UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
CENTRO DE BIOCIÊNCIASPROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ECOLOGIA
Insetos herbívoros e taxa de fecundação cruzada em
espermatófitas
Tales Martins de Alencar Paiva
Orientador: Prof. Dr. Carlos Roberto Sorensen Dutra da Fonseca
Natal - RN
Fevereiro | 2020
Tales Martins de Alencar Paiva
Insetos herbívoros e taxa de fecundação cruzada em
espermatófitas
Dissertação de mestrado apresentada ao
Programa de Pós-Graduação em Ecologia
da Universidade Federal do Rio Grande do
Norte como requisito parcial para
obtenção do grau de Mestre em ecologia.
Orientador: Prof. Dr. Carlos Roberto Sorensen Dutra da Fonseca
Natal - RN
Fevereiro | 2020
Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRN Sistema de Bibliotecas - SISBI
Catalogação de Publicação na Fonte. UFRN - Biblioteca Setorial Prof. Leopoldo Nelson - -Centro de Biociências - CB
Paiva, Tales Martins de Alencar.
Insetos herbívoros e taxa de fecundação cruzada em
espermatófitas / Tales Martins de Alencar Paiva. - Natal, 2020. 85 f.: il.
Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Centro de Biociências. Programa de Pós-graduação em
Ecologia.
Orientador: Prof. Dr. Carlos Roberto Sorensen Dutra da Fonseca.
1. Herbivoria - Dissertação. 2. Modelos evolutivos - Dissertação. 3. Sistemas sexuais - Dissertação. 4. Inimigos naturais - Dissertação. 5. Hipótese da Rainha Vermelha - Dissertação. I. Fonseca, Carlos Roberto Sorensen Dutra da. II. Universidade Federal do Rio Grande do Norte. III. Título. RN/UF/BSCB CDU 591.531.1
Tales Martins de Alencar Paiva
Insetos herbívoros e taxa de fecundação cruzada em
espermatófitas
Dissertação de mestrado apresentada ao
Programa de Pós-Graduação em Ecologia
da Universidade Federal do Rio Grande do
Norte como requisito parcial para
obtenção do grau de Mestre em ecologia.
Data da defesa: 19/02/2020
BANCA
EXAMINADORA
______________________________________
Dr. Carlos Roberto Sorensen Dutra da Fonseca
Presidente/Orientador | UFRN
______________________________________
Dra. Vanessa Graziele Staggemeier
Membro interno | UFRN
______________________________________
Dr. Gustavo Brant de Carvalho Paterno
“Uma pessoa que está sentada em vez de estar de pé;
os destinos às vezes dependem disso.”
- Trecho encontrado em alguma página de Os miseráveis (Victor Hugo) durante uma noite sem sono -
D
EDICATÓRIAVovó Terezinha e Vovô Severino,
por todo o carinho e por todos os
bons momentos que vivemos
juntos, que deixaram em mim
saudosas lembranças, dedico a
vocês esta dissertação.
A
GRADECIMENTOSM
INHA FAMÍLIAAntes de qualquer outra coisa, gostaria de agradecer aos meus pais - Letice e Francisco - obrigado pelo carinho incondicional e pelo apoio que sempre recebi de vocês em todos os meus planos, por mais improváveis que fossem. Não poderia desejar pessoas melhores para serem meus progenitores e meus guias nesta vida. Também agradeço por me proporcionarem uma boa educação, tanto formal quanto cotidiana, que me possibilitou poder ver e questionar muito do que o mundo nos apresenta, um privilégio que poucos têm em um país tão desigual.
Ao meu irmão, Théo, e minha irmã, Maria Helena, por estarem sempre ao meu lado e participarem da minha jornada, espero que continuem sempre sendo as pessoas incríveis que vejo que vocês estão se tornando. Apesar da minha pouca presença física nos últimos anos, podem sempre contar com seu irmão mais velho para tudo. Já conto com vocês para cuidarem de mim quando eu estiver caduco!
Aos meus avós - Terezinha e Severino (In memoriam) - pelo exemplo de pessoas admiráveis que vocês sempre foram. Todo carinho, encanto, diversão, alegria e incentivo que alguém pode desejar eu recebi, e ainda recebo, de vocês. Obrigado pelos dias que passamos juntos. Acho que nunca poderei agradecer da forma que vocês merecem. Se um dia eu vier a representar para alguém o que vocês representam para mim, o brilho ainda será o de vocês.
Aos meus avós - Salete (In memoriam) e Xixico - que apesar do nosso pouco tempo de convívio, em parte devido à morte e em parte devido à vida, sei do enorme carinho que sempre tiveram por mim. Gostaria de ter compartilhado com vocês algumas das histórias que me foram narradas. Não foi possível..., porém o pouco de proximidade que a vida nos permitiu foi suficiente para que fosse recheada de boas recordações.
À minha madrinha Cláudia, uma pessoa especial e radiante, portadora de um enorme coração, que mal cabe dentro do peito. Obrigado pelo carinho e afeto, e por sempre direcionar a mim bons pensamentos. Sei que poderei sempre contar com você para compartilhar bons momentos de risadas e também aquela cervejinha gelada com a turma toda (ou algumas garrafas de vinho no festival gastronômico de Martins)!
Agradeço a todos os demais familiares, meus tios, tias, primos e primas, que de alguma maneira sempre me apoiaram e me ajudaram neste caminho. Gratidão a todos vocês!
A
MIGOS E PESSOAS ESPECIAISMuitas pessoas fizeram parte desta história, velhos e novos amigos foram essenciais para que eu chegasse ao fim desta importante etapa da minha jornada acadêmica. Vou tentar sintetizar em poucos parágrafos, com a certeza que não conseguirei contemplar tudo e todos que participaram desta caminhada de forma completa.
Primeiramente, quero agradecer ao meu orientador Carlos Fonseca. Antes de tudo, pela confiança de me aceitar em seu grupo de pesquisa e me pôr à frente deste projeto, pelo qual desenvolvi um genuíno interesse e um enorme carinho. Sou grato também pelo apoio e suporte durante a elaboração e execução de todo o projeto, sempre que precisei de um norte, encontrei na sua orientação. Sem dúvidas encontrei uma ótima pessoa e um exímio pesquisador com quem espero seguir trabalhando nas próximas etapas da minha vida acadêmica!
Agradeço aos meus companheiros de laboratório: Gustavão, um cientista exemplar, cujo amor pela ciência é inspirador. Sou grato por toda a ajuda, sugestões, e por ter sido pra mim um excelente co-orientador durante essa pesquisa. Andressa, minha simpática amiga, super solícita e atenciosa, a quem agradeço pelo companheirismo durante esses anos e pela disposição para me ajudar sempre que precisei.
Agradeço a todos os amigos que fiz no PPGECO durante o mestrado, com os quais dividi bons momentos de ciência, conversas, almoços, ansiedades, cafés e cervejas. Gabriel, Ana Elizabeth, Fernanda, Kelly, Mery, Thayná, Priscila, Bruno, Coquinha, Marcelo, Milico, Ursão, André Yuri, Felipe Marinho, Paulo Henrique, Virgínia, Adriana Almeida, Milena, Nádia, Vitão, Kionara, Dimas, dona Marlene... Obrigado a todos vocês e desculpem se esqueci de mencionar alguém! Quero deixar um agradecimento especial para meu amigo Gabriel, obrigado pela parceria em todas as empreitadas que enfrentamos juntos durante esses anos, dentro e fora da pós-graduação.
Minha história na ciência começou bem antes da pós-graduação. Quero aqui agradecer ao meu ex-orientador Gabriel Costa, pela oportunidade de ingressar em um laboratório engajado e viver, ainda na graduação, um ambiente onde se respirava ciência e companheirismo. Foi ali que conheci pessoas que me fizeram ver a beleza da ciência e foi com eles que decidi dedicar minha vida a esta linda profissão. Andre (Tritão), Juan Pablo (Juanpy), Bruno Maggi, Felipe Coelho, Bruninho e Adrián (Pichi). Valeu por tudo, galera! Não posso deixar de expressar minha imensa gratidão a Andre, o primeiro amigo que fiz quando cheguei a Natal, hoje um irmão. Obrigado por guiar meus primeiros passos na ciência, pelo incentivo, conselhos, parceria e pelas conversas de bar em todos esses anos. Espero que continuemos trabalhando juntos por muito tempo! Serei eternamente grato por você ter acreditado na minha jornada acadêmica, muitas vezes mais do que eu mesmo acreditei.
Aos velhos amigos, que apesar da distância física que a vida nos impôs, sempre estiveram ao meu lado, torcendo por mim. Luiz Eduardo e João Filho, nossa amizade, que já se aproxima dos vinte anos de história, sempre será uma fonte de apoio mútuo e parceria. Meus irmãos, onde quer que estejamos me alegro em saber que posso contar com vocês. E quando a gente menos espera, um reencontro na antiga Ribeira pode encher nossa vida de alegria e vitalidade. Agradeço a Paloma, minha linda, por estar ao meu lado durante os últimos tempos, inclusive os mais difíceis. Aprendi e vivi muitas coisas bonitas graças a sua companhia. Que os melhores e mais belos seres elementais te acompanhem por toda sua vida! Te adoro, morena/ruivinha!
UFRN
Agradeço à Universidade Federal do Rio Grande do Norte, ao Centro de Biociências e ao Departamento de Ecologia, por me proporcionarem uma formação sólida, abrangente e de excelência, tanto na graduação como no mestrado, onde pude aprofundar meus conhecimentos e práticas na área a qual hoje dedico meu trabalho e esforço acadêmico com muito carinho e empenho.
Agradeço ao PPGECO por esses dois anos de aprendizado, trabalho e imersão científica, que me possibilitou crescer como pesquisador e como pessoa. A todos os professores que compõem a pós-graduação que se dedicaram em tornar este programa referência internacional em Ecologia. Espero que o programa continue crescendo e formando pesquisadores com uma visão abrangente, dotados de curiosidade e preocupações reais com a investigação científica e as causas socioambientais. Tenho muito orgulho de fazer parte desta família.
Agradeço ao professor Márcio Zikán pela oportunidade de realizar um ótimo estágio de docência durante o mestrado, onde pude participar do andamento de uma disciplina encantadora e fundamental para uma boa formação em Ciências Biológicas.
Agradeço à professora Vanessa Staggemeier pela solicitude de sempre e pelas contribuições essenciais para este trabalho, especialmente durante os processos do exame de qualificação e da defesa de dissertação.
Agradeço a todo o corpo docente que fez parte da minha trajetória desde meu ingresso na universidade, a todos os colegas que me ajudaram nessa caminhada e a todos os membros da UFRN que direta ou indiretamente contribuíram para minha formação. Para onde quer que os ventos da ciência me levem, certamente irá comigo tudo o que aprendi e vivi na UFRN.
O presente trabalho foi realizado com apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brasil (CAPES) - Código de Financiamento 001.
S
UMÁRIOL
ISTA DE FIGURAS...
XI
L
ISTA DE TABELAS...
XIII
I
NTRODUÇÃO GERAL...
1
S
INGLE CHAPTERInsect herbivores modulate outcrossing rates across seed plants...
14
A
BSTRACT………..16
I
NTRODUCTION………...17
M
ATERIAL AND METHODS………..
20
R
ESULTS……….23
D
ISCUSSION………25
C
ONCLUSIONS………...………….29
A
CKNOWLEDGEMENTS………...30
A
UTHORS’
CONTRIBUTIONS………30
D
ATA AVAILABILITY………...30
R
EFERENCES………...31
F
IGURES AND TABLES……….40
S
UPPORTING INFORMATION………43
A
PPENDIX1………..44
L
ISTA DE FIGURASFigure 1. Phylonegetic regressions between outcrossing rates and hervivores richness.
(A) for 136 species of seed plants under two alternative evolutionary models. (B) only for 83 European-native species under two alternative evolutionary models. (C) Only fore 53 exotic species under two alternative evolutinary models. Blue line: phylogenetic regression under Ornstein-Uhlenbeck model. Red line: phylogenetic regression under Brownian Motion model. Herbivores richeness values were extracted from a method to correct the effort bias (see methods)………40
Figure 2. Distribution of outcrossing rate and vegetative variables. The categorical
variables: (A) outcrossing rate and life span. (B) outcrossing rate and growth form. In both cases the points represent de mean value and bars represent the standard error. The continuous variables: (C) outcrossing rate and maximum height. (D) outcrossing rate and SLA. In both case the lines express the PGLS under Brownian Motion model (red) and under Ornstein-Uhlenbeck (blue)……….41
Figure S1. Results of herbivores simple model (pgls.her) from the 10000 randomized
datasets for both Ornstein-Uhlenbeck (PGLS - OU) and Brownian Motion (PGLS - BM) evolutionary models. Horizontal blue line indicates the significance threshold (0.05). (A) Boxplot for OU results. (B) Scatterplot for OU results. (C) Boxplot for BM results. (D) Scatterplot for BM results. For OU models 99.96% and for BM models 93.67% were below the significance threshold………..68
Figure S2. Results of all simple models for OU. HERB = Herbivores richness, SLA =
Specific Leaf Area, MAX = Maximum height, BIE = Life span-Biennial, PER = Life span-Perennial, HEM = Growth form-Hemiparasite, HER = Growth form-Herb, LIA = Growth form-Liana, SHR = Growth form-Shrub, TRE = Growth form-Tree…………..69
Figure S3. Results of all simple models for BM. HERB = Herbivores richness, SLA =
Specific Leaf Area, MAX = Maximum height, BIE = Life span-Biennial, PER = Life span-Perennial, HEM = Growth form-Hemiparasite, HER = Growth form-Herb, LIA = Growth form-Liana, SHR = Growth form-Shrub, TRE = Growth form-Tree…….…….70
Figure S4. Results of the full OU model, that includes all fixed variables. F_HERB =
Herbivores richness, F_SLA = Specific Leaf Area, F_MAX = Maximum height, F_BIE = Life span-Biennial, F_PER = Life span-Perennial, F_HEM = Growth form-Hemiparasite, F_HER = Growth form-Herb, F_LIA = Growth form-Liana, F_SHR = Growth form-Shrub, TRE = Growth form-Tree……….71
Figure S5. Results of the full BM model, that includes all fixed variables. F_HERB
= Herbivores richness, F_SLA = Specific Leaf Area, F_MAX = Maximum height,
F_BIE = Life span-Biennial, F_PER = Life span-Perennial, F_HEM = Growth
form-Hemiparasite, F_HER = Growth form-Herb, F_LIA = Growth form-Liana, F_SHR = Growth form-Shrub, TRE = Growth form-Tree………..72
L
ISTA DE TABELASTable 1. Model averaging by AICc for Ornstein-Uhlenbeck models. Bold text marks
important models in explain outcrossing rate (tm) variation (delta < 2) ……….42
Table 2. Model averaging by AICc for Brownian Motion models. Bold text marks
important models in explain outcrossing rate (tm) variation (delta < 2) ……….42
Introdução geral
EVOLUÇÃO DA REPRODUÇÃO SEXUADA
A evolução da reprodução sexuada tem sido por muitas décadas uma das grandes questões da biologia evolutiva (Lively & Morran, 2014; Meirmans, 2009). Não é novidade que o sexo é comum na natureza, sendo observado na maioria das espécies. Porém, uma observação paradoxal se torna evidente quando comparamos a reprodução sexuada com mecanismos assexuais de reprodução (Otto, 2009). O sexo apresenta custos a curto prazo que, a priori, seriam desvantajosos para as espécies que assim se reproduzem. Primeiramente, ao nível da população, o sexo impõe o “custo dos machos”, que se refere ao fato dos machos não contribuírem diretamente com novos indivíduos para a próxima geração. Isso resulta em uma prole menor que a produzida por vias assexuadas, como a partenogênese, partindo de um mesmo número de genitores (Maynard Smith, 1977). Ao nível de indivíduo, os pais sexuados são penalizados com uma redução de 50% do parentesco com a sua prole em relação aos pais assexuados, que se reproduzem de forma clonal (Williams, 1975). Portanto, populações assexuadas crescem de forma mais rápida e com a uma semelhança genética elevada entre as gerações. Frente a tais custos, esperar-se-ia que uma população sexuada invadida por uma linhagem assexuada fosse rapidamente sobrepujada por esta última. Porém, espécies com reprodução estritamente assexuada são bastante raras na natureza (Vrijenhoek, 1998). A questão que surge a partir destas observações é: quais forças evolutivas são responsáveis pela persistência da reprodução sexuada na natureza? Para responder tal questão, diversos modelos e hipóteses integrando tanto aspectos genéticos quanto ecológicos têm sido propostos. (Hamilton, 1980; Bell, 1982; Muller, 1964; Williams, 1975; ver Otto, 2009).
Dentre as primeiras hipóteses formalmente propostas para explicar a vantagem do sexo em relação à reprodução assexuada podemos elencar duas. Primeiramente, temos a hipótese de Fisher-Muller (Fisher, 1930; Muller, 1932), que propõe que populações sexuadas, devido ao fenômeno da recombinação genética, podem unir em um mesmo genoma alelos benéficos ao indivíduo, enquanto populações assexuadas dependeriam de mutações, que são estocásticas, para que este alelos fossem fixados em um mesmo indivíduo. Neste cenário, as populações sexuadas gerariam indivíduos de maior fitness
com mais frequência e, consequentemente, teriam um maior sucesso evolutivo em relação às populações assexuadas. Uma segunda hipótese clássica, proposta para explicar as vantagens do sexo, ficou conhecida como Muller’s ratchet (“A catraca de Muller”) (Muller, 1964). A observação inicial desta teoria parte de que as mutações são na maioria das vezes deletérias, raramente ocorrendo mutações que revertem os alelos deletérios à sua forma benéfica. Deste modo, uma vez que surja uma mutação em uma população assexuada, ela tende se perpetuar pelas gerações clonais, acumulando-se com novas mutações deletérias que surgirão, resultando no declínio da viabilidade dos genomas, que poderá direcionar a população à extinção. Portanto, o sexo teria a vantagem de poder recriar os genomas benéficos, através da recombinação e do cruzamento com indivíduos não afetados pelas mutações deletérias, resultando em maior resistência às mutações deletérias ao longo do tempo. Finalmente, ambas as hipóteses têm em seu cerne processos genéticos, a nível de indivíduo e de população, como principais fatores que levam à vantagem do sexo, dando pouco enfoque aos fatores ecológicos que estão por trás da seleção diferencial dos genótipos. Nós focaremos, de agora em diante, em uma hipótese que abarca tanto fatores genéticos e como ecológicos como principais mecanismos para a evolução e persistência da reprodução sexuada, a Hipótese da Rainha Vermelha.
HIPÓTESE DA RAINHA VERMELHA
A Hipótese da Rainha Vermelha (HRV) traz a coevolução através de interações bióticas do tipo parasita-hospedeiro como principal causa da pressão seletiva que favorece a evolução e persistência da reprodução sexuada nas espécies(Jaenike & June, 1978; Hamilton, 1980; Bell, 1982). À luz da HRV, os parasitas exercem uma pressão seletiva antagônica mais forte sobre o genótipo mais comum na população de hospedeiros (Hamilton, 1980). Isso beneficiará hospedeiros com genótipos raros, que logo aumentarão sua frequência na população, culminando em uma seleção dependente de frequência sobre os genótipos. Portanto, alelos raros associados à resistência à infecção aumentam sua frequência na população, tornando-se comuns, o que jogará a seleção contra eles, direcionado os parasitas a desenvolverem meios de sobrepujar tal resistência. Dessa forma, a frequência dos alelos do parasita e do hospedeiro apresentarão uma dinâmica de oscilações cíclicas (Lively, 1996). Essa “corrida armamentista” pela sobrevivência travada entre parasita e hospedeiro na HRV requer uma fonte de variabilidade genética para o surgimento dos novos genótipos (Lively, 1996). A reprodução sexuada, apesar dos seus custos inerentes à curto prazo, já mencionados, é uma estratégia que gera
variabilidade de forma rápida, fornecendo à população genótipos novos e únicos a cada geração (Hartfield & Keightley, 2012). Portanto, o sexo é capaz de originar genótipos que tenham uma elevada resistência à parasitas a cada geração, diferentemente da reprodução clonal, onde a variabilidade genética na população é dependente de mutações estocásticas (Peters & Lively, 2007).
Em diversos grupos de animais, já foram encontrados resultados empíricos condizentes com a HRV, tanto em invertebrados quanto em vertebrados. O estudo de uma clássica dinâmica parasita-hospedeiro entre um caramujo de água doce (Potamopyrgus
antipodarum) e um verme trematódeo (Microphallus sp.), foi encontrado que em
populações onde variedades assexuadas e sexuadas do caramujo coexistem, há uma pressão seletiva contra os genótipos mais comuns de hospedeiro ao longo do tempo. Foi observado, também, que os genótipos uma vez comum na população, torna-se mais susceptível à infecção pelos trematódeos anos depois (Jokela, Dybdahl, & Lively, 2009). Um outro exemplo de sistema animal que fornece suporte para a HRV foi encontrado em
Kryptolebias marmoratus, um peixe hermafrodita, com populações compostas por
indivíduos puramente hermafroditas ou por machos e hermafroditas. Maiores cargas de parasitas estavam relacionadas com maiores níveis de autofecundação, enquanto cargas menores de parasitas estavam relacionadas com altos níveis de fecundação cruzada (Ellison, Cable, & Consuegra, 2011). Estes resultados indicam que a autofecundação deixa os peixes mais susceptíveis a infecção. Portanto, para vários grupos de animais a HRV surge como uma boa preditora para a ocorrência de reprodução sexuada e assexuada entre as espécies (Neiman, Meirmans, Schwander, & Meirmans, 2018). Porém, para outros grupos de seres vivos, a relação parasita-hospedeiro como principal explicação para evolução e persistência da reprodução sexuada foi pouco testada empiricamente, continuando sub explorada.
As plantas, em especial as angiospermas, possuem uma ampla diversidade de estruturas e mecanismos que garantem uma variedade de estratégias reprodutivas (Barrett, 2002). Porém, apesar deste grande potencial para estudos que investiguem a evolução da reprodução sexuada, há poucos trabalhos que exploraram explicitamente a HRV usando as plantas como modelo. Em um estudo pioneiro, foi encontrada uma relação positiva entre a taxa de recombinação genética e a pressão de inimigos naturais, como pestes, para várias espécies de plantas (Levin, 1975). Este estudo seminal antecedeu a formalização da Hipótese da Rainha Vermelha (Hamilton, 1980), mas já continha em
seu cerne o raciocínio biológico HRV. Estudos mais recentes têm investigado a relação entre estratégias reprodutivas em plantas e a pressão de inimigos naturais, como patógenos e herbívoros, vindo a encontrar resultados conforme o esperado pela HRV (Busch, Neiman, & Koslow, 2004; Verhoeven & Biere, 2013; Paterno et al., no prelo) ou encontrando resultados não esperados pela teoria (Hartmann et al., 2017). Portanto, a dinâmica parasita-hospedeiro como principal força direcionando as plantas à reprodução sexuada ainda são escassos e controversos, necessitando de estudos empíricos tanto a nível intra como a nível interspecífico.
SISTEMAS SEXUAIS EM PLANTAS
Tradicionalmente, as plantas têm seus sistemas sexuais categorizados segundo a relação entre os níveis de autofecundação e fecundação cruzada que cada espécie apresenta, variando dentro de um gradiente que vai de espécies totalmente autofecundantes (autógamas) até espécies totalmente cruzantes (alógamas) (Lande & Schemske, 1985). Muitos fatores evolutivos e ecológicos, tantos abióticos como bióticos, podem atuar no direcionamento desses sistemas sexuais, podendo favorecer a autofecundação ou a fecundação cruzada, ou ainda a manutenção de níveis intermediários de cada modo de reprodução, em sistemas mistos estáveis (Goodwillie, Kalisz, & Eckert, 2005). Por exemplo, é esperado que em ambientes que estão em processo de colonização, como estágios iniciais de sucessão, haja uma maior riqueza de espécies autógamas, com elevados índices de autofecundação (Baker, 1955). Em tais condições, há menor disponibilidade de indivíduos coespecíficos para troca de pólen, bem como limitação de polinizadores, portanto a autogamia é favorecida em relação a alogamia, havendo a garantia reprodutiva da espécie (Hargreaves & Eckert, 2014; Kalisz, Vogler, & Hanley, 2004). Adicionalmente, as características ligadas aos sistemas sexuais podem ser afetadas, também, por outros fatores como a composição de espécies de polinizadores (Gervasi & Schiestl, 2017) e, como predito pela HRV, a pressão de inimigos naturais (Busch, Neiman e Koslow, 2004).
Dentre alguns exemplos empíricos de fatores que direcionam a evolução dos sistemas sexuais, podemos destacar que em um estudo com Clarkia xantiana, foi encontrado que plantas com baixa hercogamia e protandria, apresentaram o fitness mais elevado quando cultivadas em populações pequenas, isoladas e sem polinizadores, se comparado com plantas com alta hercogamia e protandria (Moeller & Gebre, 2005). Esse resultado aponta para a vantagem adaptativa da autofecundação em ambientes em
processo de colonização, conforme mencionado acima (Baker, 1955). Em um estudo experimental recente, foi observado o efeito de variáveis abióticas no desenvolvimento de características florais em Collinsia verna. As plantas cultivadas submetidas ao tratamento com menores tempo de luminosidade e disponibilidade de água (simulando uma estação de crescimento curta), desenvolveram características ligadas à autofecundação mais acentuadas, como um menor número de flores e um menor tamanho das flores (Spigler & Kalisz, 2013). Sintetizando, existem forças evolutivas e ecológicas direcionando mudanças nos sistemas sexuais das plantas, aumentando a aptidão da autofecundação ou da fecundação cruzada. Portanto, entender como tais sistemas podem ser medidos e estimados dentro de uma escala, seja ela contínua ou categórica, é o primeiro passo para compreender como a biologia reprodutiva das plantas responde aos mais diversos fatores ecológicos que as populações vegetais podem enfrentar.
TAXA DE FECUNDAÇÃO CRUZADA DERIVADA DE MARCADORES MOLECULARES
Os sistemas sexuais podem ser mensurados de várias formas, como métricas derivadas de características florais, por exemplo o display floral (Goodwillie et al., 2010) e a hercogamia (Opedal, 2018), ou ainda derivadas do uso de marcadores moleculares, como aloenzimas e microssatélite de DNA (Cruzan, 1998). Independente da métrica utilizada, ela será uma estimativa dentro de um gradiente que vai da autogamia à alogamia, passando pelos sistemas sexuais mistos. Porém, algumas métricas podem ser mais precisas que outras em identificar eventos autofecundação ou de fecundação cruzada na prole de um indivíduo. Uma das métricas mais sensíveis a tais eventos é a taxa de fecundação cruzada calculada a partir dos marcadores moleculares, que utilizam uma comparação de múltiplos lócus gênicos polimórficos em sua estimativa (tm; Ritland &
Jain, 1981). Esta taxa consiste em uma razão entre a prole gerada por vias autogâmicas e por vias alogâmicas, variando de 0 a 1, sendo 0 a autogamia total e 1 a alogamia total. Historicamente, espécies apresentando tm entre 0 e 0,2 são consideradas como
autofecundantes e entre 0,8 e 1 como espécies de fecundação cruzada (Schemske & Lande, 1985), os valores entre 0,2 e 0,8 são considerados sistemas mistos (Goodwillie, Kalisz e Eckert, 2005). Atualmente, ferramentas comuns para estimação do valor de tm
são softwares que utilizam de máxima verossimilhança para calcular esta taxa, como o MLT e MLTR (Ritland, 1990; Ritland, 2002). Há décadas que diversos estudos que analisam a ecologia e a evolução dos sistemas sexuais, sob os mais diversos aspectos, utilizam desta métrica ao invés de características morfológicas, por sua maior
sensibilidade e acurácia (Lande & Schemske, 1985; Goodwillie, Kalisz e Eckert, 2005; Fornoni, Ordano, Pérez-Ishiwara, Boege, & Domínguez, 2016; Moeller et al., 2017; Whitehead, Lanfear, Mitchell, & Karron, 2018). Portanto, tm é um bom estimador do
sistema sexual, por refletir com confiabilidade as taxas de fecundação cruzada apresentadas pelos indivíduos das populações estudadas.
A TAXA DE FECUNDAÇÃO CRUZADA E A RAINHA VERMELHA
Um estudo que vise a testar a HRV usando plantas como modelo deve ter em vista dois fatores principais: (I) a forma de mensuração do sistema sexual e (II) o grupo de inimigos naturais que será usado. Como exposto acima, o valor de tm é uma forma adequada e
confiável de estimação do sistema sexual. Quanto aos inimigos naturais, já se sabe que dentre os muitos antagonistas que as plantas possuem, os insetos herbívoros podem exercer um efeito significativo sobre a seleção de características relacionadas aos sistemas sexuais das plantas (Carr & Eubanks, 2014), o que faz deste grupo de inimigos naturais um dos mais adequados para se testar a HRV no reino vegetal, conforme discutido abaixo.
PRESSÃO EVOLUTIVA DE INSETOS HERBÍVOROS
A relação de entre insetos herbívoros e plantas está entre as interações ecológicas mais antigas e amplamente distribuídas na natureza. Ao longo dos milhões de anos, tal interação moldou a coevolução de características tanto nos herbívoros quanto nas plantas, podendo, inclusive, ser umas das forças responsáveis pela larga diversidade encontrada nestes dois grupos (Judith X. Becerra, 2015; Ehrlich & Raven, 1964; Futuyma & Agrawal, 2009; Marquis et al., 2016). Sob a pressão dos herbívoros, as plantas desenvolveram uma ampla uma variedade de mecanismos de defesa, como a produção de metabólitos secundários (Becerra, Noge, & Venable, 2009) e a tolerância à herbivoria (Strauss & Agrawal, 1999). A relação entre os herbívoros e os mecanismos defensivos das plantas pode ser identificada tanto em escala micro quanto em escala macroevolutiva. Por exemplo, Agrawal, Hastings, Johnson, Maron, & Salminen (2012), constataram experimentalmente que uma espécie de Onagraceae apresentava, em poucos anos, um decréscimo na resistência contra herbívoros quando cultivadas na ausência de insetos fitófagos. Este resultado demonstra que o papel dos insetos herbívoros é fundamental na persistência dos mecanismos ligados à defesa das plantas, ainda que em curtos períodos de tempo. Sob uma ótica macroevolutiva, as plantas podem sofrer diferentes pressões de
herbivoria seguindo padrões ambientais globais, como o gradiente latitudinal. Ehrlich & Raven (1964), propuseram, em um trabalho pioneiro, que baixas latitudes estariam associadas a elevadas taxas de herbivoria e, consequentemente, a maiores pressões evolutivas para o desenvolvimento de mecanismos antiherbivoria por parte das plantas. Muitos estudos encontraram resultados consistentes com essa predição (Marquis, Ricklefs, & Abdala-Roberts, 2012; Pennings et al., 2009; Salazar & Marquis, 2012; Wieski & Pennings, 2014), embora alguns estudos tenham encontrado resultados em desacordo com esta predição geral (ver Anstett, Ahern, Johnson, & Salminen, 2018).
Podemos perceber que, mesmo em diferentes escalas de análise espacial e temporal, a coevolução entre plantas e insetos herbívoros direcionando a seleção de diferentes características é evidente para ambos os grupos. A dinâmica de coevolução entre estes grupos consiste na seguinte lógica: o surgimento de uma nova mutação, ou um novo genótipo gerado pela reprodução sexuada, em uma população de plantas pode fornecer um novo mecanismo de defesa, total ou parcial, contra uma determinada espécie ou guilda de insetos herbívoros. Tal genótipo ou mutação elevaria o fitness do seu portador e tenderia a aumentar sua frequência na população. Isso forneceria uma oportunidade para que os insetos herbívoros que sobrepujassem essa defesa tivessem um aumento em seu fitness. Consequentemente, haveria o aumento da pressão seletiva para adaptação dos herbívoros a tais defesas (Ehrlich & Raven, 1964; Becerra et al, 2009; Marquis et al, 2016; Salazar et al., 2018). Fica claro que esta dinâmica inseto herbívoro-planta é regida por uma seleção dependente de frequência, logicamente idêntica a dinâmica parasita-hospedeiro proposta pela HRV para explicar a vantagem da reprodução sexuada. Portanto, fica justificado o uso dos insetos herbívoros como um bom grupo de inimigos naturais que gerem seleção de novos genótipos em plantas em estudos que visem a testar a HRV neste reino.
SÍNTESE E PROBLEMÁTICA
Finalmente, fica claro que a intrigante evolução da reprodução sexuada nos mais variados táxons, especialmente nas plantas, que apresentam diversos mecanismos e estratégias reprodutivas, é uma questão ainda aberta. Esta questão instiga estudos que abordam diversas forças seletivas como principais direcionadores do processo evolutivo. A HRV propõe a pressão de inimigos naturais como força principal para evolução e persistência do sexo. Apesar de sólidas evidências favoráveis à hipótese em vários grupos de animais, não há muitos estudos que incluam o reino vegetal como modelo. Portanto, um estudo
que busque explicar o investimento em estratégias de reprodução sexuada pelas plantas, correlacionando tal investimento com a ação de antagonistas, se faz necessário para compor o arcabouço empírico e teórico sobre a evolução dos sistemas sexuais nas plantas. Um estudo em escala macroevolutiva, incluindo em sua análise comparativa táxons com diferentes histórias evolutivas, poderia preencher esta lacuna ainda existente sobre a extensão da Hipótese da Rainha Vermelha no reino vegetal.
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SINGLE CHAPTER
I
NSECT HERBIVORES MODULATE OUTCROSSING RATES
ACROSS SEED PLANTS
Flowering tree, unknown artist.
Tales M. A. Paiva | Martin M. Gossner | Martin Brändle | Carlos R. Fonseca
Insect herbivores modulate outcrossing rates across seed plants
12
Tales M. A. Paiva1*, Martin M. Gossner2, Martin Brändle3, Carlos Roberto Fonseca1 3
4
1 Department of Ecology, Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Natal,
59072-5
970, Brazil. 6
2 Forest Entomology, Swiss Federal Research Institute WSL, Zürcherstrasse 111, 8903,
7
Birmensdorf, Switzerland. 8
3 Animal Ecology, Department of Ecology, Faculty of Biology, Philipps Universität
9
Marburg, Karl-von-Frisch Strasse 8, 35032 Marburg, Germany. 10
11 12
*Correspondence author: Tales Martins de Alencar Paiva 13
Address: Departamento de Ecologia, Universidade Federal do Rio Grande do Norte, 14
Centro de Biociências, Campus Universitário, Lagoa Nova, Natal, RN 59078-970, Brazil. 15
Email: talesmartins14@hotmail.com 16
ABSTRACT
17
Understanding the evolution of plant mating systems, which can be described by selfing 18
and outcrossing rates, is a great challenge in evolutionary biology. The Red Queen 19
hypothesis suggests that host-parasite biotic interaction is the major factor driving the 20
evolution and persistence of sexual reproduction in nature. Species under higher pressure 21
of natural enemies are expected to show higher investment in sex. There are support for 22
Red Queen for several groups of animals, however in plant kingdom this hypothesis 23
remains underexploited, especially using comparative approaches. Here, we test if 24
richness of insect herbivores associated to seed plants modulate their outcrossing rates. 25
Phylogenetic regressions, under two alternative evolutionary models (Brownian Motion 26
and Ornstein-Uhlenbeck) were used to test this hypothesis for all available species and 27
for native and exotic species, when controlling for key vegetative covariables (life span, 28
growth form, specific leaf area and maximum height). For all species, we showed that 29
plant species associated to more insect herbivores had higher outcrossing rates. We found 30
the same pattern for native species, but not for exotic species. We also found that tall and 31
longer-lived plants tend to be higher outcrossing rates than small and short-lived. These 32
results are in accordance with the expected by the Red Queen hypothesis, supporting the 33
still scarce empirical framework of macroevolutionary studies about the role of natural 34
enemies on evolution of mating system in seed plants. 35
Synthesis: The evolutionary pressure exerted by insect herbivores on seed plants
36
modulates the evolution of their mating system, particularly outcrossing rates, bringing 37
support to the application of the Red Queen hypothesis to the plant kingdom. 38
Key-words: Evolutionary models, herbivory, mating system, natural enemies, Red
39
Queen Hypothesis. 40
INTRODUCTION
41
The evolution of plant mating systems has been one of the major subjects in plant 42
reproductive biology (Barrett et al. 2003; Charlesworth 2006). Plants have a wide 43
diversity of reproductive strategies which reflect the ecological and evolutionary lability 44
of their mating system (Barrett, 2002). Many studies have grouped plants in two distinct 45
reproductive categories, selfers or outcrossers (Schemske & Lande, 1985). Others, have 46
subdivided further (Cruden, 1977). Modern molecular techniques, however, allow species 47
to be located along a continuum of outcrossing rate (tm), from obligatorily self-fertilized
48
(tm = 0) to obligatory cross-fertilized species (tm = 1). Nowadays, it is clear that stable
49
mixed mating systems, with intermediate outcrossing rates, are common in nature (Kalisz 50
et al. 2004; Goodwillie et al. 2005). To reveal the ecological and evolutionary forces that 51
drive the interspecific variation in outcrossing rate, an important step is to understand the 52
hypotheses that aim to explain the adaptative advantages of sexual reproduction over 53
parthenogenesis (see review in Hartfield & Keightley, 2012). 54
The Red Queen Hypothesis has been proposed to explain the emergence and 55
persistence of sexual reproduction (Bell 1982; Jaenike 1978; Hamilton 1980). Its major 56
assumption is that biotic interactions between short-lived natural enemies, generically 57
called parasites, and their hosts favor the maintenance of sex. Parasites are under selection 58
to be able to infect the most common genotype in host population while hosts are under 59
pressure to produce effective defenses against their parasites. Such selection generates a 60
dynamic frequency dependent selection favoring rare genotypes in both host and 61
parasites, since genotype rarity is related to higher success in virulence and defensive 62
development in parasites and hosts, respectively (see Lively, 1996). Interspecifically, the 63
theory predicts that species under stronger parasite pressure should favor outcrossing. 64
Additionally, longer host life span can be predicted to lead to higher levels of sexual 65
reproduction, since parasites will have more generations per host generation to break their 66
defense. Many theoretical and empirical studies found results in accordance with this 67
relationship between life span and sexual reproduction (Bell 1982; Barrett 1996; Lively 68
2010; Munoz et al, 2016; Moeller et al. 2017; Lesaffre & Billiard, 2019). The Red Queen 69
has received empirical support in several animal-parasite systems (Duncan & Little, 2007; 70
Lively, 1987; Schrag, Ndifon, & Read, 1994). However, when we look to the plant 71
kingdom, there are few studies that exploit the Red Queen dynamics as an explanation 72
for mating system determination in plant populations. 73
In his seminal paper, Levin (1975) proposed that intense pressure by natural 74
enemies could lead to higher genetic recombination rates in plants. Species or populations 75
under high pressure by their short-lived natural enemies, such as insect herbivores and 76
pathogens, would have mechanisms favoring higher genetic variation, such as dioecy and 77
self-incompatibility. There is some intraspecific empirical support for this hypothesis. A 78
study with a dandelion species (Taraxacum officinale) revealed that pressure of natural 79
enemies can be an important factor to explain the gradient of geographical distribution of 80
both sexual and asexual populations (Verhoeven & Biere, 2013). These authors found 81
that populations exclusively asexual were under less pressure of antagonists, matching 82
with the red queen hypothesis. On the other hand, in a recent study, the pressure of natural 83
enemies was not effective to explain the distribution of sexual and asexual populations of 84
Hieracium alpinum (Hartmann et al., 2017). Interspecifically, it has been demonstrated
85
that plants associated to a higher number of pathogenic/antagonist fungus species 86
exhibited higher outcrossing rates (Busch, 2004). 87
Insect herbivores are one of the most important natural enemies of plants. They 88
are ecologically and phylogenetically diverse and share more than 200 million years of 89
evolutionary history with their hosts (Ehrlich & Raven, 1964; Futuyma & Agrawal, 90
2009). As response to the pressure of insect herbivores, plant developed a great diversity 91
of defense mechanisms, such as production of secondary metabolic compounds (Becerra, 92
Noge, & Venable, 2009) and tolerance to herbivory (Strauss & Agrawal, 1999). The key-93
mechanism to the development of new and effective defenses against insect herbivores is 94
sex. Self-fertilization reduces the heterozygosity level of offspring which can directly 95
reduce the diversity of chemical defenses. Also, leads to the expression of deleterious 96
recessive alleles (Charlesworth & Charlesworth, 1987; Crnokrak, Barrett, Journal, & 97
Organic, 2002). Both processes can reduce the resistance of self-fertilized plants to 98
herbivores (Núñez-Farfán & Cabrales-Vargas, 1996; Ridley, Hangelbroek, Wagenius, 99
Stanton-Geddes, & Shaw, 2011). The greater genetic variability induced by sexual 100
reproduction increases the probability of producing offspring carrying rare and effective 101
defense mechanisms against their herbivores (Weismann 1887; Burt 2000; Godfrey and 102
Johnson 2014). Thus, it is expected that populations with higher self-fertilization rates are 103
more susceptible to natural enemies than populations with higher outcrossing rates (Levin 104
1975; Núñez-Farfán and Cabrales-Vargas 1996; Johnson et al. 2009). For example, 105
Johnson et al. (2009), in an experimental study with Onagracreae species, found that 106
plants of exclusively asexual linages showed greater foliar damage caused by herbivorous 107
generalist insects than the exclusively sexual lineages. As expected by theory, this result 108
suggest that outcrossing is an effective strategy in the development of defense 109
mechanisms against certain groups of insects. Despite the growing number of studies that 110
exploit the relation among mating system evolution and insect herbivores (Carr & 111
Eubanks, 2014), there is a shortage of studies analyzing this relation using a 112
macroevolutionary comparative approach. 113
Evolutionary history is a key factor that must to be considered in 114
macroevolutionary studies of plants and their associated insect herbivores. Native plants 115
generally share a long evolutionary history with the local associated herbivores. Alien 116
plants, however, when are introduced to a new environment not only leave their 117
associated herbivores behind, but can possess defense mechanisms which were never 118
experienced by the local herbivores. Therefore, it is expected that local native plants are 119
under more herbivory pressure than exotics ones, the so called enemy release hypothesis 120
(Keane & Crawley, 2002; Lucero et al., 2019). This hypothesis had empirical support for 121
plants and could be an important role in mating system evolution (Schutzenhofer, 2007). 122
For example, in two different species of Lespedeza inhabiting the same region, the 123
introduced exotic species showed more than 60% less herbivory damage than native, and 124
in both species, herbivory pressure change the chasmogamous-cleistogamous flowers 125
ratio, a reliable indicative of plant mating system (Schutzenhofer, 2007). Furthermore, 126
since exotic species coevolved with their herbivores in another context, in invaded ranges, 127
one predicts a mismatch between the number of associated herbivores and their mating 128
system strategy. 129
Several vegetative traits related to plant life history can contribute to explain the 130
variation in outcrossing rates across species (Moeller et al. 2017; Lesaffre & Billiard, 131
2019). Under the Red Queen hypothesis, as mentioned before, plants with higher life span 132
are expected to invest more in sex, increasing their outcrossing rates. However, other 133
variables can influence plant mating system evolution by affecting plant-herbivore 134
dynamics. Specific leaf area (SLA), for instance, is a key vegetative trait negatively 135
correlated to investments in constitutive defenses (Cornelissen et al. 2003) which can be 136
expected to modulate long term herbivory pressure. A recent experimental study with 137
Alternanthera philoxeroides found that in treatment submitted to herbivory, plants
showed a decrease in SLA over generations, compared to control treatment, without 139
herbivores (Dong, Fu, Luo, & Yu, 2017). 140
Here, we use a macroevolutionary approach to test the Red Queen hypothesis in 141
higher plants. In particular, phylogenetic regressions, under two alternative evolutionary 142
models (Brownian Motion and Ornstein-Uhlenbeck), were performed to test if richness 143
of insect herbivores associated to plants, used as surrogate for its long-term herbivory 144
pressure, modulate their mating system, measured by its outcrossing rate. Also, we tested 145
additional alternative models, for both native and exotic species, containing four 146
additional explanatory variables: growth form, life span, plant height, and SLA. Under 147
the Red Queen hypothesis, we expect native plants with more associated insect herbivores 148
and longer lifespan to have higher outcrossing rates; this relationship holding for native 149
but not for exotic species. 150
151
MATERIALS AND METHODS
152
Data sets
153
Our data-set on plant outcrossing rates (tm) has been built following two principal
154
approaches. First, we compiled published databases available in the literature (four 155
studies were our principal source of tm data: Goodwillie et al. 2005; Fornoni et al. 2016;
156
Moeller et al. 2017; Whitehead et al. 2018). Second, for a more complete scan of recent 157
publications, we performed a species-specific search in Web of Science, collecting all 158
studies published by each plant species until November, 23, 2018. To optimize our effort, 159
we only searched for plant species names which were present in our global insect 160
herbivore database. The search for each species included as key-word (I) the species 161
binomial and (II) the term outcrossing rate OR mating system. Our final database, 162
contained only those species that had values for both insect herbivores richness and 163
outcrossing rate values. In total, we have 136 species of spermatophytes; 104 angiosperms 164
and 32 gymnosperms (see taxonomic identity and distributions in Appendix 1, subsection 165
1.1). We checked the taxonomy identity and synonymy for all species using The Plant 166
List as base. We built a list of the collected names and the name matched and accepted in 167
The Plant List (see Appendix 1, subsection 1.1). 168
In total, our dataset had 430 records of outcrossing rate, because for several of our 169
136 species more than one outcrossing rate measurement was available in literature. For 170
example, in studies where comparisons were made across species populations, we 171
recorded all values of outcrossing rate per species (i.e. Stojanova, Cheptou, & Maurice, 172
2014). For the main analyses, we used mean outcrossing rate per species as the response 173
variable. As an alternative approach, single populations were randomly selected to 174
characterize the species in appropriate randomization tests (see Appendix 2 for details). 175
Data of insect herbivores associated to plants were acquired from a recent dataset 176
of plant-herbivore interaction for plants species occurring in Europe nowadays, built from 177
an extensive review of insect collection and literature data. Such database includes, then, 178
information both native and exotic species. All insect herbivores species recorded was 179
included in dataset, regardless of their food guild and the part of plant consumed by them. 180
Here, we used insect herbivore richness as a proxy for evolutionary herbivory pressure 181
for plant species. 182
In addition to herbivores richness, we collected data from four vegetative variables 183
for our species: life span, growth form, specific leaf area (SLA) and maximum height. 184
We used the plant traitbase LEDA (Kleyer et al., 2008) and data found in primary 185
literature as source. We used these variables as both single and covariate predictor in our 186
phylogenetical models. We classified all 136 species in three categories of life span: 187
annuals, biennials, and perennials. In the same way, we categorized all species in six 188
categories of growth form: graminoid, hemiparasite, herb, liana, shrub, and tree. For our 189
136 species, only 88 (64.7%) presented data for SLA and maximum height. For 48 species 190
containing missing data, we estimated these values by phylogenetic imputation using 191
Rphylopars package (Goolsby, Bruggeman, & Ané, 2017). Phylogenetic imputation is a
192
reliable approach to estimate missing data (Penone et al., 2014), especially when one of 193
variables have strong phylogenetical signal, such as maximum height (Pagel’s λ = 0.83, 194
p < 0.001). We estimated phylogenetical signal using phytools package (Revell, 2012). 195
Correcting the sampling effort bias
196
Sampling effort is known to influence the number of records of insect herbivores, 197
or others natural enemies, associated to plants (e.g. Busch et al. 2004). In general, richness 198
of insect herbivores is expected to be underestimated for plants poorly recorded. In order 199
to correct for such bias, we collected for each plant species the total number of recorded 200
occurrences in the Global Biodiversity Information Facility repository [gbif.org] in June, 201
25, 2019. Then, we performed a simple linear regression using the number of occurrences 202
as predictor and observed herbivore richness as response variable. As expected, we found 203
a significant positive relationship between these two variables (slope = 0.438, p-value = 204
0.000; for details see Appendix 1, section 3). Then, we extracted the residuals of this 205
model to use it as corrected herbivore richness in our phylogenetic models (hereafter, 206
simply ‘herbivore richness’). 207
Coevolutionary time
208
To analysis how coevolutionary time modulate the effect of herbivore pressure on 209
outcrossing rates, we classified the plants in two categories: European native species 210
(hereafter ‘native’) and non-European species (hereafter ‘exotic’). This classification was 211
performed with the use of plant databases and herbaria sites (see the original sources in 212
Appendix 1, subsection 1.2). Species that naturally occurs in more than one continent and 213
cosmopolitan species were considered as exotic, since herbivores richness may be under-214
sampled due the plant-insect interaction dataset was built only for European records. In 215
our 136 species, we had 83 natives and 53 exotics (see the list in Appendix 1, subsection 216
1.2). Beyond the models using data from all species, we also performed all phylogenetic 217
models described below separately for native and exotic species. 218
Phylogenetic models
219
To test the Red Queen Hypothesis, we initially used a phylogenetic regression model 220
using the mean outcrossing rate per species as response variable and richness of insect 221
herbivores as the single explanatory variable. Subsequently, we contrasted this simple 222
model with several simple and multiple regression models which were built with several 223
key vegetative traits as predictors (Table 1; for details see Appendix 1). We built all 224
models using Phylogenetic Generalized Least Squares (PGLS), to take into consideration 225
the phylogenetic proximity between species (Felsenstein, 1985; Grafen, 1989). The 226
analyses were performed using two alternative evolutionary models: Brownian Motion 227
(BM), which assumes that trait evolve according to a random walk process, where the 228
traits evolve around a mean value and the variance increases over time (Symonds and 229
Blomberg, 2014), and Ornstein-Uhlenbeck (OU), which assumes that traits evolve around 230
a single optimal value or multiple values (Butler and King, 2004; O’Meara and Beaulieu, 231
2014). The phylogenetic hypothesis used in our models was built by pruning a recently 232
published dated phylogeny for plants (Smith & Brown, 2018). To execute the PGLS 233
models we used the phylolm package (Ho & Ané, 2014). For OU models, the parameters 234
alpha (α) and squared sigma (σ²) were estimate by maximum likelihood. Lastly, we built 235
model averaging tables for both BM and OU models, using the corrected Akaike 236
Information Criterion (AICc; Hurvich and Tsai 1989), to rank all our 15 phylogenetical 237
models (see Table 1 and 2). We categorized our models in ‘simple model’ for those 238
containing one predictive variable and ‘additive model’ for those containing more than 239
one predictor. For model comparison and averaging, we used the MuMIn package 240
(Bartoń, 2019). All analytical procedures were performed in R (R core team, 2019). 241
Caveats
242
Seed plants comprehend a large phylogenetics groups and the species used here were 243
limited to those present simultaneously in two independent datasets (outcrossing rates and 244
insect herbivore richness), produced by two independent research groups. Because of that, 245
our final dataset was a little subset of total seed plants. Also, our dataset has many species 246
with agricultural importance which suffered an unknown level of artificial selection for 247
economic optimization which possibly affected their trait distributions. Finally, insect 248
herbivores represent only a fraction of plant’s natural enemies and other groups not 249
included here, such as fungal pathogens, can affect mating system (Busch, 2004). Future 250
studies designed to measure outcrossing rates in natural plant populations with distinct 251
antagonists’ pressure are needed to better support macroevolutionary studies. 252 253 RESULTS 254 Herbivores richness 255
In our main simple PGLS model, which only insect herbivores richness is the predictor 256
of outcrossing rate variation, we found a positive and significant relationship in both BM 257
and OU evolutionary models (Figure 1a; BM: slope = 0.148, p-value = 0.011; OU: slope 258
= 0.155, p-value = 0.009, α = 0.139, σ² = 0.03). When we ran a non-phylogenetic linear 259
regression, the result remains significant (OLS, slope = 0.169, p-value = 0.007), but due 260
the existence of phylogenetic signal in residuals (Pagel’s λ = 0.454, p-value = 0.000), we 261
accept the PGLS result. The phylogenetic signal in residuals disappeared in PGLS 262
regression (Pagel’s λ = 0.000, p-value = 0.995). This result remained significant when we 263
