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INSTITUTO
DE
BIOLOGIA
CAMILA
DE
ANDRADE
CAMARGO
“ATIVIDADE ANTICÂNCER DE QUERCETINA, NARIGINA, MORINA E ACETOXI DMU NO TRATAMENTO TERAPÊUTICO DE RATOS INOCULADOS
COM CARCINOSSARCOMA DE WALKER 256”
Tese apresentada ao Instituto de Biologia para obtenção do Título de Doutor em Biologia Funcional e Molecular, na área de Bioquímica.
Orientador: Prof. Dr. Hiroshi Aoyama
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iii CAMPINAS, 08 DE AGOSTO DE 2011
BANCA EXAMINADORA:
Prof. Dr. Hiroshi Aoyama
Prof. Dr. Paulo Afonso Granjeiro
Profa. Dra. Vera Lucia Scherholz Salgado de Castro
Prof. Dr. Daniel Martins de Souza
Profa. Dra. Cíntia Maria Saia Cereda
Prof. Dr. Alessandro dos Santos Farias
Prof. Dr. Claudio Martin Jonsson
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Dedico este trabalho
A todas as pessoas que têm ou tiveram câncer, em especial à Dona Lourdes (in
memoriam) e à Dona Cida.
Aos meus pais, que muito contribuíram com minha formação pessoal e profissional; ao meu marido, que sempre me apoiou e incentivou e ao meu
orientador, que acompanhou toda minha vida acadêmica; pois juntos eles tornaram possível mais esta conquista.
“Sempre estive apoiado no ombro de gigantes”! Sir Isaac Newton
Que este trabalho possa contribuir com futuros estudos que venham a proporcionar um aumento na sobrevida e melhor qualidade de vida para
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“Para estar junto não é preciso estar perto, e sim do lado de dentro.” Leonardo da Vinci
Este trabalho não teria sido possível sem a ajuda de muitas pessoas às quais agradeço o apoio dado:
Agradeço à FAPESP pelo apoio financeiro aos trabalhos desenvolvidos nesta tese.
Ao Prof. Dr. Hiroshi Aoyama, pela maravilhosa orientação, pelo acompanhamento do trabalho, disponibilidade e generosidade que sempre teve durante os meus anos de doutorado, assim como pelas correções, críticas e sugestões que sempre foram muito relevantes. Agradeço por me ajudar e apoiar a desenvolver novas idéias e também por me permitir “levantar vôo” e ir de encontro a novos horizontes, podendo conhecer assim outros continentes e levar nosso trabalho ao conhecimento de tanta gente. Não poderia deixar de agradecer também pela ótima e inesquecível convivência nestes 10 anos, no laboratório de Enzimologia, e por ter se tornado para mim, mais que um professor, um grande amigo!!
À Profa. Dra. Maria Cristina Gomes Marcondes, que aceitou ser minha
co-orientadora e muito ajudou na montagem da parte experimental com os ratos e administração das células tumorais, permitindo também o uso do seu laboratório, no Departamento de Fisiologia, sempre que precisei. Agradeço também a todos os alunos
da Profa. Maria Cristina, que sempre me ajudaram muito no uso dos equipamentos do
laboratório, com atenção e paciência, em especial à Emilliane, Rebeca, André, Bread e Ângela.
À Profa. Dra. Carmen Veríssima Ferreira, por me receber de portas abertas
sempre que precisei utilizar o Laboratório de Transdução de Sinal. Agradeço também à
Erika, técnica do laboratório do Prof. Hiroshi, pela ajuda durante o doutorado e às
técnicas Denise e Cláudia, por sempre me receberem muito bem no laboratório da Profa. Carmen. Agradeço aos alunos do Laboratório de Transdução de Sinais que me auxiliaram no uso dos equipamentos do laboratório, em especial agradeço ao
Rodrigo, que me ensinou as técnicas de Zimografia e Western Blotting, que foram de
grande importância na realização deste trabalho.
À Profa. Dra. Mary Anne Heidi Dolder, do Departamento Biologia Celular, pela
colaboração na parte experimental referente à microscopia e análises morfológicas e morfométricas realizadas neste trabalho. Em especial, agradeço às amigas Fabrícia e
Cidinha, alunas da Profa. Mary Anne, que foram de grande importância na realização destes experimentos, desde o sacrifício dos animais até o processamento dos órgãos e análises, além da bela amizade que se iniciou entre nós.
Ao Prof. Dr. Carlos Roque Duarte Correia, pela colaboração e o fornecimento do composto acetoxi DMU.
Aos alunos de iniciação científica Nathalie, Guilherme, Naegele e Luiz, que estagiaram comigo neste período e que se tornaram pessoas muito queridas, além de
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À Profa. Dra. Fernada Gadelha por emprestar o pótter, equipamento que ficou
praticamente todo o período do meu doutorado em nosso laboratório, facilitando muito a realização dos meus experimentos.
Ao Prof. Dr. Sérgio Marangoni por possibilitarem o uso do Laboratório de Química de Proteínas e ao técnico Paulinho, por me atender dia após dia na busca quase que diária por nitrogênio líquido. Á Lucilene, por toda a ajuda no cuidado do Biotério e dos animais.
À Profa. Dra. Eneida de Paula por permitir o uso do Laboratório de Biomenbranas
e do Biotério e também ao técnico Márcio e Maribel por atenderem meus pedidos sempre com boa vontade.
À Profa. Dra. Denise Vaz de Macedo por conceder o uso do Laboratório de
Bioquímica do Exercício e também do Biotério. Agradeço também à técnica Ana, sempre disposta a ajudar no que fosse preciso. Ao Renato, pelo auxilio na administração de anestésico nos ratos e à Fernanda e Bruna pela ajuda com o scanner de géis.
Aos amigos do laboratório, Miriam, Claudinha, Willian e em especial à Darlene, pelos momentos de descontração no laboratório, por fazerem dele um lugar muito mais gostoso de estar; pelas conversas, risadas, brincadeiras, desabafos, conselhos, pelas críticas também.
À Profa. Dra. Maria Eleonora, que me ajudou muito durante todo o doutorado,
dando dicas e sugestões valiosas para o desenvolvimento deste trabalho.
Aos membros da banca de qualificação: Prof. Dr. Sergio Marangoni, Prof. Dr.
Claudio Werneck e Prof. Dr. Marcelo Brocchi, e da banca de defesa (página III) por
terem participado da avaliação deste trabalho, pelas sugestões, discussões, conselhos e críticas.
À Marina, secretária do Departamento de Bioquímica, e à Andréia, secretária da pós-graduação pela disposição e por toda a ajuda que me deram até hoje.
Aos meus pais Carlos e Hilda Helena por todo o amor, incentivo, apoio e coragem que sempre me transmitiram; pelos ensinamentos que levarei sempre comigo; pelos esforços que fizeram para me dar a melhor educação possível, que me possibilitou superar todos os desafios que me foram impostos durante a vida; por sempre acreditarem em minha capacidade e me ensinarem que para conseguir meu objetivo é preciso ser perseverante e persistente; pelos conselhos, desabafos, conforto nas horas de tristeza, enfim por existirem.
Ao meu marido Carlos Eduardo pelos maravilhosos momentos juntos; por sempre estar ao meu lado me alegrando, confortando e apoiando; por todas as comemorações nas minhas conquistas; assim como pela compreensão e paciência nos dias em que eu estava estressada ou tinha que trabalhar até tarde; por me incentivar nos momentos de desânimo; enfim, por ser um grande companheiro, cúmplice e amigo.
À minha irmã Raquel por estar sempre presente em minha vida; por ser alguém com quem eu adoro conversar e dar muitas risadas e por ser tão companheira e amiga, tanto nos momentos alegres quanto tristes.
Ao meu irmão João Pedro com quem sempre me divirto muito, pois cada vez que nos encontramos é só alegria, brincadeiras, gibis e vídeo games.
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Ao meu padrasto Elídio por fazer parte da minha família; pela convivência agradável; por ser esta pessoa tão boa, honesta e amiga, sempre pronto a ajudar em qualquer situação e por tudo que tem feito por mim, minha mãe e irmã todos estes anos.
À minha madrasta Mariana por sempre me receber muito bem em sua casa e cuidar tão bem dos meus irmãos e pai.
Ao meu avô Wilson por todo seu amor, cuidado e preocupação; por vibrar comigo a cada conquista minha e por ter sido tão importante na minha vida e contribuído muito para minha educação.
Á minha avó Nica, por toda a sua dedicação, incentivo, carinho e orações; por ser esta pessoa tão bondosa com todos ao seu redor e por me receber sempre com tanto amor e alegria em sua casa, me agradando tanto com suas guloseimas.
Aos amigos Juliana, Dilermando, Milena e Bread pela grande amizade; por serem pessoas tão especiais, com as quais eu sei que posso contar sempre que precisar; pelos nossos encontros semanais divertidíssimos, pelas nossas viagens, passeios, conversas; enfim, por estarem presentes na minha vida.
À amiga Lívia, amiga para toda hora, por estar sempre presente e disposta a ajudar, quebrando os mais variados galhos, dando suporte nos momentos difíceis e compartilhando muito os alegres.
À amiga Roberta, pela presença em minha vida, mesmo à distância, me dando dicas e conselhos; por todas as conversas, sérias ou divertidas e por sempre ter me ajudado em tudo que precisei.
Aos amigos Bruno, Madla, Bispo, Daniel e Laura que estão em outro continente, porém a amizade continua a mesma. Agradeço pelas conversas via internet e pelas visitas, que driblam momentaneamente a grande saudade.
A todos os outros amigos que, apesar de não citados, não são menos importantes, agradeço pela amizade que continua até hoje desde o início da graduação e por ainda ter o prazer de encontrá-los nos corredores da Bioquímica ou fora da UNICAMP também.
Enfim, a todos que direta ou indiretamente contribuíram para que esse
viii ''Think about the generations and they say:
- We want to make it a better place For our children And our children's children
So that they know It's a better world for them And think if they can Make it a better place?"
There's a place in your heart And I know that it is love And this place could be Much brighter than tomorrow
And if you really try You'll find there's no need to cry In this place you'll feel There's no hurt or sorrow
There are ways to get there If you care enough for the living Make a little space Make a better place
Heal the world Make it a better place For you and for me And the entire human race
"Pense sobre as gerações e elas dizem:
Nós queremos fazer deste mundo um lugar melhor Para nossos filhos
E para os filhos dos nossos filhos.
Para que eles vejam
Que este é um mundo melhor para eles E saibam que podem
Fazer deste um lugar ainda melhor.
Há um lugar no seu coração E eu sei que é amor
E este lugar pode ser
Muito mais brilhante do que amanhã
E se você realmente tentar
Você descobrirá que não há necessidade de chorar Neste lugar você vai sentir
Que não há mágoa ou tristeza
Há caminhos para chegar lá
Se você se importa o suficiente com a vida Crie um pequeno espaço
Crie um lugar melhor
Cure o mundo
Faça dele um lugar melhor Para você e para mim E toda a raça humana
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“Somewhere over the rainbow Bluebirds fly And the dreams That you've dreamed of Dreams really do come true” Over The Rainbow, Harold Arlen e E.Y. Harburg
“Todavia não é nossa função controlar todas as marés do mundo, mas sim fazer o que pudermos para socorrer os tempos em que estamos inseridos, erradicando o mal dos campos que conhecemos, para que aqueles que viverem depois, tenham terra limpa para cultivar. Que tempo encontrarão não é nossa função determinar."
Gandalf, Tolkien, O senhor dos Anéis - O Retorno do Rei
“Cedo ou tarde você vai perceber, como eu, que há uma diferença entre conhecer o caminho e percorrer o caminho.” Morfeu, Matrix
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1 – INTRODUÇÃO ... 1
1.1 EPIDEMIOLOGIA DO CÂNCER ... 1
1.2 O CÂNCER E A CARCINOGÊNESE ... 2
1.3 CANCER CAQUEXIA:CARACTERÍSTICAS E METABOLISMO ... 3
1.1 CARCINOSSARCOMA DE WALKER 256... 8
1.2 CITOCINAS ... 9
1.3 FATOR DE CRESCIMENTO ENDOTELIAL VASCULAR ... 10
1.4 METALOPROTEINASES DA MATRIZ EXTRACELULAR ... 11
1.5 PROTEÍNAS TIROSINAS FOSFATASES ... 12
1.6 EFEITO DO CÂNCER CAQUEXIA EM ÓRGÃOS REPRODUTORES ... 14
1.7 OFÍGADO ... 19
1.8 TRATAMENTO TERAPÊUTICO ... 20
1.9 ESTRESSE OXIDATIVO E DEFESAS ANTIOXIDANTES ... 21
1.10 FLAVONÓIDES ... 23 2 – OBJETIVOS ... 29 3 - MATERIAIS E MÉTODOS ... 31 3.1 MATERIAIS ... 31 3.2 MÉTODOS ... 31 3.2.1 Indução Tumoral ... 32
3.2.2 Solubilização e Administração dos Flavonóides e de Acetoxi DMU ... 32
3.2.3 Experimento 1 - Avaliação da Eficácia Terapêutica dos Flavonóides e Acetoxi DMU ... 32
3.2.3.1 Dose Resposta (ED50) e Evolução Tumoral ... 34
3.2.3.2 Sobrevida ... 35
3.2.4 Experimento 2 - Tratamento Terapêutico com a ED50 dos Flavonóides e Acetoxi DMU ... 35
3.2.4.1 Coleta e Processamento das Amostras ... 36
3.2.4.2 Biometria e Morfometria ... 36
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3.2.4.5 Quantificação da Superóxido Dismutase... 39
3.2.4.6 Quantificação das Citocinas ... 39
3.2.4.7 Quantificação do Fator de Crescimento Endotelial Vascular ... 39
3.2.4.8 Quantificação da Atividade da Metaloproteinase de Matrix-2... 40
3.2.4.9 Quantificação de Proteína Tirosina Fosfatase de Baixa Massa Molecular ... 41
3.2.5 Análise dos Resultados ... 41
4 – RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 43
4.1 EXPERIMENTO 1 - AVALIAÇÃO DA EFICÁCIA TERAPÊUTICA DOS FLAVONÓIDES E ACETOXI DMU ... 45
4.1.1 Dose Resposta (ED50) e Evolução Tumoral ... 45
4.1.2 Sobrevida ... 58
4.2 EXPERIMENTO 2-TRATAMENTO TERAPÊUTICO COM A ED50... 66
4.2.1 Ganho de Peso Corporal ... 66
4.2.2 Biometria e Morfometria Testicular e Hepática ... 68
4.2.2.1 Biometria dos Testículos e dos Órgãos Reprodutivos Acessórios ... 68
4.2.2.2 Análise da Altura do Epitélio e Diâmetro dos Túbulos Seminíferos ... 76
4.2.2.3 Estereologia do Tecido Hepático ... 80
4.2.3 Estresse Oxidativo e Enzimas Antioxidantes ... 86
4.2.4 Nível Hepático e Tumoral de Citocinas Inerleucina-6 e Fator de Necrose Tumoral Alfa ... 90
4.2.5 Nível Hepático e Tumoral do Fator de Crescimento Vascular Endotelial95 4.2.1 Nível Hepático e Tumoral de Metaloproteinases de matriz-2 ... 99
4.2.2 Nível Hepático e Tumoral de Proteínas Tirosina Fosfatases de Baixa Massa Molecular ... 105
5 - CONCLUSÕES ... 111
6 - REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 113
xiii
Pág.
Figura 1: Ciclo de Cori com fontes de substratos da gliconeogênese. Os tumores
produzem fatores tais como fator de mobilização de lipídeos (LMF), que induz a degradação do tecido adiposo em ácidos graxos, e fator de indução de proteólise (PIF), que induz a degradação de proteínas (aminoácidos) no músculo esquelético. O fator de necrose tumoral α (TNF-α) também contribui para estes processos. Estes são importantes substratos gliconeogênicos que podem ser usados na síntese de proteínas de fase aguda (APP) pelo fígado. O tumor converte a glicose em lactato, que é transferido para o fígado, onde é convertido novamente em glicose. Este ciclo utiliza uma grande quantidade de energia, e pode contribuir para caquexia (Tisdale, 2002). ... 5
Figura 2: Corte esquemático de um Testículo. ... 17 Figura 3: Imagem de corte histológico de testículo mostrando detalhes da
estrutura dos túbulos seminíferos e células intersticiais. A: Corte de testículo
evidenciando túbulos seminíferos (E e L) e interstício (I). O túbulo seminífero é formado pelo epitélio seminífero (E) e lúmen (L). O epitélio seminífero contém duas populações celulares: as células da linhagem espermatogênica e as células de Sertoli. B: O interstício (espaço entre os túbulos seminíferos) é constituído de tecido conjuntivo, nervos, vasos sanguíneos e linfáticos e células de Leydig (L). As células de Leydig são responsáveis pela produção de testosterona. Espaço linfático (El): delimitados pelos vasos linfáticos. Macrófago (M). Vaso sanguíneo (v). Núcleo da célula de Sertoli no epitélio seminífero (Se). ... 18
Figura 4: Estruturas dos flavonóides quercetina, morina e narigina e de acetoxi DMU ... 28 Figura 5: Curva da dose resposta (ED50) para o tratamento terapêutico com
quercetina e a narigina. Ratos Wistar foram inoculados subcutaneamente (no
flanco direito) com células tumorais e após 3h iniciou-se o tratamento terapêutico com os flavonóides, via intraperitoneal. O tratamento foi realizado 5 vezes consecutivas por semana (n=10/grupo). Gráfico A: ratos inoculados com tumor tratados com quercetina 10, 15, 25 e 35mg/kg (TQ10, TQ15, TQ25, TQ35, respectivamente); gráfico B: ratos inoculados com tumor tratados com narigina 10, 25 e 35mg/kg (TN10, TN 25, TN 35, respectivamente). T: animais controle inoculados com tumor. Mais detalhes sobre os procedimentos para a inoculação das células tumorais nos ratos e o tratamento com os flavonóides, encontram-se descritos em Métodos. Os animais sobreviventes foram sacrificados após este período. *, ** e *** indicam diferença estatisticamente significante (p<0,05, p<0,01 e p<0,001, respectivamente) em relação ao grupo T. ... 50
Figura 6: Curva da dose resposta (ED50) para o tratamento terapêutico com
morina e o acetoxi DMU. Ratos Wistar foram inoculados subcutaneamente (no
flanco direito) com células tumorais e após 3h iniciou-se o tratamento terapêutico com os compostos, via intraperitoneal. O tratamento foi realizado 5 vezes consecutivas por semana (n=10/grupo). Gráfico A: ratos inoculados com tumor tratados com morina 10, 25 e 35mg/kg (TM10, TM25, TM35, respectivamente);
xiv
tumor. Mais detalhes sobre os procedimentos para a inoculação das células tumorais nos ratos e o tratamento com os compostos, encontram-se descritos em Métodos. Os animais sobreviventes foram sacrificados após este período. *p<0,05 em relação ao grupo T.. ... 51
Figura 7: Curva da dose resposta (ED50) para os tratamentos preventivo e
terapêutico com quercetina. Ratos Wistar foram inoculados subcutaneamente (no
flanco direito) com células tumorais e após 3h iniciou-se os tratamentos preventivo e terapêutico com quercetina 10mg/kg, via intraperitoneal, 5 vezes consecutivas por semana (n= 7/grupo). TQ10 (Prev): ratos tratados preventivamente com quercetina 10mg/kg por 30 dias antes da inoculação tumoral e após, o tratamento continuou igual aos ratos do grupo TQ10; TQ10: ratos inoculados com tumor tratados com quercetina 10mg/kg; T: animais controle inoculados com tumor. Mais detalhes sobre os procedimentos para a inoculação das células tumorais nos ratos, os tratamentos com a quercetina e o cálculo do peso do tumor, encontram-se descritos em Métodos. As colunas representam as médias ± erro padrão. *p<0,05 em relação ao grupo T. ... 52
Figura 8: Evolução tumoral dos animais tratados com a ED50 (quercetina e
narigina), que apresentaram ou não regressão tumoral, em relação aos ratos controle. Ratos Wistar foram inoculados subcutaneamente (no flanco direito) com
células tumorais e após 3h iniciou-se o tratamento terapêutico com os flavonóides, via intraperitoneal (n= 10/grupo). O tratamento foi realizado 5 vezes consecutivas por semana. A avaliação da evolução tumoral foi realizada, três vezes por semana, através do peso calculado do tumor. Este cálculo foi obtido a partir das três medidas lineares do tumor: comprimento, largura e espessura (Gomes et al., 1983).
As curvas mostram a evolução do peso tumoral dos animais que apresentaram regressão [regressão(+)] ou não [regressão(-)] do tumor, em função do tempo em comparação com o controle [T regressão(-)]. Gráfico A:
ratos inoculados com tumor tratados com quercetina 10mg/kg (TQ10); gráfico B: ratos inoculados com tumor tratados com narigina 25mg/kg (TN25). T: animais controle inoculados com tumor. Os valores indicados no gráfico correspondem à média do peso tumoral dos ratos de cada grupo. Mais detalhes sobre os procedimentos para a inoculação das células tumorais nos ratos, o tratamento com os flavonóides e o cálculo do peso do tumor, encontram-se descritos em Métodos. As colunas representam as médias ± erro padrão. *p<0,05 em relação ao grupo T regressão(-). ... 55
Figura 9: Evolução tumoral dos animais tratados com a ED50 (morina e acetoxi
DMU), que apresentaram ou não regressão tumoral, em relação aos ratos controle. Ratos Wistar foram inoculados subcutaneamente (no flanco direito) com
células tumorais e após 3h iniciou-se o tratamento terapêutico com morina e acetoxi DMU, via intraperitoneal (n= 10/grupo). O tratamento foi realizado 5 vezes consecutivas por semana. A avaliação da evolução tumoral foi realizada, três vezes por semana, através do peso calculado do tumor. Este cálculo foi obtido a partir das três medidas lineares do tumor: comprimento, largura e espessura (Gomes et al., 1983). As curvas mostram a evolução do peso tumoral dos animais que
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inoculados com tumor tratados com acetoxi DMU 25mg/kg (TAD25). T: ratos controle inoculados com tumor. Os valores indicados no gráfico correspondem à média do peso tumoral dos ratos de cada grupo. Os procedimentos para a inoculação das células tumorais nos ratos, o tratamento com os compostos e o cálculo do peso do tumor, encontram-se descritos em Métodos. As colunas representam as médias ± erro padrão. *p<0,05 em relação ao grupo T regressão(-) ... 56
Figura 10: Evolução tumoral dos animais que receberam tratamento preventivo e terapêutico com quercetina (ED50), que apresentaram ou não regressão
tumoral, em relação aos ratos controle. Ratos Wistar foram inoculados
subcutaneamente (no flanco direito) com células tumorais e após 3h iniciou-se o tratamento terapêutico com a quercetina 10 mg/kg, via intraperitoneal (n= 7/grupo). O tratamento foi realizado 5 vezes consecutivas por semana. A avaliação da evolução tumoral foi realizada, três vezes por semana, através do peso calculado do tumor. Este cálculo foi obtido a partir das três medidas lineares do tumor: comprimento, largura e espessura (Gomes et al., 1983). As curvas mostram a
evolução do peso tumoral dos animais que apresentaram regressão [regressão(+)] ou não [regressão(-)] do tumor, em função do tempo, em comparação com o controle [T regressão(-)].TQ10: ratos inoculados com tumor
tratados com quercetina 10mg/kg; TQ10(Prev): ratos tratados preventivamente com quercetina 10mg/kg por 30 dias antes da inoculação tumoral e após, o tratamento continuou igual aos ratos do grupo TQ10; T: animais controle inoculados com tumor. Mais detalhes sobre os procedimentos para a inoculação das células tumorais nos ratos, os tratamentos com a quercetina e o cálculo do peso do tumor, encontram-se descritos em Métodos. As colunas representam as médias ± erro padrão. *p<0,05 em relação ao grupo T regressão(-) ... 57
Figura 11: Sobrevida de animais inoculados com tumor de Walker 256 e tratados com quercetina e narigina. Ratos Wistar foram inoculados subcutaneamente (no
flanco direito) com células tumorais e após 3h iniciou-se o tratamento terapêutico com os flavonóides, via intraperitoneal. O tratamento foi realizado 5 vezes consecutivas por semana (n=10/grupo). Gráfico A: ratos inoculados com tumor tratados com quercetina 10, 15, 25 e 35mg/kg (TQ10, TQ15, TQ25, TQ35, respectivamente); gráfico B: ratos inoculados com tumor tratados com narigina 10, 25 e 35mg/kg (TN10, TN 25, TN 35, respectivamente). T: animais controle inoculados com tumor. Mais detalhes sobre os procedimentos para a inoculação das células tumorais nos ratos e o tratamento com os flavonóides, encontram-se descritos em Métodos. Os animais sobreviventes foram sacrificados após este período. * indica diferença estatisticamente significante (p<0,05) em relação ao grupo T. ... 59
Figura 12: Sobrevida de animais inoculados com tumor de Walker 256 e tratados com morina e actoxi DMU. Ratos Wistar foram inoculados subcutaneamente (no
flanco direito) com células tumorais e após 3h iniciou-se o tratamento terapêutico com os compostos, via intraperitoneal. O tratamento foi realizado 5 vezes consecutivas por semana (n=10/grupo). Gráfico A: ratos inoculados com tumor tratados com morina 10, 25 e 35mg/kg (TM10, TM25, TM35, respectivamente);
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tumor. Mais detalhes sobre os procedimentos para a inoculação das células tumorais nos ratos e o tratamento com os compostos, encontram-se descritos em Métodos. Os animais sobreviventes foram sacrificados após este período. * indica diferença estatisticamente significante (p<0,05) em relação ao grupo T... 60
Figura 13: Sobrevida de animais inoculados com tumor de Walker 256 que receberam tratamento preventivo e terapêutico com quercetina. Ratos Wistar
foram inoculados subcutaneamente (no flanco direito) com células tumorais e após 3h iniciou-se o tratamento terapêutico com quercetina, via intraperitoneal. O tratamento foi realizado 5 vezes consecutivas por semana (n=7/grupo). TQ10: ratos inoculados com tumor tratados terapeuticamente com quercetina 10mg/kg;
TQ10(Prev): ratos tratados preventivamente com quercetina 10mg/kg por 30 dias
antes da inoculação tumoral e após, o tratamento continuou igual aos ratos do grupo TQ10; T: animais controle inoculados com tumor. Mais detalhes sobre os procedimentos para a inoculação das células tumorais nos ratos e o tratamento com quercetina, encontram-se descritos em Métodos. Os animais sobreviventes foram sacrificados após este período. * indica diferença estatisticamente significante (p<0,05) em relação ao grupo T. ... 61
Figura 14: Aparência física dos animais tratados ou não com quercetina e narigina a partir de três semanas após a inoculação das células tumorais.
Ratos Wistar foram inoculados subcutaneamente (no flanco direito) com células tumorais e após 3h iniciou-se o tratamento terapêutico com os flavonóides, via intraperitoneal. O tratamento foi realizado 5 vezes consecutivas por semana. A avaliação da evolução tumoral foi realizada, três vezes por semana, através do peso calculado do tumor. A e B (1): ratos controle inoculados com tumor (grupo T).
A(2), rato inoculado com o tumor e tratado com 10mg/kg de quercetina que
apresentou regressão total do tumor (grupo QT10). B(2), rato inoculado com o tumor e tratado com 25mg/kg de narigina (grupo TN25). Os círculos indicam os tumores. Mais detalhes sobre os procedimentos para a inoculação das células tumorais nos ratos e o tratamento com os flavonóides, encontram-se descritos em Métodos. ... 63
Figura 15: Aparência física dos animais tratados ou não com morina e acetoxi DMU a partir de três semanas após a inoculação das células tumorais. Ratos
Wistar foram inoculados subcutaneamente (no flanco direito) com células tumorais e após 3h iniciou-se o tratamento terapêutico com morina e acetoxi DMU, via intraperitoneal. O tratamento foi realizado 5 vezes consecutivas por semana. A avaliação da evolução tumoral foi realizada, três vezes por semana, através do peso calculado do tumor. Legenda: A e B (1): ratos controle inoculados com tumor (grupo T). A(2), rato inoculado com o tumor e tratado com 25mg/kg de morina (grupo TM25); B(2), rato inoculado com o tumor e tratado com 25mg/kg de acetoxi DMU (TAD25). Os círculos indicam os tumores. Mais detalhes sobre os procedimentos para a inoculação das células tumorais nos ratos e o tratamento com os compostos, encontram-se descritos em Métodos. ... 64
Figura 16: Fotos mostrando um rato tratado com quercetina 10mg/kg que apresentou regressão tumoral e a rápida cicatrização da ferida após a saída do tumor. As fotos mostram a progressão da eliminação de um tumor que regrediu
xvii
com a quercetina, via intraperitoneal, 5 vezes consecutivas por semana. Logo que o tumor começou a dar sinais de que seria eliminado do corpo do rato (tomado como
Dia 1), ele foi fotografado nos dias 1, 2, 3, 4 e 7. Mais detalhes sobre os
procedimentos para a inoculação das células tumorais nos ratos e o tratamento com a quercetina, encontram-se descritos em Métodos. ... 65
Figura 17: Porcentagem de ganho de peso corporal dos animais tratados com a ED50, com e sem implante tumoral. Ratos Wistar foram inoculados subcutaneamente (no flanco direito) com células tumorais e após 3h iniciou-se o tratamento terapêutico com os flavonóides e acetoxi DMU, via intraperitoneal, 5 vezes consecutivas por semana, durante 21 dias (n=10/grupo). Durante todo o experimento foi feita semanalmente a medida de peso corpóreo dos animais. O ganho de peso corpóreo total foi calculado a partir da seguinte fórmula: Ganho de
Peso (21 dias) = (Pf - Pt) – Pi, (onde, Pf: peso final do animal, no dia do sacrifício; Pt: peso do tumor; Pi: peso inicial do animal, antes da indução de tumor). As barras
representam a média do ganho de peso corporal final dos ratos tratados ou não com os flavonóides e com ou sem implante tumoral. Legenda: C: ratos controle; T: ratos inoculados com tumor. Q10, N25 e M25 e AD25: correspondem aos grupos sem tumor tratado com 10mg/kg de quercetina e 25mg/kg de narigina, morina e acetoxi DMU, respectivamente; TQ10, TN25, TM25 e TAD25: correspondem aos grupos inoculados com tumor tratados com 10mg/kg de quercetina e 25mg/kg de narigina, morina e acetoxi DMU, respectivamente. Mais detalhes sobre os procedimentos para a inoculação das células tumorais nos ratos, o tratamento com os flavonóides e o cálculo do peso dos animais, encontram-se descritos em Métodos. As colunas representam as médias ± erro padrão. *** indica diferença estatisticamente significante (p < 0,001) em relação ao grupo C.. ... 67
Figura 18: Peso do testículo, epidídimo e glândula de coagulação de ratos com tumor submetidos ao tratamento terapêutico narigina e acetoxi DMU. Ratos
Wistar foram inoculados subcutaneamente (no flanco direito) com células tumorais e após 3h iniciou-se o tratamento terapêutico com os narigina e acetoxi DMU, via intraperitoneal, 5 vezes consecutivas por semana, durante aproximadamente 21 dias (n=10/grupo). Legenda: C: ratos controle; T: ratos portadores do tumor; N25 e
AD25: grupo sem tumor tratado com 25mg/kg de narigina e acetoxi DMU; TN25 e TAD25: ratos portadores do tumor tratados com 25mg/kg de narigina e acetoxi
DMU. Os procedimentos para a inoculação das células tumorais nos ratos, o tratamento com a narigina e acetoxi DMU, encontram-se descritos em Métodos. As colunas representam as médias ± erro padrão. * indica diferença estatisticamente significante (p < 0,05) em relação ao grupo C. ... 71
Figura 19: Peso da próstata e vesícula seminal de ratos tratados com e sem tumor, tratados terapeuticamente com narigina e acetoxi DMU. Ratos Wistar
foram inoculados subcutaneamente (no flanco direito) com células tumorais e após 3h iniciou-se o tratamento terapêutico com os narigina e acetoxi DMU, via intraperitoneal, 5 vezes consecutivas por semana, durante aproximadamente 21 dias (n=10/grupo). Legenda: C: ratos controle; T: ratos portadores do tumor; N25 e
AD25: grupo sem tumor tratado com 25mg/kg de narigina e acetoxi DMU; TN25 e TAD25: ratos portadores do tumor tratados com 25mg/kg de narigina e acetoxi
xviii
colunas representam as médias ± erro padrão. * indica diferença estatisticamente significante (p < 0,05) em relação ao grupo C. ... 72
Figura 20: Índice Gonadossomático de ratos tratados com e sem tumor, tratados terapeuticamente com narigina e acetoxi DMU Ratos Wistar foram inoculados
subcutaneamente (no flanco direito) com células tumorais e após 3h iniciou-se o tratamento terapêutico com os narigina e acetoxi DMU, via intraperitoneal, 5 vezes consecutivas por semana, durante aproximadamente 21 dias (n=10/grupo). Com base nos pesos corporais e testiculares obtidos após o sacrifício dos animais, foi obtido o índice gonadossomático, calculado a partir da fórmula seguinte: (PG/PC) x 100 onde, PC = peso corporal e PG = peso total dos testículos. Legenda: C: ratos controle; T: ratos portadores do tumor; N25 e AD25: grupo sem tumor tratado com 25mg/kg de narigina e acetoxi DMU; TN25 e TAD25: ratos portadores do tumor tratados com 25mg/kg de narigina e acetoxi DMU. Os procedimentos para a inoculação das células tumorais nos ratos, o tratamento com a narigina e acetoxi DMU, encontram-se descritos em Métodos. As colunas representam as médias ± erro padrão. * indica diferença estatisticamente significante (p < 0,05) em relação ao grupo C... 73
Figura 21: Fotos mostrando a vesícula seminal e testículo de ratos tratados com acetoxi DMU, com ou sem implantação tumoral. Ratos Wistar foram inoculados
subcutaneamente (no flanco direito) com células tumorais e após 3h iniciou-se o tratamento terapêutico com o acetoxi DMU, via intraperitoneal, 5 vezes consecutivas por semana, durante aproximadamente 21 dias (n=10/grupo). Foto A: comparação do tamanho das vesículas seminais de ratos tratados com acetoxi DMU sem tumor (AD25), com tumor (TAD25) e de ratos controle tumor (T); Setas
pretas: vesículas seminais; Setas vermelhas: próstatas e Setas azuis: glândulas
de coagulação. Foto B: comparação do testículo (Setas roxas) de um rato do grupo controle sem tumor (C) com os grupos AD25, T e TAD25. Foto B(2): Comparação do testículo de um rato do grupo C com o de um rato do grupo T, em detalhe. Mais detalhes sobre os procedimentos para a inoculação das células tumorais nos ratos e o tratamento com o composto, encontram-se descritos em Métodos. ... 75
Figura 22: Diâmetro tubular e altura do epitélio germinativo dos componentes do testículo de animais com ou sem tratamento com o acetoxi DMU e inoculados ou não com o tumor. Ratos Wistar foram inoculados subcutaneamente (no flanco
direito) com células tumorais e após 3h iniciou-se o tratamento terapêutico com acetoxi DMU, via intraperitoneal, 5 vezes consecutivas por semana, durante aproximadamente 21 dias (n=10/grupo). As curvas mostram o diametro dos túbulos seminíferos altura do epitélio germinativo (micrometros). Legenda: C: ratos controle, sem indução tumoral e sem tratamento com os compostos; T: ratos portadores do tumor, sem tratamento com o composto; AD25: grupo sem tumor tratado com 25mg/kg de acetoxi DMU; TAD25: ratos portadores do tumor tratados com 25mg/kg de acetoxi DMU. Os procedimentos para a inoculação das células tumorais nos ratos, o tratamento com acetoxi DMU e a técnica utilizada para análise encontram-se descritos em Métodos. As colunas repreencontram-sentam as médias ± erro padrão. * indica diferença estatisticamente significante (p < 0,05) em relação ao grupo C.77
xix
tratamento com o acetoxi DMU e inoculados ou não com o tumor, ampliação de 100X. Ratos Wistar foram inoculados subcutaneamente (no flanco direito) com
células tumorais e após 3h iniciou-se o tratamento terapêutico com acetoxi DMU, via intraperitoneal, 5 vezes consecutivas por semana, durante aproximadamente 21 dias (n=10/grupo). Os procedimentos para a inoculação das células tumorais nos ratos, o tratamento com acetoxi DMU e a técnica utilizada para análise encontram-se descritos em Métodos. ... 78
Figura 24: Morfologia do testículo. Foto de corte de testículo mostrando túbulos seminíferos (micrometros) e a altura do epitélio seminífero de animais com ou sem tratamento com narigina, inoculados ou não com o tumor, ampliação de 100X. Ratos Wistar foram inoculados subcutaneamente (no flanco direito) com
células tumorais e após 3h iniciou-se o tratamento terapêutico com acetoxi DMU, via intraperitoneal, 5 vezes consecutivas por semana, durante aproximadamente 21 dias (n=10/grupo). Os procedimentos para a inoculação das células tumorais nos ratos, o tratamento com narigina e a técnica utilizada para análise encontram-se descritos em Métodos. ... 79
Figura 25: Estereologia do tecido hepático de animais com ou sem tratamento com quercetina e acetoxi DMU e inoculados ou não com o tumor. Ratos Wistar
foram inoculados subcutaneamente (no flanco direito) com células tumorais e após 3h iniciou-se o tratamento terapêutico com quercetina e acetoxi DMU, via intraperitoneal, 5 vezes consecutivas por semana, durante aproximadamente 21 dias (n= 10/grupo). Gráfico A: tratamento terapêutico com quercetina 10mg/kg;
Gráfico B: tratamento terapêutico com acetoxi DMU 25mg/kg. Legenda: C: ratos
controle; T: ratos inoculados com tumor. Q10, AD25: correspondem aos grupos sem tumor tratado com quercetina 10mg/kg e acetoxi DMU 25mg/kg, respectivamente; TQ10, e TAD25: correspondem aos grupos inoculados com tumor tratados com quercetina 10mg/kg e acetoxi DMU 25mg/kg, respectivamente. Os procedimentos para a inoculação das células tumorais nos ratos e o tratamento com os compostos encontram-se descritos em Métodos. As colunas representam as médias ± erro padrão. * indica diferença estatisticamente significante (p < 0,05) em relação ao grupo C; a letra a indica diferença estatisticamente significante (p < 0,05) em relação ao grupo T. ... 83
Figura 26: Morfologia hepática de ratos Wistar inoculados com o tumor e tratados com acetoxi DMU. Ratos Wistar foram inoculados subcutaneamente (no flanco
direito) com células tumorais e após 3h iniciou-se o tratamento terapêutico com os flavonóides e acetoxi DMU, via intraperitoneal, 5 vezes consecutivas por semana, durante aproximadamente 21 dias (n=10/grupo). A: grupo controle sem tumor; B: grupo controle com tumor; C: grupo tratado com acetoxi DMU; D: grupo com tumor tratado com acetoxi DMU. Seta: núcleo de hepatócitos. Estrela: capilar sinusóide.
Cabeça de seta: células de Kupffer. Aumento 1000X. ... 84 Figura 27: Morfologia hepática de ratos Wistar inoculados com o tumor e tratados
com quercetina. Ratos Wistar foram inoculados subcutaneamente (no flanco
direito) com células tumorais e após 3h iniciou-se o tratamento terapêutico com quercetina, via intraperitoneal, 5 vezes consecutivas por semana, durante aproximadamente 21 dias (n=10/grupo). A: grupo controle sem tumor; B: grupo
xx
seta: células de Kupffer. Aumento 1000X. ... 85 Figura 28: Atividade da superóxido dismutase (SOD) hepática dos grupos
inoculados com tumor submetidos ao tratamento com quercetina, morina e narigina, com e sem inoculação do tumor. Ratos Wistar foram inoculados
subcutaneamente (no flanco direito) com células tumorais e após 3h iniciou-se o tratamento terapêutico com os flavonóides, via intraperitoneal, 5 vezes consecutivas por semana, durante aproximadamente 21 dias (n=10/grupo). Gráfico
A: ratos inoculados com tumor tratados com quercetina 10mg/kg (TQ10); gráfico B:
ratos inoculados com tumor tratados com narigina 25mg/kg; gráfico C: ratos inoculados com tumor tratados com morina 25mg/kg. Legenda: C: ratos controle; T: ratos inoculados com tumor. Q10, N25 e M25: correspondem aos grupos sem tumor tratado com 10mg/kg de quercetina e 25mg/kg de narigina e morina, respectivamente; TQ10, TN25 e TM25: correspondem aos grupos inoculados com tumor tratados com 10mg/kg de quercetina e 25mg/kg de narigina e morina, respectivamente. Os procedimentos para a inoculação das células tumorais nos ratos e o tratamento com os flavonóides encontram-se descritos em Métodos. As colunas representam as médias ± erro padrão. *p < 0,05; ** p < 0,01 e *** p < 0,001 em relação ao grupo C; a letra a indica diferença significante (p < 0,05) em relação ao grupo T. ... 88
Figura 29: Atividade da catalase (CAT) hepática dos grupos experimentais controle e tratados com quercetina, morina e narigina, com e sem inoculação do tumor. Ratos Wistar foram inoculados subcutaneamente (no flanco direito) com
células tumorais e após 3h iniciou-se o tratamento terapêutico com os flavonóides, via intraperitoneal, 5 vezes consecutivas por semana, durante aproximadamente 21 dias (n=10/grupo). Gráfico A: ratos inoculados com tumor tratados com quercetina 10mg/kg (TQ10); gráfico B: ratos inoculados com tumor tratados com narigina 25mg/kg; gráfico C: ratos inoculados com tumor tratados com morina 25mg/kg. Legenda: C: ratos controle; T: ratos inoculados com tumor. Q10, N25 e M25: correspondem aos grupos sem tumor tratado com 10mg/kg de quercetina e 25mg/kg de narigina e morina, respectivamente; TQ10, TN25 e TM25: correspondem aos grupos inoculados com tumor tratados com 10mg/kg de quercetina e 25mg/kg de narigina e morina, respectivamente. Os procedimentos para a inoculação das células tumorais nos ratos e o tratamento com os flavonóides encontram-se descritos em Métodos. As colunas representam as médias ± erro padrão. ** indica diferença significante (p < 0,05) em relação ao grupo C; a letra a indica diferença significante (p < 0,05) em relação ao grupo T. ... 89
Figura 30: Atividade hepática de interleucina-6 (IL-6) de ratos portadores de tumor sob os efeitos do tratamento terapêutico com narigina, morina e acetoxi DMU. Ratos Wistar foram inoculados subcutaneamente (no flanco direito)
com células tumorais e após 3h iniciou-se o tratamento terapêutico com os flavonóides e acetoxi DMU, via intraperitoneal, 5 vezes consecutivas por semana, durante aproximadamente 21 dias (n=10/grupo). Gráfico A: tecido hepático;
gráfico B: tecido tumoral. Legenda: C: ratos controle; T: ratos inoculados com
tumor. N25, M25 e AD25: correspondem aos grupos sem tumor tratado com 25mg/kg de narigina, morina e acetoxi DMU, respectivamente; TN25, TM25 e
xxi
tumorais nos ratos e o tratamento com os compostos encontram-se descritos em Métodos. As colunas representam as médias ± erro padrão. * e ** indicam diferença significante (p<0,05 e p<0,01, respectivamente) em relação aos grupos controle (C no gráfico A e T no gráfico B). ... 93
Figura 31: Nível hepático e tumoral de fator de necrose tumoral alfa (TNF-alfa) de ratos portadores de tumor sob os efeitos do tratamento terapêutico com narigina, morina e acetoxi DMU. Ratos Wistar foram inoculados subcutaneamente
(no flanco direito) com células tumorais e após 3h iniciou-se o tratamento terapêutico com os flavonóides e acetoxi DMU, via intraperitoneal, 5 vezes consecutivas por semana, durante aproximadamente 21 dias (n=10/grupo). Gráfico
A: tecido hepático; gráfico B: tecido tumoral. Legenda: C: ratos controle; T: ratos
inoculados com tumor. N25, M25 e AD25: correspondem aos grupos sem tumor tratado com 25mg/kg de narigina, morina e acetoxi DMU, respectivamente; TN25,
TM25 e TAD25: ratos portadores do tumor tratados com 25mg/kg de narigina,
morina e acetoxi DMU, respectivamente. Os procedimentos para a inoculação das células tumorais nos ratos e o tratamento com os compostos encontram-se descritos em Métodos. As colunas representam as médias ± erro padrão. * e *** indicam diferença significante (p<0,05 e p<0,001, respectivamente) em relação aos grupos controle (C no gráfico A e T no gráfico B). ... 94
Figura 32: Expressão hepática e tumoral de Fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) de ratos portadores de tumor sob os efeitos do tratamento terapêutico com quercetina. Ratos Wistar foram inoculados subcutaneamente (no
flanco direito) com células tumorais e após 3h iniciou-se o tratamento terapêutico com quercetina, via intraperitoneal, 5 vezes consecutivas por semana, durante aproximadamente 21 dias (n=10/grupo). Gráfico A: tecido hepático; gráfico B: tecido tumoral. Legenda: C: ratos controle; T: ratos portadores do tumor; Q10: grupo sem tumor tratado com 10mg/kg de quercetina; TQ10: ratos portadores do tumor tratados com 10mg/kg de quercetina. Os procedimentos para a inoculação das células tumorais nos ratos, o tratamento com quercetina e a técnica usada para a dosagem encontram-se descritos em Métodos. As colunas representam as médias ± erro padrão. *** indica diferença significante (< 0,001) em relação aos grupos controle (C no gráfico A e T no gráfico B); a letra a indica diferença estatisticamente significante (p < 0,05) em relação ao grupo T. ... 97
Figura 33: Expressão hepática e tumoral de Fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) de ratos portadores de tumor sob os efeitos do tratamento terapêutico com narigina, morina e acetoxi DMU. Ratos Wistar foram inoculados
subcutaneamente (no flanco direito) com células tumorais e após 3h iniciou-se o tratamento terapêutico com os flavonóides e acetoxi DMU, via intraperitoneal, 5 vezes consecutivas por semana, durante aproximadamente 21 dias (n=10/grupo).
Gráfico A: tecido hepático; gráfico B: tecido tumoral. Legenda: C: ratos controle; T:
ratos portadores do tumor; N25, M25 e AD25: correspondem aos grupos sem tumor tratado com 25mg/kg de narigina, morina e acetoxi DMU, respectivamente; T N25,
TM25 e TAD25: ratos portadores do tumor tratados com 25mg/kg de narigina,
morina e acetoxi DMU, respectivamente. Os procedimentos para a inoculação das células tumorais nos ratos e o tratamento com os compostos encontram-se
xxii
no gráfico B). ... 98
Figura 34: Zimograma mostrando a atividade gelatinolítica de MMP-2 hepática e tumoral (MMP-2), bem como seu zimogênio (Pró MMP-2) em animais portadores de tumor sob os efeitos do tratamento terapêutico com quercetina. Ratos Wistar foram inoculados subcutaneamente (no flanco direito)
com células tumorais e após 3h iniciou-se o tratamento terapêutico com quercetina, via intraperitoneal, 5 vezes consecutivas por semana, durante aproximadamente 21 dias (n=10/grupo). Legenda: C: ratos controle; T: ratos inoculados com tumor. Q10: correspondem aos grupos sem tumor tratado com 10mg/kg de quercetina; TQ10: correspondem aos grupos inoculados com tumor e tratados com 10mg/kg de quercetina; T(T) e TQ10(T) se referem às amostras do tecido tumoral. Os procedimentos para a inoculação das células tumorais nos ratos e o tratamento com quercetina encontram-se descritos em Métodos. As colunas representam as médias ± erro padrão. * indica diferença significante (p < 0,05) em relação ao grupo C; a letra a indica diferença significante (p < 0,05) em relação ao grupo T; a letra b indica diferença significante (p < 0,05) em relação ao grupo T(T). ... 101
Figura 35: Zimograma mostrando a atividade gelatinolítica de MMP-2 hepáticas (MMP-2), bem como seu zimogênio (Pró MMP-2) em animais portadores de tumor sob os efeitos do tratamento terapêutico com narigina. Ratos Wistar
foram inoculados subcutaneamente (no flanco direito) com células tumorais e após 3h iniciou-se o tratamento terapêutico com narigina, via intraperitoneal, 5 vezes consecutivas por semana, durante aproximadamente 21 dias (n=10/grupo). Legenda: C: ratos controle; T: ratos inoculados com tumor. N25: correspondem aos grupos sem tumor tratado com 25mg/kg de narigina; TN25: correspondem aos grupos inoculados com tumor tratados com 25mg/kg de narigina. T(T) e TN25(T) se referem às amostras do tecido tumoral. Os procedimentos para a inoculação das células tumorais nos ratos e o tratamento com o flavonóide encontram-se descritos em Métodos. As colunas representam as médias ± erro padrão. * indica diferença significante (p<0,05) em relação ao grupo C; a letra a indica diferença significante (p<0,05) em relação ao grupo T; a letra b indica diferença significante (p<0,05) em relação ao grupo T(T). ... 102
Figura 36: Zimograma mostrando a atividade gelatinolítica de MMP-2 hepáticas (MMP-2), bem como seu zimogênio (Pró MMP-2) em animais portadores de tumor sob os efeitos do tratamento terapêutico com morina. Ratos Wistar
foram inoculados subcutaneamente (no flanco direito) com células tumorais e após 3 horas iniciou-se o tratamento terapêutico com morina, via intraperitoneal, 5 vezes consecutivas por semana, durante aproximadamente 21 dias (n=10/grupo). Legenda: C: ratos controle; T: ratos inoculados com tumor. M25: correspondem aos grupos sem tumor tratado com 25mg/kg de morina; TM25: correspondem aos grupos inoculados com tumor tratados com 25mg/kg de morina. T(T) e TM25(T) se referem às amostras do tecido tumoral. Os procedimentos para a inoculação das células tumorais nos ratos e o tratamento com morina encontram-se descritos em Métodos. As colunas representam as médias ± erro padrão. * indica diferença significante (p<0,05) em relação ao grupo C; a letra a indica diferença significante
xxiii
Figura 37: Zimograma mostrando a atividade gelatinolítica de metaloproteínases de matrix extracelular-2 (MMP-2) hepáticas e tumorais, bem como seu zimogênio (Pró MMP-2) em animais portadores de tumor submetidos ao tratamento terapêutico com acetoxi DMU. Ratos Wistar foram inoculados
subcutaneamente (no flanco direito) com células tumorais e após 3h iniciou-se o tratamento terapêutico acetoxi DMU, via intraperitoneal, 5 vezes consecutivas por semana, durante aproximadamente 21 dias (n=10/grupo). Legenda: C: ratos controle; T: ratos inoculados com tumor. AD25: correspondem aos grupos sem tumor tratado com 25mg/kg de acetoxi DMU; TAD25: correspondem aos grupos inoculados com tumor tratados com 25mg/kg de acetoxi DMU. T(T) e TAD25(T) se referem às amostras do tecido tumoral. Os procedimentos para a inoculação das células tumorais nos ratos e o tratamento com acetoxi DMU encontram-se descritos em Métodos. As colunas representam as médias ± erro padrão. A letra b indica diferença significante (p<0,05) em relação ao grupo T(T). ... 104
Figura 38: Expressão da Proteína Tirosina Fosfatase de Baixa Massa Molecular (PTP) no tecido hepático de ratos portadores de tumor sob os efeitos do tratamento terapêutico com quercetina. Ratos Wistar foram inoculados
subcutaneamente (no flanco direito) com células tumorais e após 3h iniciou-se o tratamento terapêutico com quercetina, via intraperitoneal, 5 vezes consecutivas por semana, durante aproximadamente 21 dias (n=10/grupo). Legenda: C: ratos controle; T: ratos inoculados com tumor. Q10: correspondem aos grupos sem tumor tratado com 10mg/kg de quercetina; TQ10: correspondem aos grupos inoculados com tumor tratados com 10mg/kg de quercetina. Os procedimentos para a inoculação das células tumorais nos ratos e o tratamento com quercetina encontram-se descritos em Métodos. As colunas representam as médias ± erro padrão. ** indica diferença significante (p<0,01) em relação ao grupo C; a letra a indica diferença significante (p<0,05) em relação ao grupo T. ... 107
Figura 39: Expressão da Proteína Tirosina Fosfatase de Baixa Massa Molecular (PTP) no tecido hepático de ratos portadores de tumor sob os efeitos do tratamento terapêutico com narigina. Ratos Wistar foram inoculados
subcutaneamente (no flanco direito) com células tumorais e após 3h iniciou-se o tratamento terapêutico com narigina, via intraperitoneal, 5 vezes consecutivas por semana, durante aproximadamente 21 dias (n=10/grupo). Legenda: C: ratos controle; T: ratos inoculados com tumor. N25: correspondem aos grupos sem tumor tratado com 25mg/kg de narigina; TN25: correspondem aos grupos inoculados com tumor tratados com 25mg/kg de narigina. Os procedimentos para a inoculação das células tumorais nos ratos e o tratamento com os flavonóides encontram-se descritos em Métodos. As colunas representam as médias ± erro padrão. *** indica diferença significante (p<0,001) em relação ao grupo C; a letra a indica diferença significante (p<0,05) em relação ao grupo T. ... 108
Figura 40: Expressão da Proteína Tirosina Fosfatase de Baixa Massa Molecular (PTP) no tecido hepático de ratos portadores de tumor sob os efeitos do tratamento terapêutico com morina. Ratos Wistar foram inoculados subcutaneamente (no flanco direito) com células tumorais e após 3h iniciou-se o tratamento terapêutico com morina, via intraperitoneal, 5 vezes consecutivas por
xxiv
tratado com 25mg/kg de morina; TM25: correspondem aos grupos inoculados com tumor tratados com 25mg/kg de morina. Os procedimentos para a inoculação das células tumorais nos ratos e o tratamento com o flavonóide encontram-se descritos em Métodos. As colunas representam as médias ± erro padrão. * e *** indicam diferença significante (p<0,05 e p<0,001, respectivamente) em relação ao grupo C; a letra a indica diferença estatisticamente significante (p<0,05) em relação ao grupo T. ... 109
Figura 41: Expressão da Proteína Tirosina Fosfatase de Baixa Massa Molecular (PTP) no tecido tumoral de ratos portadores de tumor sob os efeitos do tratamento terapêutico com quercetina, narigina e morina. Ratos Wistar foram
inoculados subcutaneamente (no flanco direito) com células tumorais e após 3h iniciou-se o tratamento terapêutico com os flavonóides, via intraperitoneal, 5 vezes consecutivas por semana, durante aproximadamente 21 dias (n=10/grupo). Legenda: T: ratos portadores do tumor; Q10, N25 e M25: correspondem aos grupos sem tumor tratado 10mg/kg quercetina e 25mg/kg de narigina e morina, respectivamente; TQ10, T N25 e TM25: ratos portadores do tumor tratados com 10mg/kg quercetina e 25mg/kg de narigina e morina, respectivamente. Os procedimentos para a inoculação das células tumorais nos ratos e o tratamento com os flavonóides encontram-se descritos em Métodos. As colunas representam as médias ± erro padrão. *** indica diferença significante (p<0,001) em relação ao grupo T. ... 110
xxv
Tabela 1: Proporção volumétrica dos componentes do testículo de ratos inoculados ou não com o tumor, com ou sem tratamento com Acetoxi DMU.
xxvi
AD: grupo dos ratos tratados com acetoxi DMU
C: grupo controle dos ratos sem tratamento e sem tumor. CAT: catalase
ED50: dose resposta IL-6: interleucina-6
M: grupo dos ratos tratados com morina MMP-2: metaloproteinases de matriz-2 N: grupo dos ratos tratados com narigina
PTP-LMW: proteína tirosina fosfatase de baixa massa molecular Q: grupo dos ratos tratados com quercetina
SOD: superóxido dismutase
T: grupo controle dos ratos portadores de tumor
TAD: grupo dos ratos portadores de tumor tratados com acetoxi DMU TM: grupo dos ratos portadores de tumor tratados com morina
TN: grupo dos ratos portadores de tumor tratados com narigina TNF-α: fator de necrose tumoral alfa
TQ: grupo dos ratos portadores de tumor tratados com quercetina VEGF: fator de crescimento vascular endotelial
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"Todas as coisas são um veneno e nada existe sem veneno, apenas a dosagem é razão para que uma coisa não seja um veneno" Theophrastus Bombastus von Hohenheim (Paracelso)
Atualmente o câncer é um problema de saúde pública mundial, em virtude do aumento de sua incidência. A anorexia e a perda de peso involuntária são comuns em pacientes oncológicos. Esta condição, também conhecida como caquexia, afeta a capacidade funcional, a resposta ao tratamento, a qualidade de vida e a sobrevida do paciente. Estima-se que aproximadamente dois milhões de pessoas no mundo morrem anualmente devido às conseqüências da via câncer/caquexia. O modelo estudado neste trabalho é o carcinossarcoma de Walker 256 (W256), que tem como característica principal o desenvolvimento da caquexia nos animais portadores, devido ao seu comportamento biológico agressivo, crescimento invasivo e alto potencial de metástase.
Os flavonóides, fitocompostos polifenólicos encontrados em plantas, apresentam diversas atividades biológicas, principalmente, devido as suas propriedades antioxidantes e habilidades em modular diversas enzimas ou receptores celulares. Estes compostos possuem efeitos protetores contra doenças relacionadas ao sistema cardiovascular, certas etiologias de câncer, doenças provocadas pela fotossensibilidade e envelhecimento, dentre outras.
A proposta do presente estudo foi avaliar os efeitos dos flavonóides quercetina, narigina, morina e do composto acetoxi DMU (um derivado sintético do resveratrol e do DMU-212), na prevenção/atenuação da caquexia e inibição do crescimento do tumor em ratos portadores de W256, num estudo pré-clínico. Ratos machos sadios foram inoculados subcutaneamente, no flanco direito, com as células tumorais e tratados com diferentes doses dos compostos (10, 25 e 35mg/kg), via intraperitoneal, 5 dias consecutivos por semana, durante 50 dias ou até o óbito. A administração de 10mg/kg de quercetina e de 25mg/kg de narigina, morina e do composto acetoxi DMU inibiram cerca de 50% o crescimento do tumor (ED50) quando comparado com os animais controle inoculados com tumor, sem tratamento (grupo Tumor). A ED50 para os
xxviii
aumento de 30, 70, 60 e 70%, respectivamente, na sobrevida dos ratos tratados (p < 0,05) em contraste aos 100% de mortalidade observada no grupo Tumor. Outra conseqüência da administração da ED50foi a ocorrência de regressão tumoral em 2, 5, 2 e 3 animais, respectivamente, para os tratamentos com quercetina, narigina, morina e acetoxi DMU (n=10).
O tratamento com os compostos também foi eficiente em manter os níveis das citocinas TNF-α e IL-6 (no tecido hepático e tumoral do hospedeiro), mediadores do processo caquético, semelhantes aos encontrados nos ratos controle sem tumor (grupo Controle). Já os ratos do grupo Tumor apresentaram altos níveis destas citocinas, tanto nas amostras de fígado como nas de tumor. Os tratamentos promoveram também um alto potencial anti-angiogênico, mostrado através da diminuição na expressão de VEGF e nas atividades das MMP-2 presentes nas amostras de fígado e tumor. Os níveis de VEGF encontrados nos fígados dos ratos do grupo Tumor foram significantemente maiores que os do grupo Controle.
Outro efeito do tratamento com os compostos foi uma diminuição significativa na expressão da proteína tirosina fosfatase de baixa massa molecular (nas amostras de fígado e tumor), que havia sido super-expressa em animais do grupo Tumor.
As análises dos pesos dos testículos e órgãos reprodutivos acessórios (epidídimo, vesícula seminal, glândula de coagulação e próstata) foram feitas para os animais tratados com narigina e acetoxi DMU. Os resultados indicaram uma redução significativa nos órgãos dos animais do grupo Tumor em comparação com o grupo Controle. Pelo contrário, o tratamento terapêutico de ratos com tumor com a narigina e o acetoxi DMU se mostrou eficaz em proteger a morfologia destes órgãos e inibir esta redução.
De acordo com os resultados obtidos, o melhor tratamento foi obtido com o acetoxi DMU. Os resultados obtidos neste trabalho confirmam o efeito dos flavonóides e de acetoxi DMU em diminuir os sintomas da caquexia no modelo tumoral utilizado para experimentação e em inibir o crescimento tumoral, contribuindo, assim, para uma melhor compreensão da ação in vivo destes compostos, tanto no organismo sadio como na presença do tumor.
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Currently, cancer is a public health problem worldwide in virtue of the increase in incidence. Anorexia and involuntary weight loss are common in cancer patients. This condition, also known as cachexia, affects the functional capacity, response to treatment, quality of life and patient survival. It is estimated that approximately two million people worldwide die annually because of cancer cachexia consequences. In this work the Walker 256 carcinosarcoma (W256) is used as an experimental model to establish cancer cachexia in infected animals. Furthermore, it presents an aggressive biological behavior, local invasive growth and high metastasis potential.
Flavonoids are polyphenolic compounds with several biological activities mainly due to its antioxidant properties and ability to modulate several enzymes or cellular receptors. These characteristics are associated with the protective effect attributed to these compounds against cardiovascular system diseases, some causes of cancer, diseases caused by photosensitivity and aging, among other.
The aim of this study was to evaluate the effects of the flavonoids quercetin, naringin and morin and the compound acetoxy DMU (a synthetic derivative of resveratrol and DMU-212) in the cachexia prevention/attenuation and inhibition of tumor growth in rats bearing W256, in a preclinical study. Healthy male rats were inoculated with tumor cells and treated with different doses of quercetin, naringin, morin and acetoxy DMU (10, 25 and 35mg/kg) intraperitoneally administered, 5 consecutive times a week, during 50 days or until death. The administration of 10 mg/kg quercetin and 25mg/kg naringin, morin and acetoxy DMU inhibited about 50% of tumor growth (ED50) compared with Tumor group (untreated). The ED50 values for the treatment with quercetin, naringin, morin and acetoxy DMU were responsible for a survival increase about 30, 50, 40 and 60%, respectively, in contrast to 100% mortality observed in the tumor group. Another consequence of the ED50 administration was the tumor regression in 2, 5, 2 and 3 animals, respectively, for treatment with quercetin, naringin, morin and acetoxy DMU (n=10).
The effect of treatment with these compounds on cytokines mediators of the cachectic process (in liver and tumor tissue) was efficient in maintaining the TNF-α
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presented high levels of these cytokines in both liver and tumor samples. The treatments also promoted a high potential anti-angiogenic, shown by the decrease in VEGF expression and MMP-2 activity of liver and tumor samples. The VEGF levels found in Tumor group (liver samples) were significantly higher than the Control group.
Another effect of treatment with the compounds was a significant decrease in the low molecular weight protein tyrosine phosphatase expression (in liver and tumor tissue), which had been over-expressed in Tumor group.
Analyses of testes and accessory reproductive organs weights (epididymis, seminal vesicle, coagulating gland and prostate) were made for animals treated with narigina and acetoxy DMU. The results indicated a significant reduction in Tumor group organs compared with the Control group. On the other hand, the naringin and acetoxi DMU therapeutic treatments of rats with tumor have been proven effective in protecting the morphology of these organs and inhibiting its reduction.
According to the results, the best treatment was obtained with the acetoxy DMU. The results of this work confirm the effect of these flavonoids and acetoxi DMU on reducing the cachexia symptoms and tumor growth inhibition, contributing to a better understanding of the action of these compounds in vivo, both in healthy and in tumor organisms.
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INTRODUÇÃO
"Temos que suportar 2 ou 3 larvas se quisermos conhecer as borboletas" O Pequeno Príncipe
1.1 Epidemiologia do câncer
A cada ano, o câncer tem se consolidado como um problema de saúde pública em todo o mundo. Segundo recente relatório da Agência Internacional para Pesquisa em Câncer (WHO, 2009) o impacto global do câncer mais que dobrou em 30 anos, sendo hoje a segunda causa de morte por doença nos países desenvolvidos, perdendo apenas para as doenças cardiovasculares. Importante causa de doença e morte no Brasil, o câncer representa quase 17% dos óbitos de causa conhecida (SIM, 2009).
A Organização Mundial da Saúde (WHO, 2008) estimou que, em 2008, ocorreriam 12,4 milhões de novos casos e 7,6 milhões de óbitos por câncer no mundo. Destes, os mais incidentes foram o câncer de pulmão (1,52 milhões de casos novos), mama (1,29 milhões) e cólon e reto (1,15 milhões). O câncer de pulmão foi a principal causa de morte, devido ao mau prognóstico (1,31 milhões), seguido pelo câncer de estômago (780 mil óbitos) e pelo câncer de fígado (699 mil óbitos).
No Brasil, segundo o Instituto Nacional do Câncer (INCA, 2010), as estimativas para 2010/2011 apontam para a ocorrência de 236.240 casos novos para o sexo masculino e 253.030 para o sexo feminino. O câncer de pele do tipo não melanoma (114 mil casos novos) deverá ser o mais incidente na população brasileira, seguido pelos tumores de próstata (52 mil), mama feminina (49 mil), cólon e reto (28 mil), pulmão (28 mil), estômago (21 mil) e colo do útero (18 mil), (INCA, 2010).
