Resistência ao metotrexato está diretamente associada à concentração de glutationa em linhagens de leucemia linfoide aguda

UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS FACULDADE DE CIÊNCIAS MÉDICAS

RAFAEL RENATINO CANEVAROLO

RESISTÊNCIA AO METOTREXATO ESTÁ DIRETAMENTE ASSOCIADA À CONCENTRAÇÃO DE GLUTATIONA EM LINHAGENS DE LEUCEMIA LINFOIDE

AGUDA

CAMPINAS 2017

RAFAEL RENATINO CANEVAROLO

RESISTÊNCIA AO METOTREXATO ESTÁ DIRETAMENTE ASSOCIADA À CONCENTRAÇÃO DE GLUTATIONA EM LINHAGENS DE LEUCEMIA LINFOIDE

AGUDA

Tese apresentada à Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Doutor em Ciências, Área de Concentração Genética Médica.

ORIENTADOR: JOSÉ ANDRÉS YUNES

ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA TESE DEFENDIDA PELO

ALUNO RAFAEL RENATINO CANEVAROLO

E ORIENTADO PELO PROF. DR. JOSÉ ANDRÉS YUNES.

CAMPINAS 2017

BANCA EXAMINADORA DA DEFESA DE DOUTORADO

ORIENTADOR: PROF. DR. JOSÉ ANDRÉS YUNES

MEMBROS:

1. PROF. DR. JOSÉ ANDRÉS YUNES

2. PROF. DR. CARLOS ALBERTO SCRIDELI

3. PROF. DR. RUI MANUEL VIEIRA REIS

4. PROFA. DRA. SARA TERESINHA OLLALA SAAD

5. PROF. DR. JÖRG KOBARG

Programa de Pós-Graduação em Ciências Médicas da Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas.

A ata de defesa com as respectivas assinaturas dos membros da banca examinadora encontra-se no processo de vida acadêmica do aluno.

A Deus, aos mencionados nos Agradecimentos, aos pacientes do Centro Infantil Boldrini e de todos os centros oncológicos, dedico este trabalho.

AGRADECIMENTOS

Aos meus pais, Daniel e Marta, que sempre estiveram comigo em minha caminhada pessoal e profissional, o meu amor incondicional.

Aos meus familiares, em especial meus avós, por toda a ternura e amor.

Aos meus amigos de dentro e fora do laboratório, por todo o companheirismo e cumplicidade.

À minha namorada Natália, pelo incentivo e compreensão das minhas muitas ausências por motivos acadêmicos.

Ao meu orientador Andrés e à minha coorientadora Ana, pelos valiosos ensinamentos e pela paciência para com minhas limitações.

Aos meus professores e aos membros da banca examinadora desta tese, pela disponibilidade e compartilhamento de todo o conhecimento.

Ao Centro Infantil Boldrini, ao Laboratório Nacional de Biociências (LNBio/CNPEM) e ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Médicas da Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas pela infraestrutura operacional e administrativa para a execução deste trabalho, bem como aos seus diretores, técnicos e funcionários por todo auxílio e amizade.

Ao apoio financeiro da Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) – processo nº 2012/11952-0.

“Nós sentimos que o que estamos fazendo é apenas uma gota no oceano. Mas o oceano seria menor se essa gota viesse a faltar”

(Santa Madre Teresa de Calcutá)

“Onde estiver o teu tesouro, aí estará teu coração”

RESUMO

A leucemia linfoide aguda (LLA) é o tipo de câncer mais comum da infância, correspondendo a 25% de todos os casos de câncer nesta faixa etária. Um dos quimioterápicos utilizados na terapia da LLA (e de doenças autoimunes como a artrite reumatoide) é o metotrexato (MTX), um antagonista do ácido fólico (antifolato). O mecanismo de ação do MTX enquanto quimioterápico é primariamente atribuído à inibição da enzima dihidrofato redutase, que sintetiza tetrahidrofolato a partir de dihidrofolato – etapa fundamental na síntese de novo de nucleotídeos purínicos utilizados na divisão celular. Em artrite reumatoide, doses menores de MTX inibem a enzima 5-aminoimidazole-4-ribonucleotídeo-carboxamida formiltransferase (ATIC), o que culmina com a produção de altos níveis de adenosina, um potente anti-inflamatório. No entanto, diversos trabalhos recentes continuam a apresentar mecanismos e efeitos até então desconhecidos por meio dos quais o MTX atua no ambiente celular, atestando que os mecanismos de ação do MTX parecem ser tão múltiplos quanto complexos. Utilizando diversas técnicas de biologia molecular, este trabalho procurou expandir o conhecimento existente da ação do MTX em LLA. Para isso, diversos parâmetros biológicos foram mensurados sob efeito ou não do MTX em um painel de 13 linhagens celulares de LLA. Foram realizados ensaios de proliferação, estudos metabolômicos, de sinergismo com drogas, quantificação da respiração celular e da produção de espécies reativas de oxigênio (ROS), além da medição da ativação da via de sinalização do NF-κB. A resistência das linhagens ao MTX em 48 h de tratamento (mas não em 96 h) mostrou-se relacionada ao tempo de duplicação celular. O tratamento com MTX alterou a concentração de 28 metabólitos intracelulares, com destaque para o consistente aumento da glicina. As concentrações intracelulares de asparagina, guanosina e glutationa – inclusive a expressão de genes da via desta última – se mostraram associadas com a resistência ao MTX. A suplementação do meio de cultura com N-acetilcisteína, um metabólito precursor de glutationa, promoveu proliferação e resistência ao MTX; entretanto, o tratamento das células com piperlongumina ou peróxido de hidrogênio, dois sequestradores de glutationa e promotores de ROS, não potencializou o efeito do MTX. MTX induziu ROS nas LLA após 6 h de tratamento, embora com baixo fold change. Paradoxalmente, a taxa de aumento de ROS correlacionou-se diretamente com a resistência ao MTX e a concentração intracelular de glutationa. O consumo de oxigênio das linhagens não se mostrou associado com a resistência ao MTX e um teste preliminar mostrou que o MTX não alterou a respiração celular. O MTX ativou o fator de transcrição NF-κB em algumas linhagens de LLA e, curiosamente, a ativação deste fator de transcrição pelo fator de necrose tumoral alfa (TNF-α) mostrou-se positivamente correlacionada com a resistência das linhagens leucêmicas ao MTX. Uma vasta revisão bibliográfica permitiu tanto a integração dos resultados obtidos ao conhecimento mais atual sobre o assunto, quanto o apontamento de novos caminhos a serem explorados em etapas futuras.

Palavras-chave: Leucemia Linfoide Aguda, Metotrexato, Resistência a Drogas, Metaboloma, Glutationa, Espécies Reativas de Oxigênio, Fator de Transcrição NF-κB, Sinergia de Drogas.

ABSTRACT

Acute lymphoblastic leukemia (ALL) is the most common type of childhood cancer, accounting for 25% of all cancers in this age group. One of the chemotherapeutics used in the therapy of ALL (and autoimmune diseases such as rheumatoid arthritis) is methotrexate (MTX), a folic acid antagonist (antifolate). As a chemotherapeutic agent, MTX´s mechanism of action is primarily attributed to the inhibition of the dihydrophate reductase enzyme, which synthesizes tetrahydrofolate from dihydrofolate – a key step in the de novo synthesis of purine nucleotides used in cell division. In rheumatoid arthritis, lower doses of MTX inhibit the 5-aminoimidazole-4-ribonucleotide-carboxamide formyltransferase (ATIC) enzyme, which culminates in the production of high levels of adenosine, a potent anti-inflammatory. However, recent works continue to present previously unknown mechanisms and effects through which MTX acts within the cell, attesting that MTX´s mechanisms of action appear to be as multiple as complex. Using several techniques of molecular biology, this work sought to expand the existing knowledge of the action of MTX in ALL. For this purpose, several biological parameters were measured under or without MTX treatment in a panel of 13 ALL cell lines. Proliferation tests, metabolic studies, drug synergism, quantification of cellular respiration and the production of reactive oxygen species (ROS) were performed, as well as the measurement of the activation of the NF-κB signaling pathway. Resistance of the MTX strains within 48 h of treatment (but not 96 h) was related to the proliferation rate of the cells. Treatment with MTX altered the concentration of 28 intracellular metabolites, highlights for a consistent increase in glycine concentration. Intracellular concentrations of asparagine, guanosine and glutathione – including the expression of genes from glutathione pathway – were associated with MTX resistance. Supplementation of the culture medium with N-acetylcysteine, a precursor metabolite of glutathione, promoted proliferation and resistance to MTX; however, cell treatment with piperlongumine or hydrogen peroxide, two glutathione scavengers and ROS promoters, did not potentiate the effect of MTX. MTX induced ROS in ALL after 6 h of treatment with low fold change, though. Paradoxically, higher ROS production was found in cell lines with high MTX resistance and intracellular glutathione. The oxygen uptake of the cell lines was not associated with MTX resistance and a preliminary test showed that MTX did not alter cellular respiration. MTX activated the transcription factor NF-κB in some ALL cell lines and, interestingly, the activation of this transcription factor by tumor necrosis factor alpha (TNF-α) was positively correlated with the resistance of leukemic lines to MTX. A wide bibliographic review allowed both the integration of the obtained results to the most current knowledge on the subject, and the identification of new paths to be explored in future stages.

Key words: Acute Lymphoblastic Leukemia, Methotrexate, Drug Resistance, Metabolome, Glutathione, Reactive Oxygen Species, Transcription Factor NF-κB, Drug Synergism.

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

1

H-RMN: ressonância magnética nuclear de prótons 2DCF: 2´,7´-diclorofluoresceína

2DG: 2-deoxi-D-glicose 5-FU: 5-fluorouracil

7-OH MTX: 7-hidroximetotrexato

AICAR: 5-aminoimidazole-4-ribonucleotídeo-carboxamida AR: artrite reumatoide

Ara-C: 1-β-d-arabinofuranosilcitosina

ARE: elemento responsivo a antioxidante (antioxidant responsive element) Asn: asparagina

ATIC: 5-aminoimidazole-4-ribonucleotídeo-carboxamida formiltransferase ATO: trióxido de arsênio

BAY: BAY 11-7082

BBSKE: 1,2-[bis(1,2-benzisoselenazolona-3(2H)-cetona)]etano BSO: butionina sulfoximina

CB: ―compound builder‖

CPss: concentração plasmática no estado estacionário CPT1: carnitina palmitoiltransferase 1

DAMPA: ácido 2,4-diamino-N10-metilpteroico dCK: desoxicitidina quinase

DHF: dihidrofolato

DHFR: dihidrofolato redutase

DHMEQ: desidroximetilepoxiquinomicina

FCCP: carbonilcianuro-p-trifluorometoxifenilhidrazona FDR: taxa de falsa descoberta

FPGS: folilpoliglumatato sintase G6PD: glicose-6-fosfato desidrogenase

GBTLI: Grupo Brasileiro de Tratamento das Leucemias na Infância GGH: gama-glutamil hidrolase

GSH: glutationa reduzida GSSG: glutationa oxidada H2O2: peróxido de hidrogênio

IC10: 10% da concentração inibitória máxima

IC50: 50% da concentração inibitória máxima (half maximum inhibitory concentration) IL: interleucina

INF-γ: interferon gama

JNK: quinases c-Jun N-terminal LLA: leucemia linfoide aguda

LDL: lipoproteína de baixa densidade

MDR: resistência a múltiplas drogas (multidrug resistance) MGd: motexafin gadolinium

MTHFR: metilenotetrahidrofolato redutase

MTX: metotrexato

MTXPG: derivado poliglutâmico de metotrexato NAC: N-acetillcisteína

NBMPR: nitrobenziltioinosina NF-κB: fator nuclear kappa B PEITC: fenetil isotiocianato PL: piperlongumina

R10: meio de cultura RPMI-1640 suplementado com 10% de soro fetal bovino, penicilina e estreptomicina

RE: retículo endoplasmático

ROS: espécies reativas de oxigênio (reactive oxygen species) SAH: s-adenosil-L-homoserina

SAM-e: s-adenosil-L-metionina

shRNA: ―short hairpin RNA‖

SNP: polimorfismo de nucleotídeo único (single nucleotide polymorphism) THF: tetrahidrofolato

TNF-α: fator de necrose tumoral alfa TNX: tiorredoxina

TrxR: tiorredoxina redutase TYMS: timidilato sintase V-ATPase: ATPase vacuolar

Δ NF-κB: razão (fold change) entre ativação do NF-κB em células tratadas com TNF-α ou MTX e células não tratadas (controle)

Δ ROS: razão (fold change) entre espécies reativas de oxigênio produzidas em células tratadas com metotrexato e em células não tratadas (controle)

SUMÁRIO

1. Introdução...13

2. Objetivos...27

3. Material e Métodos...29

4. Resultados...34

Parte I: Fenótipo de resistência ao MTX, tempo de duplicação celular, efeito do MTX no metaboloma celular e papel da glutationa na resistência à droga...34

Parte II: Função mitocondrial e resistência ao MTX...56

Parte III: Testes de interação entre o MTX e inibidores da autofagia ou da síntese proteica...63

Parte IV: A via do NF-κB e a resistência ao MTX...68

5. Discussão...75

6. Conclusão...103

7. Referências...105

Apêndice 1 – Tabelas e figuras suplementares...128

Apêndice 2 – Teste de sensibilidade ao pemetrexed...156

Apêndice 3 – Estrutura molecular dos compostos utilizados...158

1. Introdução

A leucemia linfoide aguda pediátrica

A leucemia é uma neoplasia caracterizada pela proliferação desordenada de células hematopoiéticas em processo de diferenciação (portanto, ainda sem função biológica) que vão substituindo a população de precursores hematopoiéticos saudáveis na medula óssea. A leucemia pode ser aguda ou crônica, linfoide ou mieloide, dependendo da taxa de progressão da doença e do progenitor hematopoiético comprometido, respectivamente. A leucemia linfoide aguda (LLA) é o tipo de câncer mais comum da infância (< 15 anos), correspondendo a 80% dos casos de leucemia e a 25% de todos os casos de câncer nesta faixa etária (1). Apenas no Brasil, estima-se que ocorrerão cerca de 12.600 casos novos de câncer em crianças e adolescentes no Brasil por ano em 2016 e 2017, dos quais 3.150 deverão ser de LLA (2).

Tradicionalmente a LLA tem sido classificada em fenótipo LLA-T (quando a linhagem afetada refere-se à de linfócitos T, que corresponde a aproximadamente 15% dos casos) e LLA-B derivada (quando as células afetadas são derivadas de células B, que corresponde a 85% dos casos); estes subtipos são então subdivididos de acordo com as anormalidades de cariótipo, incluindo aneuploidia e translocações cromossômicas (3). A ocorrência de diversos tipos de alterações genéticas como translocações, inversões, deleções e duplicações de cromossomos ou partes dos cromossomos, faz com que a LLA seja uma doença bastante heterogênea. Este fato, somado às particularidades dos pacientes – com relação à tolerância e metabolização das drogas –, tornaria necessária, em tese, a prescrição individualizada do tratamento. Na prática, porém, os pacientes são classificados em dois grandes grupos – grupo de alto risco e grupo de baixo risco – sendo a intensidade do regime terapêutico ajustada a cada um deles.

A classificação dos pacientes nos grupos de risco leva em conta, basicamente, a idade e o número de células leucêmicas ao diagnóstico. Pacientes com idade inferior a 1 ano ou superior a 9 anos vão para o grupo de alto risco, bem como pacientes que apresentam mais de 50.000 glóbulos brancos por microlitro de sangue ao diagnóstico. No atual protocolo do Grupo Brasileiro de Tratamento das Leucemias na Infância (GBTLI-LLA-2009), pacientes de baixo risco que não respondem adequadamente às primeiras 4 semanas do tratamento são transferidos para o grupo de alto risco. Os indicativos de resposta insatisfatória são: (i) presença de mais de 1.000 blastos por microlitro de sangue no dia 8 após o início da terapia, por doença residual mínima (DRM) (ii) presença de ≥ 10% de blastos na medula no dia 15 e

(iii) medula óssea com ≥ 0,1% de linfoblastos no dia 35 no caso de LLA B-derivada ou ≥ 1% no caso de LLA-T. Pacientes do grupo de alto risco são alocados nesta categoria, pois têm maior probabilidade de sofrer recaída da doença.

Translocações cromossômicas recorrentes são típicas da LLA e mais recentemente também foram descobertas em outros tipos de câncer. Estas levam à formação de fusões gênicas com consequente produção de proteínas quiméricas de função pró-oncogênica. Além das translocações cromossômicas, na última década foram descritas uma série de outras mutações focais, algumas das quais levam a ganho de função, como as descritas por nosso grupo no gene IL7R para 9% das LLA-T (4), e outras que levam à perda de supressores tumorais, como deleções do CDKN2A em cerca de 70% dos casos de LLA (5,6).

Dentre os subgrupos de LLA infantil de pior prognóstico estão:

 LLA-T de fenótipo prematuro (Early T-Phenotype Acute Lymphoblastic Leukemia, ETP-ALL): representa ~12% das LLA-T pediátricas (5). Caracteriza-se pela falta de expressão de CD1A e CD8, fraca expressão de CD5 e expressão de pelo menos um ou mais dos seguintes marcadores (de linhagem mielóide ou de células tronco): CD117, CD34, HLA-DR, CD13, CD33, CD11b, ou CD65 (7). Apresenta taxa de sobrevivência de aproximadamente 19% comparada aos 84% das demais LLA-T segundo dados do St. Jude Children’s Research Hospital (8). A resposta a longo prazo deste subtipo é uma das piores entre as LLA pediátrica de alto risco, sendo igual ou pouco inferior à LLA BCR-ABL1 ou LLA com rearranjo do gene MLL.

 LLA Hipodiploide (< 46 cromossomos): A maioria dos pacientes com hipoploidia apresenta 45 cromossomos em suas células leucêmicas. Leucemias com menos de 45 cromossomos possuem prognóstico ainda pior que aquelas com 45 cromossomos (9). Análises de expressão gênica, alterações indel e sequenciamento massivo identificaram múltiplas alterações genéticas recorrentes que distinguem as LLA ―near-haploid‖ (24-31 cromossomos) e LLA ―low-hypodiploid‖ (32-39 pares de cromossomos) e que são raras ou ausentes em outros subtipos de LLA. Alterações genéticas envolvendo TP53 (91%), RB1 (41%) e IKZF2 (53%; membro da família IKAROS de fatores de transcrição) são marcadores da LLA ―low-hypodiploid‖; em contraste, a maioria dos casos de LLA ―near-haploid‖ possui alterações em receptores de tirosina quinase e Ras (71%) e em IKZF3 (13%). As células da LLA hipodiploide apresentam ativação das vias Ras e PI3K e são sensíveis a inibidores de PI3K, sugerindo um possível alvo terapêutico para este subtipo de LLA (10). Por outro lado,

cariótipos hiperdiploides com mais de 50 cromossomos (particularmente trissomias dos cromossomos 4, 10, 17, 18) identificam pacientes com um prognóstico favorável (11,12).

 LLA com rearranjos do MLL (11q23): rearranjos do gene MLL (11q23) são muito comuns na LLA do lactente, representando mais do que 75% dos casos (13). A t(4;11)(q21;q23) com fusão MLL-AF4 é o rearranjo 11q23 mais prevalente na LLA e está relacionado a prognóstico ruim (14). Chama a atenção a promiscuidade de rearranjos envolvendo o gene MLL: até o momento foram descritos 121 rearranjos diferentes, para os quais 79 genes parceiros já foram identificados. O que estes genes parceiros têm em comum é o fato de constituírem um ou diferentes complexos proteicos que atuam na elongação da transcrição via interação com DOT1, metil transferase da lisina 79 da histona H3, ou com P-TEFb (positive transcription elongation factor b)(15).

 LLA cromossomo Filadélfia Positiva: a LLA Filadélfia Positiva (Ph+) caracteriza-se pela translocação cromossômica t(9;22)(q34;q11), a qual gera a proteína de fusão BCR-ABL1 que apresenta atividade tirosina quinase constitutiva. Três tipos de proteínas BCR-ABL1 foram identificadas, as quais diferem nos exons de BCR presentes na fusão: a ABL1p210, que é marcador da Leucemia Mielóide Crônica (16); a BCR-ABL1p230, que foi detectada em LMC neutrófila e em raros outros casos de LMC (17); e aBCR-ABL1p190, que está presente em cerca de 20-30% dos adultos e 3-5% das crianças portadoras da LLA B-derivada (18,19). A presença da t(9;22) está associada a prognóstico desfavorável, fato que vem sendo alterado com a incorporação de inibidores da ABL tirosina quinase no tratamento (como o imatinibe e o dasatinibe). De maneira geral, estes medicamentos são semelhantes e altamente eficazes, entretanto, existem casos de persistência de células residuais BCR-ABL1 positivas, detectadas por técnica de PCR (20), que podem levar à recaída da doença devido ao surgimento de mutações de ponto no gene fusionado BCR-ABL1 que prejudicam a ligação do inibidor na proteína e levam à resistência (21).

 LLA BCR-ABL1-like: apesar deste novo subtipo de LLA não apresentar a translocação t(9;22), seu perfil de expressão gênica é muito similar ao da LLA Filadélfia Positiva (LLA BCR-ABL1 positiva) – daí o seu nome – e acomete ~10% dos pacientes. Este subtipo de LLA está associado a um grande risco de recaída pós-tratamento, independentemente de idade, contagem leucocitária, citogenética e níveis de doença residual mínima (22). Assim como a LLA BCR-ABL1 positivo, a BCR-ABL1-like acomete precursores de célula B, e também apresenta elevada frequência de microdeleções de IZKF1. Metade dos casos de LLA BCR-ABL1-like possuem rearranjo cromossômico envolvendo o gene CRLF2 (IGH@-CRLF2 e P2RY8-CRLF2) que ocasionam hiperexpressão do mesmo

(23). Análises genéticas em 154 casos de LLA BCR-ABL1-like evidenciaram a presença de mutações ou fusões gênicas ativadoras das tirosinas quinases: 12.6% dos pacientes apresentavam rearranjos envolvendo os genes ABL1, ABL2, CSF1R e PDGFRB (conhecidos por responderem a tratamentos com dasatinibe); outros numerosos casos apresentavam rearranjos envolvendo EPOR (3.9%), JAK2 (7.4%) e CRLF2 (49.7%); e alterações genéticas em IL7R, FLT3, KRAS, SH2B, JAK1, JAK3 e TYK2 (24). Um terço dos casos com rearranjo de CRLF2 apresenta mutações concomitantes em JAK (25).

Melhorias graduais na quimioterapia adaptada à estratificação dos pacientes e cuidados de apoio ao longo das últimas cinco décadas têm elevado as taxas de cura de casos novos de LLA infantil para o patamar de 85% em países desenvolvidos (26,27). Avanços recentes nas análises genéticas das células leucêmicas prometem elevar ainda mais a porcentagem de cura ao promover novos insights sobre os mecanismos de resistência a drogas, bem como ao identificar novos alvos moleculares para terapia (28). Por exemplo, a expressão gênica global de LLA de precursores de células T mostrou-se similar à de células-tronco hematopoiéticas normais e de leucemias mieloides. Este achado sugeriu que terapias originalmente direcionadas a LLA mieloide poderiam beneficiar este subtipo de LLA de alto risco (29). Além disso, estudos de associação genética ampla mostraram que variações genéticas germinais também contribuem para a resistência a drogas e recaída da doença (30). Compreender os mecanismos de resistência à quimioterapia convencional e utilizar drogas direcionadas a novos alvos moleculares parecem ser as melhores estratégias para o aperfeiçoamento do tratamento da LLA.

Ácido fólico e metotrexato

O ácido fólico, também chamado folato, folacina, ácido pteroil-L-glutâmico ou Vitamina B9, é uma vitamina essencial para seres humanos, que não a sintetizam (31). O termo ―fólico‖ é derivado do latim folium, que significa ―folha‖ – os vegetais de folha verde-escuro, bem como vísceras de animais, estão entre as principais fontes desta vitamina (32). O folato é necessário para a produção e manutenção de novas células, para a síntese de DNA e RNA e para a prevenção de alterações no DNA (33). O folato é necessário para transportar grupos de um carbono para reações de metilação e síntese de ácidos nucleicos (sendo o mais notável a timina, mas também as bases purínicas) (34). Assim, a deficiência de folato dificulta a síntese de DNA e a divisão celular, afetando sobretudo as células hematopoiéticas devido à sua maior taxa de proliferação. Uma vez que a deficiência de folato limita a divisão celular, a

eritropoiese (isto é, a produção de glóbulos vermelhos) é dificultada e leva à anemia megaloblástica, caracterizada por grandes glóbulos vermelhos imaturos (35). O folato é usado como suplemento alimentar por mulheres grávidas para a prevenção de defeitos do tubo neural do feto; mais da metade dos casos de bebês nascidos com esse tipo de malformação é atribuída à escassez desta vitamina (32).

O metotrexato (MTX), um antagonista do ácido fólico, é um difundido agente quimioterápico e supressor do sistema imunológico (36). Desenvolvido em 1947 por Yellapragada Subbarow como uma variação de aminopterina, o MTX foi primeiramente usado na clínica contra a leucemia linfoblástica aguda (LLA) por Sidney Farber, do Children’s Medical Center de Boston. Em um trabalho seminal de 1948, Dr. Farber relatou uma remissão temporária da neoplasia em crianças que receberam aminopterina (37). No entanto, os superiores índices terapêuticos do MTX fizeram com que a aminopterina fosse rapidamente substituída pelo antifolato na prática clínica. Desde então, o MTX tem sido prescrito para uma variedade de tipos de câncer, incluindo câncer de mama, cabeça e pescoço, bexiga, pulmão, linfoma e osteossarcoma (36). Enquanto agente quimioterápico, o mecanismo de ação do MTX é atribuído ao seu efeito "antimetabólico". O composto compete com o dihidrofolato pelo sítio ativo da dihidrofolato redutase (DHFR), a enzima que catalisa a produção de tetrahidrofolato (THF) – o doador de carbono de várias reações envolvidas na síntese de purinas e pirimidinas – precursores de DNA e RNA e, portanto, essenciais para a proliferação celular (38). Ademais, o THF desempenha função em uma segunda via bioquímica importante: o ciclo da metionina-homocisteína, necessário para o fornecimento de um radical metil em reações de metilação do DNA, RNA, proteínas e outros (39). Portanto, o MTX basicamente interrompe a síntese e a metilação de DNA, RNA e proteínas (40).

Os transportadores de folato (ex: SLC19A1) são responsáveis por internalizar o MTX extracelular; a folilpoliglumatato sintase (FPGS), enzima citosólica, catalisa a adição de múltiplos (até seis) resíduos de glutamato ao MTX, formando derivados poliglutâmicos (MTXPGs) que, ao contrário do MTX, são retidos intracelularmente (41). MTXPGs podem se acumular no citosol e atingir níveis que excedem substancialmente a capacidade de ligação à DHFR, ocasionando assim uma inibição completa da biossíntese de THF a partir de dihidrofolato (DHF) (42). MTXPGs de cadeia longa (isto é, com quatro a seis resíduos de glutamato) inibem as enzimas envolvidas na síntese de pirimidinas, tais como a timidilato sintase (TYMS), que catalisa a transferência do grupo metil do 5,10-metileno-THF para dUMP, produzindo assim DHF e dTMP (41,43) – um esquema do mecanismo de ação

encontra-se na Figura 1. A parada da biossíntese de pirimidinas impede o progresso do ciclo celular através da fase S, inibe a divisão celular e promove a apoptose (44).

Figura 1. Mecanismos de ação do MTX. Retirado e traduzido de Roberts e col. (45); a

autorização para uso encontra-se no Anexo desta tese.

O metotrexato na leucemia linfoide aguda

Desde a sua introdução, protocolos quimioterápicos contendo MTX se mostraram fundamentais para alcançar efeitos curativos em LLA. De fato, a resposta in vivo ao MTX é prognóstica mesmo para regimes poli-quimioterápicos (46,47). Ensaios clínicos indicaram que o nível de exposição sistêmica a altas doses de MTX pode ter uma influência positiva no prognóstico de crianças com LLA, e nós recomendamos o trabalho de Paugh e cols. (48), que traz detalhes dos ensaios clínicos mencionados neste parágrafo. Uma relação significativa entre as concentrações plasmáticas de MTX no estado estacionário (isto é, depois de atingido um equilíbrio a partir do qual a concentração passa a ser mais ou menos constante) e

sobrevida livre de eventos foi observada em um estudo com crianças com LLA de baixo risco tratadas no St. Jude Children’s Research Hospital (SICRH) com o protocolo Total-XS (49). Pacientes com depuração sistêmica (clearance) rápida de altas doses de MTX apresentaram reduzidas concentrações plasmáticas deste agente no estado estacionário (CPSS) e maior risco de recaída da doença do que pacientes com altas CPSS de MTX (49) – este risco permaneceu elevado mesmo quando foram considerados outros fatores prognósticos, como a contagem de glóbulos brancos e o índice de DNA. Uma relação similar entre CPSS do MTX durante a fase de manutenção da terapia e o risco de recaída também foi observada em um teste clínico realizado pelo Pediatric Oncology Group (50).

Polimorfismos genéticos têm sido associados à toxicidade do MTX e à recaída da LLA. Por exemplo, o polimorfismo G80A no gene do transportador membranar de folato (SLC19A1) foi associado a uma menor sobrevida livre de eventos (51). Pacientes de LLA portadores de um alelo da timidilato sintase associado a uma menor produção de sua proteína apresentaram maior sobrevida livre de eventos, presumivelmente devido a uma maior susceptibilidade a drogas que alvejem esta enzima (52,53). Pacientes com atividade reduzida de metilenotetrahidrofolato redutase (MTHFR) tiveram maior risco de toxicidade (mucosite) ao receberem baixas doses de MTX (54). Dois polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) em SLCO1B1 (que codifica um polipeptídeo transportador de ânions orgânicos) foram associados tanto com depuração plasmática (clearance) do MTX quanto com toxicidade gastrointestinal durante as fases de consolidação e manutenção do tratamento (55). Este transportador, localizado na membrana de hepatócitos, retira o MTX da corrente sanguínea e o direciona ao trato digestivo, possivelmente por excreção biliar. Rápido clearance plasmático do MTX resultava em maior concentração da droga no trato digestivo e, consequentemente, em maior toxicidade gastrointestinal.

Uma vez que MTXPGs são as formas ativas estáveis do MTX, responsáveis por sua ação no interior da célula, níveis intracelulares mais elevados de MTXPGs foram associados a um melhor prognóstico, tal como em: pacientes pediátricos versus adultos (56); LLA hiperdiploide versus não hiperdiploide (47,57,58); LLA sem rearranjos versus com rearranjos TEL-AML1 ou E2A-PBX1 (47); leucemia B- versus T-derivada (56,58,59) (leucemias B-derivadas tem expressão aumentada de FPGS e reduzida de DHFR (38)). As concentrações de MTXPGs e nucleotídeos de tioguanina em eritrócitos puderam predizer o prognóstico dos pacientes que foram tratados com um protocolo que incluía baixas doses de MTX (com 6-mercaptopurina) na fase de manutenção da terapia (60). O padrão de expressão

gênica de células leucêmicas de LLA recém-diagnosticada, remanescentes na corrente sanguínea após uma dose inicial (up-front) de MTX, pôde predizer a sobrevida livre de eventos em longo prazo (61), e maior acúmulo de MTXPGs de cadeia longa em linfoblastos leucêmicos mostrou-se fortemente associado a maior sobrevida global (10 anos) e sobrevida livre de eventos (10 anos) em pacientes com LLA (47).

Por outro lado, diversos mecanismos de resistência ao MTX foram identificados: absorção diminuída de MTX devido a deficiências no transporte membranar por SLC19A1 (47,62,63); maior expressão de transportadores de efluxo do MTX (59,64,65); poli-glutamilação deficiente de MTX por FPGS (59,66,67); níveis ou estruturas alteradas de enzimas alvo (68,69) e aumento da hidrólise de MTXPGs por gama-glutamil hidrolases (GGH) nos lisossomos (70,71) – embora o papel da GGH na eficácia do MTX permaneça controverso (72–74). Foi observado que os níveis de MTXPGs não se correlacionaram com a porcentagem de células em fase S, o que sugeriu que o aumento dos níveis de MTXPGs não poderia ser atribuído a proporções elevadas de células em síntese ativa de DNA (57). Recentemente, foi demonstrado em linhagem celular de câncer de pulmão um mecanismo de resistência adquirida ao MTX causado pela perda de um microRNA (miR-200c) (75), e que linhagens de LLA submetidas à hipóxia in vitro adquiriam resistência ao MTX por meio da inibição da expressão de proteínas pró-apoptóticas (Bax, Bim e caspase 3 clivada) e aumento da expressão de proteínas antiapoptóticas (Bcl-2 e Mcl-1), sem alteração da proliferação celular (76) – um dado curioso, uma vez que a hipóxia do ambiente medular parece estimular a proliferação da leucemia (77), enquanto favorece a quiescência de células-tronco hematopoiéticas e do câncer (cancer stem cells) (78,79). Um estudo recente mostrou que a superexpressão do receptor alfa relacionado a estrogênio (ERRα) ab-rogou a produção de espécies reativas de oxigênio (ROS) – e, com isso, a apoptose – causada por MTX em linhagem de osteossarcoma, correlacionando, pela primeira vez, a resistência ao MTX à expressão de um receptor nuclear e apontando-o como um potencial alvo para a otimização da terapia com MTX (80).

O fenômeno da resistência a drogas se constitui em um obstáculo na busca por regimes quimioterápicos eficazes, de forma que outros mecanismos moleculares subjacentes à quimiorresistência provavelmente permanecem obscuros (47). Neste cenário, o MTX continua a ser um componente importante de regimes quimioterápicos antileucêmicos e objeto de contínua investigação (48).

O metotrexato em doenças autoimunes

O mecanismo de ação do MTX em doenças autoimunes é importante para se entender alguns resultados desta tese e por isso será abordado. O potencial clínico de antifolatos contra doenças autoimunes foi primeiramente relatado em 1951, quatro anos após a primeira síntese do MTX. Observou-se que a aminopterina inibiu a proliferação de linfócitos e outras células responsáveis pela inflamação na articulação de pacientes com artrite reumatoide (AR) (81). Uma lacuna de três décadas se seguiu até que vários estudos realizados na década de 1980 mostraram que o MTX possuía efeitos anti-inflamatórios em pacientes com AR, evidenciado pela melhora da função das articulações e por uma marcante diminuição na dor (39). Ao longo dos anos, o MTX também passou a ser usado contra outras doenças inflamatórias e autoimunes, como a psoríase (82)e a doença de Crohn (83,84). O vasto espectro de uso do MTX na prática clínica levou a Organização Mundial de Saúde a incluí-lo em sua Lista de Medicamentos Essenciais, que reúne os medicamentos mais importantes e necessários em um sistema de saúde básico (85).

Em contraste com as altas doses empregadas no tratamento de neoplasias, doses muito mais reduzidas e infrequentes de MTX são utilizadas no tratamento de doenças inflamatórias, de modo que os mecanismos de ação podem diferir grandemente entre estes casos. Entretanto, como no câncer, os mecanismos exatos subjacentes à ação anti-inflamatória do MTX permanecem imprecisos e inconclusivos, apesar do uso generalizado do antifolato (86). O mecanismo de ação do MTX em baixas doses parece resultar em um efeito mais anti-inflamatório do que antiproliferativo (imunossupressor) (87): MTXPGs se ligam com alta afinidade a enzimas que requerem folato como co-fator, incluindo a timidilato sintase (TYMS) e a 5-aminoimidazole-4-ribonucleotídeo-carboxamida (AICAR) formiltransferase (ATIC). MTXPGs inibem ATIC de forma ainda mais potente do que DHFR, causando acumulação de AICAR e dos seus metabólitos (88), que por sua vez inibem a adenosina-desaminase e a monofosfato de adenosina (AMP) adenosina-desaminase, gerando aumento dos níveis de adenosina endógena – um nucleosídeo com potente efeito anti-inflamatório (89,90). Um esquema deste mecanismo de ação também está na Figura 1. A síntese de adenosina modulada por MTX, a sua liberação para o meio extracelular e a subsequente ativação de receptores de adenosina compõem um dos mecanismos responsáveis pelo efeito anti-inflamatório do MTX (86,91,92); mas o MTX também inibe a ativação, altera a expressão de citocinas e moléculas de adesão e induza apoptose em células T (93–96). As concentrações de MTXPGs encontradas em eritrócitos, neutrófilos e em células mononucleares após a

administração de MTX se correlacionaram com a eficácia clínica deste agente em pacientes com AR (97,98).

O complexo mecanismo de ação do metotrexato

Embora a aprovação do MTX para uso oncológico tenha sido atribuída à sua menor toxicidade em comparação com outros agentes disponíveis naquele contexto (99), os efeitos colaterais do MTX podem ser tão diversos quanto debilitantes. As manifestações mais comuns incluem náusea, fadiga, febre, leucopenia e mucosite; já os efeitos colaterais mais graves podem incluir complicações hepáticas ou pulmonares, erupções cutâneas, convulsões e até morte (para se tentar evitar estes efeitos, é usual o monitoramento das concentrações plasmáticas de MTX e a administração de acido fólico, o chamado ―resgate‖) (100). Tal realidade insta a busca da compreensão das bases moleculares das diferenças clínicas da resposta ao tratamento dentre os pacientes com LLA. Em particular, a identificação ao diagnóstico dos pacientes que são mais propensos a apresentar efeitos colaterais poderá permitir a adaptação de protocolos e a implementação de novas estratégias de tratamento (47).

Os mecanismos de ação do MTX parecem ser múltiplos e complexos. Babiak e cols. (101) demonstraram que o MTX pode inibir in vitro uma série de enzimas dependentes de NAD+: 2-oxoglutarato, isocitrato, malato, piruvato, succinato, 6-fosfogluconato e glicose-6-fosfato desidrogenases; gama-glutamilcisteína sintetase, glutationa redutase e glutationa peroxidase. A eventual inibição in vivo dessas importantes enzimas metabólicas poderia impactar uma significativa parcela do metabolismo celular. Uma revisão recente pontuou alguns efeitos do MTX independentes da inibição de DHFR (102). Espécies reativas de oxigênio (ROS) mediadas por MTX ganharam importância como mecanismo de ação da droga na imunossupressão em doenças autoimunes (103), na citotoxicidade em neoplasias (incluindo LLA) (104) e também na insurgência de efeitos colaterais como mucosite (105). Recentemente, foi mostrado que o MTX é capaz de induzir a expressão dos fatores de transcrição JUN e FOS, bem como a produção das interleucinas 1 e 6 (IL-1 e IL-6, respectivamente) na linhagem celular monocítica U937 (106). Pacientes com AR que receberam MTX em baixas doses também apresentaram superexpressão de JUN, em conjunto com a produção de ROS, a ativação de JNK (quinases c-Jun N-terminal), e a indução dependente de JNK de genes cujos produtos polipeptídicos promovem a apoptose, sugerindo que a apoptose induzida por MTX é pelo menos parcialmente mediada por JNK (93). MTX

também reduziu a expressão de RNAm de interferon gama (IFN-γ) e interleucina 17A (IL-17A) em ratos acometidos por atrite (107). A combinação de MTX e 1-β-d-arabinofuranosilcitosina (ara-C) há tempos é amplamente aceita como eficaz no tratamento da leucemia e do linfoma (62,63), mas apenas em 2006 foi mostrado que o MTX aumenta a incorporação ao DNA e a citotoxicidade de Ara-C por meio da regulação da desoxicitidina-quinase (dCK), uma enzima que atua na via de resgate da biossíntese de nucleotídeos (108). Todos estes dados sugerem que os vários mecanismos pelos quais o MTX exerce o seu efeito ainda estão distantes de ser totalmente compreendidos (104).

A continuidade de um projeto: NF-κB e resistência ao MTX

Este trabalho é a continuação de nossa Dissertação de Mestrado (109). As mesmas linhagens celulares empregadas no presente estudo haviam sido classificadas como resistentes ou sensíveis ao MTX, sendo o perfil metabolômico destes grupos comparado entre si. Além de sugerir alguns metabólitos candidatos a indicadores da resistência ao MTX, nosso estudo fez inferências sobre possíveis mecanismos subjacentes a este fenótipo clinicamente adverso. Mapas de ―interação‖ molecular foram construídos com auxílio do software ―Ingenuity Pathway Analysis‖, uma base de dados que permite a integração de diferentes níveis de organização biológica a partir de uma lista de metabólitos, proteínas ou genes. Estes ―mapas de interação‖ possibilitaram uma melhor compreensão de nossos resultados experimentais, ao integrar diversas vias bioquímicas (que de outro modo apenas seriam consideradas individualmente) e ao sugerir a via de sinalização do NF-κB na resistência ao MTX.

A Figura 2 traz os mapas de interação obtidos durante o mestrado, construídos com os metabólitos que discriminaram as linhagens de LLA resistentes das sensíveis ao MTX em duas situações distintas: quando as células foram mantidas apenas em meio de cultura (isto é, em situação ―basal‖) ou quando foram tratadas com MTX. A presença do TNF (fator de necrose tumoral), FOS e cAMP em ambos os mapas de interação apontou para uma importância constitutiva destas vias – não alterada pela ação da droga – na resistência ao MTX. Por outro lado, peróxido de hidrogênio (relacionado ao metabolismo de espécies reativas de oxigênio: ROS, reactive oxygen species), NAD+ e lactato (relacionados ao metabolismo energético), surgiram apenas no mapa feito a partir da condição de tratamento com MTX, indicando que estas moléculas e vias são moduladas pela ação do antifolato.

Foram os nós TNF, FOS, ROS e glicose que motivaram, portanto, a investigação do papel da via do NF-κB na resistência ao MTX.

O NF-κB é um complexo proteico que atua como fator de transcrição, com atividade pró-sobrevivência, antiapoptótica e proliferativa. Indutores conhecidos do NF-κB incluem ROS, o fator de necrose tumoral alfa (TNF-α), interleucina 1-beta (IL-1β), lipopolissacarídeo bacteriano (LPS) e radiação ionizante (110,111). Assim como a radiação ionizante, o MTX também causa quebras do DNA (112). Curiosamente, células primárias de LLA resistentes in vitro à radiação ionizante (que causa quebras no DNA) – fenótipo associado à pior evolução clínica dos pacientes – apresentaram maior atividade de NF-κB (113). O NF-κB é um fator de transcrição sensível à variação redox no ambiente intracelular e tem sido proposto como um sensor para o stress oxidativo (114). Espécies reativas de oxigênio (ROS) podem ativar o NF-κB diretamente (115) e ROS também estão envolvidas na ativação do NF-κB por outros estímulos, tais como pelo fator de necrose tumoral alfa (TNF-α) e por interleucina-1 (116).

Diversos trabalhos já investigaram a relação entre a via do NF-κB e a resistência a MTX, em variados modelos de patologias. A interação entre MTX e NF-κB, no entanto, parece variar substancialmente, dependendo do contexto biológico. Por exemplo, o MTX ativou a via do NF-κB em linhagem de queratinócitos hiperproliferativos (HaCat), com concomitante redução da inflamação e promoção da apoptose (117). Similar ativação mostrou-se ser a causa da perda óssea (via promoção da osteoclastogênese) observada em pacientes com câncer tratados com o antifolato (118). O NF-κB também foi ativado em hepatócitos de ratos tratados com MTX, com inibição da proteína antiapoptótica Bcl-2 dependente de NF-κB (119). Por outro lado, o MTX inibiu a via do NF-κB: em Jurkat, por meio da depleção de tetrahidrofolato (THF), da ativação de JNK e p53 (120); da inibição da fosforilação e degradação de IkB-α e da liberação de adenosina (121); e em artrite reumatoide, por meio do aumento dos níveis de lincRNA-p21 (122). Na linhagem promielocítica HL-60, o MTX alterou o processo de reciclagem proteica ao reduzir a quantidade de diversas subunidades estruturais e regulatórias que compõem o proteassoma; uma das principais consequências foi a não degradação da proteína reguladora IkB-α, com consequente supressão do NF-κB (123). Fibroblastos embrionários murinos que tiveram silenciada a expressão gênica da subunidade p65 do NF-κB ficaram mais sensibilizados à ação do MTX e, em resposta ao tratamento com o antifolato, a localização celular de p65, IkB-α e Bax foi alterada (124).

Com relação à combinação de drogas, um inibidor específico de NF-κB (desidroximetilepoxiquinomicina, DHMEQ) sinergizou com cisplatina, MTX e doxorrubicina em linhagens celulares de osteossarcoma; no entanto, ao contrário da cisplatina, para a qual o tratamento simultâneo com DHMEQ mostrou melhores resultados, o sinergismo do inibidor de NF-κB com MTX ou doxorrubicina foi mais intenso quando o regime de tratamento foi escalonado, independentemente de qual droga fora aplicada em primeiro lugar (125). Em pacientes com artrite reumatoide, a combinação de MTX com inibidores de TNF-α prolongou a sobrevivência dos pacientes em comparação à monoterapia com tais inibidores (126).

Desta forma, buscamos averiguar se o MTX é capaz de modular a via do NF-κB em linhagens celulares de LLA, bem como se a ativação ou inibição desta importante via de sinalização altera a resistência das linhagens ao antifolato.

Figura 2. Mapas de ―interação‖ construídos a partir de metabólitos que se mostraram

aumentados da condição de resistência (vermelho) e de sensibilidade (azul), em amostras (A) sem tratamento ou (B) tratadas com MTX. As linhas contínuas representam relações diretas, mediadas por enzimas; linhas tracejadas representam relações indiretas. Circulados estão componentes (TNF, ROS, FOS e glicose) implicados up ou downstream na via de sinalização do NF-κB. Retirado de Canevarolo e cols. (109).

2. Objetivos

Objetivo geral:

Expandir o conhecimento a respeito do mecanismo de ação do MTX e da resistência ao antifolato em LLA por meio da: i) medição de parâmetros biológicos em estado constitutivo (basal) ou alterado pelo quimioterápico; ii) discussão dos resultados à luz dos dados disponíveis na literatura e iii) proposição de novos experimentos a serem realizados em etapas subsequentes.

Objetivos específicos:

 Construir curvas dose-resposta e determinar o IC50 do MTX para as linhagens de LLA após tratamento por 48 ou 96 h

 Determinar o tempo de duplicação das linhagens e averiguar a existência de correlação entre este parâmetro e a resistência das linhagens ao MTX

 Caracterizar e buscar compreender biologicamente as alterações metabólicas induzidas pelo tratamento com MTX

 Averiguar se a resistência das linhagens ao MTX (considerada em termos de IC50) está correlacionada com a concentração de um ou mais metabólitos, bem como, com a expressão de genes participantes de suas vias bioquímicas

 Averiguar se o cotratamento com compostos precursores, depletores ou inibidores da síntese de glutationa altera a sensibilidade das linhagens ao MTX

 Determinar se o MTX é capaz de induzir a formação de ROS nas linhagens, bem como, se esta indução está associada ao grau de resistência ao antifolato.

 Quantificar a taxa de consumo de oxigênio das linhagens e determinar se a resistência ao MTX está relacionada à respiração celular basal

 Averiguar se compostos promotores ou inibidores da beta-oxidação alteram a sensibilidade das linhagens ao MTX

 Determinar se o MTX interage antagônica ou sinergicamente com inibidores da tradução proteica ou da autofagia

 Averiguar se o MTX é capaz de ativar a via do NF-κB, bem como, se tal ativação se correlaciona com o grau de resistência das linhagens

 Determinar se o cotratamento com um ativador ou inibidores farmacológicos da via do NF-κB altera a sensibilidade das linhagens ao MTX

Figura 2. Esquema detalhando as partes que compõem este trabalho. As seções de Resultados e Discussão foram subdivididas de acordo com

3. Material e Métodos

Linhagens celulares. Seis linhagens celulares precursoras de células B (Nalm6, Nalm16, Nalm30, REH, RS4;11 e 697) e 7 de células T (ALL-SIL, CCRF-CEM, HPB-ALL, Jurkat, Molt-4, P12-ICHIKAWA e TALL-1) foram estudadas neste trabalho. As linhagens foram cultivadas em meio de cultura RPMI-1640 (Cultilab) suplementado com 10% de soro fetal bovino (Cultilab), penicilina a 100 IU/mL e estreptomicina a 100 µg/mL (Sigma-Aldrich) – neste trabalho chamado de meio ―R10‖ –, mantidas a 37 ºC e em atmosfera com 5% de CO2 em todos os experimentos.

Reagentes. Metotrexato (MTX), BAY 11-7082 (BAY), piperlongumina (PL), N-acetillcisteína (NAC), fenetil isotiocianato (PEITC), butionina sulfoximina (BSO) e demais compostos foram adquiridos da empresa Sigma-Aldrich. TNF-α recombinante humano foi adquirido da empresa Peprotech (Rocky Hill, NJ, EUA). Todos os reagentes foram ressuspendidos de acordo com as instruções do fabricante, sendo as soluções estoque armazenadas a -20 ºC (com exceção do BSO, cuja solução estoque foi preparada no momento de uso devido à sua sensibilidade ao descongelamento). As diluições dos compostos a serem usadas nos experimentos foram preparadas somente no momento de uso.

Ensaios de viabilidade celular. Oitenta microlitros de uma suspensão de 4,0 x 105 células/mL foram semeadas por poço em uma placa de cultura de células de 96 poços. Vinte microlitros de meio de cultura (R10) contendo doses decrescentes de MTX (ou outras drogas), preparado no momento do experimento, foram adicionados em cada poço. Controles negativos receberam apenas veículo. Seguiu-se incubação por 48 ou 96 h. Após o período de tratamento, o meio condicionado de cada poço foi substituído por 200 µL de tampão fosfato (PBS 1X) contendo calceína AM (Sigma-Aldrich) a 2 µmol/L. As placas de cultura foram incubadas em estufa por 30 min antes da leitura da fluorescência (excitação/emissão: 492/518 nm). Para considerar a distribuição heterogênea das células, a fluorescência de cada poço foi medida em 25 pontos (uma matriz de varredura 5 x 5), sendo os valores resultantes integrados (somados) ao final. Alternativamente à calceína AM, o ensaio de redução do MTT ((brometo de 3-(4,5-dimetil-tiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio, Sigma-Aldrich) também foi utilizado para determinação da viabilidade celular. Após o período de tratamento, 20 µL de MTT (5 mg/mL) foram adicionados em cada poço. Após uma incubação de quatro horas, os cristais de

formazan produzidos foram dissolvidos pela adição de 100 microlitros de uma solução de 10% de dodecil sulfato de sódio contendo HCl a 10 mmol/L. Após incubação overnight, a absorbância foi medida a 570 nm. A utilização de calceína AM ou MTT está indicada em cada caso. Quando a sobrevivência foi expressa percentualmente, esta foi determinada em relação ao controle negativo.

Determinação do tempo de duplicação celular. Cinquenta mil células em 200 µL de R10 foram semeadas por poço, em triplicatas, em placas de cultura de 96 poços. Uma pequena alíquota (15 µL) da suspensão de células foi retirada diariamente para contagem das células vivas em microscópio (exclusão das células mortas por azul de trypan). O tempo de duplicação das linhagens foi determinada a partir das curvas de proliferação obtidas.

Extração metabólica para análise por ressonância magnética nuclear de prótons (1H-RMN). Durante a fase de crescimento exponencial, 2 x 108 células foram ressuspendidas em 200 mL de R10 e divididas igualmente em dois frascos de cultura celular. Após 12 h de aclimatação em estufa de cultura celular, MTX (25 nmol/L) ou veículo foi adicionado aos frascos e o tratamento se estendeu por 24 h. As células foram então lavadas com solução salina (PBS 1X) e armazenadas em -80 oC. Todas as linhagens, tratadas ou não, foram analisadas em triplicata. O extrato metabólico foi obtido por meio do protocolo de extração com metanol/clorofórmio, adaptado de La Belle (127). Resumidamente, as células foram sonicadas (Sonics Vibra Cell) em uma mistura gelada de metanol (1,66 mL) e clorofórmio (0,83 mL) por 3 min. A seguir, água Milli Q (1,25 mL) e clorofórmio (1,25 mL) gelados foram adicionados à mistura sonicada, seguido de uma rápida vortexação. Após centrifugação (3,4 x 103 g por 20 min a 4 ºC), 2,6 mL da fase sobrenadante (composta de água, metanol e metabólitos polares) foram coletados e liofilizados.

Aquisição dos espectros de 1H-RMN. Os extratos metabólicos liofilizados foram ressuspendidos em uma solução de 0,6 mL de água deuterada (D2O, 99,9%; Cambridge Isotope Laboratories Inc., Massachusetts, EUA) contendo tampão fosfato a 100 mmol/L (estoque a 1 mol/L feito com 0,28 mol/L de NaH2PO4 e 0,72 mol/L de Na2HPO4) e 0,5 mmol/L de TSP (ácido 3-(trimetil-silil)-2,2',3,3'-tetradeuteropropiônico ou TMSP-d4;

Cambridge Isotope Laboratories, MA), sendoinseridos em tubo de RMN de 5 mm para aquisição imediata. Os espectros foram adquiridos em um espectrômetro Varian Inova RMN (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, EUA) equipado com uma sonda de ressonância tripla e operando a uma frequência de ressonância de 1H a 500 MHz e temperatura constante de 25 °C. Foram realizados 256 scans, com intervalos entre scans (delays) de 1,5 seg, janela de leitura de 16 ppm e tempo de aquisição de 4 segundos. Correções na fase e na linha de base do espectro, bem como a identificação e quantificação metabólica foram realizadas utilizando o software Chenomx NMR Suite 7.1 (Chenomx Inc., Edmonton, Canadá).

Análise de expressão gênica das linhagens de LLA por microarranjo de DNA. Os dados de expressão gênica foram gentilmente cedidos por Dr. André B. Silveira. Detalhes sobre a obtenção destes dados podem ser consultados na seção experimental de seu trabalho (128). Resumidamente, 5 a 10 x 107 células permaneceram 6 h em meio de cultura, tiveram o RNA extraído pelo método do fenol-clorofórmio seguido de purificação com o RNAeasy Mini Kit (Qiagen, Inc., Valencia, CA, USA). Amostras foram processadas com o One-Cycle Target Labeling e Control Reagents Kit (Affymetrix, SantaClara, CA, USA) e hibridizados em arrays HG-U133 Plus 2.0 (Affymetrix).

Quantificação de espécies reativas de oxigênio. Células (50 mil células em 100 µL de R10, em triplicatas) foram semeadas em placas de cultura de 96 poços e tratadas ou não com MTX por 6, 12, 24 ou 48 h. Em cada tempo de coleta, as células foram lavadas em PBS 1X, ressuspendidas em 100 µL de tampão fosfato contendo o corante fluorescente 2’,7’-diclorofluoresceína (2DCF, Molecular Probes, Thermo Fisher Scientific Inc.) a 2 µmol/L, e incubadas por 30 min em estufa. Após nova lavagem em PBS 1X para retirada do excesso de corante, as células foram ressuspendidas em 300 µL de PBS 1X para aquisição imediata da florescência (excitação/emissão: 495/521 nm) por citometria de fluxo (BD FACS Canto II equipado com o software FACS Diva BD). Apenas as células vivas foram consideradas na análise. Uma vez que a unidade de medida da fluorescência é arbitrária, os resultados foram expressos em termos de média geométrica da intensidade de fluorescência.

Respiração celular. Quatro ou oito milhões de células (dependendo da linhagem celular) foram ressuspendidas em 2 mL de RPMI-1640 (sem suplementação) e inseridas na câmara do oxígrafo (Oxygraph-2k, OROBOROS, Innsbruck, Áustria) para estimação do consumo de oxigênio. A agitação (300 rpm) e temperatura (37 °C) foram mantidas constantes ao longo do experimento. Após 10 min para estabilização, oligomicina (2 μg/mL) ou FCCP (pulsos de 100 nmol/L até atingir o platô máximo) foram adicionados à suspensão das células. O consumo de oxigênio basal ou sob o efeito de oligomicina ou FCCP foi determinado pelo software OROBOROS DatLab e normalizado pelo número de células, conteúdo proteico ou atividade de citrato sintase.

Atividade da enzima citrato sintase. Este protocolo foi adaptado de trabalhos anteriores (129,130). Células (5 x 104 células/poço) foram semeadas em placas de cultura de 96 poços em 200 µL de tampão contendo Tris-HCl (10 mmol/L, pH 8,0), Triton X-100 (0,1%), EDTA (1 mmol/L), acetil-CoA (50 μmol/L) e ácido 5,5'-ditio-bis-(2-nitrobenzoico) (DTNB ou ―reagente de Ellman‖). A reação foi iniciada com a adição de oxalacetato (100 μmol/L) e alterações na absorbância, medida a 412 nm, foram monitoradas por 5 min a 30 °C em um leitor de placas (PowerWave XS 2, BioTek Instruments, Winooski, EUA). A atividade da enzima citrato sintase foi calculada usando-se o coeficiente de absorção do DTNB (ε412= 13,6 (mmol/L)-1cm-1) e expressa em termos de nmol/min/mg de proteína.

Transdução de linhagens de LLA com vetor repórter para NF-κB. Cento e quarenta microlitros de uma suspensão de células (a 2,15 x 105 células/mL R10) foram semeadas em placas de 96 poços. Dez microlitros de suspensão viral comercial (Cignal Lenti NFκB Reporter (luc) Kit, CLS-013L, Qiagen) foram adicionados em cada poço, acrescidos de polibreno (8 μL/mL), resultando em uma multiplicidade de infecção (MOI) de aproximadamente 11 partículas virais por célula. Controles de transdução, para os quais a suspensão viral comercial foi substituída por meio de cultura, também foram preparados. As células foram submetidas a uma spin infection de 60 min a 580 g e a 37 ºC, seguindo-se 24 h de incubação em estufa. A seguir, 120 μL (dos 150 μL em cada poço) foram substituídos por meio de cultura (R10) fresco, seguindo-se nova incubação por 48 h. Após expansão satisfatória das células, puromicina (1,5 μL/mL) foi adicionada ao meio de cultura para

seleção das células transduzidas. Não foi realizada a transdução com vetores lentivirais contendo o gene da luciferase sem região promotora específica.

Ensaio de luminescência com células transduzidas com vetor repórter para NF-κB. Oitenta microlitros de uma suspensão de células (1,875 x 106

células/mL R10) foram semeadas em placas de cultura de 96 poços. A seguir, 20 μL de R10, MTX (concentração final a 100 nmol/L) ou TNF-α (concentração final a 100 ng/mL) foram adicionados. Após incubação em estufa celular pelos tempos indicados, as placas foram centrifugadas por 15 min a 400 g e o sobrenadante foi descartado por inversão. Em cada poço foram adicionados 75 μL de tampão fosfato (PBS 1X) e 75 μL de solução de luciferina (Dual Glo Luciferase, Promega, Madison, EUA). Após 10 min de incubação em temperatura ambiente, a luminescência foi medida em leitor de placas Synergy H1 Hybrid Reader (Biotek Instruments, Winooski, EUA) com auxílio do software Gen5 (v. 2.03.1). A luminescência de cada poço foi medida em 25 pontos (uma matriz de varredura 5 x 5, com ganho de aquisição igual a 250), sendo os valores integrados (somados) ao final.

Análise estatística. Todos os gráficos (curvas dose-resposta e estimativas dos valores de IC50 e tempo de duplicação, histogramas, gráficos de correlação) foram feitos com auxílio do software Prism (v.5, GraphPad Software, La Jolla, EUA). A plataforma on-line MetaboAnalyst (131) foi usada na realização do teste de Wilcoxon (teste não-paramétrico para amostras pareadas) para a determinação dos metabólitos modulados pelo MTX. Para a aferição da existência de correlação entre concentração metabólica, expressão gênica, IC50 de drogas, etc., foi empregado o coeficiente de correlação de Spearman (para dados não-paramétricos) no software Prism. Valores de p ≤ 0,05 foram considerados significativos.

4. Resultados

Parte I: Fenótipo de resistência ao MTX, tempo de duplicação celular, efeito do MTX no metaboloma celular e papel da glutationa na resistência à droga

Resistência ao MTX e sua associação com a proliferação celular

As linhagens de LLA foram tratadas com doses crescentes de MTX por 48 ou 96 horas (Figura 3). A sobrevivência foi determinada em relação ao controle negativo. A

Tabela 1 traz os valores encontrados de IC50.

Figura 3. Curvas dose-resposta ao MTX das linhagens de LLA (A) T- e (B) B-derivadas. A

viabilidade celular obtida em cada concentração de MTX foi comparada à do controle negativo, que havia recebido apenas veículo (sobrevivência definida como 100%). Todos os tratamentos com MTX, incluindo os controles negativos, foram feitos em triplicata. Preto: 48 h de tratamento; verde: 96 h. Ensaio de redução do MTT (resultados semelhantes foram obtidos com calceína AM).

Tabela 1. Valores de IC50 do MTX para as linhagens de LLA.

Linhagem IC50 48 h (nmol/L) IC50 96 h (nmol/L) T-derivadas HPB-ALL 85,55* 38,42 Jurkat 10,88 35,95 Molt4 31,26 19,56 CCRF-CEM 33,75 12,80 TALL-1 14,24 12,45 P12-ICHIKAWA 13,75 11,77 ALL-SIL 69,55 5,52 B-derivadas Nalm16 91,78* 32,96 RS4;11 40,56 17,89 697 19,95 17,06 Nalm30 100,80* 14,15 Nalm6 18,37 11,61 REH 14,97 9,16

*estimativas matemáticas que devem ser tomadas com cautela, uma vez que não houve redução (< 50%) da sobrevivência mesmo nas doses mais altas testadas.

É sabido que o MTX causa parada do ciclo celular na fase S (44). É de se esperar, portanto, que células que proliferem mais rapidamente sejam mais sensíveis à ação do MTX do que aquelas com ciclagem mais lenta. As linhagens de LLA deste estudo foram deixadas proliferar livremente de modo a terem determinado o seu tempo de duplicação (Figura 4A). A seguir, verificamos a existência de correlação entre resistência ao MTX e tempo de duplicação. Uma forte correlação positiva foi encontrada entre os valores de IC50 do MTX em 48 h e o tempo de duplicação celular (Figura 4B); já em 96 h, esta correlação foi perdida. Estes resultados indicaram que o tempo de duplicação é um fator determinante do fenótipo de resistência das linhagens leucêmicas ao MTX em tempos curtos de tratamento. Por outro lado, a resistência das linhagens a tempos mais longos de tratamento deve estar associada a outros fatores biológicos que não a velocidade de ciclagem celular. Para excluirmos a possibilidade da resistência ao MTX ser devida a algum traço genético marcante das células leucêmicas, as características genéticas das linhagens foram levantadas (Apêndice

1 – Tabela S1). Nenhum dado genético específico pareceu correlacionar-se com a resistência

Figura 4. (A) Proliferação celular em meio de cultura para determinação do tempo de

duplicação das linhagens de LLA. (B) Correlação entre tempo de duplicação celular e resistência ao MTX (expressa em termos de IC50). A associação positiva em 48 h foi perdida em 96 h. r = coeficiente de correlação (Spearman); p = nível de significância da correlação.

Efeitos do MTX no metaboloma celular

Os dados metabolômicos foram extraídos de Canevarolo (109), de modo que mais informações podem ser encontradas no referido trabalho. Estes dados foram aqui recuperados devido a novas análises estatísticas realizadas: o estudo de 2012 visava encontrar diferenças metabólicas entre linhagens de LLA com diferentes fenótipos de resistência ao MTX, classificadas após 48 h de tratamento com a droga (comparação entre linhagens sensíveis versus resistentes); já o presente trabalho buscou caracterizar o efeito do MTX no metaboloma celular (comparação entre células tratadas versus não tratadas).

Resumidamente, 78 espectros de ressonância magnética nuclear de prótons (1 H-RMN) foram estudados, sendo identificados e quantificados 72 metabólitos. A Figura 5 traz um espectro representativo. Alguns sinais do espectro não foram identificados pela biblioteca de compostos do software Chenomx; a eles foi atribuída a sigla ―CB‖ (de compound builder,

A

nome da seção do software que permite o desenho ―customizado‖ de sinais para os quais não há correspondência com metabólitos) e enumerados sequencialmente (isto é, CB-1, CB-2, etc.). Os 12 sinais ―CB‖ – é possível que dois ou mais sinais ―CB‖ sejam a assinatura de um mesmo metabólito, por isso, aqui usaremos ―sinais‖ ao invés de ―compostos‖ para nos referirmos a eles – puderam ser quantificados de modo relativo entre os espectros e, desta forma, foram considerados na análise estatística.

Figura 5. (A) Espectro representativo de 1H-RMN. (B) e (C) são ampliações das respectivas regiões do espectro destacadas em (A). Extraído e traduzido de Canevarolo e cols. (109) com permissão dos autores.

Foi realizado um teste t não paramétrico pareado (teste de Wilcoxon, considerando o par tratado/ não tratado de uma mesma linhagem) para todos os metabólitos, objetivando encontrar os compostos que foram modulados pelo tratamento com MTX. Vinte e oito metabólitos (38,9% do total) e 3 (dentre 12) sinais ―CB‖ foram modulados pela droga (Tabela 2). Dos 28 compostos alterados, 13 tiveram suas concentrações aumentadas e 15 reduzidas pelo quimioterápico. Os metabólitos e sinais mais alterados pelo tratamento estão na Figura 6.

Apenas a título de curiosidade, as concentrações relativas de MTX, CB-MTX2 e CB-21 foram correlacionadas entre si (Apêndice 1 – Figura S1). A forte correlação entre CB-MTX2 e CB-21 sugere tratarem-se de dois sinais espectrais de um mesmo metabólito não identificado; já o CB-MTX parece ser um segundo metabólito independente dos demais. Ao contrário dos outros sinais ―CB‖ que foram encontrados indistintamente em todos os espectros, os sinais CB-MTX e CB-MTX2 receberam esta identificação por serem praticamente exclusivos dos espectros de amostras tratadas com a droga. Inicialmente, isto nos fez pensar tratar-se de alguma versão metabolizada da droga, ainda que experimentos sejam necessários para comprovar esta hipótese; entretanto, a ausência de correlação entre as concentrações relativas destes sinais com o IC50 do MTX parece contradizer esta hipótese (Figura S2). Além disso, segundo a opinião de espectroscopistas de RMN (personal communication), a região espectral na qual os sinais CB-MTX e CB-MTX2 foram encontrados não parece condizente com a assinatura espectral do MTX ou de seus metabólitos diretos: DAMPA (ácido 2,4-diamino-N10-metilpteroico, uma versão inativa de MTX hidrolisado pela enzima carboxipeptidase G2 (132)) e 7-hidroximetotrexato (7-OH MTX, (133,134)).