Prevalência do papilomavírus humano (HPV) em lesões malignas da cavidade oral e sua associação com fatores de risco para o câncer oral

Texto

(1)UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA MESTRADO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE. BRUNO EDUARDO SILVA DE ARAUJO. PREVALÊNCIA DO PAPILOMAVÍRUS HUMANO (HPV) EM LESÕES MALIGNAS DA CAVIDADE ORAL E SUA ASSOCIAÇÃO COM FATORES DE RISCO PARA O CÂNCER. ARACAJU 2013.

(2) BRUNO EDUARDO SILVA DE ARAUJO. PREVALÊNCIA DO PAPILOMAVÍRUS HUMANO (HPV) EM LESÕES MALIGNAS DA CAVIDADE ORAL E SUA ASSOCIAÇÃO COM FATORES DE RISCO PARA O CÂNCER ORAL. 2013.

(3) BRUNO EDUARDO SILVA DE ARAUJO. PREVALÊNCIA DO PAPILOMAVÍRUS HUMANO (HPV) EM LESÕES MALIGNAS DA CAVIDADE ORAL E SUA ASSOCIAÇÃO COM FATORES DE RISCO PARA O CÂNCER ORAL Dissertação apresentada ao Núcleo de PósGraduação em Medicina da Universidade Federal de Sergipe como requisito parcial à obtenção do grau de Mestre em Ciências da Saúde.. Orientador: Prof. Dr. Alexandre Sherlley Casimiro Onofre. ARACAJU 2013.

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(5) FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA BIBLIOTECA DA SAÚDE UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE. Araújo, Bruno Eduardo Silva de A663p. Prevalência do papilomavírus humano (HPV) em lesões malignas da cavidade oral e sua associação com fatores de risco para o câncer oral / Bruno Eduardo Silva de Araújo. -Aracaju, 2013. 000 f. : il.. Orientador (a): Prof. Dr. Alexsandre Sherlley Casimiro Onofre.. Dissertação (Mestrado em Ciências da Saúde) Universidade Federal de Sergipe, Pró-Reitoria de PósGraduação e Pesquisa, Núcleo de Pós-Graduação em Medicina.. 1. Papilomavírus. 2. Boca - Câncer. 3. Diagnóstico oral 4. Estomatologia. 5. Odontologia I. Título.. CDU 616.31-006.6.

(6) BRUNO EDUARDO SILVA DE ARAUJO. PREVALÊNCIA DO PAPILOMAVÍRUS HUMANO (HPV) EM LESÕES MALIGNAS DA CAVIDADE ORAL E SUA ASSOCIAÇÃO COM FATORES DE RISCO PARA O CÂNCER Dissertação apresentada ao Núcleo de PósGraduação em Medicina da Universidade Federal de Sergipe como requisito parcial à obtenção do grau de Mestre em Ciências da Saúde. Aprovada em: _____/_____/_____. _________________________________________ Orientador: Prof. Dr. Alexandre Sherlley Casimiro Onofre. _________________________________________ 1º Examinador: Prof. Dr. Carlos Eduardo Queiroz Lima,. _________________________________________ 2º Examinador: Prof. Dr. Luiz Carlos Ferreira da Silva. PARECER ________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ _____________________________________________________________________.

(7) DEDICATÓRIA. Dedico este trabalho a meus pais, Maria de Fátima e Carlos Alberto, e a minha esposa, Isabela Karoline, por serem meu porto seguro e minha inspiração..

(8) AGRADECIMENTOS A Deus por iluminar meu caminho nos momentos em que faltou esperança e por tornar esta etapa da minha vida numa grande oportunidade de crescimento profissional e pessoal. À minha família que me apoiou em todos os momentos, em especial a meus pais por serem a base de tudo que eu sou e a minha esposa por enfrentar todas as ocasiões de dificuldade ao meu lado com muita dedicação e carinho. Ao meu orientador, prof, Dr. Alexandre Sherlley, pela confiança, incentivo, ensinamentos transmitidos e por ser um amigo acima de tudo. Foi uma honra ser orientado por um profissional de tamanha grandeza. À prof. Maria Luiza Bazzo, por abrir as portas do LBBM me proporcionando uma oportunidade de aprendizado ímpar, além de permitir que nosso projeto fosse concluído. Respeito-a imensamente como profissional e pessoa de espírito elevado. À prof. Elena Riet Rivero, por fornecer as amostras para o estudo e sempre estar disposta a nos ajudar com dicas que acabaram por ser essenciais para o sucesso do mesmo. A todos que me ajudaram com os experimentos no LBBM. Ao Toni Ricardo Martins e Marcos André Schörner, por despenderem um tempo precioso me ensinando as técnicas e me fornecendo subsídios teóricos. A Lisléia Golfetto e Eduardo Venâncio Alves, por toda ajuda e comprometimento mesmo com tantos afazeres. O altruísmo que vocês demonstraram me fez nutrir uma profunda admiração e uma amizade. A todos os amigos do HU, Chris Nogueira, Simone Senna, Renata Rudolf, Ana Carolina, Ana Paula, Felipe De Rocco, Rodrigo Prim, Letícia Muraro, Manoela Reis, além dos já citados, por todos os momentos de descontração que me suavizaram o fato de estar longe de minha família. Aos professores que formaram a banca de qualificação, Dr. Luiz Carlos Ferreira da Silva, Dr. Alexandre Luna e Silvio Dolabella, por todas correções e sugestões durante a e após a qualificação..

(9) RESUMO O câncer oral é um dos tipos de câncer mais comuns na população mundial e, no Brasil, estima-se para os anos de 2012 e 2013 uma taxa de 9.990 novos casos. Os principais fatores de risco para o câncer da cavidade oral são o tabagismo, o etilismo e as infecções pelo Papilomavírus Humano (HPV). Devido ao impacto da infecção pelo HPV na população sexualmente ativa, além de um importante fator de risco para o desenvolvimento de câncer na cavidade oral, a análise da presença do vírus nos pacientes com lesões suspeitas (neoplasias orais) se mostra importante para o entendimento da infecção e a inovação do diagnóstico. Este estudo salienta a importância de se incluir no diagnóstico oral do paciente a análise da infecção pelo HPV, já que este influencia o prognóstico e o tratamento da doença, além de contribuir com outras pesquisas que tenham o objetivo de determinar a incidência do HPV na mucosa oral. Foram utilizadas amostras parafinizadas de biópsias orais extraídas de 25 pacientes atendidos no Ambulatório de Estomatologia do Hospital Universitário da UFSC no período de 2006 a 2011. O estudo foi do tipo retrospectivo, transversal, descritivo, com análise qualitativa de material coletado. Após a extração do DNA pelo método Salting-out, as amostras foram analisadas pela técnica da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) para verificar da presença do vírus. A associação entre a idade dos pacientes e a presença do HPV foi analisada através do teste T de Student para amostras independentes. As variáveis como tabagismo, etilismo e sexo foram analisadas usando o teste exato de Fisher. A associação entre o HPV e o câncer oral foi analisada através do teste de Qui-quadrado. Foi demonstrado que 40% das amostras analisadas estavam infectadas com HPV. A análise de fatores ligados a infecção pelo HPV nas lesões neoplásicas demonstrou que os pacientes infectados pelo HPV são significtivamente mais velhos que os pacientes que não apresentaram infecção. As outras variáveis não demonstraram diferença significativa. Descritores: HPV; Câncer Oral; PCR..

(10) ABSTRACT Oral cancer is one of the most common cancers worldwide, in Brazil is estimated for the years 2012 and 2013 the rate of 9,990 new cases. The main risk factors for oral cancer are smoking, alcohol consumption and infection by human papillomavirus (HPV). Due to the impact of HPV infection in sexually active population, and the fact that the infection is an important risk factor for development of oral cancer, the analysis of the presence of the virus in patients with suspicious lesions (oral cancer) proves to be important for understanding infection and innovation diagnosis. This study will emphasize the importance of including in patient diagnosis the analysis of HPV infection, as this would influence prognosis and treatment of disease. Furthermore, this work may contribute to other studies which aim to determine the incidence of HPV in the oral mucosa. The present study aimed to analyze the possible relationship of the virus in the development of malignant oral lesions. The samples of oral biopsy were taken from 25 patients treated at the Clinic of Stomatology of the University Hospital of UFSC in the period from 2006 to 2011. The study was the type retrospective, crosssectional descriptive with qualitative analysis of material extraction colected. After the extraction by salting-out method, the samples were analyzed by PCR. PCO3/PCO4 primer were used for beta globin gene, MY09/MY11 for HPV detection and GP5 + / GP6 + for nested PCR. The association between patient age and the presence of HPV was analyzed using the Student t test for independent samples. Variables such as smoking, drinking and sex were analyzed using the Fisher exact test. The association between HPV and oral cancer was analyzed using the chi-square test. About 40% of the samples were infected with HPV. The analysis of factors related to HPV infection in neoplastic lesions showed that patients infected with HPV are significantly older than patients without infection. The other variables showed no significant difference. Key-words: HPV; Oral Cancer; PCR.

(11) LISTA DE FIGURAS E TABELAS. Figura 1: Representação da partícula viral do HPV......................................... Pág. 17. Figura 2: Representação esquemática do genoma do HPV.............................. Pág. 18. Figura 3: Fluxograma da patogênese do Câncer de Células Escamosas através do HPV de alto risco............................................................................................. Pág. 22 Figura 4: Distribuição percentual dos casos de câncer de boca em relação a localizações anatômicas das lesões............................................................. Pág. 34 Figura 5: Revelação dos géis com DNA das amostras, após a eletroforese em gel de agarose.............................................................................................................. Pág. 35. Tabela 1: Primers utilizados ............................................................................. Pág. 31 Tabela 2: Distribuição das lesões pela localização nos casos de HPV positivo e negativo............................................................................................................... Pág. 36 Tabela 3: Distribuição, médias e desvios padrões das variáveis independentes de acordo com a infecção pelo HPV no grupo de pacientes com neoplasia oral.... Pág. 36.

(12) LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS DNA. “Deoxyribonucleic Acid” traduzido como ácido desoxirribonucléico.. E6. Refere-se ao gene ou a proteína E6 do Papilomavírus Humano.. E7. Refere-se ao gene ou proteína E7 do Papilomavírus Humano.. G1. Intervalo pós-mitótico e pré-síntese de DNA.. HPV. “Human Papillomavirus”, traduzido como Papilomavírus Humano.. LCR. “Long Control Region”, traduzido como região de controle longo.. ORF. “Open Reading Frames”, traduzido como sequência de leitura aberta.. PCR. “Polymerase Chain Reaction”, traduzido como reação em cadeia da polimerase.. p53. Refere-se à proteína p53 ou ao gene p53.. pRb. Proteína do retinoblastoma.. RNA. “Ribonucleic Acid”, traduzido como ácido ribonucléico.. RNAm. “Messenger Ribonucleic Acid”, traduzido como ácido ribonucléico mensageiro..

(13) SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO .......................................................................................................... 15 2. REVISÃO DE LITERATURA .................................................................................. 16 2.1. PAPILOMA VÍRUS HUMANO ............................................................................. 16 2.1.1. Histórico ........................................................................................................................ 16 2.1.2. Morfologia, estrutura e composição da partícula viral .................................................. 17 2.1.3. Filogenética ................................................................................................................... 19 2.1.4. Mecanismos de Carcinogênese do HPV ....................................................................... 20 2.1.5. HPV e o Câncer Oral ..................................................................................................... 22. 2.2. CÂNCER ORAL ..................................................................................................... 23 2.2.1. Epidemiologia do câncer oral ........................................................................................ 23 2.2.2. Indicadores de prognóstico............................................................................................ 25 2.2.3. Diagnóstico ................................................................................................................... 26 2.2.4. Fatores de Risco ............................................................................................................ 27. 3. JUSTIFICATIVA ....................................................................................................... 28 4. OBJETIVOS ............................................................................................................... 29 4.1. OBJETIVO GERAL ................................................................................................ 29 4.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS .................................................................................. 29 5. METODOLOGIA....................................................................................................... 30 5.1. DELINEAMENTO DO ESTUDO .......................................................................... 30 5.2. AMOSTRAS ........................................................................................................... 30 5.3. EXTRAÇÃO DO DNA ........................................................................................... 30 5.4. ANÁLISE DAS AMOSTRAS ................................................................................ 31 5.4.1. PCR para o gene da beta globina humana ..................................................................... 32 5.4.2. PCR com oligonucleotídeos My09/My11 ..................................................................... 32 5.4.3. Nested PCR ................................................................................................................... 32. 5.5. ANÁLISE ESTATÍSTICA ...................................................................................... 33 6. RESULTADOS .......................................................................................................... 34 6.1. CARACTERIZAÇÃO DAS AMOSTRAS ............................................................. 34 6.2. ANÁLISE DA ASSOCIAÇÃO ENTRE VARIÁVEIS INDEPENDENTES, INFECÇÃO PELO HPV E CÂNCER ORAL................................................................ 36 7. DISCUSSÃO .............................................................................................................. 37.

(14) 8. CONCLUSÕES .......................................................................................................... 42 REFERÊNCIAS ............................................................................................................. 43.

(15) 1. INTRODUÇÃO O câncer oral é um dos tipos de câncer mais comuns na população mundial e sua incidência vem crescendo nos últimos anos. A estimativa de incidência anual é de cerca de 275.000 casos (FERLAY et al., 2004). Estima-se que, nos anos de 2012 e 2013, ocorram aproximadamente 9.990 novos casos no Brasil (INCA, 2012). Historicamente, o câncer oral acomete principalmente adultos acima dos 40 anos com histórico de tabagismo e/ou etilismo. Porém, nos últimos anos, os estudos epidemiológicos demonstraram um aumento da incidência em adultos jovens, paralelamente aos relatos da presença do papiloma vírus humano (HPV) em lesões cancerígenas. Assim, além dos fatores de risco já conhecidos, a infecção pelo HPV surge como um fator importante no desenvolvimento da neoplasia oral. O HPV é o vírus transmissível mais comum no mundo e frequente na população sexualmente ativa, apresentando elevada prevalência em ambos os sexos (NADAL; MANZIONE, 2006; WOODMAN et al., 2007). Os tipos 6, 11, 16 e 18 são os mais prevalentes na mucosa oral ou cervical, sendo o tipo 16 o mais frequente na mucosa oral. Porém, apesar do HPV ser amplamente aceito com um fator de risco para o câncer oral, é desconhecida a real dimensão de sua influência no desenvolvimento dessa patologia. A falta de informações sobre o mecanismo molecular responsável pelo desenvolvimento da neoplasia e as diferentes metodologias utilizadas nos trabalhos epidemiológicos ainda geram dúvidas sobre a real importância do vírus no câncer oral. A técnica de reação em cadeia de polimerase (PCR) é uma das mais utilizadas para o diagnóstico do HPV, em função de sua alta sensibilidade e especificidade. A técnica consiste em utilizar iniciadores ou primers que se ligam a sequências específicas do DNA viral com o intuito de amplifica-las. Devido ao impacto da infecção pelo HPV na população sexualmente ativa, além de ser um importante fator de risco para o desenvolvimento de cancêr na cavidade oral, a análise da presença do vírus em pacientes com câncer oral se mostra importante para o entendimento da infecção e a inovação do diagnóstico..

(16) 2. REVISÃO DE LITERATURA 2.1. PAPILOMA VÍRUS HUMANO 2.1.1. Histórico Os relatos mais antigos de verrugas genitais partiram dos gregos e romanos que se referiam a elas como “figueiras” ou “condilomas” que significava algo como “tumor redondo” (BAFVERSTEDT, 1967). A partir da epidemia de sífilis na Europa no final do século XV, as verrugas genitais despertaram o interesse da comunidade científica, atribuindo-se o aparecimento das mesmas ao “veneno venéreo” transmitido pela sífilis (ALMEIDA FILHO, 1999). No decorrer dos anos, as verrugas genitais foram atribuídas a fatores como a gonorreia, irritação cutânea de origem inespecífica e corrimento vaginal (CRONQUIST, 1912; ORIEL, 1971). O primeiro relato de isolamento do HPV ocorreu em 1933 em papilomas de coelhos, onde se observou que alguns desses papilomas progrediam para lesões malignas (SHOPE, 1933). No início do século XX foi comprovada a natureza viral das verrugas genitais, suspeitando-se que sua origem e desenvolvimento eram independentes de outras doenças (CIUFFO, 1907). A transmissão sexual foi descrita em 1954, quando foi observada pela primeira vez a presença de verrugas genitais em esposas de soldados que voltavam da guerra da Coréia, onde haviam mantido relações com mulheres nativas, nas quais era alta a prevalência de condilomatose genital (BARRETT; SILBAR; MCGINLEY, 1954).. O advento da biologia molecular através da técnica de hibridização em 1974 possibilitou grande avanço na identificação do vírus, permitindo que em 1976 a comunidade científica admitisse pela primeira vez a hipótese do envolvimento do HPV na etiologia do câncer genital (zur HAUSEN et al., 1974; zur HAUSEN, 1976). A partir do final da década de 1970, foram identificados diversos tipos de HPV em várias lesões de pele e de mucosas – verrugas, displasias epiteliais e carcinomas de cérvice uterina e de pênis, o que reforçou a sua importância médica (DOORBAR; STERLING, 2001).. 16.

(17) No início dos anos 1980, os tipos de HPV 16 e 18 foram identificados e sua relação com o câncer cervical foi estabelecida, sendo em 1987 publicado o primeiro estudo epidemiológico sobre HPV e câncer cervical (DE VILLIERS et al., 1987).. 2.1.2. Morfologia, estrutura e composição da partícula viral Os HPV são vírus não envelopados, arredondados, com diâmetro em torno de 55 nm (DOORBAR; STERLING, 2001). A partícula viral, ou vírion consiste de uma capa protéica, o capsídeo, que envolve o genoma viral (Figura1). Seu capsídeo, com aproximadamente 2 nm de espessura, é composto por 72 unidades morfológicas, os capsômeros, dispostos segundo uma simetria icosaédrica (T=7). Os capsômeros, localizados em cada um dos 12 vértices, são pentavalentes, isto é, circundados por cinco capsômeros adjacentes, e os outros 60 capsômeros são hexavalentes (BAKER et al, 1991). Os 72 capsômeros são pentâmeros da proteína estrutural principal, L1, de 54 kDa (LETO et al, 2011).. Figura 1: Representação da partícula viral do HPV (RODEN; MONIE; WU, 2009). O genoma viral (Figura 2) é formado por duas fitas circulares de DNA, com cerca de 8.000 pares de bases (pb), ligadas covalentemente e associadas a histonas de origem celular. Está dividido em três regiões, de acordo com a sua localização e propriedades funcionais: as regiões E (early) e L (late), denominadas ORFs (open read frames), e uma terceira região, LCR (long control region) ou NCR (non-coding region) ou URR (upstream regulatory region), que contém elementos reguladores da origem da replicação e da expressão de genes reguladores da transcrição viral (BOOY et al, 1998; 17.

(18) LETO et al, 2011). Na região E encontram-se até oito genes (E1 a E8), que são responsáveis pela replicação do HPV (E1 e E2), transcrição do DNA (E2), maturação e liberação das partículas virais (E4), transformação celular (E5, E6, E7) e imortalização (E6 e E7). Estes dois últimos genes também codificam proteínas associadas à malignização de lesões (SYRJANEN; SYRJANEN, 1999).. Figura 2: Representação esquemática do genoma do HPV (DOORBAR, 2006).. Os genes da região L (L1 e L2) codificam, respectivamente, as proteínas principal e secundária do capsídeo (HAZARD et al., 2007). A região tardia L1 ORF é a mais conservada entre os HPVs. O seu produto, proteína L1, representa 80% das proteínas do capsídeo viral, constituindo a proteína mais abundante e de alta imunogenicidade. A proteína L2, como a L1, contribui para a incorporação do DNA viral dentro do vírion. A região LCR encontra-se entre L1 e E6 e possui entre 500 e 1.000 pares de bases. Em geral, não é bem conservada entre os HPVs e está envolvida com a expressão gênica e com a replicação viral que ocorre no núcleo da célula do hospedeiro (LETO et al, 2011). 18.

(19) 2.1.3. Filogenética Através dos estudos filogenéticos mais de 100 tipos de HPV foram identificados a partir da análise do DNA do vírus associada à regiões epiteliais específicas (BERNARD, 2005; DE VILLERS et al., 2004; DE VILLIERS, 2001). Os tipos de HPV responsáveis pela hiper proliferação epitelial benigna são considerados de baixo risco enquanto os tipos associados à lesões pré-malignas e carcinomas invasivos de células escamosas são considerados de alto risco (CLIFFORD, 2003; ZUR HAUSEN et al, 2002). Os gêneros Alfa e Beta papilomavírus são os mais importantes, com aproximadamente 90% dos tipos de HPV já identificados. O gênero Beta compreende os vírus associados a infecções cutâneas em indivíduos imunocomprometidos e entre os que sofrem da doença hereditária epidermodisplasia verruciforme (EV), podendo se proliferar sem controle e originar o câncer de pele do tipo não melanoma (DOORBAR, 2006). O gênero Alfa compreende o maior número de tipos de HPV, que infectam a mucosa e a genitália, incluindo os vírus cutâneos como o HPV2, que causa verrugas comuns, raramente relacionadas com câncer (DE VILLERS et al., 2004). Os demais tipos de HPV pertencem aos gêneros Gamma, Mu e Nu, geralmente associados aos papilomas cutâneos e às verrugas benignas (PERSSON; ANDERSSON; KRANTZ, 1996; SHAMANIN et al, 1994). Diferentemente de outros grupos virais, os HPVs não estão associados a sorotipos, sendo sua classificação baseada em tipos distintos na espécie de origem e no grau de relação dos genomas virais mediante a sua comparação (HAZARD et al., 2007). Apesar dos mais de 100 tipos de HPV, o genoma de muitos tipos ainda não foi identificado pelos métodos convencionais (HAZARD et al., 2007). Os diferentes gêneros de HPV compartilham menos de 60% de similaridade na sequência de nucleotídeos do capsídeo principal da proteína L1 ORF. Entre as espécies virais de um mesmo gênero 60% a 70% apresentam similaridade. Considera-se um novo tipo de HPV quando o seu genoma apresenta variações maiores que 10% nos genes L1, E6 e E7 ou quando comparados com outro tipo de HPV previamente conhecido. As diferenças genômicas entre 2% e 10% representam novos subtipos e variações menores que 2% constituem variantes de tipos (DE VILLERS et al., 2004).. 19.

(20) Na cavidade oral, 24 genótipos de HPV (HPV-1, 2, 3, 4, 6, 7, 10, 11, 13, 16, 18, 30, 31, 32, 33, 35, 45, 52, 55, 57, 59, 69, 72 e 73) já foram identificados entre as lesões benignas e 13 genótipos de HPV (HPV-2, 3, 6, 11, 13, 16, 18, 31, 33, 35, 52, 57 e 58 ) entre as lesões malignas (KOJIMA et al, 2003; SYRJÄNEN, 2003).. 2.1.4. Mecanismos de Carcinogênese do HPV Quando as proteínas E6/E7 são expressas em células infectadas pelo HPV de baixo risco pode haver a formação de tumores benignos. No entanto, quando as proteínas E6/E7 são expressas na infecção por HPV de alto risco, elas assumem o papel de oncoproteínas e têm a capacidade de induzir displasia e lesões malignas epiteliais (JASTREBOFF; CYMET, 2002; VON KNEBEL, 2002). As oncoproteínas E6 e E7 podem inativar o mecanismo genético que controla a apoptose e o ciclo celular (JASTREBOFF; CYMET, 2002; VON KNEBEL, 2002). O sinal da atividade oncogênica da proteína E6 de HPV de alto risco é a degradação do gene supressor de tumor p53. As funções da p53 no ciclo celular incluem o controle da transição da fase G1 para fase S do ciclo celular no checkpoint de G1, por induzir a expressão de inibidores de ciclinas como p16, p21e p27 que bloqueiam a atividade dos complexos ciclina-CDKs, impedindo o ciclo celular por bloquear a progressão na transição G1/S (MILLER, 2005). A oncoproteína E6 de HPVs de alto risco pode também mediar a proliferação celular através do domínio PDZ (DOORBAR, 2005). Os domínios PDZ são encontrados em áreas de contato entre células, como as junções das células epiteliais, e estão associados a vias de transdução de sinais. A ligação da oncoproteína E6 de HPVs de alto risco a proteínas das famílias PDZ pode resultar em degradação do domínio PDZ levando a desregulação da organização, diferenciação e integridade cromossomal de células infectadas com o vírus (OLIVEIRA et al., 2007; LONGWORTH & LAMINIS, 2004). A oncoproteína E7 dos HPVs de alto risco tem a capacidade de iniciar a síntese do DNA em células epiteliais diferenciadas principalmente por se ligar e inativar o gene supressor de tumor Rb. A família das proteínas Rb tem um papel essencial no controle do ciclo celular por comandar o checkpoint entre as fases G1 e S. O gene Rb hiperfosforilado se liga ao fator de transcrição formando um complexo Rb-E2F, 20.

(21) tornando o E2F indisponível para a transcrição de genes associados com a síntese de DNA. Em consequência da fosforilação do gene Rb pelo complexo ciclina-CDK, E2F é liberada do complexo repressor E2F-Rb, e isto induz a transcrição dos genes da fase S (DOORBAR, 2005; JAMESON, 1998; LONGWORTH; LAMINIS 2004; NGUYEN et al., 1998; VON KNEBEL, 2002). A E7 pode interagir também com outros fatores celulares que controlam o ciclo celular, como as histonas desacetilases, o complexo de transcrição AP-1 e inibidores de CDK, p21 e p27 (DOORBAR, 2005). Além disso, E7 de HPV tipos 16 e 18 pode diminuir a expressão de moléculas do complexo de histocompatibilidade MHC-1, interferindo na apresentação de antígenos e resultando na subexpressão da resposta imunológica, permitindo assim ao HPV persistir na infecção celular (MILLER, 2005). As oncoproteinas E7 de HPVs de alto risco podem ainda induzir a erros de duplicação nos cromossomos levando ao desequilíbrio da regulação da formação e função do fuso mitótico, contribuindo com a instabilidade genômica da célula (DUENSING; MÜNGER, 2004). Os efeitos patológicos das oncoproteínas E6 e E7 no ciclo celular interferem na transformação celular epitelial associada ao HPV, e promove a instabilidade genômica celular que predispões as células infectadas à completa transformação maligna. E7 ativa a síntese de DNA e os mecanismos de replicação celular que estão normalmente inativos nas células epiteliais maduras, iniciando assim o crescimento celular patológico. Por induzir a sobrevivência celular e atrasar a apoptose das células com DNA danificado, E6 permite a E7 exercer e sustentar este efeito patológico (VON KNEBEL, 2002). As oncoproteínas do HPV podem atuar sinergicamente com proto-oncogenes intranucleares, com citoquinas que se ligam e ativam o promotor de E6/E7, com fatores exógenos, incluindo substâncias cancerígenas no tabaco e agentes dietéticos, esteróides, raios UV e radiação X, para promover a tumorogenese mediada pelo HPV (BONNEZ, 2002) (Figura 3).. 21.

(22) Figura 3: Fluxograma da patogênese do Câncer de Células Escamosas através do HPV de alto risco (FELLER et al., 2010).. 2.1.5. HPV e o Câncer Oral O primeiro relato sugestivo de etiologia viral em carcinoma de células escamosas oral ocorreu em 1983. O estudo revelou, através da microscopia de luz, alterações sugestivas de infecção por HPV em 16 de 40 amostras analisadas. Sugeriu-se, a partir deste estudo preliminar, que cerca de 20% dos carcinomas orais podem estar associados com HPV (SYRJANEN et al., 1983). O DNA do HPV foi detectado pela primeira vez em carcinoma epidermóide oral em 1985 (COX et al., 1991).A infecção pelo HPV e o câncer de células escamosas da orofaringe esta associada com a prática de sexo orogenital e com o comportamento sexual de alto risco, como ter relações sexuais com muitos parceiros, principalmente quando se começa essa prática muito jovem 22.

(23) (CAMERON & HAGENSEE, 2008; D’SOUZA et al, 2007; MORK et al, 2001; GILLISON; LOWY, 2004; KREIMER et al, 2004; SYRJANE, 2007). Em um estudo destinado principalmente a infecção vulvogenital pelo HPV, o tabagismo e aumento da idade foram considerados fatores de risco associados ao aumento da frequência de infecções persistentes por HPV oral em mulheres. Isto provavelmente acontece porque o tabaco media a desregulação genética e imunológica, tornando os tecidos mais suscetíveis à infecção pelo HPV (D’SOUZA et al, 2007). O HPV está fortemente associado ao desenvolvimento de câncer de orofaringe e alguns cânceres da cavidade oral (HENNESSEY et al, 2009). Apesar desse tipode infecção oral pelo HPV ser adquirida preferencialmente no ato sexual, o contato dos lábios entre parceiros e entre membros da família, autoinoculação e transmissão no nascimento também são vias pelas quais a infecção oral pelo HPV pode ser estabelecida (FAKHRY; GILLISON, 2006; MORK et al., 2001; KREIMER et al., 2004). As infecções subclínicas causadas pelo HPV não são incomuns. É possível que o epitélio possa servir como reservatório para o vírus que, quando ativado, pode exercer um papel no câncer de células escamosas oral (FELLER et al, 2010). O câncer de boca e faringe foi investigado em 93 pacientes dos EUA, onde se observou que ambos os tipos de HPV (oncogênicos e não oncogênicos) foram encontrados em uma taxa mais elevada em pessoas diagnosticadas com câncer de cavidade oral ou faringe (SMITH et al., 1998).. 2.2. CÂNCER ORAL 2.2.1. Epidemiologia do câncer oral O câncer da cavidade oral compreende cerca de 30% dos tumores malignos de cabeça e pescoço. Aproximadamente 90% dos casos são carcinomas de células escamosas (COOPER et al., 2009), enquanto os 10% restantes representam neoplasias malignas raras (formas incomuns de carcinoma de células escamosas, tumores de glândulas salivares menores, melanomas, linfomas, sarcomas) e uma variedade de tumores malignos de origem odontogênica (DE CAMARGO et al., 2010). O câncer oral é um problema grave e crescente em muitas partes do mundo, sendo o sexto tipo de câncer mais comum no mundo. A estimativa de incidência anual é 23.

(24) de cerca de 275.000 casos, sendo que dois terços desses casos ocorrem em países em desenvolvimento (FERLAY et al., 2004). Na União Européia, o câncer de boca ocupa a sétima posição em incidência (BOYLE; FERLAY, 2005). Dentro dos países da UE as maiores taxas de incidência no sexo masculino são encontradas na França e na Hungria, e as taxas mais baixas na Grécia e no Chipre (BLACK et al, 1997). O risco de desenvolvimento de câncer oral em europeus está estimado em 1,85% para os homens e 0,37% para as mulheres. As taxas de incidência são maiores na Europa Ocidental em comparação com o Norte ou Sul da Europa. Maiores taxas de mortalidade, no entanto, são relatados da Europa Oriental (WARNAKULASURIYA, 2009). Na última década a França apresentou cerca de 15.500 casos de câncer de lábio e cavidade oral notificados anualmente. Isso equivale a 5,5% da incidência de câncer no país. As taxas de incidência relatadas na França foram 32,2 (homens) e 4,7 (mulheres) por 100.000 (padronizado para populações europeias) (REMONTET et al., 2003). A incidência de câncer de boca no sexo masculino é extremamente elevada no norte da França, com uma taxa de quase 42,3 por 100.000 habitantes entre os homens, no Somme e nas regiões do Baixo Reno (WARNAKULASURIYA, 2009). Países como Espanha, Portugal, Alemanha, Suíça e regiões do norte da Itália relataram taxas intermediárias de incidência em comparação com outros países da Europa (WARNAKULASURIYA, 2009). Aproximadamente 34.360 casos de câncer bucal são relatados anualmente nos EUA. As taxas de incidência são de 15,6 por 100.000 homens e 6,1 por 100.000 mulheres (10,5 para homens e mulheres). As taxas mais elevadas são observadas entre os homens negros (HOMER, et al., 2008). Na América do Sul e no Caribe, os cânceres de boca ocupam o quinto posto entre os homens e o sexto entre as mulheres. A população masculina do Brasil apresenta o maior risco do mundo para desenvolver o câncer de boca, seguido pela França e Índia (WUNSCH-FIHO; CAMARGO, 2001). No Caribe, a cidade de Porto Rico tem a maior incidência de câncer oral (>15 por 100.000 habitantes) e Cuba possui uma incidência intermediária (WUNSCH-FIHO; CAMARGO, 2001; GARROTE et al., 2001).. 24.

(25) Os dados observados na África são limitados a poucos hospitais que fazem algum tipo de registro, sendo difícil analisar a verdadeira incidência nesse continente, mas as taxas relatadas não demonstram evidências de que o câncer bucal seja um problema sério no continente africano. Há estudos no Sudão que sugerem que as taxas de câncer oral em homens são altas, ligando a alta incidência ao toombak, um produto resultado de uma mistura de tabaco com bicarbonato de sódio (IDRIS et al, 1995). Alguns dos países com as maiores taxas de incidência de câncer bucal no mundo estão localizados na região do sul da Ásia. A Índia sempre foi citada como o país com maior incidência no mundo, embora em alguns relatórios recentes Sri Lanka e Paquistão estejam no topo do ranking. Só na Índia mais de 100.000 casos são registrados a cada ano (WARNAKULASURIYA, 2009). O câncer oral é incomum no Japão. A taxa de incidência em 2001 foi de 5,3 por 100.000 habitantes (MARUGAME et al, 2007). Na maioria dos países, o câncer oral é mais comum em homens do que em mulheres. As diferenças sexuais relatadas são atribuídas aos hábitos de risco dos homens e exposição à luz solar (para o câncer de lábio). A proporção de homens para mulheres diagnosticadas com câncer oral, no entanto, diminuiu ao longo das décadas, sendo atualmente 1,5:1 (WARNAKULASURIYA, 2009). O risco de desenvolver câncer oral aumenta com a idade e, na maioria dos casos, é maior em pessoas com 50 anos ou mais. De 2000 a 2004, a idade média do diagnóstico nos EUA foi de 62 anos (National Institute of Cancer, 2008).Para a maioria dos países, as taxas ajustadas de mortalidade de câncer bucal foram estimadas em 3-4 por 100.000 homens e 1,5-2,0 por 100.000 para as mulheres. A mortalidade por câncer bucal aumentou sensivelmente na maioria dos países europeus, entre as décadas 1950 e 1980 (LA VECCHIA et al., 2010). 2.2.2. Indicadores de prognóstico Há um número de fatores prognósticos que determinam a sobrevida dos pacientes e afetam as decisões de tratamento. Os fatores mais comuns de prognóstico são o tamanho do tumor (estágio T), envolvimento da regional nodal (fase N) e a presença ou ausência de metástases à distância (fase M). Esta classificação TNM é usada ainda hoje, com várias modificações. O prognóstico de um paciente sofrendo de 25.

(26) câncer da cavidade oral está também relacionado com as comorbidades, como estado nutricional e imunidade (GENDEN et al., 2010). A presença de invasão perineural, resposta linfocitária e profundidade de invasão são exemplos de parâmetros histopatológicos não contabilizados no atual sistema de estagiamento. Além disso, a proliferação extracapsular, que pode estar associada com uma redução de 50% na sobrevivência, pode ter um impacto significativo sobre o prognóstico de pacientes com lesão localizada (TAKES et al., 2010). Entre outros parâmetros particularmente preditivos de metástase nodal, a espessura do tumor tem sido associada com a recorrência local e a sobrevida no câncer de língua (YUEN et al, 2000). A exata correlação entre profundidade da invasão e a sobrevivência não está clara; no entanto, vários estudos têm sugerido que se a espessura do tumor for maior do que 4,0 milímetros aumenta significativamente o risco de metástase cervical e, portanto, tem um impacto negativo sobre a sobrevivência (ASAKAGE et al., 1998). Características histopatológicas que influenciam no risco de recorrência regional e local incluem embolia linfática e invasão perineural. No entanto, o prognóstico mais significativo no câncer oral é a presença da proliferação extracapsular de metástases linfonodais (ALVI; JOHNSON, 1996; WOOLGAR et al., 1994). Como a presença da proliferação extracapsular tem sido identificada como um indicador de mau prognóstico, os pacientes com espalhamento extracapsular são comumente tratados com a terapia adjuvante, incluindo radioterapia e quimioterapia. No entanto, apesar da terapia adjuvante, um terço dos pacientes experimentará a recidiva (GREENBERG et al, 2003). 2.2.3. Diagnóstico A biópsia cirúrgica representa o método mais confiável de diagnóstico e fornece ao patologista informações necessárias para fazer um diagnóstico definitivo de carcinoma invasivo. O diagnóstico do carcinoma invasivo demanda uma profunda avaliação da extensão do tumor (GENDEN et al, 2010). A utilização de imagens de fluorescência pode ser útil na detecção de alterações pré-malignas e determinação da extensão da mucosa patologicamente alterada (UPILE et al., 2009). 26.

(27) Uma vez que um diagnóstico definitivo foi obtido, o diagnóstico de imagem é essencial para determinar a fase do tumor e a presença de metástases. Embora incomum no estágio inicial, a presença de metástases distantes, bem como de câncer primário do trato aerodigestivo superior deve ser avaliado por exame físico ou radiografia de tórax ou tomografia computadorizada (TC) (GENDEN et al, 2010). 2.2.4. Fatores de Risco O uso concomitante do tabaco e álcool contribui com o aumento da incidência de muitas neoplasias, especialmente neoplasias de cabeça e pescoço. Homens que bebem e fumam tem o aproximadamente 38 vezes mais chance de desenvolver câncer de cabeça e pescoço do que homens que não tem esses hábitos (BRENNAN et al., 2004). As mutações no gene p53 estão mais frequentemente presentes em tumores de consumidores de bebidas alcoólicas e que fazem uso do tabaco, do que em indivíduos não etilistas e não tabagistas (MIYAZAKI et al., 2002; MORITA et al., 2002). Nas últimas décadas, dados epidemiológicos e moleculares tem indicado o envolvimento do papiloma vírus humano de alto risco no câncer de células escamosas de cabeça e pescoço (GILLISON et al, 2000). O potencial oncogênico do HPV de alto risco é atribuível à sua capacidade de inserir fragmentos específicos de DNA (genes E5, E6 e E7) no genoma do hospedeiro. Como resultado desta integração, algumas funções essenciais dos fatores supressores de tumor (p21, p53 e vias pRb, respectivamente) são anuladas, levando a defeitos na apoptose, mecanismos de reparação de DNA, regulação do ciclo celular e, finalmente, a imortalização celular (RAGIN et al., 2007).. 27.

(28) 3. JUSTIFICATIVA As lesões malignas de cavidade oral têm sido estudadas extensivamente para se avaliar possíveis alterações genéticas. Determinar a influência da infecção viral nessas lesões pode elucidar o papel do HPV na carcinogênese e ajudar a orientar futuras estratégias de prevenção e detecção precoce do câncer de boca mais comum, o carcinoma de células escamosas orais. Como tal, muitos estudos têm sido realizados para detectar a presença de HPV no epitélio oral através de uma variedade de métodos laboratoriais. O presente estudo tem como objetivo contribuir com mais informações sobre a presença do HPV em lesões orais malignas e a influência de outros fatores no desenvolvimento do câncer e/ou na infecção pelo HPV. O Ambulatório de Estomatologia do Hospital Universitário da UFSC atende exclusivamente a pacientes do Sistema Único de Saúde (SUS), portadores de lesões bucais das mais diferentes etiologias, muitas delas manifestações bucais de doenças sistêmicas ou genéticas, servindo como referência para atenção terciária na área do diagnóstico bucal. Esse estudo poderá salientar a importância de se incluir no diagnóstico do paciente a análise da infecção pelo HPV, já que este poderia influenciar o prognóstico e o tratamento da doença. Além disso, este trabalho pode contribuir com outras pesquisas que tenham o objetivo de determinar a incidência do HPV na mucosa oral.. 28.

(29) 4. OBJETIVOS 4.1. OBJETIVO GERAL Avaliar a prevalência do vírus do papiloma humano (HPV) em amostras clínicas de lesões orais malignas, oriundas de pacientes atendidos no Ambulatório de Estomatologia do Hospital Universitário da Universidade Federal de Santa Catarina (UFSC) 4.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS - Detectar o HPV em amostras clínicas de lesões orais; - Analisar a associação entre os fatores de risco para o câncer oral e a prevalência de HPV nas lesões analisadas.. 29.

(30) 5. METODOLOGIA. 5.1. DELINEAMENTO DO ESTUDO O estudo foi do tipo retrospectivo, transversal, descritivo, com análise qualitativa de material coletado. 5.2. AMOSTRAS Para avaliar a prevalência do HPV em lesões orais de pacientes atendidos no Ambulatório de Estomatologia do Hospital Universitário da Universidade Federal de Santa Catarina (UFSC) foram utilizadas 25 amostras parafinadas de tecido oral mantidas pelo Laboratório de Patologia Bucal (LPB) da UFSC, que apresentaram resultados positivos para câncer no período de 2006 a 2011. Todas as informações dos pacientes foram mantidas em sigilo e as fichas clínicas foram armazenadas no prédio do Centro de Ciências da Saúde, sob a responsabilidade do professor orientador. 5.3. EXTRAÇÃO DO DNA Cortes de 7 µm de espessura foram obtidos dos blocos parafinados, armazenados em microtubos tipo Eppendorf e mantidos a -20ºC até o momento do processamento.A extração do DNA foi realizada pelo método de Rivero et al. (2006). Os cortes parafinados foram mergulhados em xilol pré-aquecido a 65ºC por 30 min. e, posteriormente, agitados vigorosamente por 20 segundos e centrifugados a 9300 g por 5 min. O sobrenadante foi retirado e o pellet submetido a uma nova lavagem com xilol. Para cada amostra foram realizadas de 3 a 4 lavagens até a parafina ser completamente removida. Em seguida, as amostras passaram pelo processo de retirada completa do xilol e reidratação, sendo submetidas a lavagens sucessivas com 1 ml de etanol absoluto, 1 ml de etanol 90%, 1 ml de etanol 70% e 1 ml de água deionizada. Após cada lavagem as amostras foram agitadas por 15 segundos, centrifugadas a 9300g por 5 min e o sobrenadante removido. Apenas uma lavagem foi feita com cada substância. 30.

(31) Na sequência, as amostras foram incubadas em agitador térmico a 65ºC para evaporar todo resquício de álcool. Após a secagem, foi adicionado 180µl de tampão de lise ATL Qiagen® e 40 µl de proteinase K Qiagen®. Os tubos contendo a amostra, o tampão de lise e a proteinase K foram incubados em agitador térmico a 65ºC por 72 horas, com adições de 20µl de proteinase K a cada 24 horas. As amostras foram mantidas a temperatura ambiente por 10 min. e colocadas novamente no agitador térmico por 1 hora a 90ºC. Os tubos receberam 200 µl de acetato de amônio 4M, foram Agitados vigorosamente por 15 segundos, incubados em gelo por 5 min. e centrifugados a 13.000g por 3 min. O sobrenadante foi transferido para outro tubo e adicionado 600 µl de isopropanol. O tubo foi centrifugado a 16.000g por 1 min. o sobrenadante descartado e o DNA lavado com etanol 70%. Após a centrifugação a 16.000g por 1 min, o sobrenadante foi descartado e o DNA dissolvido em 40 µl de solução TE (Tris-HCl 10mM, pH 7.4 e EDTA 1mM, pH 8) e mantido a -20ºC até a análise. 5.4. ANÁLISE DAS AMOSTRAS. As amostras foram analisadas pela técnica de PCR com os primers consenso (Tabela 1) para a detecção do gene da beta globina humana e do HPV. Todas as análises foram realizadas em termocicladores do modelo Mastercycle Personal® (Eppendorf), com os programas de temperatura sendo definidos com base na literatura e em testes realizados previamente no laboratório. Tabela 1: Lista de primers utilizados no estudo.. Iniciadores. Sequência de Nucleotídeos. PCO3. 5´- ACACAACTGTGTTCACTAGC - 3´. PCO4. 5´- CAACTTCATCCACGTTCACC - 3´. My09. 5´-CGTCCMARRGGAWACTGTC-3´. My11. 5´-GCMCAGGGWCATAAYAATGG-3. GP5+. 5´-TTTGTTACTGTGGTAGATACTAC-3´. GP6+. 5´-GAAAAATAAACTGTAAATCATATTC-3´. Temperatura de. Produto. Pareamento. Amplificado. 56ºC. 110 pb. 55ºC. 450 pb. 40ºC. 150 pb. 31.

(32) Utilizou-se em cada PCR um controle positivo e um controle negativo para a validação o teste.. 5.4.1. PCR para o gene da beta globina humana O DNA das amostras foi submetido à amplificação pela PCR com os iniciadores PCO3 e PCO4 para o gene da beta globina humana, utilizado como controle interno positivo. A PCR foi realizada em 20μl de volume final contendo 1,5 mM MgCl2, 0,2 mM dNTPs, 10 moles de cada iniciador, tampão 10X (200mM Tris-HCl pH 8.4, 500mM KCl), 1U de Taq DNA polimerase recombinante (Invitrogen), 3 uL do DNA molde. As condições da amplificação foram: 95ºC por 3 minutos, 39 ciclos de 95ºC por 1 minuto, 56°C por 1 minuto, 72°C por 2 minutos e um ciclo final de 72ºC por 7 minutos. 5.4.2. PCR com oligonucleotídeos My09/My11 Primers consensu degenerados My09/My11 foram utilizados para amplificar o DNA viral. Esse par de oligonucleotídeos tem como alvo sequências conservadas do gene L1 e pode amplificar um amplo espectro de tipos de HPV, e têm sido utilizados em vários estudos epidemiológicos em grande escala, gerando um produto de 450 pares de base. A PCR foi realizada em 20μl de volume final contendo 1,5 mM MgCl2, 0,2 mM dNTPs, 10 moles de cada iniciador; tampão 10X (200mM Tris-HCl pH 8.4, 500mM KCl), 1U de Taq DNA polimerase recombinante (Invitrogen) e 1uL a 3 uL do DNA molde. As condições da amplificação foram: 95ºC por 3 minutos, 39 ciclos de 94ºC por 1 minuto, 55°C por 1 minuto, 72°C por 1 minuto e um ciclo final de 72ºC por 5 minutos. 5.4.3. Nested PCR As amostras que não foram amplificadas na PCR com os oligonucleotídeos consensu MY09/MY11 foram submetidas a uma nova amplificação, agora com os. oligonucleotídeos GP5+/GP6+ (DE RODA-HUSMAN et al., 1995). A PCR foi realizada em 20μl de volume final contendo 1,5 mM MgCl2, 0,2 mM dNTPs, 10 moles de cada iniciador, tampão 10X (200mM Tris-HCl pH 8.4, 500mM KCl), 1U de Taq 32.

(33) DNA polimerase recombinante (Invitrogen) e 1μl do produto da PCR amplificada com os iniciadores MY09/MY11 como molde. As condições da amplificaçãoforam: 95ºC por 3 minutos, 39 ciclos de 94°C por 1 minuto, 40°C por 2 minutos, 72°C por 1 minuto e um ciclo final de 72°C por 5 minutos. 5.4.4. Eletroforese em Gel de Agarose As amostras amplificadas pela PCR foram submetidas à eletroforese em gel de agarose a 2,5%). O gel foi corado com solu o de brometo de etídeo a 1% e visualizado em transiluminador sob luz UV de 320 nm. 5.5. ANÁLISE ESTATÍSTICA As análises foram feitas utilizando o software SPSS 20 (Chicago Illinois, USA). A associação entre a idade dos pacientes e a presença do HPV foi analisada através do teste T de Student para amostras independentes. As variáveis como tabagismo, etilismo e sexo foram analisadas usando o teste exato de Fisher. A associação entre o HPV e o câncer oral foi analisada através do teste de qui-quadrado.. 33.

(34) 6. RESULTADOS 6.1. CARACTERIZAÇÃO DAS AMOSTRAS As amostras foram provenientes de pacientes com idade entre 41 e 80 anos (56,65 ± 10,46 anos), com maior prevalência de pacientes do sexo masculino (82%). A análise dos hábitos de risco para o desenvolvimento do câncer oral demonstrou que 96% eram tabagistas, 40% etilistas e 40% mantinham os dois hábitos no grupo de lesões neoplásicas. Em relação à localização das lesões, 4 ocorreram na mucosa jugal, 11 no assoalho da boca, 5 na língua, 2 no palato duro ou mole, 1 na maxila, 1 no trígono retromolar e 1 não foi relatada (Figura 4).. Figura 4: Distribuição percentual dos casos de câncer de boca em relação a localização anatômica das lesões.. A análise histopatológica dos cortes corados em hematoxilinaeosina demonstrou que as células neoplásicas exibiam graus variados de atipia, representados por pleomorfismo celular e nuclear de grau discreto a intenso, mitoses atípicas e formação de pérolas córneas. Em relação ao HPV, 10 amostras foram positivas (40%) e 15 negativas (60%) (Figura 5). Nenhuma amostra positiva para o HPV amplificou com os primers My09/My11, sendo necessária realização da nested PCR. 34.

(35) Figura 5: Imagens dos géis revelados em câmara UV. As amostras marcadas com quadrados vermelhos foram consideradas positivas. M=marcador de peso molecular; CP=controle positivo; CN=controle negativo.. 35.

(36) 6.2. ANÁLISE DA ASSOCIAÇÃO ENTRE VARIÁVEIS INDEPENDENTES, INFECÇÃO PELO HPV E CÂNCER ORAL Foi realizada uma análise da relação entre a infecção pelo HPV e algumas características dos pacientes com neoplasia, com o intuito de verificar a existência de fatores que corroboram a infecção e/ou o desenvolvimento do câncer oral. Tabela 2: Localização das lesões em pacientes com câncer oral com e sem infecção pelo HPV. Infecção pelo HPV Total Localização Positivo Negativo n Assoalho Mucosa Jugal Lábio Inferior Rebordo Palato Língua Região Retromolar Não Informado. n. n. 3 2 1 1 0 1 1 1. 7 2 1 0 2 4 1 0. 10 4 2 1 2 5 2 1. A tabela 2 mostra que a não há predominância de uma localização em relação à presença do HPV, sugerindo que não há influência da localização da lesão no desenvolvimento da infecção. Em alguns casos, os pacientes possuíam mais de uma lesão na mucosa oral. Através da análise da relação das variáveis independentes (Tabela 3), foi possível verificar que os pacientes com lesões neoplásicas e infecção pelo HPV tinham idades significativamente maior do que os pacientes deste grupo em que não se detectou o HPV. Não houve associação estatisticamente comprovada entre a infecção pelo HPV e as demais variáveis. Tabela 3: Análise da possível associação entre as variáveis independentes e a infecção pelo HPV em pacientes com neoplasia oral. Variáveis. Infecção pelo HPV Positivo Negativo. Idade. 64 ± 10,76. 52,8 8,13. Feminino Masculino Etilismo Não Sim Tabagismo Não Sim. 3 (30%) 7 (70%) 5 (50%) 5 (50%) 0 (0%) 8 (80%). 2 (13%) 13 (86%) 10 (66,7%) 5 (33,3%) 1 (7%) 12(80%). Sexo. P. 0,010* 0,358** 0,442** 1,000**. *Teste T de amostras independentes; ** Teste exato de Fisher. 36.

(37) 7. DISCUSSÃO. Carcinomas de boca estão entre os cânceres mais comuns no mundo, com cerca de 400.000 casos no mundo e taxa de sobrevivência de 60% em 5 anos (LOHAVANICHBUTR et al, 2012). O aumento da incidência desse câncer na população mais jovem, combinado com o fracasso em melhorar as taxas de sobrevivência e dados que sugerem que fatores de risco tradicionais podem não ser responsáveis por uma parcela dos casos em jovens, demonstram a importância de uma melhor compreensão da epidemiologia do câncer oral (ZYGOGIANNI et al., 2011). Como outros tumores das vias digestivas superiores, o carcinoma epidermoide de cavidade oral é reconhecidamente uma neoplasia que atinge preferencialmente os pacientes do sexo masculino (DE CARVALHO et al., 2001). Alguns estudos demonstram uma predominância do sexo feminino (BORGES, et al., 2008), porém isso se deve possivelmente a uma baixa quantidade de amostras analisadas. Trabalhos com um número elevado de amostras estabelecem o sexo masculino como o mais atingido por esta neoplasia (GERVASIO et al., 2001; SOUZA, 1996; PITHAN, 2004; OLIVER; HELFRICK; GARD, 1996). Observou-se nesse estudo que 80% das lesões neoplásicas eram de pacientes do sexo masculino. Isso pode ser explicado pelo comportamento sexual, consumo de tabaco e álcool. Homens têm mais parceiras sexuais durante a vida e consomem mais tabaco e álcool, fatores relacionados à infecção pelo HPV. Além disso, diferenças na imunidade entre homens e mulheres, relacionadas a questões hormonais, podem explicar em parte essa maior prevalência nos homens (KLEIN, 2000). A idade média dos pacientes com câncer oral foi de 56,65 anos, um pouco abaixo do valor encontrado em outros trabalhos (CORRENTI; RIVERA; CAVAZZA, 2004; OLIVEIRA; RIBEIRO-SILVA; ZUCOLOTO, 2006; OLIVER; HELFRICK; GARD, 1996; SOUZA, 1996), onde as médias ficaram acima dos 60 anos. Embora alguns estudos indiquem aumento da prevalência do carcinoma oral em adultos jovens (LLEWELLYN; JOHNSON; WARNAKULASURIYA, 2001; LYPE, 2001), a idade mínima no nosso estudo foi de 41 anos, semelhante à Kademani et al., 2005.. 37.

(38) A língua, o assoalho bucal e o lábio inferior são as localizações mais comumente relatadas nos estudos de câncer bucal (DEDIVITIS et al., 2004; GERVASIO et al., 2001 MOREIRA, 1997; OLIVER; HELFRICK; GARD, 1996). O lábio inferior foi a região onde a maioria da lesões foi encontrada, com uma porcentagem semelhante a outros estudos (KOWALSKI et al., 1994; GERVASIO et al., 2001; PITHAN, 2004), com 28% dos casos. Uma grande quantidade de fatores ambientais e de estilo de vida têm sido identificados como fatores de risco para o câncer bucal. No entanto, o tabagismo e consumo de álcool são amplamente considerados como principais fatores de risco evitáveis. Além disso, o efeito sinérgico do uso do tabaco e do álcool também está envolvido no desenvolvimento da neoplasia (SHENOI et., 2012). O tabagismo e etilismo também estão relacionados com um pior prognóstico da doença. Apesar de alguns autores negarem essa associação (LOW et al., 2003), a maioria reporta uma alta taxa de mortalidade em fumantes e etilistas com câncer oral (LEITE; KOIFMAN, 1998; KOWALSKI; LATORRE, 2000; RIBEIRO; KOWALSKI; LATORRE, 2003). No grupo de lesões neoplásicas 96% fumavam, 40% consumiam bebidas alcoólicas e 40% mantinham os dois hábitos. Embora os fatores de risco mais comuns na patogênese do câncer de boca sejam os agentes infecciosos, dietas pobres em frutas e legumes, bem como o consumo de tabaco e álcool (PINDBORG, 1980), recentemente o possível papel etiológico do HPV nas lesões orais pré-neoplásicas e neoplásicas também tem sido sugerido (PREMOLIDE-PERCOCO; RAMIREZ, 2001). A incidência de câncer oral tem aumentado significativamente nas últimas três décadas e o HPV tem sido diretamente implicado como a causa subjacente (NÄSMAN; ATTNER; HAMMARSTEDT, 2009; CHATURVEDI; ENGELS; PFEIFFER, 2011). Enquanto a incidência de câncer oral sem a presença do HPV diminuiu em 50% nos EUA entre 1988 e 2004 (de 2,0 casos por 100.000 habitantes a 1,0 por 100.000), a incidência de câncer oral HPV-positivo aumentou 225% (de 0,8 por 100.000 para 2,6 por 100. 000), com predomínio entre jovens, homens e brancos (CHATURVEDI; ENGELS; PFEIFFER, 2011).. 38.

(39) No entanto, a associação de HPV em lesões orais pré-cancerosas e cancerosas não tem sido tão consistente como cânceres cervicais. As taxas relatadas de detecção molecular do HPV em neoplasias de cabeça e pescoço variam entre 0-100% (HA; CALIFANO, 2004; SYRJANEN, 2007). Esta variação extrema na prevalência pode ser devido à análise de lesões essencialmente diferentes como se fossem do mesmo tipo, baixo número de amostras, diferenças nas técnicas de amostragem, nas origens etnogeográficas dos indivíduos examinados, nos métodos de detecção do HPV aplicados e nos métodos de extração da amostra (HOBBS et al., 2006; TERMINE et al., 2008; SYRJANEN, 2005). No presente estudo nós utilizamos amostras parafinadas de biópsias orais com no máximo 4 anos de armazenamento. Com esse tipo de amostra foi possível extrair satisfatoriamente o DNA, com um rendimento de 190 a 710 ng/µl e uma relação DNA/proteína variando entre 1,68 a 2,0. A biópsia continua sendo o procedimento mais comum para se coletar material para análise, graças à possibilidade de usar a mesma amostra para o exame morfológico e para o teste de HPV. Além disso, a biópsia oral proporciona uma amostra mais representativa quando comparada a citologia exfoliativa, pois inclui células da camada basal, onde o vírus pode estar presente em uma forma latente e não produtiva (LONGWORTH; LAIMINS, 2004). Os testes moleculares mais utilizados para a detecção do HPV são hibridização in situ e PCR ou ambos. Apesar da técnica de PCR não-quantitativa não permitir a determinação da atividade infecciosa, ela é útil porque fornece melhor sensibilidade e especificidade do que a técnica de hibridização in situ (MARUR et al., 2010). No nosso estudo foi utilizada a técnica de PCR qualitativa, com os iniciadores consenso MY09/MY11 e GP5+/GP6+ para a nested-PCR. Estudos que usaram PCR como método de detecção demonstraram uma maior prevalência (34,8%) do HPV em relação aos estudos que utilizaram hibridização in situ (32,9%) (TERMINE et al., 2008). Foram analisadas 25 amostras de lesões orais neoplásicas no estudo, sendo que em 10 (40%) foi possível detectar o HPV e 15 não apresentaram amplificação com os iniciadores consenso. Alguns estudos que utilizaram amostras conservadas em blocos de parafina e analisadas pela técnica de PCR demonstraram porcentagem muito semelhante 39.

(40) ao apresentado nesse estudo (DAHLSTROM, ADLER-STORTHZ, ETZEL, 2003; HAMMARSTEDT, LINDQUIST, DAHLSTRAND, 2006; TACHEZY; KLOZAR; SALAKOVA, 2005). Todas as amostras positivas apenas amplificaram com a nested PCR, demonstrando que apesar da quantidade considerável de DNA (190-710 ng/µl) extraído das amostras, apenas uma pequena parte era de DNA viral ou a maior parte do DNA viral não estava em um estado adequado para replicação. A origem etnogeográfica dos pacientes é uma variável importante quando se se estuda a prevalência do HPV em neoplasias orais. Países asiáticos, por exemplo, têm a maior taxa de HPV oral do mundo (LONGWORTH; LAIMINS, 2004; KOJIMA, MAEDA, SUGITA, 2002; ZHANG et al., 2004; SUGIYAMA, BHAWAL, KAWAMURA, 2007). No Brasil, Fregonesi, Teresa, Duarte, (2003) obtiveram um resultado muito similar ao do presente estudo com 39% de positividade para o HPV utilizando hibridização in situ. Porém, outros trabalhos apresentaram números inferiores, como Rivero et al. (2007) que não encontrou nenhuma lesão positiva, Soares et al. (2002) com 20% de amostras positivas e Miguel et al. (1998) com 11%. Ainda não está claro se o uso do tabaco e/ou álcool e a presença do HPV são ou não sinérgicos na etiopatogenia de câncer oral (GILLISON et al., 2000; GILLISON; LOWY, 2004). Tem sido postulado que o tabagismo pode suprimir a resposta imune facilitando assim a persistência do HPV. Este passo é importante para o desenvolvimento do câncer relacionado ao HPV, pois as proteínas E6 e E7 poderiam assim inativar as proteínas supressoras de tumor p53 e pRB, respectivamente (MÜNGER et al.,1992). O tabagismo poderia também causar danos no DNA, induzindo aberrações nas células e, na falta de p53 e pRB, levar a carcinogênese (GICHKI et al., 2012). Também tem sido sugerido que o potencial carcinogênico do HPV aumenta com a integração viral com o DNA do hospedeiro (SPENCE; FRANCO; FERENCZY, 2005). O processo de integração ocorre em locais frágeis ou pontos críticos do DNA danificado e existem evidências de que o tabaco induz quebras no DNA de células humanas (LUO et al., 2004). Assim, um aumento na frequência da integração do HPV. 40.

(41) em fumantes pode aumentar o risco de carcinogênese por um efeito sinérgico em umgrupo particular de pacientes. No que concerne à presença do HPV em lesões malignas de pacientes fumantes, todas as amostras continham DNA viral, porém não houve associação estatisticamente comprovada (p=1,000) entre a presença do HPV e o tabagismo, já que 92% das amostras negativas para o HPV também eram de pacientes fumantes. Foi feita também uma análise de uma possível associação entre fatores que poderiam estar relacionados com um risco maior de instalação e persistência do HPV em lesões orais, como idade, gênero e etilismo. O álcool assim como o tabaco é reconhecido como um dos principais fatores de risco para o câncer oral por causar lesões na mucosa oral (SHENOI et al., 2012), porém não houve associação estatística (p=0,442) entre o etilismo e a presença do HPV. A análise da variável sexo em relação ao HPV demonstrou que apesar de uma maior porcentagem de homens com HPV-positivo (70%) em relação às mulheres (30%) a associação não foi estatisticamente significativa, concordando com os trabalhos de Bouda et al. (2000) e Giovanelli et al. (2002). A prevalência de HPV oral também aparenta aumentar com a idade, o que é incomum para uma doença sexualmente transmissível. Não está claro o que causa esse padrão de prevalência relacionado à idade, já que uma maior incidência de novos casos de infecção pelo HPV entre pessoas com mais de 40 anos comparado a adolescentes e jovens adultos é improvável. Especulações sobre as possíveis causas deste padrão incluem diminuição da remoção do HPV oral e com o passar dos anos ou a reexpressão de infecções latentes por mudanças na habilidade do sistema imunológico controlar essas infec ões (D’SOUZA; DEMPSEY, 2011). Em concordância com Sugyiama et al. (2003),. nosso. estudo. demonstrou. que. os. pacientes. HPV-positivos. eram. significativamente mais velhos que pacientes HPV-negativos.. 41.

(42) 8. CONCLUSÕES. A prevalência da infecção pelo HPV nos pacientes com câncer oral foi de 40%, muito semelhante à de outros trabalhos que utilizaram o mesmo tipo de amostra e técnica. Em nosso estudo, não foi possível observar associação estatisticamente comprovada entre a presença do HPV e o tabagismo, etilismo ou sexo dos pacientes nos carcinomas orais analisados. Houve diferença significativa entre as médias das idades dos pacientes HPV positivos e negativos. Pacientes HPV-positivos era significativamente mais velhos do que os que não estavam infectados com o HPV.. 42.

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