE
MICROSSATÉLITES ENTRE Theobroma cacao E
T. grandiflorum
ANALINE DOS SANTOS NASCIMENTO
ILHÉUS – BAHIA – BRASIL Fevereiro de 2014
ANALINE DOS SANTOS NASCIMENTO
TRANSFERABILIDADE E MAPEAMENTO DE
MICROSSATÉLITES ENTRE Theobroma cacao E
T. grandiflorum
Dissertação apresentada à Universidade Estadual de Santa Cruz, como parte das exigências para obtenção do título de Mestre em Genética e Biologia Molecular.
Área de concentração: Genética e Biologia Molecular
ILHÉUS – BAHIA – BRASIL Fevereiro de 2014
ANALINE DOS SANTOS NASCIMENTO
TRANSFERABILIDADE E MAPEAMENTO DE
MICROSSATÉLITES ENTRE Theobroma cacao E T. grandiflorum
Dissertação apresentada à Universidade Estadual de Santa Cruz, como parte das exigências para obtenção do título de Mestre em Genética e Biologia Molecular.
Área de concentração: Genética e Biologia Molecular
APROVADA: 27 de fevereiro de 2014.
_________________________ ______________________________
Prof.(a) Dra. Fabienne Micheli Prof. Dr. Uilson Vanderlei Lopes
CIRAD/ UESC CEPLAC
_____________________________ ______________________________
Prof. Dr. Ronaldo Carvalho Santos Prof. Dr. Didier Clément
AGRADECIMENTOS
À Deus pelo dom da vida e por nunca ter me abandonado em nenhum momento da minha existência.
Aos meus pais (biológicos e de coração) e ao meu marido pelo amor incondicional oferecido a mim, pela dedicação e confiança.
À Universidade Estadual de Santa Cruz pela oportunidade de cursar a pós-graduação.
À CAPES-EMBRAPA e CNPq pela concessão da bolsa de estudos e financiamento do projeto coordonado pela Dra Fabienne Micheli do CIRAD-UESC
À CEPLAC/CEPEC-BA pela infraestrutura laboratorial, disponibilidade de pessoal para condução do projeto.
À CEPLAC/CPATU- PA pela concessão e acondicionamento de parte do material biológico utilizado no experimento.
Ao Dr. Didier Clément pela orientação, amizade, confiança, dedicação e ensinamentos adquiridos.
À Dra. Karina Peres Gramacho pela orientação, colaboração e apoio para execução dos trabalhos.
Ao Dr. Rafael Moysés Alves da EMBRAPA-BELÉM pela co-orientaçao e concessão de marcadores moleculares utilizados no projeto.
Ao Dr. Paulo Albuquerque pelos ensinamentos acadêmicos, culturais e receptividade na cidade de Belém do Pará.
À Dra. Lucília Marcellino do CENARGEN-BRASÍLIA pela concessão de parte dos marcadores moleculares utilizados na pesquisa.
A toda equipe que compõe a família FITOMOL, em especial, Louise e Tamiles pelos momentos divertidos na bancada, Lívia Lemos, Rodrigo Ganem, Seu José, Seu Ruben, Kaleandra Sena, Maria Rafaela, Everton Cruz, que sempre colaboram para o bom funcionamento de laboratório e por facilitarem tanto o dia-a-dia.
Às amigas de toda vida Lívia Santana dos Santos e Verônica Cordeiro Silva pela dedicação, amizade, companheirismo, incentivo e apoio sempre.
Aos amigos Luciel Fernandes, Geovane Campanha, Marcos Ramos, Rangeline Avezedo, Nara Braz, Francisca Jucá, pela dedicação, apoio e companheirismo durante todas as etapas de execução do projeto.
À todos colegas da turma 2012/2014 do mestrado pelo companheirismo.
Aos professores do Programa de Pós-graduação em Genética e Biologia Molecular pelas lições aprendidas e compartilhadas durante todo o curso de mestrado, em especial, Ronan Corrêa Xavier, Carlos Priminho Pirovani e Fernanda Amato Gaiotto pelos ensinamentos na área genética e de melhoramento molecular.
Aos coordenadores e funcionários do PPGGBM pelo apoio e dedicação.
A todos que tiveram participação direta ou indireta na execução desse trabalho, MUITO OBRIGADA!
ÍNDICE EXTRATO ... viii ABSTRACT ... x 1. INTRODUÇÃO ... 1 2. REVISÃO DE LITERATURA ... 2 2.1 Theobroma cacao L... 3
2.1.1 BIOLOGIA E DISPERSÃO GEOGRÁFICA ... 3
2.1.2 IMPORTÂNCIA ECONÔMICA ... 4
2.2 Theobroma grandiflorum ... 5
2.3 MARCADORES MOLECULARES NA CONSTRUÇAO DE MAPAS GENÉTICOS ... 7
2.4 TRANSFERABILIDADE DE MARCADORES E MAPEAMENTO COMPARATIVO ... 8 3. MATERIAL E MÉTODOS ... 11 3.1 MATERIAL BIOLÓGICO ... 11 3.2 MARCADORES MOLECULARES ... 13 3.3 EXTRAÇÃO DE DNA ... 14 3.4 AMPLIFICAÇÃO ... 15 3.5 GENOTIPAGEM ... 16
3.6 MAPEAMENTO GENÉTICO PARCIAL DE Theobroma grandiflorum ... 16
3.7 BLAST DAS SEQUÊNCIAS DOS SSR DE Theobroma Grandiflorum NO GENOMA DE Theobroma Cacao ... 17
4. RESULTADOS ... 18
4.2 AMPLIFICAÇÃO E GENOTIPAGEM ... 19
4.3 MAPEAMENTO GENÉTICO PARCIAL DA ESPÉCIE Theobroma grandiflorum ... 23
4.4 BLAST DAS SEQUÊNCIAS DOS SSR DE Theobroma Grandiflorum NO GENOMA DE Theobroma Cacao ... 25
5. DISCUSSÃO ... 30
6. CONCLUSÕES ... 33
7. REFERÊNCIAS ... 34
EXTRATO
NASCIMENTO, Analine dos Santos, MSc, Universidade Estadual de Santa Cruz, Ilhéus,
Fevereiro de 2014. TRANSFERABILIDADE E MAPEAMENTO DE
MICROSSATÉLITES ENTRE Theobroma cacao E T. grandiflorum. Orientador: Didier Clément. Co-orientadora: Karina Peres Gramacho/Rafael Moysés Alves.
O gênero Theobroma abrange 22 espécies nativas da região amazônica. Duas espécies são cultivadas no Brasil: Theobroma cacao e T. grandiflorum. Theobroma cacao, tem um longo
acervo de estudos relacionados à sua biologia, reprodução e interações com as doenças como a vassoura-de-bruxa causada pelo fungo Moniliophthora perniciosa que afeta severamente a produção de cacau no Brasil. T. grandiflorum é economicamente importante para os estados amazônicos do Brasil onde foram desenvolvidos alimentos e cosméticos com a polpa e manteiga do cupuaçu, mas esta espécie é também afetada pela vassoura-de-bruxa. Com a evolução do uso de ferramentas moleculares é possível ter informações sobre a transferabilidade de marcadores moleculares desenvolvidos em cada espécie e subsequentemente realizar estudos em mapeamento. Este trabalho teve como objetivo i) testar a transferabilidade de marcadores moleculares microssatélites, específicos de T. cacao em T.
grandiflorum, e específicos de T. grandiflorum em T. cacao, ii) construir um mapa genético a
partir de um cruzamento de T. grandiflorum realizado com os pais 174 x 1074, respectivamente resistente e susceptível à vassoura-de-bruxa e a partir dos primeiros resultados da genotipagem da população, iii) posicionar no genoma do cacau os marcadores microssatélites de T. grandiflorum. Foram assim testados nos pais CP174 e CP1074 e em alguns indivíduos, 181 marcadores específicos de cacau em cupuaçu e em cinco genótipos de cacau representativos da diversidade: B97/61/B2; Scavina-6; ICS1, SIC864 e CCN51, 44 marcadores microssatélites de T. grandiflorum. Os microssatélites de T. grandiflorum foram desenvolvidos por duas equipes da Embrapa: 14 microssatélites pelo CENARGEN e 30 pelo CPATU. Foi feito um primeiro mapeamento genético parcial com o software JoinMap 4.1 a partir da matriz de genotipagem, anteriormente obtida pela equipe do CPATU junto com a CEPLAC (Belém) e constituída de 142 indivíduos e 36 microssatélites (cacau e cupuaçu), polimórficos nos pais 174 e 1074. Usando a página de internet do CIRAD (Cocoagen DB/Gbrowser) dedicado ao sequenciamento do genoma do cacau, foi realizado um blast das sequências dos primers de 149 microsatélites de T. grandiflorum, 14 deles obtidos a partir de
sequencias Express Sequence Tags (EST). Resultados obtidos na triagem dos 181 microssatélites de cacau mostraram que 74 marcadores amplificaram (43,09 %), desses, 44 foram polimórficos (56,41%) entre os pais CP174 e CP1074. Os 14 microssatélites de ESTs, anteriormente testados para o polimorfismo entre os pais CP174 e CP1074 se revelaram, em parte, monomórficos. O resultado do teste de amplificação dos 14 microssatélites mostrou que a partir dos nove que foram amplificados só dois (c_180 e c_203B) apresentaram-se polimórficos. Entre os nove amplificados, sete apresentaram diversos alelos nos cinco genótipos de cacau analisados. O resultado da amplificação de 30 microssatélites (polimórficos nos pais do cruzamento) nos cinco clones de cacau, mostraram que 28 amplificaram, mostrando alelos diferentes entre eles. O resultado do mapeamento genético de 36 microssatélites, utilizando JoinMap 4.1, permitiu mapear 9 e 16 microssatélites, respectivamente, de cacau e cupuaçu em sete grupos de ligação, desses, seis, onde cinco (2,3,4,5 e 8) foram identificados como os grupos de ligação do mapa de referência cacau. A partir dos 147 microssatélites de T.grandiflorum, 38 microssatélites foram blastados de uma ou duas seqüências de primers (foward e reverse), desses, 5 estavam localizados no cromossomo Tc00 (sequências não localizadas entre os 10 cromossomos). Os 33 SSR localizados nos cromossomos (1 a 10) foram posicionados no mapa genético de referência de cacau. Dentre os que apresentaram blast positivos com os dois primers, cinco foram identificados no grupo de ligação Tc00; 18 foram identificados nos cromossomos do cacau e posicionados no mapa genético consenso do cacau. Os resultados do presente trabalho permitiram obter mais informações sobre a transferabilidade e mapeamento de marcadores microssatélites entre Theobroma cacao e T.grandiflorum. As perpectivas de trabalho serão finalizar o primeiro mapa genético da espécie T.grandiflorum, utilizando os marcadores polimórficos identificados em cacau, bem como iniciar as primeiras análises e localização de QTLs associados à resistência à vassoura-de-bruxa em parceria com a CEPLAC de Belém.
ABSTRACT
NASCIMENTO, Analine dos Santos, MSc, Universidade Estadual de Santa Cruz, Ilhéus, Fevereiro de 2014. TRANSFERABILITY AND MAPPING MICROSATELLITE BETWEEN Theobroma cacao and T. grandiflorum. Orientador: Didier Clément. Co-orientadores: Karina Peres Gramacho/ Rafael Moysés Alves.
The Theobroma genus includes 22 species native to the Amazon region. Two species are grown in Brazil: Theobroma cacao and T. grandiflorum. T. cacao has a longe collection of knowledge related to the biology, reproduction and interactions with diseases such as the witches' broom caused by the fungus Moniliophthora perniciosa which severely affects the production of cocoa in Brazil. T. grandiflorum is economically important for the Amazonian regions of Brazil where food and cosmetics with the pulp of the cupuaçu have been developed, but this species is also affected by the witches' broom disease. With the evolution of the use of molecular tools it is possible to have information about the transferability of molecular markers developed in each species and subsequently to perform mapping studies. This study aimed to i) test the transferability of microsatellites, specific of T. cacao in T.
grandiflorum and specific of T. grandiflorum in T. cacao, ii) build a genetic map from a cross
of T. grandiflorum made from 174 x 1074 parents, respectively resistant and susceptible to witches' broom disease using the first results of the genotyping of the population, and finally, iii) try to locate microsatellites of T. grandiflorum in the cocoa genome. Thus, 181 markers specific of cocoa were tested in the parents CP174 and CP1074 and some individuals, and 44 markers specific of cupuaçu, five cacao genotypes representative of diversity as: B97/61/B2 ; Scavina - 6 ; ICS1 , SIC864 and CCN51. Microsatellites of T. grandiflorum were developed by two teams of Embrapa 14 and 30 microsatellites respectively by CENARGEN and CPATU. A first partial genetic map was carried out using JoinMap 4.1 software from the genotyping matrix of 142 individuals and 36 polymorphic microsatellites (cocoa and cupuaçu) in CP174 and CP1074, previously obtained by the team CPATU and CEPLAC (Belém). Using the internet site of the CIRAD (Cocoagen DB / GBrowser), dedicated to the sequencing results of the cocoa genome, the sequences of the primers for 149 microsatellites of T. grandiflorum, incluing 14 from Expressed Sequence Tag (ESTs) of CENARGEN were
were amplified among them 44 were polymorphic (56.41%) on the CP174 and CP1074 parents. The 14 microsatellites from ESTs, previously tested for the polymorphism on CP174 and CP1074 parents, have been found in part monomorphic. The result of the amplification test from 14 microsatellites on 174 and 1074, showed that among the 9 that were amplified, only two (c_180 and c_203B) showed polymorphism. Among the 9 microsatellites amplified, 7 showed several alleles in the five cacao genotypes analyzed. Results of the amplification of 30 microsatellites of the CPATU (polymorphic in the parents of the cross) in all five cacao clones showed that 28 presented different alleles. The result of the genetic mapping from 36 microsatellites, using JoinMap 4.1, allowed to map 9 and 16 microsatellites respectively from cocoa and cupuaçu into seven groups, where five (2, 3, 4, 5 e 8) have been identified as the linkage groups of the cocoa reference map. From the 147 microsatellites of T. grandiflorum, 38 microsatellites were blasted from one or two sequences of primers (forward and reverse) whose 5 were located on the chromosome Tc00 (unlocated sequences on the 10 chromosome). Thirty-three SSRs located on the chromosomes (1 to 10) were positioned on the reference consensus genetic map of cocoa. The results of this study indicate more information about the transferability and mapping of microsatellite markers between T. cacao and T. grandiflorum. The perspectives of this work will be finished the first genetic map of T.
grandiflorum species using polymorphic markers identified in cocoa and start the first
analyzes and localization of QTLs associated with resistance to witches' broom in partnership with CEPLAC of Belém station.
1 INTRODUÇÃO
Theobroma cacao L. e Theobroma grandiflorum são duas das espécies mais
exploradas da família Malvaceae, são diplóides (2n=20 cromossomos) e perenes (ALVES et al., 2007). Theobroma cacao L. é considerado ainda uma das fontes de renda de pequenos e grandes produtores agrícolas devido ao seu produto final, o chocolate, que nas últimas décadas do século passado foi considerado um dos motores da economia do Brasil e outros países, como a Costa de Marfim, primeiro produtor de cacau no mundo (QUEIROZ et al., 2003). Theobroma grandiflorum que esta distribuído principalmente na região Amazônica e por toda Mata Atlântica onde ele foi introduzido. A espécie vem ganhando destaque no panorama agrícola e econômico do país decorrente do crescente consumo de sua polpa para fabricação de produtos alimentícios como sucos, sorvetes, geleias, devido ao seu sabor e aroma característicos sendo também explorado pela indústria de cosméticos (ALVES et al., 2007).
No fim do século passado, as plantações de Theobroma cacao foram praticamente devastadas das fazendas da Bahia e adjacências em decorrência da atuação do fungo basidiomiceto Moniliophthora perniciosa, causador da doença vassoura-de-bruxa. A vassoura-de-bruxa apareceu no estado da Bahia em 1989 (PEREIRA et al., 1996). O fungo infecta vários tecidos da planta: ramos, almofadas florais, flores e frutos maduros. O crescimento hipertrófico dos meristemas vegetativos infectados, chamado de “vassoura”, é o sintoma mais característico da doença. Vários esforços têm sido deflagrados pelos governos federal e estadual, no sentido de tentar recuperar a cacauicultura baiana, usando, entre outros, a clonagem de materiais resistentes (LOPES et al., 2011) . No CEPEC (Centro de Pesquisas do Cacau - CEPLAC) começaram os estudos de genética molecular para conhecer a diversidade do cacaueiro e do fungo, bem como a identificação das regiões do genoma (os QTLs – Quantitative Trait Loci) implicadas na expressão da resistência à vassoura-de-bruxa (QUEIROZ et al., 2003.; BROWN et al., 2005.; FALEIRO et al., 2006)
O primeiro caso de infecção em T. grandiflorum no sul da Bahia foi relatado em meados de 1997 (LOPES, et al., 2001). Os estudos relacionados ao cupuaçu ainda estão em andamento com grupos de pesquisas, entre eles a CEPLAC e a UESC na Bahia ,o
CENARGEN (Brasília) e o CPATU (Pará em parceria com o CIRAD). em Belém-PA, estão sendo realizadas as primeiras etapas de melhoramento do cupuaçuzeiro. O mapeamento genético do cupuaçuzeiro foi iniciado na EMBRAPA-CPATU envolvendo uma população oriunda dos paisCP174(resistente) eCP1074(susceptível). A equipe está realizando a genotipagem e fenotipagem, inicialmente de 200 plantas deste cruzamento, hoje com 142 indivíduos no campo. Já foram passados 30 marcadores microssatélites (SSRs) específicos do cacaueiro e 117 específicos do cupuaçuzeiro. No total 13 SSRs do cacauiero e 23 SSRs do cupuaçuzeiro foram detectados como polimórficos na população para a equipe CPATU-CEPLAC (Belém).
Diante desse cenário, este trabalho surge como uma das etapas de um projeto maior que visa a construção do mapa genético de T. grandiflorum para fins de conhecimento e melhoramento genético da espécie com a utilização de marcadores moleculares microssatélites. Com isso tivemos como objetivo principal a obtenção de, por meio de transferabilidade, marcadores informativos da espécie T. cacao que pudessem ser utilizados na construção de um mapa genético parcial para a espécie T. grandiflorum.
2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 Theobroma cacao L.
2.1.1 BIOLOGIA E DISPERSÃO GEOGRÁFICA
A espécie Theobroma cacao L. que hoje pertence ao gênero Theobroma, família Malvaceae e a ordem Malvales, anteriormente era classificada na família Sterculiaceae do gênero Theobroma (ALVERSON et al., 1999). T. cacao é considerada a mais importante para o setor econômico, de um conjunto de 22 espécies que compõem este gênero, seguido pela espécie T. grandiflorum (Willd. Ex Spreng Schum) (BARTLEY, 2005).
O cacaueiro é uma planta nativa das florestas úmidas das Américas do Sul e Central; o seu provável centro de origem corresponde as nascentes do alto Amazonas (CHEESMAN, 1944, DIAS, 2001). É uma espécie alógama, perene e com genoma composto por 2n=20 cromossomos com tamanho do genoma estimado em 0,43 ou 0,415 x 109 picogramas (FIGUEIRA et al., 1992, ARGOUT et al., 2010). O cacaueiro pertence à classe das dicotiledôneas e, suas sementes representam a parte economicamente aproveitável do fruto. Chega a atingir 20 metros de altura em condições silvestres, mas em condições de cultivo normalmente alcançam ao redor de 5 metros.
Do seu provável centro de origem, espalhou-se em duas principais direções, o que resultou nos dois principais grupos genéticos (CUATRECASAS, 1964). Na América do Sul, o Criollo, é cultivado hoje principalmente na Venezuela, e o Forastero em todos países produtores de cacau incluindo o Brasil. Um terceiro grupo, denominado Trinitário, é apresentado por alguns pesquisadores como originário de um cruzamento entre um Criollo e um Forastero da bacia amazônica (MOTAMAYOR et al., 2008). A maior parte da produção
mundial de cacau cerca de 85% provém de cruzamento entre os Forasteros e Forastero com Trinitario sendo o último predominante também nas plantações brasileiras. Segundo Rosário et al. (1978), o grupo Criollo é considerado como o primeiro cacau a ser domesticado, possuindo frutos grandes com casca enrugada, responsável pela produção de um chocolate mais refinado.
2.1.2 IMPORTÂNCIA ECONÔMICA
O cacau é mundialmente conhecido devido ao seu produto comercial de maior valor econômico, a semente, que devidamente fermentada e seca passa a ser denominada amêndoa. Com ela é fabricado um dos produtos que por muitos anos foi a principal fonte de renda de pequenos, médios e grandes produtores agrícolas do Brasil, principalmente no sul da Bahia, o chocolate (QUEIROZ et al., 2003).
Diferentes áreas econômicas estão diretamente envolvidas na cadeia produtiva do cacau, desde o pequeno produtor agrícola, aos grandes compradores e exportadores de seus produtos, entre eles o mais comercialmente rentável, o chocolate. Todo este setor movimenta recursos financeiros de 2,3 bilhões de reais (ICCO, 2009). Hoje no Brasil, 60% da produção de amêndoas concentram-se no Sul de Bahia, enquanto que os outros 40% são produzidos principalmente nos estados do Pará, Espírito Santo e Rondônia. Além de representar uma importante fonte de renda para os produtores, a cultura do cacau no Brasil possui um caráter conservacionista, porque seu plantio é realizado junto a árvores nativas nas regiões da Mata Atlântica e da Amazônia (ANUÁRIO ESTATÍSTICO DO BRASIL, 2003).
Doenças como a vassoura-de-bruxa que atingem o cacaueiro, têm causado muitas perdas e dizimação de propriedades que acarretaram em falências e êxodo rural. Dentre os anos de 1990 e 2003, houve a redução de 356,2 mil toneladas para 170,0 mil toneladas na produção brasileira (TREVIZAN, 1996). A enfermidade vassoura-de-bruxa, causada pelo fungo Moniliophthora perniciosa (AIME e PHILLIPS-MORA, 2005), é a principal doença que afeta a cacauicultura no Brasil, encontrando-se espalhada por todos os estados produtores.
2.2 Theobroma grandiflorum (Willd. ex. Spreng.) Schum
O cupuaçuzeiro é uma planta perene, com altura de 6 a 10 metros, atingindo mais de 18 metros nos indivíduos silvestres na mata alta. Os frutos têm formatos variáveis, oblongos,
ovalados, elípticos, obovóides ou redondos, diâmetro transversal de 9 a 15 cm, diâmetro longitudinal de 10 a 40 cm, peso variando de 200 a 4000 g, com média de 1200 g, sendo 38%, em média de polpa, 17% de sementes frescas, e 43% de casca; a espessura da casca (epicarpo e mesocarpo) varia de 0,6 a 1 cm de espessura. As sementes, em número de 15 a 50, são ovóides ou ovóide-elipsóides, de 2,0 a 3,0 cm de comprimento; 2,0 a 2,5 cm de largura, 1,0 a
1,8 cm de espessura e peso de 4 a 7 gramas(CALZAVARA, 1987;VENTURIERI, 1993).
Theobroma grandiflorum é uma planta comum na região amazônica, encontrada em
estado silvestre na parte Sul e Sudeste da Amazônia Oriental (VENTURIERI et al., 1985). Pode ser encontrado por toda a bacia Amazônica, sendo uma das fruteiras mais atrativas da região, em decorrência de aroma e sabor específicos de sua polpa. Dentro do gênero Theobroma, o fruto do cupuaçu é o que apresenta maior tamanho. As análises de polpa revelam excelentes características e teores médios de fósforo e de vitamina C superiores a muitas outras polpas de frutas (CALZAVARA, 1987). Estas características somadas ao fácil manuseio, industrialização e abertura do mercado às frutas exóticas, vêm despertando acentuado interesse não só do mercado regional, bem como, abrindo caminhos para exportação nacional e internacional, com isso é notório o aumento do fluxo de capital na região e diminuição do êxodo rural. Destaca-se nesse mercado o estado do Pará, que é responsável pela maior produção do fruto no país (HOMMA et al., 2001). Com sua polpa são preparados sucos, sorvetes, licores, compotas, cremes e doces. Da semente, pode ser fabricado um produto similar ao chocolate, caseiro ou industrial, que recebe o nome de cupulate (CALZAVARA, 1987).
O cupuaçuzeiro foi introduzido na Bahia, por volta de 1930 por Gregório Bondar, no município de Uruçuca, e, posteriormente por imigrantes japoneses em outros municípios (LOPES, 1999). No final da década de 90, a área cultivada com cupuaçu era de aproximadamente 254 hectares, sendo 45 hectares em produção e 209 hectares em desenvolvimento, com produção em torno de 200 toneladas de polpa (LOPES, 1999). As condições climáticas favoráveis ao cultivo do cupuaçuzeiro são muito variáveis. Essa espécie tem seu desenvolvimento favorecido em regiões de clima sub-úmido ou com elevada umidade, com chuvas anuais bem distribuídas e superiores a 1.800 mm e temperatura média anual acima de 22ºC (DINIZ et al., 1984; ROCHA et al., 1999).
A descoberta pelo consumidor dos produtos obtidos a partir da polpa causou a ampliação do sistema de cultivo do cupuaçu, favorecendo o surgimento de pequenas e médias agroindústrias, com geração de empregos diretos e indiretos, tanto nos centros urbanos, quanto nas unidades produtivas, absorvendo a mão-de-obra familiar. Além disso, a motivação
para a implantação de sistemas agroflorestais na Amazônia tem encontrado no cupuaçuzeiro um importante componente (SOUZA et al., 1999; ALVES, 2002).
Visando identificar e selecionar frutos com melhores características qualitativas da polpa com fins industriais, o programa de melhoramento genético do cupuaçuzeiro do Centro de Pesquisa Agroflorestal da Amazônia Oriental (CPATU), da EMBRAPA, seleciona genótipos quanto à produção, resistência a doenças e pragas, menor tendência à alternância de produção, maior período de colheita (SOUZA e SOUZA, 2002).
2.3 MARCADORES MOLECULARES NA CONSTRUÇÃO DE MAPAS
GENÉTICOS
Os polimorfismos genéticos em nível de DNA são abundantes nos genomas vegetais e podem ser detectados por diferentes técnicas de biologia molecular, gerando marcadores moleculares informativos. Marcadores moleculares baseados na amplificação de fragmentos de DNA pela reação em cadeia da polimerase (PCR) têm sido largamente empregados nos programas de melhoramento de plantas, bem como na caracterização de populações, construções de mapas de ligação e detecção de Quantitative Trait Loci (QTL) entre outras aplicações (FERREIRA; GRATTAPAGLIA, 1998).
Diferentes tipos de marcadores moleculares (os quais podem ser loco-específicos dominantes) são utilizados para construir um mapa de ligação como: RAPD – DNA polimórfico amplificado ao acaso; AFLP – polimorfismo de comprimento de fragmentos amplificados ou loco codominante (como microssatélites); RFLP – polimorfismo de comprimento de fragmentos de restrição obtidos por cortes aleatórios da fita dupla de DNA.
Os marcadores moleculares microssatélites (Simple Sequence Repeats - SSR) são formados por sequências curtas de dois a cinco nucleotídeos repetidos em tandem, os quais são flanqueados por sequências únicas não repetidas. A variação alélica em locos de microssatélites pode ser facilmente detectada por PCR usando primers flanqueadores específicos. O polimorfismo baseado na variação do número de sequências repetidas dos microssatélites é provavelmente ocasionado pelo escorregamento da DNA polimerase na replicação do DNA ou pela troca de fragmentos desiguais entre os cromossomos (HANCOCK, 2000).
Em plantas, os microssatélites são muito frequentes e distribuídos ao acaso ao longo do genoma, também sendo utilizados em estudos sobre a diversidade genética, caracterização
de germoplasma, construção de mapas genéticos e localização de QTLs. Atualmente vários locos de microssatélites estão mapeados na espécie T. cacao distribuídos ao longo dos 10 cromossomos (LANAUD et al., 1995; PUGH et al., 2004; BROWN et al., 2005; SCHNELL et al., 2007.; FALEIRO et al., 2006; ALLÈGRE et al., 2011). A saturação de mapas genéticos é relevante para obtenção de informações importantes sobre estrutura genética da espécie, desde a associação com caracteres qualitativos, localização dos grupos de ligação e identificação de regiões genômicas associadas a caracteres quantitativos.
O mapeamento genético teve inicio após o reconhecimento do fenômeno da ligação genética (MORGAN, 1910). Ele toma como base a hipótese de que a co-segregação de dois marcadores indica a proximidade entre eles, e que a probabilidade de ocorrer permutas genéticas entre esses dois marcadores é menor, quanto menor for a distância entre eles. Dessa forma, é possível ordenar de forma linear a informação genética ao longo dos cromossomos. A disponibilidade e facilidade de confecção de marcadores moleculares e metodologias estatísticas eficientes fizeram com que, atualmente, estejam disponíveis mapas genéticos saturados para a maioria das espécies cultivadas, dentre elas a soja (CORREA, 1995), o café (PEARL et al., 2004), o milho (BRUNELLI et al., 2002), o eucalipto (GRATTAPAGLIA; SEDEROFF, 1994), o feijão (FALEIRO et al., 2003).
Para construção de um mapa genético é necessário obedecer alguns parâmetros como a seleção da população mais apropriada para mapear; o cálculo das frequências de recombinação em pares, usados nesta população; o estabelecimento de grupos de ligação; a estimativa das distâncias no mapa entre marcas e a determinação da ordem linear por marcadores, de forma a minimizar os eventos de recombinação. A escolha de genitores para desenvolvimento de mapas genômicos é crítica em plantas perenes arbóreas e o tipo de marcador a ser utilizado deve ser considerado. Os genitores devem ser importantes no programa de melhoramento, apresentando nível satisfatório de polimorfismo para o tipo de marcador a ser usado, além de segregar para várias características qualitativas e quantitativas de importância (componentes de produção, resistência a doenças, etc.) e de qualidade do produto, para maximizar a obtenção de informações (FIGUEIRA; CASCARDO, 2001).
Para a construção destes mapas utilizam-se marcadores moleculares, explorando a configuração de marcadores dominantes e codominantes (LANAUD et al., 1995; RISTERUCCI et al., 2000; CLEMENT et al., 2003; PUGH et al., 2004; BROWN et al., 2005). Quando construídos os primeiros mapas genéticos para cacau, os marcadores dominantes (RAPDs e AFLPs), mais abundantes, foram utilizados com efeito de saturação. Populações de tipos “F2” resultando da auto polinização do clone TSH516 (Scavina-6 x ICS1)
foram geradas na CEPLAC e usadas para a identificação de regiões do genoma (QTLs) associadas a resistência a M. perniciosa (QUEIROZ et al., 2003; BROWN et al., 2005; FALEIRO et al., 2006) e também com qualidade da semente (ARAÚJO, 2002). Além disso, Albuquerque (2006) detectou três QTLs associados à resistência a vassoura-de-bruxa, um no grupo de ligação 8 do cruzamento entre ICS 39 x CAB 208 e dois no mapa do cruzamento ICS 39 x CAB 0214, sendo um no grupo de ligação 4 e outro no grupo de ligação 9 .
2.4 TRANSFERABILIDADE DE MARCADORES E MAPEAMENTO
COMPARATIVO
O método de transferir marcadores SSR de uma espécie para outra, conhecido como transferabilidade de primers ou amplificação cruzada, tem revelado sucesso como no caso da transferência dentro de diferentes famílias de plantas, especialmente nas leguminosas (KULEUNG et al. 2003; PEAKALL et al. 1998). No entanto, as taxas de amplificação cruzada são maiores quando as espécies são de mesmo gênero, como observado no caso da soja, em que houve transferência para 65% para espécies de Glicine e apenas 13% para espécies dos outros gêneros. Esses trabalhos sugerem maior possibilidade de transferência entre espécies do mesmo gênero. Além disso, ressaltam a possibilidade de estudar espécies de menor interesse econômico, que por isso em muitos casos ainda não foram estudadas (KULEUNGet al. 2004; PEAKALL et al. 1998).
O uso de mapeamento para estudos comparativos ou de sintenia colabora com o entendimento sobre a evolução dos genomas, no qual se comparam as estruturas genômicas das diferentes espécies, observando a homologia dos genes, conservação da distância e a ordem de ligação nos cromossomos; é usado também como um meio de obtenção de mapa único de referência (CARNEIRO; VIEIRA, 2002). Uma revisão feita por Coelho e Silva (2005) revela uma alta taxa de homologia entre a estrutura genômica de diversas espécies, indicando que genes de interesse ou até mesmo QTLs são compartilhados por vários genomas diferentes. Marcadores microssatélites obtidos a partir de ESTs, também chamados de EST-SSR, por serem desenvolvidos a partir de regiões transcritas do genoma, podem aumentar a eficiência na seleção assistida por marcadores (SAM) (CAIXETA et al., 2006). Ao contrário de microssatélites gerados de sequências de DNA genômico, que tendem a se agrupar próximos ao centrômero, os EST-SSR concentram-se em regiões ricas em genes, e por serem baseados em regiões codificadoras do genoma, espera-se que sejam mais conservados em diferentes espécies, permitindo assim o estudo comparativo e estudos de evolução
(VARSHNEY et al., 2005). Apesar dessas vantagens, os EST-SSRs apresentam-se com menor polimorfismo em relação aos SSRs derivados de bibliotecas genômicas, devido ao alto grau de conservação existente nas sequências de DNA em regiões transcritas (MORETZSOHN et al., 2005).
As chances de sucesso no uso de transferência de marcadores são inversamente proporcionais à distância evolucionária entre as duas espécies. No caso do gênero Theobroma, já foram isolados, seqüenciados e avaliados uma grande quantidade de locos, pelo grupo do CIRAD, em Montpellier – França (ALLEGRE et al., 2011). Foi verificado que primers desenhados para T. cacao (cacaueiro) amplificavam microssatélites de outras espécies do gênero, inclusive o cupuaçuzeiro (ALVES et al., 2007).
3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1 MATERIAL BIOLÓGICO
Para realização do mapeamento genético e estudos de transferabilidade de marcadores entre espécies T. cacao x T. grandiflorum foi utilizada uma progênie composta por 142 indivíduos da espécie T. grandiflorum originada a partir do cruzamento entre os genótipos CP174 X CP1074, resistente e susceptível à vassoura-de-bruxa, respectivamente, e contrastantes para outras características como tamanho e formato dos frutos como exemplificado na Figura 1.
(a) (b)
Figura 1: Frutos de T. grandiflorum pertencentes ao cruzamento que deu origem a população (a) Genótipo CP174; (b) Genótipo CP1074.
A população está localizada na Estação de Recursos Genéticos José Haroldo – CEPLAC/ERJOH, no município de Benevides, estado do Pará (Figura 2). As plantas que compõem a população apresentam idades diferentes, pois alguns exemplares morreram e foram substituídos por outras mudas do mesmo genótipo (dado pessoal).
Figura 2: Estação CEPLAC/ERJOH, população de T. grandiflorum
Para os estudos de transferabilidade de marcadores entre as espécies T. grandiflorum x T. cacao, foi utilizada uma seleção de cinco genótipos de T. cacao (Criollo B97/61/B2, Scavina 6, ICS1, SIC864 e CCN51) contrastantes e representativos da diversidade do T.
cacao. Esses genótipos foram escolhidos em diferentes regiões geográficas conforme Tabela
1 e Figura 3, assim como são contrastantes para diferentes características por isso foram utilizados em cruzamentos para estudos de melhoramento do cacaueiro (ICS1 x Scavina6) e (SIC864 x CCN51), sendo desenvolvidos em centros de melhoramento vegetal, a exemplo, da CEPLAC de Ilhéus, Bahia. O genótipo Criollo B97/61/B2 foi escolhido por ser o exemplar utilizado nos estudos de sequenciamento do cacau (ALLEGRE et al., 2011 ).
Tabela 1. Origem dos cinco genótipos de Theobroma cacao Nome Grupo Região/País
B97/61/B2 Criollo Belize
Scavina-6 Forastero (Alto Amazonico) Peru
ICS1 Trinitário Trinidad
SIC864 Forastero (Baixo Amazonico) Brasil
Figura 3: Localização dos clones utilizados na figura que apresenta a diversidade de T. cacao obtida com marcadores SSRs entre Criollo (vermelho); Forestaro Baixo Amazônico (verde); Forastero Alto Amazônico (azul), Trinitário e Criollo já cruzados com outro material (cor de rosa e laranja) e cacaueiros da Guyana Francesa (verde) (Motamayor et al., 1997).
Foram coletadas amostras foliares de todos os indivíduos para posterior extração de DNA. Esse material foi cortado em discos foliares, acondicionados em tubos Eppendorf de 2 mL armazenados em freezer -80°C e liofilizados durante 24 horas antes da extração.
3.2 MARCADORES MOLECULARES
Foram utilizados 44 marcadores microssatélites específicos de T. grandiflorum determinados como polimórficos nos pais CP174 e CP1074 do cruzamento do cupuaçuzeiro dentre eles 14 SSR/EST cedidos pela EMBRAPA/CENARGEN e 30 oriundos da biblioteca SSR feita com DNA genômico cedidos pela EMBRAPA/CPATU (Tabela 2). Além desses, 181 marcadores específicos de T. cacao foram escolhidos em diferentes grupos de ligação do
cacaueiro e utilizados para realizar uma triagem dos SSRs polimórficos entre CP174 e CP1074. A lista dos SSRs utilizados é apresentada no anexo 1.
Tabela 2: Marcadores moleculares específicos de T. grandiflorum (EMBRAPA CENARGEN e CPATU) utilizados nos testes de transferabilidade com T. cacao
Nome Origem Instituição
cupuaçu_rep_c295 EST CENARGEN
cupuaçu_rep_c293_C EST CENARGEN
cupuaçu_rep_c180 EST CENARGEN
cupuaçu_rep_c432 EST CENARGEN
cupuaçu_c4949 EST CENARGEN
cupuaçu_rep_c2763 EST CENARGEN
cupuaçu_rep_c431C EST CENARGEN
cupuaçu_rep_c203_A EST CENARGEN
cupuaçu_rep_c203_B EST CENARGEN
cupuaçu_rep_c618 EST CENARGEN
cupuaçu_rep_c1251 EST CENARGEN
cupuaçu_rep_c339 EST CENARGEN
cupuaçu_rep_c1773 EST CENARGEN
cupuaçu_rep_c733 EST CENARGEN
Tg04 SSR CPATU Tg05 SSR CPATU Tg09 SSR CPATU Tg11 SSR CPATU Tg13 SSR CPATU Tg17 SSR CPATU Tg20 SSR CPATU Tg21 SSR CPATU Tg30 SSR CPATU Tg31 SSR CPATU Tg39 SSR CPATU Tg43 SSR CPATU Tg44 SSR CPATU Tg47 SSR CPATU Tg48 SSR CPATU Tg54 SSR CPATU Tg62 SSR CPATU Tg64 SSR CPATU Tg65 SSR CPATU Tg70 SSR CPATU Tg71 SSR CPATU Tg72 SSR CPATU Tg76 SSR CPATU Tg77 SSR CPATU Tg88 SSR CPATU Tg89 SSR CPATU Tg90 SSR CPATU Tg102 SSR CPATU Tg108 SSR CPATU Tg113 SSR CPATU
3.3 EXTRAÇÃO DE DNA
Foram extraídos DNA de amostras foliares de todos os genótipos seguindo o protocolo MATAB (Mixed AlkylTrimethylAmmonium Bromide) (RISTERUCCI, 2000), que consiste na maceração de uma porção do material vegetal liofilizado em presença de nitrogênio líquido. O volume final foi acondicionado em tubos Eppendorf de 2 mL e adicionados 850 µL de tampão de extração [Tris-HCl 100 mmol.L-1, pH 8,0; EDTA 20 mmol.L-1, pH 8,0; NaCl 1,4 mol.L-1; Na2SO3 10 mM; 1%PEG 6000; 2% MATAB] aquecido a 60oC em banho-maria.
Foi utilizado o MATAB por resultar num volume maior de material para extração, assim como se mostrou também, um detergente mais eficiente na dissociação das paredes celulares do material vegetal (Figura 4).
Figura 4: Maceração de tecido foliar. (SANTOS et al., 2014)
Após 60 min em banho-maria a 74 oC, foram adicionados a cada tubo 800 µL de clorofórmio: álcool isoamílico (24:1). As amostras foram submetidas à centrifugação a 13200 rpm, por 10 min. O sobrenadante resultante foi transferido para outros tubos e adicionou-se 700 µL de álcool isopropílico gelado em cada um, seguido de uma leve agitação. Os tubos foram colocados em freezer por pelo menos uma hora. Em T. cacao é possível fazer a coleta dos
pellets, devido ao alto teor de polissacarídeos de seu precipitado, porém em T. grandiflorum
foi necessária uma nova centrifugação por 5 min para concentrar o DNA no fundo do tubo, de onde então foi realizado o descarte do sobrenadante e em seguida a lavagem do precipitado com etanol 70%. Em seguida os tubos foram secos a temperatura ambiente e o precipitado foi ressuspenso em solução de TE (10 mmol.L-1 Tris-HCl, EDTA 1 mmol.L-1, pH 8,0) contendo RNAse na concentração final de 40 µg e incubados em estufa a 37°C por 60 min.
Para verificar a integridade do DNA extraído, uma alíquota de 5 µL de cada amostra, adicionada de 3 µL do corante tipo IV (Bromofenol Blue a 0,25 %, sacarose 40 %) e 2 µL de gel-red [1 ng/µL], foi aplicada em gel de agarose a 2 %, utilizando como tampão de corrida o TAE 1X (EDTA 2 mol.L-1; Tris-acetato 9 mol.L-1) para realização de corrida eletroforética em cuba horizontal a 80 volts por 30 min.
3.4 AMPLIFICAÇÃO
Para os primers de cacau foram utilizados os seguintes volumes para reação de PCR com volume final de 20 µL, contendo entre 5 e 10 ng de DNA, 0,2 µM de cada primer, 2,0 mM deMgCl2 (Fermentas), 0,2 mM de dNTP, 1X de tampão (10X) e 0,5 a 1U de Taq DNA
polimerase (Fermentas). A temperatura de anelamento dos primers foi testada com a utilização de dois protocolos touchdown (TD), como segue: o primeiro é composto por 10 ciclos para desnaturação a 94°C por 4 minutos, anelamento do primer geralmente entre 60 - 48°C usando 1ºC de decréscimo, e extensão a 72°C por 1 min e 30 s, e uma extensão final de 4 min a 72ºC. O segundo touchdown segue as mesmas especificações do primeiro com a ressalva de que sua variação de temperatura de anelamento variou entre 55 e 46°C.
Para os marcadores de cupuaçu desenvolvidos pela EMBRAPA/CENARGEN, foi utilizado um programa de PCR disponibilizado pela equipe, seguindo as conformações a seguir: 96ºC por 2 min, 9 ciclos para desnaturação a 94ºC por 45 s, anelamento do primer entre 62 – 48ºC usando 0.5ºC de decréscimo, extensão a 72ºC por 45 s, seguidos por 30 ciclos a 94ºC por 45 s, 58ºC por 1 min e 72ºC por 45 s, finalizando em 72ºC por 5 min.
Para os marcadores desenvolvidos pela EMBRAPA/CPATU foi utilizado o mesmo protocolo que aquele descrito acima para cacaueiro.
3.5 GENOTIPAGEM
Os fragmentos obtidos após amplificação foram revelados por eletroforese em gel de poliacrilamida denaturante a 6% corado com nitrato de prata de acordo com Creste et al.
(2001) e Gramacho et al. (2003) e em agarose Metaphor 4% corado em Gel Red. Ambos apresentaram resultados satisfatórios.
3.6 MAPEAMENTO GENÉTICO PARCIAL DE Theobroma grandiflorum
O mapa genético parcial da espécie Theobroma grandiflorum foi construído utilizando os resultados de genotipagem cedidos pela equipe da EMBRAPA/CEPLAC-CPATU. Uma matriz de genotipagem de 142 indivíduos e 36 SSRs foi utilizada correspondendo respectivamente ao número de plantas vivas quando foi feito o levantamento em agosto de 2013 e o número de SSRs efetivamente polimórficos entre os pais da população (CP174 e CP1074). Para construção do mapa foi utilizado o software JoinMap 4.1 (VAN OOIJEN et al., 2006) utilizando-se LOD 3,0 e 4,0 e máximo de 45% de frequências de recombinação. Foram testadas duas funções de mapeamento, Haldane e Kosambi, sendo que não houve diferença significativa entre as duas no resultado final, assumindo-se o resultado proposto pela função Kosambi. O mapeamento foi realizado considerando a população de tipo CP do JoinMap que significa que a progênie é o resultado do cruzamento entre dois pais que podem ser heterozigotos e/ou homozigotos, com possíveis genótipos apresentados na tabela 3.
Tabela 3: Descrição da segregação de alelos e possíveis genótipos numa população de tipo CP (Cross Pollinators*).
Código Descrição da segregação Genótipos possiveis
[ab x bc] Loco heterozigoto para ambos os pais (4 alelos) ac ad bc bd
[ef x eg] Loco heterozigoto para ambos os pais (3 alelos) ee ef eg fg
[hk x hk] Loco heterozigoto para ambos os pais (2 alelos) hh hk kk
[lm x ll] Loco heterozigoto para o primeiro pai lm ll
[nn x np] Loco heterozigoto para o primeiro pai nn np
*códigos do programa JoinMap v4.1 (VAN OOIJEN et al., 2006), de uma população caracterizada como “cross pollinators”. Que são aquelas provenientes de genitores heterozigotos com fase de ligação dos locos originalmente desconhecida.
3.7 BLAST DAS SEQUÊNCIAS DOS SSR Theobroma grandiflorum NO GENOMA
Foram utilizados nessa etapa 149 marcadores, onde 135 foram cedidos pelo CPATU, desses 105 foram considerados monomórficos e 30 polimórficos, mais 14 marcadores oriundos do CENARGEN. Estes SSRs foram submetidos à comparação com sequências do genoma do cacau disponíveis na Database CocoaDB (http://cocoagendb.cirad.fr/gbrowse/cgi-bin/gbrowse/theobroma/) para o posicionamento físico, também conhecido por BLAST nos cromossomos e no mapa genético de referência do cacau.
4. RESULTADOS
4.1 EXTRAÇÃO DE DNA
O DNA das amostras vegetais de T. grandiflorum foi obtido através de um protocolo utilizado para extração de DNA de folhas de cacau (MATAB). Foram extraídos 142 amostras de DNA a partir de aproximadamente 300 mg de tecido vegetal que apresentaram qualidade e integridade satisfatórias para a execução das análises moleculares (Figura 5).
A eletroforese ocorreu com a ausência de marcador de peso molecular, pois as amostras foram submetidas à análise pelo picodrop para quantificação de DNA, que em T.
grandiflorum variou de 200 a 1000 ng/ul de DNA.
A diluição de DNA para execução da etapa molecular obedeceu à proporção de 1: 100, onde 1 ul de DNA concentrado era diluído em 99 ul de água ultrapura. Foram realizados testes com outras concentrações, porém o que apresentou resultado mais satisfatório foi utilizado como padrão de diluição.
Figura 5: Verificação da integridade de algumas amostras de DNA extraídas de T.
grandiflorum. Gel de agarose a 1% corado com Gel Red, após eletroforese em cuba horizontal
a 80 volts por 30 minutos.
4.2 AMPLIFICAÇÃO E GENOTIPAGEM
Os padrões de bandas obtidos foram avaliados quanto à ocorrência de amplificação e quanto à presença de polimorfismos de DNA.
Os pais da população de T. grandiflorum foram submetidos a um screnning em conjunto com uma uma amostra de seis indivíduos da população para encontrar primers que apresentassem: i) transferabilidade entre as espécies, ii) e/ou marcadores polimórficos para construção do futuro mapa genético da espécie utilizando o cruzamento CP174 x CP1074. Nessa etapa foram utilizados 181 marcadores específicos de T. cacao (Anexo 1). No total, 78
marcadores amplificaram (43,09%). Das amplificações, 42 apresentaram polimorfismo (56,41%). Os marcadores polimórficos (Tabela 4) foram selecionados para serem genotipados em toda população para serem mapeados no cruzamento de T. grandiflorum.
Foi realizado um segundo screening com os 30 marcadores específicos de cupuaçu em uma seleção de cinco diferentes genótipos de cacau (Criollo, Scavina 6, ICS1, SIC864 e CCN51) (Figura 6) para testar a transferabilidade entre espécies. Dos 30 microssatélites genômicos, 28 (93,3%) foram transferíveis para cacau, dois não amplificaram. Dos marcadores que apresentaram transferabilidade, 10 apresentaram um padrão de alelos homozigotos, Tg05, Tg09, Tg11, Tg20, Tg30, Tg48, Tg76, Tg88, Tg108 e Tg113 o que corresponde a 35,71%.
Tabela 4: Relação dos marcadores específicos do cacaueiro polimórficos em T. grandiflorum com as sequências (forward e reverse), tamanho esperado em pares de bases (pb), motifs de repetição, temperatura de Melting (ºC) e grupo de ligação (LG) em que está localizado no mapa genético de T. cacao.
De acordo com a Tabela 5 os genótipos que apresentaram maior taxa de transferabilidade foram o Criollo e o Scavina6, e o genótipo que apresentou menor taxa de transferabilidade foi o CCN51.
Figura 6: Padrões de amplificação em agarose Metaphor 3% dos 30 marcadores genômicos específicos de T. grandiflorum nos cinco diferentes genótipos de T. cacao (Criollo, Sca6, ICS1, SIC864, CCN51).
Tabela 5: Transferabilidade dos 30 marcadores específicos de cupuaçu cedidos pela EMBRAPA/CPATU nos diferentes genótipos de cacau.
Marcador/Genótipo Criollo Sca6 ICS1 SIC864 CCN51
Tg04 + - + + + Tg05 + + + + + Tg09 + + + + - Tg11 + + + + - Tg13 + + + + + Tg17 + + + + + Tg20 + + - + - Tg21 + + + - + Tg30 + + + - + Tg31 + + + + + Tg39 - - - - - Tg43 - - - - - Tg44 + + + + - Tg47 + + + + + Tg48 + + + - +
Tg54 + + + + - Tg62 + + + + + Tg64 + + + + + Tg65 + + + + + Tg70 + + + + + Tg71 + + + + + Tg72 + + + + + Tg76 - + + + + Tg77 + + + + + Tg88 + + + + + Tg89 + + + + + Tg90 - - - - - Tg102 + + + + + Tg108 + + + + + Tg113 + + + + -
(+) Apresentaram transferabilidade; (-) Não apresentaram transferabilidade.
O mesmo teste foi realizado com os 14 marcadores cedidos pelo CENARGEN e o resultado mostra que nove SSRs amplificaram em cacau mostrando diferentes alelos (Tabela 6, Figura 7). Dos nove SSRs que amplificaram com os pais CP174 e CP1074 do cruzamento do cupuaçuzeiro foram encontrados dois polimórficos: o c_180 e o c_1251 (Tabela 6).
Tabela 6: Marcadores SSR-EST específicos de cupuaçu cedidos pelo CENARGEN, com amplificação em cacau e nos genótipos de cupuaçu CP174 e CP1074.
Nome num alellos alelos 174 1074 Criollo (B97/61/B2) Scavina-6 ICS1 SIC864 CCN51
C_432 2 (A B) (A B) AB AB AB AB AB AB AB C_168 3 (A-B-C) (A-B-C) BC BC AC AC AC AC AC C_4949 2 (A-B) (A-B) AB AB AB AA AA AA AA C_295 4 (A-B-C-D) (A-B-C-D) BD BD AC AC AC AA AC C_432 3 (A-B-C) (A-B-C) AB AB BC AB n AB BC C_180 2(A-B) (A-B) AB AA
C_203A 2(A-B) (A-B) AB AB AA AA AA AA AB
C_203B 2(A-B) (A-B) AB AB AA AA AB
C_1251 2(A-B) (A-B) AB BB
(a) (b)
Figura 7: (a) Amplificação em gel de poliacrilamida 6% de alguns marcadores específicos de
T. grandiflorum em genótipos de cacau e nos genitores da população. 1: CP174; 2: CP1074;
3: Criollo; 4: Scavina6; 5: ICS1; 6: SIC864; 7: CCN51. (b) Marcador polimórfico c_180 nos pais e numa amostra da população.
4.3 MAPEAMENTO GENÉTICO PARCIAL DA ESPÉCIE Theobroma
grandiflorum.
O mapeamento parcial foi realizado a partir de 36 marcadores incluindo 13 SSRs do cacaueiro e 23 SSRs do cupuaçuzeiro todos genotipados pela EMBRAPA/CPATU-PA. A matriz de genotipagem foi transformada para ser utilizada de acordo com a segregação dos alelos para uma população CP (Tabela 3). A análise de segregação dos 36 locos está representada na Tabela 7, que identifica em números como foi realizada a distribuição dos alelos na população para cada marcador. Alguns marcadores como mTgM11, mTgM48 e mTcCIR182 apresentaram distorção de segregação. Um total de 11 marcadores não se uniram aos grupos de ligação. O mapa genético de T. grandiflorum foi construído com base em 25 marcadores, onde, 9 eram do cacaueiro e 16 marcadores do cupuaçuzeiro, e foram formados sete grupos de ligação, com cobertura total de 644,5 cM, cinco dos grupos são similares aos grupos de ligação do cacaueiro (GL2, GL3, GL4, GL6, GL8). Os grupos de ligação apresentaram grande diferença em relação aos seus comprimentos variando do menor grupo (GL7) que apresentou apenas dois marcadores com distância de 27.1 cM ao maior grupo (GL3) que apresentou seis marcadores abrangendo uma distância de 151.4 cM.
Tabela 7: Frequência e segregação dos locos nas plantas da populaçao de T. grandiflorum. (Tabela gerada pelo programa JoinMap).
Locus: Nome do marcador; Segregation: Tipo de segregação; (-) Indivíduos que não apresentaram segregação para o marcador; X2: Valor de qui-quadrado; Df: Graus de liberdade; Signif.: Indicativo proporcional de diferença entre a frequência dos genótipos esperada e a frequência observada, traduzindo a importância da distorção na segregação; Classification: Genótipos possíveis por segregação.
Os marcadores propostos para o mapeamento foram expostos ao programa JoinMap para análise de segregação. Tal análise resultou na distribuição disposta na Tabela 7, onde é apresentada a segregação de cada marcador e a quantidade de indivíduos por segregação.
Nenhum marcador apresentou segregação do tipo <abxbc>, 14 marcadores apresentaram segregação do tipo <nnxnp>, sete apresentaram padrão de segregação <efxeg>, sete apresentaram padrão <lmxll> e oito marcadores apresentaram padrão <hkxhk>.
Como pode ser visto na tabela acima alguns marcadores apresentaram distorção de segregação mendeliana, isso foi levado em consideração para a construção do mapa genético,
Nº Loco Segregaçao ee ef eg fg hh hk kk ll lm nn np -- X2 Df Signif. Classificaçao
1 mTgM9 <nnxnp> 0 0 0 0 0 0 0 0 0 63 77 2 1,4 1 - [nn:np] 2 mTgM11 <efxeg> 50 17 24 26 0 0 0 0 0 0 0 25 21,15 3 ******* [ee:ef:eg:fg] 3 mTgM13 <nnxnp> 0 0 0 0 0 0 0 0 0 65 76 1 0,86 1 - [nn:np] 4 mTgM17 <nnxnp> 0 0 0 0 0 0 0 0 0 76 66 0 0,7 1 - [nn:np] 5 mTgM20 <lmxll> 0 0 0 0 0 0 0 68 72 0 0 2 0,11 1 - [ll:lm] 6 mTgM30 <efxeg> 41 38 32 29 0 0 0 0 0 0 0 2 2,57 3 - [ee:ef:eg:fg] 7 mTgM31 <nnxnp> 0 0 0 0 0 0 0 0 0 70 72 0 0,03 1 - [nn:np] 8 mTgM39 <nnxnp> 0 0 0 0 0 0 0 0 0 64 69 9 0,19 1 - [nn:np] 9 mTgM43 <efxeg> 29 43 37 32 0 0 0 0 0 0 0 1 3,2 3 - [ee:ef:eg:fg] 10 mTgM47 <efxeg> 32 34 37 39 0 0 0 0 0 0 0 0 0,82 3 - [ee:ef:eg:fg] 11 mTgM48 <hkxhk> 0 0 0 0 0 60 82 0 0 0 0 0 98,11 2 ******* [hh:hk:kk] 12 mTgM54 <lmxll> 0 0 0 0 0 0 0 62 80 0 0 0 2,28 1 - [ll:lm] 13 mTgM62 <nnxnp> 0 0 0 0 0 0 0 0 0 86 56 0 6,34 1 ** [nn:np] 14 mTgM65 <nnxnp> 0 0 0 0 0 0 0 0 0 60 80 2 2,86 1 * [nn:np] 15 mTgM72 <nnxnp> 0 0 0 0 0 0 0 0 0 67 43 32 5,24 1 ** [nn:np] 16 mTgM76 <nnxnp> 0 0 0 0 0 0 0 0 0 78 64 0 1,38 1 - [nn:np] 17 mTgM77 <hkxhk> 0 0 0 0 35 60 45 0 0 0 0 2 4,29 2 - [hh:hk:kk] 18 mTcCIR17 <nnxnp> 0 0 0 0 0 0 0 0 0 70 55 17 1,8 1 - [nn:np] 19 mTcCIR25 <hkxhk> 0 0 0 0 29 65 36 0 0 0 0 12 0,75 2 - [hh:hk:kk] 20 mTcCIR26 <efxeg> 29 48 34 31 0 0 0 0 0 0 0 0 6,23 3 - [ee:ef:eg:fg] 21 mTcCIR57 <nnxnp> 0 0 0 0 0 0 0 0 0 70 71 1 0,01 1 - [nn:np] 22 mTcCIR134 <lmxll> 0 0 0 0 0 0 0 70 63 0 0 9 0,37 1 - [ll:lm] 23 mTcCIR135 <nnxnp> 0 0 0 0 0 0 0 0 0 56 83 3 5,24 1 ** [nn:np] 24 mTcCIR162 <efxeg> 35 32 40 29 0 0 0 0 0 0 0 6 1,94 3 - [ee:ef:eg:fg] 25 mTcCIR276 <lmxll> 0 0 0 0 0 0 0 64 68 0 0 10 0,12 1 - [ll:lm] 26 mTcCIR75 <efxeg> 29 41 34 29 0 0 0 0 0 0 0 9 2,91 3 - [ee:ef:eg:fg] 27 mTcCIR12 <lmxll> 0 0 0 0 0 0 0 59 76 0 0 7 2,14 1 - [ll:lm] 28 mTcCIR124 <lmxll> 0 0 0 0 0 0 0 58 57 0 0 27 0,01 1 - [ll:lm] 29 mTcCIR148 <nnxnp> 0 0 0 0 0 0 0 0 0 72 58 12 1,51 1 - [nn:np] 30 mTcCIR182 <hkxhk> 0 0 0 0 30 93 2 0 0 0 0 17 42,31 2 ******* [hh:hk:kk] 31 mTgM88 <hkxhk> 0 0 0 0 31 73 33 0 0 0 0 5 0,65 2 - [hh:hk:kk] 32 mTgM89 <lmxll> 0 0 0 0 0 0 0 64 63 0 0 15 0,01 1 - [ll:lm] 33 mTgM102 <hkxhk> 0 0 0 0 37 74 30 0 0 0 0 1 1,04 2 - [hh:hk:kk] 34 mTgM108 <hkxhk> 0 0 0 0 25 68 48 0 0 0 0 1 7,68 2 ** [hh:hk:kk] 35 mTgM113 <hkxhk> 0 0 0 0 35 68 39 0 0 0 0 0 0,48 2 - [hh:hk:kk] 36 mTgM114 <nnxnp> 0 0 0 0 0 0 0 0 0 80 60 2 2,86 1 * [nn:np]
sendo realizado um teste com esses marcadores e sem os mesmos. Os resultados obtidos foram similares, admitimos o mapa que continham os marcadores com tal distorção, já que tinhamos um número relativamente pequeno de marcadores.
Foram formados sete grupos de ligação com 25 marcadores ordenados. Dos sete grupos de ligação cinco correspondem aos grupos de ligação do cacaueiro, os grupos GL4 e GL5 no mapa proposto correspondem ao GL4 do mapa genético do cacaueiro (Figura 8).
Figura 8: Mapa genético do cruzamento CP174 x CP1074 com 9 SSRs de cacau e 16 SSRs de cupuaçu. A linha acima representa a correspondência com os grupos de ligação do cacaueiro.
4.4 POSICIONAMENTO FÍSICO DOS MARCADORES DE CUPUAÇU NO GENOMA DO CACAU
Nesse trabalho foram analisados 149 pares de sequências dos microssatélites específicos de T. grandiflorum, com o objetivo de encontrar regiões similares conservadas entre essa espécie e T. cacao e construir um mapa físico posicionando os marcadores SSRs do cupuaçuzeiro nos grupos de ligação do cacaueiro (ALLEGRE et al., 2011) cujas sequências
estão disponíveis no banco de dados do genoma do cacau em:
http://cocoagendb.cirad.fr/gbrowse/cgi-bin/gbrowse/theobroma/. A tabela geral do resultado dos
blast no genoma do cacau (positivos com dois primers, positivo com apenas um primer e
negativo sem alinhamento) estão apresentados no Anexo 2. Das 149 sequências analisadas, 20 apresentaram alinhamento completo com sequências (forward e reverse), assim, dos 14 marcadores de origem EST do grupo CENARGEN apenas oito pares apresentaram similaridade nas duas sequências de primers (57,14%). Em contrapartida dos 135 marcadores originados a partir de DNA genômico do grupo CPATU apenas 12 marcadores apresentaram similaridade completa com o genoma do cacau (8,8%). Os marcadores utilizados nessa análise foram também identificados no genoma do cacaueiro para localizar os genes que ficaram na mesma sequência ou próximas delas, conforme Tabela 8. Além disso, foi realizado o posicionamento de alguns marcadores com só uma sequência do primer encontrada no resultado do blast para ter no final 31 marcadores SSRs do cupuaçuzeiro localizados no mapeamento genético de referência do cacau (ALLÈGRE et al., 2011). A tabela 8 mostra o alinhamento das posições dos marcadores SSRs de T. grandiflorum no mapa genético de T.
Cromossomo Scafold mapa genético cM Começo Fim St SSR Seq. Instituiçao Começo Fim Amplicon pb
Tc01 TcSNP1475 2,9 832179 833143
Tc01 3784 868433 871006 1 Putative WD repeat-containing protein 82-B Tg 24 Seq genoma CPATU 877045 877162 118
Tc01 3784 872939 874740 -1 Protein WUSCHEL Tg 25 Seq genoma CPATU 877140 877243 104
Tc01 mTcCIR184 2,0 876927 877408
Tc01 TcSNP1432 12,2 2789714 2790453
Tc01 3968 2952051 2952323 -1 Hypothetical protein
Tc01 3968 2954706 2959183 -1 Polyadenylate-binding protein 2 c692_C EST CENARGEN 2959034 2959692 659
Tc01 TcSNP479 12,6 2978357 2979363
Tc01 TcSNP1031 20,2 4243476 4244907
Tc01 4398 4506224 4506874 1 Putative uncharacterized protein
Tc01 4398 4507779 4511716 -1 AP2-like ethylene-responsive transcription factor AIL6 Tg 102 Seq genoma CPATU 4509926 4510029 104
Tc01 TcSNP962 21,2 4693788 4697228
Tc01 C66 25,2 5132737 5132867
Tc01 4398 5306299 5312566 1 Asparagine synthetase [glutamine-hydrolyzing]
Tc01 4398 5314437 5317870 -1 Putative uncharacterized protein Tg 96 Seq genoma CPATU 5314708 N/A
Tc01 TcSNP82 24,0 5323430 5326584
Tc01 mTcCIR604 49,8 17961405 17963422
Tc01 123 17962519 17968369 1 Putative uncharacterized protein Tg 122 Seq genoma CPATU 17971070 N/A
Tc01 123 17972297 17980209 -1 Predicted protein
Tc01 mTcCIR541 49,8 18463402 18465416
Tc02 TcSNP122 37,3 6304544 6306436
Tc02 2364 6552306 6553832 -1 Putative copper-transporting ATPase PAA1 Tg 32 Seq genoma CPATU 6554703 N/A
Tc02 2364 6555106 6561007 -1 Potassium transporter 7
Tc02 TcSNP214 37,0 6566850 6569757
Tc02 2364 6637732 6644631 1 Putative Endoplasmic reticulum-Golgi intermediate compartment protein 3 Tg 22 Seq genoma CPATU 6642488 N/A
Tc02 2364 6645757 6649133 -1 Putative Protein trpH
Tc02 TcSNP1195 40,4 6725576 6725926
Tc02 mTcCIR482 60,3 17270150 17272240
Tc02 4658 17832603 17832929 1 Putative Spermidine synthase
Tc02 2068 17864074 17868047 1 Spermidine synthase Tg 127 seq genoma CPATU 17861027 N/A
Tc02 2068 17868762 17869694 -1 Putative uncharacterized protein
Tc02 TcSNP798 60,8 17905579 17906358
Tc02 mTcCIR606 73,3 23577185 23579201
Tc02 1776 23895631 23896091 1 Hypothetical protein Tg 49 Seq genoma CPATU 23881231 23881364 134
Tc02 TcSNP324 80,9 24856959 24859850
Tc02 mTcCIR228 90,9 26252963 26253241
Tc02 3367 26326912 26332785 1 Putative Mitotic checkpoint protein bub3
Tc02 3367 26334407 26335584 1 Eukaryotic translation initiation factor 5A-2 c180 EST CENARGEN 26334484 N/A
Tc02 mTcCIR361 88,7 26585289 26586606
Tc03 TcSNP1062 18,1 11313395 11314233
Tc03 2161 11483274 11484587 -1 Eukaryotic peptide chain release factor subunit 1-3 Tg 103 Seq genoma CPATU 11485748 11486063 316
Tc03 mTcCIR133 18,6 11777597 11778122
Tc03 mTcCIR78 43,6 19330503 19331047
Tc03 1205 19444553 19447607 1 Protein phosphatase 2C 57 c432 EST CENARGEN 19453902 19460025 6124 ??
Tc03 1205 19454165 19457109 -1 Putative Importin subunit beta-1
Tc03 TcSNP633 49,5 19621201 19624109
Tc03 TcSNP928 59,9 21919426 21919735
Tc03 1431 21982120 21986865 -1 Adenine phosphoribosyltransferase 1 Tg 91 Seq genoma CPATU 21985815 21985990 176
Tc03 1431 21997541 21999162 -1 WRKY transcription factor 22
Tc03 TcSNP1183 61,5 22063277 22064213
Funçao
T. cacao - Genoma e mapa genético T. Grandiflorum SSR marcadores blastados no genoma do cacau
Locos 5` 3 Forward primer 5 – 3 Reverse primer Tam. Esperado(pb) Motifs Tm
Tabela 8: Resultado do blastblast no genoma do cacau, dois primers (2 ou 1) dos SSRs de cupuaçu obtidos pelo CENARGEN e CPATU, com identificação
Cromossomo Scafold mapa genético cM Começo Fim St SSR Seq. Instituiçao Começo Fim Amplicon pb
Tc04 TcSNP948 48,5 20224185 20225728
Tc04 2637 20432527 20433593 -1 DNA binding protein, putative
Tc04 2637 20438087 20442185 -1 Bet1-like SNARE 1-2 Tg 45 Seq genoma CPATU 20433737 N/A
Tc04 TcSNP530 48,9 20655766 20656471
Tc05 TcSNP871 1,2 389594 390264
Tc05 2322 669089 670267 -1 Cytochrome b c431C EST CENARGEN 670239 670510 272
Tc05 2322 670393 670685 1 Hypothetical protein
Tc05 TcSNP949 1,2 981509 983488
Tc05 mTcCIR156 7,2 1912249 1912605
Tc05 2507 1912294 1912800 -1 Probable proteasome inhibitor Tg 62 Seq genoma CPATU 1912377 N/A
Tc05 TcSNP160 8,5 2064274 2066424
Tc05 TcSNP1360 22,1 4824890 4827171
Tc05 3000 4862509 4862869 1 Hypothetical protein
Tc05 3000 4873932 4884240 1 Putative Transcriptional activator DEMETER c4949 EST CENARGEN 4877515 N/A
Tc05 _gTcCIR101 23,5 4876241 4876536
Tc05 TcSNP1111 28,3 12004359 12005290
Tc05 387 12106499 12109409 -1 Putative TGACG-sequence-specific DNA-binding protein TGA-1B (Fragment) c2763 EST CENARGEN 12108098 N/A
Tc05 mTcCIR420 28,3 12117268 12119644
Tc06 TcSNP1156 21,9 6986051 6987013
Tc06 1169 6986244 6992002 -1 NADP-dependent malic enzyme c618 EST CENARGEN 6992017 6992199 183
Tc06 TcSNP305 19,3 7238965 7239801
Tc06 TcSNP495 51,2 14255734 14257216
Tc06 1107 14402858 14406370 1 Hypothetical protein c203_A ou B EST CENARGEN 14402937 14403153 217
Tc06 TcSNP1144 52,9 14402944 14404024
Tc06 mTcCIR337 57,4 14859824 14860557
Tc06 1107 15002060 15003159 -1 Predicted protein Tg 48 Seq genoma CPATU 15005803 15005967 165
Tc06 mTcCIR9 60,2 15005639 15005955
Tc07 mTcCIR113 8,9 677729 678000
Tc07 18 1161273 1166902 1 DNA topoisomerase 1 c1251 EST CENARGEN 1161691 N/A
Tc07 18 1167792 1169075 1 Putative F-box protein At5g07610
Tc07 _gTcCIR155 14,7 1413429 1413562
Tc07 TcSNP1335 41,7 7758342 7762053
Tc07 2778 7769253 7771846 -1 Putative uncharacterized protein Tg 107 Seq genoma CPATU 7770762 N/A
Tc07 2778 Tc07_g012040 7777134 7780073 -1 C2 domain-containing protein At1g53590
Tc07 mTcCIR147 41,3 7860575 7860984
