UNIVERSIDADE FEDERAL DOS VALES DO JEQUITINHONHA E MUCURI Programa de Pós Graduação em Biocombustíveis
Paula Villela Dessimoni Spencer
CARACTERIZAÇÃO BIOQUÍMICA DE LIPASES DE FUNGOS FILAMENTOSOS VISANDO A PRODUÇÃO DE BIOCOMBUSTÍVEIS.
Diamantina 2022
Paula Villela Dessimoni Spencer
CARACTERIZAÇÃO BIOQUÍMICA DE LIPASES DE FUNGOS FILAMENTOSOS VISANDO A PRODUÇÃO DE
BIOCOMBUSTÍVEIS.
Tese apresentada ao programa de poós- graduação em Biocombustiveis da Universidade Federal dos Vales do Jequitinhonha e Mucuri, como requisito para obtenção do título de doutora.
Orientador: David Lee Nelson
Coorientador: Vivian Machado Benassi
Diamantina 2022
Catalogação na fonte - Sisbi/UFVJM
Elaborada pelo Sistema de Geração Automática de Ficha Catalográfica da UFVJM com os dados fornecidos pelo(a) autor(a).
Este produto é resultado do trabalho conjunto entre o bibliotecário Rodrigo Martins Cruz/CRB6- 2886
e a equipe do setor Portal/Diretoria de Comunicação Social da UFVJM V735 Villela Dessimoni Spencer, Paula
2022 CARACTERIZAÇÃO BIOQUÍMICA DE LIPASES DE FUNGOS
FILAMENTOSOS VISANDO A PRODUÇÃO DE BIOCOMBUSTÍVEIS.
[manuscrito] / Paula
Villela Dessimoni Spencer. -- Diamantina, 2022.
130 p. : il.
Orientador: Prof. David Lee Nelson.
Coorientador: Prof. Vivian Machado Benassi.
Tese (Doutorado em Biocombustíveis) -- Universidade Federal dos Vales do Jequitinhonha e Mucuri, Programa de Pós-Graduação em Biocombustíveis, Diamantina, 2022.
PaulaVillela Dessimoni Spencer
CARACTERIZAÇÃO BIOQUÍMICA DE LIPASES DE FUNGOS FILAMENTOSOS VISANDO A PRODUÇÃO DE
BIOCOMBUSTÍVEIS.
Tese apresentada ao DOUTORADO EM BIOCOMBUSTÍVEIS, nível de DOUTORADO como parte dos requisitos para obtenção do título de DOUTORA EM BIOCOMBUSTÍVEIS.
Orientador (a): Prof. Dr. David Lee Nelson
Data da aprovação:
18/10/2022
Prof. Dr. SANDRO LUIZ BARBOSA DOS SANTOS - UFVJM
Prof.Dr.ª JULIANA ROCHA DE MEIRA PIRES – IFNMG Prof.Dr.ª CLINÁSCIA RODRIGUES ROCHA ARAÚJO - IFNMG
Prof.Dr.ª ROSYMAR COUTINHO DE LUCAS – UNIFAL Prof.Dr. PAULO HENRIQUE FIDÊNCIO – UFVJM
Diamantina
AGRADECIMENTOS
Primeiramente a Deus por me iluminar e me guiar em todos os momentos da minha vida. Aos meus pais Ricardo e Nísia pelo apoio e amor de sempre, principalmente a minha mãe que além dos ensinamentos diários pelos ensinamentos profissionais, meu exemplo de mãe e mulher. Ao meu marido Milton pela paciência e dedicação, permitindo que o meu sonho se tornasse real e pelos nossos lindos e abençoados filhos que nos foi concedido durante o meu doutorado, Arthur e Maria Luiza que são minha razão de continuar lutando e me mostrou o verdadeiro significado do amor. Aos meus irmãos Gabriel e Pedro pela presença constante em minha vida. A todos os professores David, Vivian e Márcio pelo empenho e dedicação, a todos do programa em biocombustíveis e da UFVJM. A todos os técnicos e alunos que se empenharam para o andamento da tese com tanto carinho. A FAPEMIG, CAPES, CNPq pelo apoio financeiro.
Enfim agradeço a todos os envolvidos que se esforçaram para que esse trabalho se tornasse possível.
¨Por isso não tema, pois estou com você; não tenha medo, pois sou o seu Deus. Eu o fortalecerei e o ajudarei; Eu o segurarei com a minha mão direita vitoriosa¨.
Isaías 41:10
RESUMO
Muitos microrganismos secretam enzimas durante o seu crescimento, uma dessas enzimas são as lipases que são utilizadas em vários setores biotecnológicos. Uma de suas aplicações é na reação de transesterificação para produção de biodiesel. O objetivo foi coletar, isolar fungos filamentosos produtores de lipase e analisar as características morfológicas macroscópicas dos fungos filamentosos isolados e do banco de fungos do laboratório, assim como, padronizar o cultivo do microrganismo selecionado para uma maior atividade lipolítica, seguindo caracterização bioquímica da lipase solúvel produzida em meio submerso e caracterização físico-química dos óleos vegetais. Sendo assim foi possível isolar doze fungos filamentosos de distintas amostras coletadas em Diamantina-MG, cuja maioria apresentou coloração branca, aspecto seco, topografia plana e pigmentação. Analisou-se o efeito da temperatura no crescimento dos doze fungos isolados e dos oito fungos filamentosos do banco de fungo do laboratório em meio de cultura sólido contendo aveia e Batata-Dextrose-Ágar (BDA), onde obteve-se as maiores taxas de crescimento em ambos os meios de cultura a 30ºC. Pela triagem de produção lipolítica o fungo do banco 3.2TA pertencente ao filo Mucoromycota e obteve o maior halo de crescimento, sendo selecionado para a fermentação submersa. Analisaram-se cinco meios de cultura submersos para a produção de lipase e a melhor atividade foi obtida no meio Adams após 72 horas de cultivo, seguindo a otimização, observou-se que a maior atividade na fonte de nitrogênio foi em ureia, peptona e extrato de levedura. Para a fontes de sais a maior atividade foi em sais CP e Khanna com pH inicial de 4,0. A fonte de carbono foi analisada e a melhor atividade foi obtida em óleo de oliva. Foi realizada a caracterização bioquímica da enzima sobre os efeitos do pH e temperatura onde apresentou melhor atividade nas faixas de pHs 7-14 a altas temperaturas. A termoestabilidade da enzima foi a 55oC nos tempos de 60 e 90 min. A estabilidade ao pH foi a um pH de 5,5, nos tempos de incubação de e 60 min. A estabilidade a solventes foi obtida em metanol e etanol. A maior hidrólise enzimática ocorreu em azeite de oliva, seguido do óleo de algodão, soja e milho. Foi realizada a caracterização físico química de diferentes óleos vegetais, o maior índice de acidez foi no óleo de dendê e de oliva. O maior valor para índice de peroxido foi em óleo de abacate, oliva, pequi e os menores em óleo de trigo. Para o índice de saponificação os maiores valores foram no óleo de abacate, trigo, canola. Para o material insaponificável os maiores valores foram nos óleos de soja, algodão, girassol, e o menor valor no óleo de dendê. Sendo esses parâmetros físicos- químicos importantes a serem realizados em matérias primas como óleos vegetais que são utilizadas na produção de biodiesel.
Palavras-chave: Fungos filamentosos, lipases, caracterização enzimática, biodiesel.
ABSTRACT
Many microorganisms secrete enzymes during their growth, one of these enzymes are lipases that are used in various biotechnological sectors. One of its applications is in the transesterification reaction for biodiesel production. The objective was to collect, isolate lipase- producing filamentous fungi and analyze the macroscopic morphological characteristics of the isolated filamentous fungi and the laboratory fungal bank, as well as standardize the cultivation of the selected microorganism for greater lipolytic activity, following biochemical characterization of the soluble lipase. produced in submerged medium and physicochemical characterization of vegetable oils. Thus, it was possible to isolate twelve filamentous fungi from different samples collected in Diamantina-MG, most of which presented white coloration, dry appearance, flat topography and pigmentation. The effect of temperature on the growth of the twelve isolated fungi and of the eight filamentous fungi from the fungus bank in the laboratory was analyzed in a solid culture medium containing oat and Potato-Dextrose-Agar (PDA), where the highest growth rates were obtained. in both culture media at 30ºC. By screening for lipolytic production, the fungus from bank 3.2TA belonging to the phylum Mucoromycota obtained the highest growth halo, being selected for submerged fermentation. Five submerged culture media were analyzed for the production of lipase and the best activity was obtained in Adams medium after 72 hours of cultivation, following the optimization, it was observed that the highest activity in the nitrogen source was in urea, peptone and extract of yeast. For the salt sources, the highest activity was in CP and Khanna salts with an initial pH of 4.0. The carbon source was analyzed and the best activity was obtained in olive oil. The biochemical characterization of the enzyme was carried out on the effects of pH and temperature where it showed better activity in the ranges of pH 7-14 at high temperatures. The enzyme thermostability was at 55oC for 60 and 90 min. The pH stability was at a pH of 5.5, at incubation times of and 60 min. Solvent stability was achieved in methanol and ethanol. The highest enzymatic hydrolysis occurred in olive oil, followed by cotton, soybean and corn oil. The physicochemical characterization of different vegetable oils was carried out, the highest acidity index was in palm and olive oil. The highest value for peroxide index was in avocado, olive, pequi oil and the lowest in wheat oil. For the saponification index the highest values were in avocado, wheat and canola oil. For the unsaponifiable material, the highest values were in soybean, cotton, sunflower oils, and the lowest value in palm oil. These physical-chemical parameters are important to be performed in raw materials such as vegetable oils that are used in the production of biodiesel.
Keywords: Filamentous fungi, lipases, enzymatic characterization, biodiesel.
LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS
AcGs: ácidos graxos
AFM: Microscopia de força atômica AGL: Ácidos graxos livres
ANP: Agência Nacional do Petróleo, Gás Natural e Biocombustíveis AOCS: Association of Official Analytical Chemists
ATP: Adenosina trifosfato BDA: Batata-Dextrose-Ágar
CNPE: Conselho Nacional de Política Energética DAG: Diacilgliceróis
DCCR2: Delineamento Composto Central Rotacional com duas variáveis DNA: Ácido desoxirribonucleico
FES: Fermentação em estado sólido FS: Fermentação submersa
IE: Índice Enzimático
ITS: Identificação da região interna transcrita do gene ribossomal
LMEDP: Laboratório de Micologia, Enzimologia e Desenvolvimento de Produtos MAG: Monoacilgliceróis
MAPA: Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento MEA: Malt Extract Agar
MEV: Microscopia eletrônica de varredura do microrganismo MIC: Ministério da Indústria e do Comércio
PCR: Polymerase Chain Reaction ou reação em cadeia da polimerase PNPB: Programa Nacional de Produção e Uso do Biodiesel
PROALCOOL: Programa Nacional do Álcool RM: razões molares
TAG: Triacilgliceróis U: Unidade de lipase EL: Extrato de Levedura PP: peptona
Ur: Ureia
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1. TIPOS DE HIFAS DOS FUNGOS DILAMENTOSOS. (A) HIFAS NÃO SEPTADAS E (B) HIFA SEPTADA. ... 5 FIGURA 2. MACROCULTIVO E MICROCULTIVO DO FUNGO PENICILLIUM SP. ... 9 FIGURA 3. ESQUEMA DAS ETAPAS UTILIZADAS PARA A IDENTIFICAÇÃO MOLECULAR DE
FUNGOS. ... 10 FIGURA 4. REAÇÕES DE CATALISE ENZIMÁTICA. ... 14 FIGURA 5. ESQUEMAS DE CATALISE REPRESENTATIVOS PARA A HIDROLISE DE
TRIACILGLICERÓIS. ... 16 FIGURA 6. TRANSESTERIFICAÇÃO DE TRIACILGLICERÍDEOS COM METANOL EM MEIO
ALCALINO... 24 FIGURA 7. PROCESSO ENZIMÁTICO DA PRODUÇÃO DE BIODIESEL. ... 28 FIGURA 8. ESQUEMA COM AS MOLÉCULAS PRECURSORA DO TRIACILGLICEROL. ... 30 FIGURA 9. ESTRUTURA MOLECULAR DOS PRINCIPAIS ÁCIDOS GRAXOS DOS ÓLEOS VEGETAIS
... 31 FIGURA 10. MANUTENÇÃO DA CEPA. (A) FUNGOS FILAMENTOSOS ISOLADOS EM POTES DE
PLÁSTICO CONTENDO MEIO DE AVEIA. (B) SUSPENSÃO DE ESPOROS EM SÍLICA GEL. ... 37 FIGURA 11. CÂMARA DE MICROCULTIVO. ... 38 FIGURA 12. DETERMINAÇÃO DO RAIO DO MICÉLIO. ... 39 FIGURA 13. FOTO REPRESENTATIVA DO HALO ENZIMÁTICO PELA LIBERAÇÃO DE ÁCIDOS
GRAXOS PELAS LIPASES. ... 39 FIGURA 14. IMAGEM REPRESENTATIVA DA FERMENTAÇÃO SUBMERSA PARA PRODUÇÃO DE
LIPASES PELOS FUNGOS FILAMENTOSOS. ... 42 FIGURA 15. IMAGEM REPRESENTATIVA DOS FUNGOS FILAMENTOSOS ISOLADOS. (A) FUNGOS
ISOLADOS A PARTIR DAS FOLHAS E TERRA DO PÉ DE JABUTICABA E (B) FUNGOS
ISOLADOS A PARTIR DAS FOLHAS DE FEIJÃO ANDU (CAJANUS CAJAN). ... 47 FIGURA 16. IMAGEM MICROSCÓPICA DO FUNGO FILAMENTOSO PJ12, ISOLADO A PARTIR DE
AMOSTRAS COLETADAS DE FOLHAS E TERRA DA JABUTICABEIRA. ... 49 FIGURA 17. TAXA DE CRESCIMENTO FÚNGICO (CENTÍMETROS/HORA) EM MEIO DE CULTURA
SÓLIDO BDA. ... 51 FIGURA 18. IMAGEM DE MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE VARREDURA (MEV) DO FUNGO 3.2TA.
... 56 FIGURA 19. EFEITO DO PH E TEMPERATURA DA REAÇÃO ENZIMÁTICA PELO MÉTODO DE
DELINEAMENTO COMPOSTO CENTRAL ROTACIONAL COM DUAS VARIÁVEIS (DCCR2) ... 69 FIGURA 20. ATIVIDADE ENZIMÁTICA RELATIVA EM PORCENTAGEM DIFERENTES
TEMPERATURAS E TEMPO DE INCUBAÇÃO. ... 71 FIGURA 21. ATIVIDADE ENZIMÁTICA RELATIVA E SUA ESTABILIDADE EM DIFERENTES PH E
TEMPO DE INCUBAÇÃO... 73
LISTA DE TABELAS
TABELA 1. REAÇÕES LIPOLÍTICAS EM DIFERENTES SETORES INDUSTRIAIS. ... 3
TABELA 2. MICRORGANISMOS COMO FONTE DE LIPASE. ... 17
TABELA 3. COMPOSIÇÃO DOS ÁCIDOS GRAXOS PRESENTES NO ÓLEO DE OLIVA ... 31
TABELA 4. COMPOSIÇÃO DOS ÁCIDOS GRAXOS PRESENTES NO ÓLEO DE CANOLA. ... 32
TABELA 5. COMPOSIÇÃO DOS ÁCIDOS GRAXOS PRESENTES NO ÓLEO DE DENDÊ. ... 32
TABELA 6. COMPOSIÇÃO DOS ÁCIDOS GRAXOS PRESENTES NO ÓLEO DE MILHO. ... 33
TABELA 7. COMPOSIÇÃO DOS ÁCIDOS GRAXOS PRESENTES NO ÓLEO DE SOJA. ... 34
TABELA 8. COMPOSIÇÃO DOS ÁCIDOS GRAXOS PRESENTES NO ÓLEO DE GIRASSOL. ... 34
TABELA 9. COMPOSIÇÃO DOS ÁCIDOS GRAXOS PRESENTES NO ÓLEO DE ALGODÃO. ... 35
TABELA 10. DETERMINAÇÃO DO LOCAL E DA AMOSTRA ONDE FORAM ISOLADOS OS FUNGOS FILAMENTOSOS SELECIONADOS DO BANCO DE FUNGOS DO LABORATÓRIO. ... 36
TABELA 11. PLANEJAMENTO FATORIAL. ... 44
TABELA 12. CARACTERÍSTICAS MACROSCÓPICAS DOS FUNGOS FILAMENTOS ISOLADOS. ... 48
TABELA 13. TAXA DE CRESCIMENTO FÚNGICO (CENTÍMETROS/HORA) PRODUZIDO PELOS FUNGOS FILAMENTOSOS EM MEIO AVEIA. ... 50
TABELA 14. TAXA DE CRESCIMENTO FÚNGICO (CENTÍMETROS/HORA) EM MEIO DE CULTURA SÓLIDO BDA. ... 51
TABELA 15. HALO DE CRESCIMENTO FÚNGICO (CENTÍMETROS) E HALO ENZIMÁTICO (CENTÍMETROS) OBTIDOS PELOS FUNGOS ISOLADOS EM MEIO DE CULTURA SÓLIDO CONTENDO AZEITE. ... 53
TABELA 16. HALO DE CRESCIMENTO FÚNGICO (CENTÍMETROS) E HALO ENZIMÁTICO (CENTÍMETROS) OBTIDOS PELOS FUNGOS DO BANCO EM MEIO DE CULTURA SÓLIDO CONTENDO AZEITE. ... 54
TABELA 17. DETERMINAÇÃO DO MEIO DE CULTURA E TEMPO DE CRESCIMENTO PARA O CULTIVO DO FUNGO ISOLADO 3.2TA PARA PRODUÇÃO LIPOLÍTICA. ... 57
TABELA 18. EFEITO DA FONTE DE NITROGÊNIO NA PRODUÇÃO DE LIPASES PELO FUNGO ISOLADO 3.2TA. ... 61
TABELA 19. ANÁLISE DA INFLUÊNCIA DE DIFERENTES FONTES DE SAIS SOBRE A PRODUÇÃO LIPOLÍTICA. ... 63
TABELA 20. EFEITO DO PH INICIAL DO MEIO DE CULTURA NA PRODUÇÃO DE LIPASES PELO FUNGO ISOLADO 3.2TA. ... 64
TABELA 21. EFEITO DE DIFERENTES FONTES DE CARBONO NA PRODUÇÃO DE LIPASES. ... 65
TABELA 22. ATIVIDADE ENZIMÁTICA CONFORME DELINEAMENTO. ... 69
TABELA 23. ATIVIDADE ENZIMÁTICA CONFORME ESTABILIDADE DA ENZIMA EM DIFERENTES TEMPERATURAS. ... 71
TABELA 24. ATIVIDADE ENZIMÁTICA CONFORME ESTABILIDADE DA ENZIMA EM DIFERENTES PH. ... 73
TABELA 25. ESTABILIDADE ENZIMÁTICA A SOLVENTES ORGÂNICOS. ... 75
TABELA 26. ESTABILIDADE ENZIMÁTICA FRENTE A DIFERENTES ÓLEOS VEGETAIS. ... 77
TABELA 27. RESULTADOS OBTIDOS NA CARACTERIZAÇÃO DOS ÓLEOS. ... 79
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO GERAL ... 1
2. OBJETIVOS ... 4
2.1 OBJETIVO GERAL ... 4
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ... 4
3. REVISÃO DA LITERATURA... 5
3.1 FUNGOS ... 5
3.2 ENZIMAS ... 11
3.3 LIPASES ... 13
3.4 BIODIESEL ... 22
3.5 ÓLEOS VEGETAIS ... 29
3.5.1 COMPOSIÇÃO DOS ÓLEOS VEGETAIS ... 29
4. MATERIAL E MÉTODOS ... 35
4.1 MICRORGANISMOS EM ESTUDO ... 35
4.2 MANUTENÇÃO DE CEPA ... 37
4.3 MICROCULTIVO ... 37
4.4 MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE VARREDURA DO MICRORGANISMO ... 38
4.5 ANÁLISE DA TEMPERATURA DE CRESCIMENTOS DOS FUNGOS FILAMENTOSOS ISOLADOS ... 38
4.6 SELEÇÃODE FUNGOS FILAMENTOSOS PRODUTORES DE LIPASES ... 39
4.7 INÓCULO ... 40
4.8 OBTENÇÃO DO EXTRATO BRUTO EXTRACELULAR E O MICÉLIO DO FUNGO ... 40
4.9 DOSAGEM DA ATIVIDADE ENZIMÁTICA ... 41
4.10 DEFINIÇÃO DO MELHOR MEIO DE CULTURA PARA O CULTIVO DO FUNGO SELECIONADO E ANÁLISE DO TEMPO DE CRESCIMENTO DO MICRORGANISMO PARA PRODUÇÃO DE LIPASE ... 42
4.11 ANÁLISE DE DIFERENTES FONTES DE NITROGÊNIO DO MEIO DE CULTURA NA PRODUÇÃO ENZIMÁTICA ... 42
4.12 ANÁLISE DE DIFERENTES FONTES DE SAIS DO MEIO DE CULTURA NA PRODUÇÃO ENZIMÁTICA ... 43
4.13 ANÁLISE DO PH INICIAL DO MEIO DE CULTURA NA PRODUÇÃO ENZIMÁTICA... 43
4.14 ANÁLISE DE DIFERENTES FONTES DE CARBONO ... 43
4.15 CARACTERIZAÇÃO BIOQUÍMICA ... 44
4.15.1 EFEITO DO PH E TEMPERATURA ... 44
4.15.2 ESTABILIDADE DA ENZIMA À DIFERENTES TEMPERATURAS ... 44
4.15.3 ESTABILIDADE AO PH ... 45
4.15.4 ESTABILIDADE A SOLVENTES ... 45
4.16 CARACTERIZAÇÃO FISICO-QUÍMICA DOS ÓLEOS ... 45
4.16.1 ÁCIDOS GRAXOS LIVRES (AGL) ... 45
4.16.2 ÍNDICE DE PERÓXIDOS (IP) ... 45
4.16.3 ÍNDICE DE SAPONIFICAÇÃO (IS) ... 45
4.16.4 MATERIAL INSAPONIFICÁVEL (MINSAP) ... 45
4.17 ANÁLISE DOS EXPERIMENTOS ... 46
5. RESULTADOS E DISCUSSÕES ... 46
5.1 ISOLAMENTO DE FUNGOS FILAMENTOSOS E ANÁLISE DAS CARACTERÍSTICAS MORFOLÓGICAS MACROSCÓPICAS DOS MICRORGANISMOS ... 46
5.2 ANÁLISE DAS CARACTERÍSTICAS MICROSCÓPICAS DOS FUNGOS FILAMENTOSOS ISOLADOS ... 48
5.3 ANÁLISE DA TEMPERATURA DE CRESCIMENTO DOS FUNGOS ISOLADOS ... 49
5.4 SCREENING DE FUNGOS FILAMENTOSOS PRODUTORES DE LIPASES ... 52
5.5 MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE VARREDURA ... 56
5.6 MÉTODO DE DOSAGEM DE LIPASES ... 57
5.6.1 DEFINIÇÃO DO MELHOR MEIO DE CULTURA PARA O CULTIVO DO FUNGO ISOLADO SELECIONADO E ANÁLISE DO TEMPO DE CULTIVO ... 57
5.6.2 ANÁLISE DO EFEITO DEDIFERENTES FONTES DE NITROGÊNIO DO MEIO DE CULTURA NA PRODUÇÃO ENZIMÁTICA... 60
5.6.3 ANÁLISE DE DIFERENTES FONTES DE SAIS DO MEIO DE CULTURA NA PRODUÇÃO ENZIMÁTICA ... 62
5.6.4 ANÁLISE DO PH INICIAL DO MEIO DE CULTURA NA PRODUÇÃO ENZIMÁTICA ... 64
5.6.5 ANÁLISE DE DIFERENTES FONTES DE CARBONO ... 65
5.7 CARACTERIZAÇÃO BIOQUÍMICA ... 68
5.7.1 EFEITO DO PH E TEMPERATURA NA REAÇÃO ENZIMÁTICA ... 68
5.7.2 ESTABILIDADE DA ENZIMA À DIFERENTES TEMPERATURAS ... 70
5.7.3 ESTABILIDADE AO PH ... 72
5.7.4. ESTABILIDADE A SOLVENTES ... 75
5.7.5 HIDRÓLISE EM DIFERENTES ÓLEOS ... 76
5.8 CARACTERIZAÇÃO DOS ÓLEOS ... 78
6. CONCLUSÃO ... 82
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS... 83
ANEXO I ... 112
1. INTRODUÇÃO GERAL
O reino Fungi é um dos mais diversos da Terra, cujos organismos vivem em diversos ambientes e sua dispersão na natureza ocorre por meio de agentes do ar e água, sementes, insetos, animais e seres humanos. A grande biodiversidade das espécies fúngicas reflete-se em suas características macroscópicas, em diferentes propriedades biológicas, em variados sistemas enzimáticas e em uma vasta produção metabólica (MENOLLI et al., 2015).
Esse Reino é composto por leveduras, organismos unicelulares, e por fungos filamentosos, organismos multicelulares. Esses organismos conseguem sobreviver por uma grande variedade de compostos orgânicos, podem habitar diversos ambientes como solo, água do mar, água doce e viver associados a animais, insetos, plantas e detritos (MENOLLI et al., 2015).
Os fungos filamentosos são utilizados na produção de medicamentos e alimentos, resolução de racematos, processos fermentativos e degradação natural de resíduos ambientais há tempos. Os processos químicos associados a este uso são bem conhecidos e a importância industrial e ecológica dos fungos é inegável. Para a produção de medicamentos que revolucionaram o estilo e a expectativa de vida humana, até a fabricação de queijos, a química e a microbiologia andam juntas para o entendimento dos processos químicos e bioquímicos e para o aperfeiçoamento das tecnologias envolvidas (TAKAHASHIA et al., 2017).
As lipases (triacilglicerol-acil-hidrolases E.C.3.1.1.3) têm sido definidas como carboxilesterases que hidrolisam acilgliceróis de cadeia longa, ou seja, com cadeia acila constituída por mais de 10 átomos de carbono. Enzimas que apresentam a capacidade de hidrolisar apenas acilgliceróis de cadeia com menos de 10 carbonos são denominadas genericamente como esterases (GHALY et al., 2010; JAEGER & REETZ 1998;). Os substratos naturais para lipases são óleos e gorduras contendo triacilgliceróis constituídos de ácidos graxos de cadeia longa, ou seja, ligações ésteres tríplices, enquanto esterases atuam sobre um único tipo de ligação éster, liberando ácidos graxos de baixo peso molecular (MESSIAS et al., 2011).
Os fungos filamentosos são amplamente reconhecidos como sendo as melhores fontes enzimáticas, com várias patentes de aplicação da enzima, suas principais fontes de obtenção de lipases para aplicação industrial têm sido os microrganismos, por apresentarem procedimentos mais simples de isolamento a partir do caldo fermentativo, são geralmente mais estáveis e com propriedades bem mais diversificadas que as lipases de outras fontes. Nesse aspecto (CARDENAS et al., 2001).
Muitos microrganismos secretam lipases durante o seu crescimento em resíduos orgânicos, pois esses restos constituem uma fonte significativa de nutrientes que servem como meio de crescimento para os organismos capazes de produzir lipases. No entanto, a disponibilidade de lipases que tenham características apropriadas para uma aplicação específica é ainda um fator limitante; sendo assim, a identificação de condições para melhoria de sua produção através de matérias-primas menos onerosas continua a ser importante tópico de pesquisa. A utilização e reciclagem de recursos renováveis levam ao que tem sido denominado de “tecnologia limpa”, sendo uma técnica em que os materiais que representam uma ameaça para o meio ambiente são usados para promover a produtividade dos recursos necessários para tornar a atividade humana sustentável (SALIHU et al., 2012).
As lipases são muito utilizadas em diversos setores industriais em virtude das reações que podem catalisar, como a hidrólise total ou parcial de triacilgliceróis (TAG) para fornecer diacilgliceróis (DAG), monoacilgliceróis (MAG), glicerol e ácidos graxos livres (SHARMA;
CHISTI; BANERJEE, 2001), além de reações de esterificação e transesterificação de lipídios, como mostra a (Tabela 1, pag14).
Por este motivo, são aplicáveis na indústria química para a produção de surfactantes (WATANABE et al., 2001; PRIYANKA et al., 2018), na formulação de detergentes, na resolução de misturas racêmicas (BELI; MAGESTE; TAKETANI, 2019; SAMOYLOVA et al., 2019), no tratamento de resíduos ricos em óleos e gorduras (FACCHINI et al., 2015;
SAMOYLOVA et al., 2019) e na área da saúde, compondo medicamentos, em diagnósticos, cosméticos ou antibióticos (PASCOAL et al., 2018; CONTESINI et al., 2020). Recentemente, têm sido utilizadas na indústria da bioenergia para a produção de biodiesel (PARK; SATO;
KOJIMA, 2006; NORJANNAH et al., 2016; MOAZENI; CHEN; ZHANG, 2019).
Destacam-se estudos de aplicação de lipase na geração de energia como a produção de biocombustível, alternativo ao óleo diesel, a partir de óleos vegetais brutos(NORJANNAH et al., 2016; MOAZENI; CHEN; ZHANG, 2019). O uso de lipases para produção de biodiesel é de relevante importância, considerando-se o crescimento da utilização desse biocombustível em âmbito mundial, não somente pelo aspecto do meio ambiente, mas, principalmente, por se tratar de uma fonte de energia renovável.
No entanto, seu elevado custo e as dificuldades referentes ao controle do processo têm reduzido seu uso (VILLENEUVE et al., 2000; WANG et al., 2008). A transesterificação utilizando catalisadores enzimáticos vem sendo estudada, testando lipases solúveis e imobilizadas disponíveis comercialmente com resultados promissores (NASCIMENTO et al., 2001; BONINE, et al. 2014; NEMATIAN, et al. 2022;).
Tabela 1. Reações lipolíticas em diferentes setores industriais.
INDÚSTRIA AÇÃO PRODURO OU
APLICAÇÃO
Referência Alimentos Hidrólise, aromas,
transesterificação
Remoção de óleos, agentes flavorizantes,
prolongar a vida de prateleira
ULLAH et al., 2016; SARMAH
et al., 2017;
PRIYANKA et al., 2018 Têxtil Hidrólise Melhoria da qualidade do
tecido
HASAN;
SHAH;
HAMEED, 2006; ASSIS &
MUNARO,2016 Biocombustíveis Hidrólise,
transesterificação, síntese
Catalisador da síntese de biodiesel
NORJANNAH et al., 2016;
MOAZENI;
CHEN;
ZHANG, 2019 Farmacêutica Transesterificação,
hidrólise
Lipídios específicos, digestivos
PASCOAL et al., 2018;
CONTESINI et al., 2020 Cosméticos Síntese Emulsificantes,
umidificantes
BELI;
MAGESTE;
TAKETANI, 2019 Papel e Celulose Hidrólise Melhoria da qualidade do
papel
HASAN;
SHAH;
HAMEED, 2006 Limpeza Hidrólise Remoção de gorduras ZHIRYAKOVA,
et al., 2011;
SAMOYLOVA et al., 2019.
Tratamento Efluentes
Hidrólise, transesterificação
Tratamentos de efluentes HASAN;
SHAH;
HAMEED, 2006;
FACCHINI et al., 2015;
SAMOYLOVA et al., 2019 Devido alguns pontos positivos, que podem minimizar alguns problemas relatados pelo uso da catálise alcalina; entre eles cita-se o fato de que as enzimas não formarem sabões e poderem esterificar os ácidos graxos livres com baixo custo energético em temperatura 20- 50 °C (HALIM et al., 2009; OLIVEIRA 2019; TUDORACHE, 2021).
2. OBJETIVOS 2.1 Objetivo geral
Coletar, isolar fungos filamentosos produtores de lipase e analisar as características morfológicas macroscópicas dos fungos filamentosos isolados e do banco de fungos do laboratório, assim como, padronizar o cultivo do microrganismo selecionado para uma maior atividade lipolítica, seguindo caracterização bioquímica da lipase solúvel produzida em meio submerso e caracterização físico-química dos óleos vegetais.
2.2 Objetivos específicos
1. Coletar distintos materiais para isolar fungos filamentosos;
2. Caracterizar morfologicamente macroscopicamente os fungos filamentosos isolados;
3. Determinar os possíveis gêneros dos fungos isolados;
4. Analisar a temperatura de crescimento dos fungos filamentosos isolados e do banco de fungos do laboratório em meio sólido próprio para lipases;
5. Analisar a produção de lipases pelos microrganismos isolados e selecionar o fungo para desenvolvimento do trabalho;
6. Determinar o meio de cultura e o tempo de crescimento do fungo para uma maior produção enzimática;
7. Determinar a fonte de nitrogênio, solução de sais e fonte de carbono do meio para uma maior produção enzimática;
8. Determinar o pH inicial do meio de cultivo e a concentração de esporos para uma maior atividade lipolítica;
9. Caracterizar bioquimicamente a enzima quanto à temperatura e pH de reação, estabilidade da enzima à temperatura e ao pH;
10. Caracterizar físico quimicamente, óleos vegetais, quanto ao índice de acidez, peróxido, saponificação e material insaponificável.
3. REVISÃO DA LITERATURA
3.1 FUNGOS
Os fungos são microrganismos eucarióticos sendo decompositores químicos de matéria orgânica para obtenção de energia, ou seja, são considerados quimiorganotróficos e heterotróficos por utilizarem como fonte de energia e de carbono compostos orgânicos (DEACON et al. 2006; HAGESKAL et al., 2009). Normalmente crescem melhor em ambientes em que o pH é próximo a 5, quase todos os fungos são aeróbicos, a maioria dos fungos é resistente à pressão osmótica; muitos, consequentemente, podem crescer em concentrações relativamente altas de açúcar ou sal. Os fungos podem crescer em substâncias com baixo grau de umidade, necessitam de menos nitrogênio para o crescimento sendo capazes de metabolizar materiais complexos como a lignina (TORTORA et al., 2012). Fazendo com que os fungos desenvolvam em substratos diversos como paredes de banheiro, couro de sapatos, jornais velhos, alimentos, entre outros ambientes e materiais.
Esse Reino é composto por leveduras, organismos unicelulares, e por fungos filamentosos, organismos multicelulares. Os fungos filamentosos, possuem micélio (massas visíveis), constituídos por hifas (longos filamentos) que se ramificam e se entrelaçam (TAKAHASHI et al., 2017), caracterizadas por serem finas (5 a 10 μm de diâmetro), transparentes e rígidas podendo possuir septos (hifas septadas) ou não possuírem divisões entre as células (hifas cenocíticas ou não septadas) (Figura 1), as quais crescem por alongamento pela ponta, pois nessa região a ligação dos polissacarídeos ainda não é fixa, o que permite a inclusão de outras unidades (NOGUEIRA & FILHO, 2015).
Figura 1. Tipos de hifas dos fungos dilamentosos. (A) hifas não septadas e (B) hifa septada.
Fonte: TORTORA et al., 2012
Os septos das hifas são invaginações produzidas em espaços regulares com um, dois ou mais núcleos, dividindo os filamentos em células distintas. Em outras espécies, o septo
raramente está presente surgindo apenas na base de estruturas reprodutivas ou em partes velhas formando micélios asseptados ou cenocíticos, caracterizado essencialmente por uma célula com muitos núcleos (NOGUEIRA & FILHO, 2015).
Os fungos filamentosos apresentam estruturas de reprodução assexuada e/ou sexuada.
Na reprodução assexuada, somática ou vegetativa, não envolve a fusão de gametas, chamada fase anamórfica (fase assexual), enquanto a reprodução sexuada ou teleomórfica, há alta incidência de recombinação e formação de novos genótipos, envolvendo a união de dois núcleos compatíveis, um indivíduo pode produzir diferentes tipos de sexos (masculino ou feminino) compatíveis ou não (NOGUEIRA & FILHO, 2015).
Atualmente no Reino Fungi são descritos em 20 filos, utilizando uma abordagem filogenética: Aphelidiomycota, Ascomycota, Basidiobolomycota, Basidiomycota, Blastocladiomycota, Calcarisporiellomycota, Caulochytriomycota, Chytridiomycota, Entomophthoromycota, Entorrhizomycota, Glomeromycota, Kickxellomycota, Monoblepharomycota, Mortierellomycota, Mucoromycota, Neocallimastigomycota, Olpidiomycota, Rozellomycota, Sanchytriomycota e Zoopagomycota. Na literatura encontramos estudos desatualizados apresentando somente alguns deles, como Chytridiomycota, Neocallimastigomycota, Blastocladiomycota, Glomeromycota, Ascomycota e Basidiomycota, e até mesmo filos que foram reclassificados, como o Zygomycota (GALINDO et al., 2021).
Vários estudos têm sido conduzidos em diversos ecossistemas, avaliando os fungos filamentosos presentes em variadas composições (EVANS et al.; BORGES et al., 2013; SILVA, 2014; GODINHO et al., 2015).
Em relação aos registros catalogados por Maia & Carvalho (2010), há mais espécies de fungos na Mata Atlântica (1.664 spp.), seguida pela Caatinga (734 spp.) e a Amazônia (519 spp.), com número menos representativo no Cerrado (291 spp.). A Região Nordeste é a que possui registro de maior diversidade de espécies, com 1.749, seguida pela Sudeste com 1.411, Sul com 1.320, Norte com 743 e Centro-Oeste com 296.
O maior número de espécies se destaca-se nos Estados de São Paulo (1.161 spp.), Pernambuco (937 spp.), Rio Grande do Sul (856 spp.), Bahia (584 spp.), Paraná (529 spp.), Santa Catarina (482 spp.), Rio de Janeiro (443 spp.), Amazonas (408 spp.), Minas Gerais (399 spp.) e Pará (302 spp.). A despeito dos dados referentes ao Amazonas e ao Pará, observa-se que a Região Norte carece de coletores e estudiosos de fungos pois, nos demais estados, o número de registros é extremamente baixo: Rondônia (116 spp.), Amapá (88 spp.), Roraima (75 spp.), Acre (61 spp.) e Tocantins (5 spp.). Além desses, destacam-se ainda a Região Centro-Oeste
(Mato Grosso 135 spp., Goiás 104 spp., Mato Grosso do Sul 82 spp., Distrito Federal 77 spp.), o Maranhão e o Espírito Santo como locais em que pouco se conhece acerca da diversidade micológica (MAIA & CARVALHO, 2010).
Em estudos realizados por Coutinho & Maia (2018) foram identificadas quarenta e sete espécies nas áreas revegetadas e 39 nas áreas naturais, dessas distribuídas em 12 gêneros e seis famílias (Chaetomiaceae, Cunninghamellaceae, Hypocreaceae, Nectriaceae, Ophiocordycipitaceae e Trichocomaceae).
Souto & Firmino (2018) efetuaram o levantamento de fungos associados às plantas nativas do Cerrado Mineiro no município de Monte Carmelo, em diferentes áreas e diferentes épocas do ano sendo encontrados nove fungos pertencentes a dois diferentes filos, Ascomycota e Basidiomycota, apresentando possivelmente, duas novas espécies para a Ciência.
Santos e colaboradores (2018) estudaram a diversidade dos fungos encontrados nas orquídeas silvestres e cultivadas no sul da Bahia, sendo encontrados fungos patogênicos, endofíticos e sapróbios dos quais doze são novos registros para a ciência quanto à distribuição geográfica e/ou ocorrência em novos hospedeiros.
Vale citar que os fungos filamentosos são de fácil cultivo, podendo se desenvolver em meios de cultura relativamente simples quanto à sua composição, devido à sua diversidade metabólica e taxa de crescimento elevada (TREVISAN, 2004).
A utilização desses fungos pode trazer opções mais sustentáveis ou ocupar nichos ainda inocupados. Os fungos podem ajudar a resolver problemas difíceis para a química, como a funcionalização de carbonos não ativados, a remoção sustentável de poluentes em áreas contaminada, a produção de novos fármacos e a produção de novos produtos (TIGINI et al., 2010; CHAPLA et al., 2013; SOARES et al., 2020).
Os fungos filamentosos realizam funções de grande importância em diversos setores (ambiental, ecológico e econômico), na economia, como na indústria alimentícia, para produção de alimentos fermentados e bebidas alcoólicas (ULLAH et al., 2016; SARMAH et al., 2017;
PRIYANKA et al., 2018), como o caso dos fungos Penicillium camemberti e Penicillium roqueforti, que são de grande importância no processo de fabricação de queijos (GIRAUD et al., 2010).
Os fungos contribuem também na indústria farmacêutica, produzindo metabólitos biologicamente ativos com fins farmacológicos diversos, como antibióticos, imunossupressores, antiparasitários e agentes anticancerígenos, alguns dos quais serviram como base para o desenvolvimento de muitos fármacos (RATEB & EBEL, 2011; PASCOAL et al., 2018; CONTESINI et al., 2020). Os fungos são utilizados no processo de biodegradação
KAWAMOTO, 2005; HASAN; SHAH; HAMEED, 2006; FACCHINI et al., 2015;). São produtores de enzimas de interesse para indústria (WANG et al., 2005; CHAMY, 2017; SILVA, et al. 2018) e para a biotransformação (LOPES et al., 2016).
Também são de grande importância agrícola e ecológica, pois mantém o equilíbrio do ambiente, decompondo restos vegetais, auxiliando no crescimento e proteção das plantas. Os fungos capazes de solubilizar fosfato, tais como os do gênero Aspergillus, Penicillium e Fusarium, desempenham papel importante no aumento da biodisponibilidade de fosfatos do solo para as plantas, podendo atuar como biofertilizantes (ELIAS et al., 2016). Com base no acervo de funções desempenhadas pelos fungos, pode se afirmar que estes microrganismos são, sem dúvida, de grande interesse biotecnológico.
A coleta do material biológico, a triagem de materiais com as características de interesse e, finalmente, a seleção da melhor opção que apresente os atributos desejados para desenvolver e produzir um produto comercial ou mesmo para aplicá-lo em processos industriais fazem parte das etapas para a descoberta de um possível recurso biotecnológico (BULL et al., 2000).
A técnica de isolamento no estudo de bioprospecção é muito utilizada com a finalidade de verificar quais microrganismos estão presentes em determinado ambiente. A diversidade e abundância de microrganismos varia de acordo com o tipo de ambiente e a função específica desempenhada (LEE, 2013).
A maioria dos fungos são mesófilos, cuja temperatura ideal de crescimento é de 5 até 35 °C, com temperatura ótima em torno de 28 ºC. No entanto, alguns fungos são excepcionalmente capazes de crescer e viver sob temperaturas elevadas. Assim, a temperatura tem um papel importante e fundamental para a distribuição de organismos na terra (OLIVEIRA et al., 2015).
Uma definição dada por Cooney & Emerson (1964) classificam os fungos como termofílicos aqueles com uma temperatura de crescimento máxima de 50 °C ou superior e mínima de 20 °C, enquanto são considerados fungos termotolerantes aqueles que suportam uma temperatura máxima de crescimento de 50 °C e que exibem a temperatura mínima de crescimento abaixo de 20 °C.
Os fungos termófilos são os principais componentes da microbiota que se desenvolve em pilhas de produtos agrícolas e silvícolas, grãos armazenados, madeira, material de nidificação de animais, sistemas de compostagem, além de outros acúmulos de matéria orgânica (LEE et al., 2014).
Os fungos termófilos são fundamentais no processo de decomposição da matéria orgânica (HEATON et al., 2012), participam deste processo em conjunto com os microrganismos mesófilos, os quais, por meio de sua intensa atividade metabólica, promovem
um rápido aumento de temperatura, favorecendo a ascensão dos termofílicos e termoresistentes.
Nesta etapa, estes últimos desempenham um importante papel na quebra de substâncias complexas, como polissacarídeos (celulose, hemicelulose e pectina) e lignina (SZÉKELY et al., 2009).
A identificação dos fungos filamentosos é realizada principalmente por taxonomia clássica e por biologia molecular. Na taxonomia clássica, utilizam-se características morfológicas macroscópicas (superfície e o reverso da colônia, aspecto da borda, diâmetro, cor dos conídios e micélio, textura, presença de exudados e pigmentos solúveis, etc), microscópicas (forma e cor da hifa, presença ou não de septos, tipo e arranjo de esporos, etc.) e velocidade de crescimento (Figura 2) (KURTZMAN et al., 2011).
Figura 2. Macrocultivo e microcultivo do fungo Penicillium sp.
a) verso da colônia cultivada em meio ágar batata dextrose (BDA);
b) frente da colônia cultivada em meio BDA;
c) verso da colônia cultivada em meio ágar extrato de malte (MEA);
d) frente da colônia cultivada em meio MEA;
e), f) e g) conidióforos característicos do gênero Penicillium: estruturas de reprodução no formato de vassoura com ramificações.
Fonte: (TAKAHASHI, et al. 2017)
A identificação por biologia molecular (Figura 3) é uma forma mais moderna que consiste das seguintes etapas: i) extração do DNA, a partir do rompimento da parede celular e de membranas; remoção de impurezas e obtenção do DNA nuclear; ii) utilização da técnica de PCR, para a amplificação da sequência de DNA, sendo as sequências da região ITS as mais utilizadas para a identificação dos fungos, sendo consideradas o segmento universal para este grupo; iii) visualização do segmento de DNA que foi amplificado usando eletroforese; iv)
purificação do segmento de DNA, para eliminação dos reagentes utilizados na PCR; v) sequenciamento, que identifica a ordem dos nucleotídeos adenina, citosina, guanina e timina em um fragmento de DNA e vi) análises em programas computacionais, para encontrar similaridades entre as sequencias dos organismos alvos com sequências depositadas em um banco de dados (ABRÃO et al., 2014; MORAES et al., 2015).
Figura 3. Esquema das etapas utilizadas para a identificação molecular de fungos.
Fonte: (TAKAHASHI et al., 2017)
A utilização da taxonomia polifásica é também importante para a identificação, ela consiste na combinação de várias ferramentas, como características morfológicas, fisiológicas, bioquímicas e moleculares para identificar e/ou descrever novas espécies de fungos (MORAIS et al., 2016). O grande avanço nesta área é decorrente da crescente utilização de espectrometria de massas, associada a técnicas estatísticas, para a identificação de fungos filamentosos e outros microrganismos, patogênicos ou não (TAKAHASHI et al., 2017).
A identificação taxonômica (antes restrita a um número exíguo de especialistas) e a identificação molecular (que exige equipamentos específicos e insumos caros) ganharam na instrumentação química uma aliada, capaz de identificar microrganismos a partir de quantidades pequenas de material biológico, em uma análise rápida e eficiente. Assim a técnica de MALDI-TOF ampliou a agilidade de projetos de bioprospecção de metabólitos fúngicos, causando um impacto significativo também na medicina, pela possibilidade de identificar, com rapidez, microrganismos patogênicos, inclusive em amostras biológicas recolhidas de pacientes, em substituição aos morosos processos convencionais de isolamento (WIESER et al., 2012).
3.2 ENZIMAS
As enzimas constituem o grupo mais importante de produtos biológicos de necessidade humana. Diversos processos industriais, especificamente nas áreas ambiental, de biotecnologia e de alimentos empregam a tecnologia das enzimas em várias de suas etapas. A introdução de enzimas como catalisadores em processos industriais, a exemplo das microbianas, mostra-se vantajosa, uma vez que as enzimas são específicas e geralmente não apresentam toxicidade, sendo estas características desejáveis tanto pela indústria, quanto para a preservação do meio ambiente (ESPOSITO; AZEVEDO, 2010).
Enzimas como lipases, xilanases, pectinases e celulases abrangem todos os ramos da indústria, na de alimentos utiliza estas enzimas para a obtenção de alimentos mais saborosos, sucos com menor viscosidade e cor, enriquecimento nutricional de rações animais e obtenção de produtos à base de leite, na farmacêutica utilizam para a obtenção de fármacos e de produtos cosméticos, enquanto que na química empregam para a obtenção de ésteres, branqueamento da polpa kraft em detergentes (GHORAI et al., 2009).
O emprego de enzimas microbianas no setor industrial é de grande interesse. Além de possibilitarem a criação de um novo produto, sua utilização pode alterar a composição de produtos que já estão disponíveis no mercado, bem como melhorar sua qualidade.
Adicionalmente, a produção de enzimas microbianas é de particular interesse, devido ao curto período de geração dos microrganismos, à grande diversidade de processos metabólicos e de enzimas existentes. Desta forma, o uso de microrganismos como recurso biotecnológico para a produção de enzimas industrialmente relevantes tem estimulado sua exploração. Nas últimas décadas, o emprego de fungos em bioprocessos tem ganhado importância devido à produção de inúmeras enzimas, com as mais diversas características físico-químicas e excelente potencial para a aplicação industrial (GOSWAMI; PATHAK, 2013).
A capacidade de síntese em larga escala, bem como a facilidade com que estas enzimas são secretadas para o meio externo constituem apenas algumas das características que tornam as espécies fúngicas particularmente interessantes do ponto de vista industrial. Por serem geralmente extracelulares, o processo de recuperação do meio de fermentação de enzimas fúngicas é facilitado. Adicionalmente, as enzimas de origem fúngica, bem como as produzidas por outros microrganismos, não estão sujeitas às intempéries climáticas como as de origem vegetal, sendo produzidas sob condições controladas de cultivo (GERMANO et al., 2003;
PANDEY et al., 2005; ORLANDELLI et al., 2012).
A aplicação industrial de enzimas tornou-se possível devido aos esforços iniciais de Jokichi Takamine (1894, 1914) e de Boidin & Effront (1917), que cultivaram enzimas de fungos e
bactérias, respectivamente, em escala industrial. Cerca de 58% das enzimas industriais são produzidas por leveduras e fungos filamentosos e cerca de 30% por bactérias, apenas 8% são produzidos por animais e 4% por plantas.
Essas fontes são economicamente favoráveis, pois o seu cultivo simples não envolve quaisquer restrições relacionadas com tempo e espaço em comparação com outras fontes. As tecnologias avançadas permitem que os genomas de microrganismos sejam sequenciados de maneira muito eficiente e que muitas novas sequências de genes que codificam variantes de enzimas sejam também identificadas (SRIVASTAVA, 2019).
É enorme a lista de enzimas produzidas por fungos, entre elas estão as amilases, proteases, quitinases, celulases, lipases e muitas outras que possuem potencial para serem empregadas em diferentes funções, o que coloca o Brasil como um dos países de maior potencial de matéria orgânica, considerado autossuficiente, que poderia ser utilizada como substrato de baixo custo para fermentações (DABAJA et al., 2019).
Atualmente, cerca de 200 enzimas são utilizadas comercialmente. Dentre estas, as enzimas hidrolíticas somam aproximadamente 75% das enzimas utilizadas em processos industriais (VANDENBERGHE et al., 2016).
Em relação ao mercado global de vendas de enzimas, até a década de 1960 as vendas totais eram de apenas alguns milhões por ano. Após a melhor compreensão da bioquímica dos processos de produção, que envolve os processos de fermentação e métodos de recuperação, além dos avanços nos métodos de uso e o aumento da demanda por novos biocatalisadores, esse mercado tem crescido espetacularmente (MONDAL et al., 2016).
Espera-se que o mercado de enzimas de biocombustíveis cresça globalmente. O principal fator que impulsiona o mercado é a crescente demanda por biodiesel, etanol celulósico e de milho, combustíveis de avião entre outros juntamente com as crescentes preocupações ambientais, com isso espera-se domine o segmento de aplicação do mercado global de enzimas de biocombustíveis devido à crescente inclinação contra a gasolina como meio de combustível mais limpo. O Mercado Global de Enzimas de Biocombustíveis é parcialmente consolidado por natureza, com alguns grandes players dominando uma parcela significativa do mercado, as principais empresas são AB Enzymes, DuPont, Iogen Corporation, DSM e BASF SE, Novozymes entre outras (MORDOR, 2022).
O crescente aumento das pesquisas na área da enzimologia estimula a descoberta de novos microrganismos produtores de enzimas que apresentem alta produtividade, especificidade e estabilidade das enzimas. Esses biocatalisadores têm sido usados, em grande escala, na indústria de tecidos (celulases), detergentes (proteases e lipases), alimentos e bebidas (amilases, pectinases, proteases e celulases), couro (proteases e lipases) (SOARES, 2010;
PASHA et al., 2013) e na dieta de ruminantes para o aumento da digestibilidade (enzimas fibrolíticas) (MARTINS et al., 2006).
Vale citar que a atividade enzimática produzida por fungos, está diretamente ligada ao potencial industrial, recuperação ambiental, ou na biodegradação de matérias com função econômica, social e ambiental (SILVA & MALTA, 2016).
Segundo Papadaki e colaboradores (2020), o mercado global de enzimas foi avaliado em US $ 7,1 bilhões em 2017 e deverá chegar a US$ 10,5 bilhões em 2024, com uma taxa de crescimento anual de 5,7% de 2018 a 2024, sendo que a Europa foi responsável por 1/3 de produção global de enzimas em 2017 e no mesmo ano, estimou-se que cerca de 70% da quota de mercado de enzimas era produzida por microrganismos.
3.3 LIPASES
As lipases (triacilglicerol-acil hidrolases – E.C. 3.1.1.3) são enzimas pertencentes a família das α/β hidrolases, relatadas como proteínas monoméricas amplamente distribuídas na natureza pertencentes `a classe das hidrolases e possuem como principal função biológica a capacidade de catalisar a hidrólise de ligações ésteres presentes em triacilgliceróis para formar ácidos graxos livres, diacilgliceróis, monoacilgliceróis e glicerol. Além de catalisarem naturalmente reações de hidrólise, são também capazes de catalisar reações de esterificação, transesterificação (acidólise e alcóolise), interesterificação e aminólise em ambientes não aquosos (Figura 4, pag. 29) (ALMEIDA et al., 2011; GODOY et al., 2011; GOPINATH et al., 2013; CORTEZ et al., 2017).
A variação na molécula de lipase se dá pela sua fonte produtora da enzima, porém algumas características destas enzimas são padrão, como a massa molar da proteína, que varia entre 19 a 75 kDa. As lipases de origem microbiana, são glicoproteínas e possuem cerca de 258 a 544 resíduos de aminoácidos, onde na grande maioria, apresentam caráter hidrofóbico, sendo responsáveis pela interação da enzima com o substrato. As lipases possuem faixa ótima de pH muito ampla, podendo variar entre pH 4 e 9, assim como a temperatura ótima de reação variar entre 25 e 70 °C (SALIHU et al., 2012; ANGAJALA et al., 2016).
As enzimas lipolíticas são amplamente encontradas na natureza (animais, plantas e microrganismos). Os microrganismos são conhecidos como bons produtores de lipases, fazendo parte desta categoria os fungos, leveduras e bactérias (Gram-positivas e Gram-negativas), sendo que as lipases produzidas por estes microrganismos são, em sua maioria, consideradas extracelulares (MAHALE et al., 2015).
Figura 4. Reações de catalise enzimática.
Composto por uma tríade catalítica, formada pelos aminoácidos serina, histidina e aspartato, onde este último pode ser substituído em algumas conformações pelo glutamato é a composição do sítio ativo da lipase. Nesta tríade catalítica, a serina é responsável por ser o aminoácido nucleofílico, que realiza o ataque a carbonila do substrato, a histidina possui a cadeia lateral básica, e o aspartato ou glutamato, são os aminoácidos com a cadeia lateral ácida (ANGAJALA, et al. 2016).
Nesses sítios ativos a maioria das lipases possuem uma proteção denominada “tampa”, que é uma estrutura helicoidal hidrofóbica. Esta estrutura secundária define o estado da enzima, tampa aberta (enzima está na sua conformação ativa, e o substrato pode entrar em contato com o sítio ativo, realizando assim a catálise enzimática) e com a tampa fechada (conformação enzimática está inativa, e o substrato não tem acesso ao sítio ativo). Essa abertura ou fechamento da estrutura, está relacionada ao ambiente que a enzima se encontra, devido sua característica hidrofóbica, microambientes hidrofóbicos auxiliam para uma conformação aberta (FRANCOLINI et al., 2020).
As lipases agem sobre substratos hidrofóbicos em condições de sistemas bifásicos entre água/óleo, denominada de ativação interfacial, e relaciona o aumento da atividade da lipase em contato com o substrato emulsionado ou em forma de micelas. Essa característica interfacial foi descrita inicialmente por Sarda & Desnuelle (1958) e tem sido utilizada para diferenciar a preferência das lipases por substratos lipídicos insolúveis, de cadeia longa, que se mantenham na interface óleo-água ou água-solvente orgânico de outras enzimas como esterases e cutinases que apresentam preferências por substratos lipídicos solúveis, de cadeia curta (FRANCOLINI et al., 2020).
As lipases podem ser classificadas em três grupos, de acordo com Cortez et al, (2017) no que diz respeito a sua atuação sobre determinada região do triacilglicerol: (a) Lipases não específicas: não apresentam especificidade com relação `a natureza do grupo acil ou `a posição em que está esterificado, caracterizadas por catalisarem a hidrólise completa das moléculas de triacilglicerol, de forma aleatória, para formar glicerol e ácidos graxos livres, formando monoacilgliceróis e diacilgliceróis como intermediários na mistura reacional; (b) Lipases 1,3 específicas: catalisam a liberação de ácidos graxos especificamente nas posições 1 e 3 dos triacilgliceróis e formam produtos diferentes daqueles obtidos por lipases não regiosseletivas e (c) Lipases ácido graxo específicas: catalisam a hidrólise de ésteres cujos ácidos graxos são de cadeia longa insaturada, contendo dupla ligação cis no carbono 9 (Figura 5).
Figura 5. Esquemas de catalise representativos para a hidrolise de triacilgliceróis.
(a)lipase não específica, (b) lipase 1,3 específica e (c) lipase ácido graxo específica.
Fonte: (KAPOOR & GUPTA 2012; JENSEN 1974), adaptado.
As enzimas lipolíticas obtidas a partir de fungos e bactérias são amplamente empregadas em aplicações biotecnológicas e em síntese orgânica (ANDUALEMA et al., 2012). Fungos normalmente são mais preferenciais devido a maior produção de enzimas extracelulares, o que facilita a extração do meio de fermentação, além da expectativa crescente do seu emprego como biocatalisadores na forma de células integrais, o que simplifica e pode reduzir o custo dos processos reacionais nos quais são utilizados. As lipases extracelulares são secretadas em quantidades significativas por algumas espécies de fungos filamentosos quando estes são cultivados em condições apropriadas, sendo facilmente separadas da massa micelial por filtração ou centrifugação. Apenas pequena quantidade de lipases tem sido encontrada dentro ou aderida ao micélio (TREICHEL et al., 2010; RODRIGUES et al., 2016). Uma lista com os tipos mais comuns de microrganismos produtores de lipases é apresentada na (Tabela 2).
Tabela 2. Microrganismos como fonte de lipase.
Fonte Microrganismos
Fungos Penicillium citrinum, Penicillium restrictum, Penicillium simplicissimum, Penicillium verrucosum, Rhizopus arrhizus, Rhizopus chinensis, Rhizopus homothallicus, Rhizopus oryzae, Rhizopus sp., Aspergillus sp., Aspergillus carneus, Aspergillus niger, Geotrichum sp., Geotrichum candidum, Colletotrichum gloesporioides
Leveduras Rhodotorula mucilaginosa, Yarrowia lipolytica, Candida utilis, Candida rugosa, Candida artictica, Candida cylindracea, Candida sp., Trichosporon asahii, Aureobasidium pullulans, Saccharomyces cerevisiae, Williopsis californica.
Bactérias Pseudomonas sp., Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter radioresistens, Bacillus stearothermophilus, Bacillus sp., Bacillus coagulans, Bacillus subtilis, Staphylococcus caseolyticus, Burkholderia cepacia, Burkholderia multivorans, Serratia rubidaea.
Fonte: Treichel et al (2010), adaptado.
Entre os fungos filamentosos a lipase, como outras enzimas extracelulares, também pode estar em formas múltiplas, sendo a sua formação dependente de características de cultivo tais como composição do meio de cultura, parâmetros físico-químicos, idade do cultivo e a presença de agentes indutores ou inibidores sendo promissoras para a produção em aplicações industriais por diversos motivos, como: produção por processos fermentativos em grande escala com regularidade, requerimentos nutricionais bastante simples, alta variedade, rendimento elevado e alta estabilidade fora da célula (JESUS et al., 2016).
Estas características têm levado a sua aplicação em vários processos catalíticos industrialmente importantes (SHARMA & KANWAR, 2014; CORTEZ et al., 2017;
ZAVARISE & PINOTTI, 2020). Apresentam procedimentos mais simples de isolamento, são mais estáveis e com propriedades mais diversificadas que as lipases de outras fontes (MACEDO et al., 2009). Por serem biocatalisadores bastante eficazes devido a elevada atividade específica do substrato, elas possuem um baixo impacto no ambiente (FRANKEN et al., 2010).
As lipases se classificam em terceiro lugar, dentre as enzimas que participam do grande volume de vendas no mercado, ficando atrás apenas das proteases e das amilases (CARVALHO et al., 2017). Podem ser utilizadas na indústria de alimentos (aditivos para modificação de aromas), farmacêutica (medicamentos), química fina (síntese de ésteres), produção de detergentes (hidrólise de gorduras), tratamentos de águas residuais (decomposição de substâncias oleaginosas), produção de biodiesel, bem como em ensaios biomédicos (RAMNATH et al., 2016; BANSODE & RATHOD, 2017).
São amplamente utilizadas no processamento de gorduras e óleos, detergentes e fórmulas desengordurante, processamento de alimentos, síntese de produtos químicos finos e produtos farmacêuticos, fabricação de papel e produção de cosméticos (SHARMA et al., 2001;
PINTO, 2019; BAPTISTE, 2020).
Vários trabalhos relatam lipases fúngicas na literatura e algumas espécies têm demonstrado possuir a estabilidade adequada e capacidade satisfatória de biocatálise para serem empregadas em reações de síntese nos laboratórios de química orgânica e, assim, serem consideradas de relevância à aplicação industrial (OLIVEIRA, 2017; SILVA, 2019;
POOZZOBON, 2020).
Especialmente nas áreas de engenharia de proteínas e enzimologia em meios não convencionais o interesse industrial por lipases vem aumentando gradativamente, as quais ampliaram consideravelmente o potencial de aplicação das enzimas como catalisadores em processos industriais (ROVEDA et al., 2010; ALMEIDA, 2017; GUARNIERI, 2020).
Sendo de suma importância a otimização das condições de cultivo, visto que influenciam diretamente sobre o microrganismo produtor da enzima, bem como na excreção desta para o meio de cultivo ou retenção da lipase dentro das células (QIAO et al., 2017).
Aos fatores nutricionais a produção das lipases microbianas está fortemente relacionada, como os tipos e concentrações de nutrientes, presença, ausência e concentração de indutores, e fatores físicos, como aeração do meio, agitação, temperatura e pH (COLLA et al., 2016). Todos estes parâmetros devem ser avaliados e selecionados de acordo com o microrganismo e com a isoforma da lipase (MORAIS et al., 2016).
Para que haja uma produção eficiente de lipase, o meio de cultura deve conter fontes de carbono, fontes de nitrogênio e vitaminas. Estas fontes têm que ser de fácil metabolização pelos microrganismos para que estes apresentem um crescimento ideal e uma produção enzimática eficiente (SOUZA et al., 2020).
De acordo com a literatura, o meio de cultura para o crescimento dos microrganismos é um fator essencial para a produção da lipase, pois é necessário o indutor para que o microrganismo produza a enzima de interesse e fontes nutricionais eficientes (ALMEIDA et al., 2016; CORTEZ et al., 2016; KRÜGER, 2017).
Uma importante fonte é a de nitrogênio para o crescimento celular e síntese enzimática, pois as células utilizam o nitrogênio principalmente para sintetizar os grupos amino que estão presentes nos aminoácidos para síntese de proteínas. Algumas fontes de nitrogênio são mais utilizadas na composição dos meios de cultura para a produção enzimática, como o extrato de levedura, peptona, caseína. As fontes orgânicas de nitrogênio favorecem o crescimento e desenvolvimento celular por possuírem alguns fatores nutricionais adicionais que são necessários para o desenvolvimento celular e metabolismo, como vitaminas, cofatores e aminoácidos (SUNDAR & KUMARESAPILLAI, 2013), especificamente para a lipase, o nitrogênio é importante para formação da sua tríade catalítica no seu sítio ativo. O nitrogênio é a base do glutamato e da glutamina, e no processo de biotransformação, que ocorre no interior da célula, estes são precursores da histidina, aminoácido presente no sítio ativo (NELSON &
COX, 2018).
Os minerais também são importantes componentes no meio de cultura para à produção de lipase. O metabolismo celular exige a presença de íons para estabilização de enzimas específicas que estão relacionadas a diferentes rotas metabólicas existentes no sistema dos microrganismos, pois servem como cofatores para enzimas. Um cofator importante para o crescimento celular e produção de outras enzimas é o Mg2+, pois ele estabiliza as enzimas fosforilativas com o ATP para fornecimento de energia. Assim como a presença de sais formados por fósforo é importante para o desenvolvimento celular, pois o fósforo é componente base das moléculas de ATP, que geram energia para que ocorram todas as funções celulares (TORTORA et al., 2012).
Carboidratos e fontes indutoras podem ser utilizadas como fontes de carbono combinadas, podendo aumentar a produção da enzima. Isto é explicado pelo consumo da fonte de carbono consideradas mais simples não oleaginosa que induz o aumento sua biomassa.
Devido à alta densidade celular, a concentração final de enzima no meio é provavelmente elevada (GALVAGNO et al., 2011).
A escolha de um indutor ideal poderá determinar a produtividade do biocatalisador, a presença de nutrientes com alto teor lipídico pode aumentar os níveis de atividade da lipase, induzindo os microrganismos já considerados produtores, a estimular seu metabolismo, e sua rota de biossíntese para o aumento da produção (CORTEZ et al., 2016; MORAIS et al., 2016;
MAROTTI et al., 2017).
Nos trabalhos de Zeng e colaboradores (2006) e Wang e colaboradores (2008) foram avaliadas diversas fontes de óleo e o efeito destas sobre a produção de lipase por Rhizopus arrhizus. A composição dos ácidos graxos presentes em cada óleo vegetal influenciou diretamente na síntese metabólica (CORTEZ et al., 2016). Com isso um bom indutor pode ser eficiente para a suplementação de meios de culturas.
Almeida e colaboradores (2016) utilizaram o azeite de oliva para suplementar o meio de cultivo para a produção de lipase por C. viswanathii, sendo observada que a alta capacidade de indução na produção de lipase do azeite de oliva está relacionada a sua composição formada por 70% de ácido oleico. Portanto, o uso de óleo de soja é uma alternativa para ser utilizado como fonte de carbono nos cultivos que visam produzir lipase por microrganismo, em cultivo submersos ou em cultivos sólidos. A sua composição também apresenta a presença de ácido oleico, porém em menor quantidade 21,15%, em maior quantidade, está presente o ácido linoleico 57% (SILVA & GIOIELLI, 2006).
A utilização de resíduos já foi relatada de forma eficiente para espécies dos gêneros Pseudomonas, Bacillus, Candida, Rhodococcus and Staphylococcus (HABA et al., 2000) assim como outros indutores tais como óleo de jojoba, óleo de milho e óleo de algodão; além de meios suplementares contendo coprodutos de cervejaria, extrato de malte e tween 80, têm sido frequentemente investigados (MAKHSUMKHANOV et al., 2003; TAN et al., 2004;
BANCERZ et al., 2005).
As principais técnicas utilizadas para a produção de lipases microbianas são a fermentação submersa (FS) e a fermentação em estado sólido (FES).
Quando o processo de crescimento microbiano é um substrato sólido sem água livre aparente a fermentação é definida em estado sólido (FES), muito utilizado para a produção de enzimas microbianas devido às vantagens econômicas e biotecnológicas sobre a fermentação submersa convencional. Entre as principais vantagens, está a possibilidade de utilização de resíduos agroindustriais sólidos (por exemplo, bagaço de cana-de-açúcar, farelo de arroz e farelo de soja, entre outros) que servem como fonte de carbono e energia para o crescimento dos microrganismos, contribuindo também para uma destinação adequada desses resíduos (AITA et al., 2019).
Quando o crescimento ocorre na presença de excesso de água é definido como fermentação submersa (FS). Durante a FS os microrganismos são suspensos em um meio líquido contendo nutrientes dissolvidos necessários para seu desenvolvimento e síntese de produtos de interesse (FARINAS, 2015).
Algumas vantagens do uso da FS em relação a FES podem ser descritas, como a FES ainda necessita de um escalonamento adequado quanto à purificação dos produtos finais e biomassa, uma vez que o substrato é caracterizado por um nível de pH relativamente alto (7,5 e 8,1), o que pode representar um fator de limitação em culturas de fungos, normalmente estabelecidos em ambiente ácido. A FS através da sua diluição, juntamente com os efeitos de tampão podem evitar a alteração do pH, mantendo assim um ambiente adequado às condições exigidas pelos microrganismos. Além disso, a turbulência aprimorada melhora a acessibilidade do substrato (MUSATTI et al., 2017).
Torna-se difícil generalizar qual a melhor técnica, FS ou FES, e qual seria a mais apropriada para produção lipases e fazer uma comparação quantitativa uma vez que os métodos utilizados para determinação da atividade lipolítica são diferentes (TREICHEL et al., 2010).
A seleção de microrganismos, controle das condições físico-químicas críticas (pH, temperatura, tempo de fermentação, difusão de oxigênio, entre outros), substratos, e suplementos que possam contribuir para alcançar rendimentos elevados de produção associado a custos reduzidos tem como estudo a produção de lipases por FS e FES (THOMAS et al., 2013;
MORAIS et al., 2016).
A utilização de lipases em processos industriais tem sido fortemente encorajada em substituição aos processos químicos convencionais, com o objetivo de minimizar a formação de produtos indesejáveis durante os processos reacionais e, em geral, atender aos conceitos da química verde (LERIN et al., 2014; BANSODE & RATHOD, 2017).
Portanto seu alto custo envolvido e as dificuldades operacionais para a produção e utilização destas enzimas, frequentemente, limitam seu uso (VETEIKYT et al., 2017). A fim de solucionar os problemas supracitados, e outros interesses, estudos envolvendo lipases vêm apresentando elevado crescimento.
No trabalho realizado por Kleinert (2020) avaliou a capacidade da levedura em produzir lipases, foi realizado a fermentação submersa com as cepas de Y. lipolytica com capacidade de produção de lipase.
Garrido e colaboradores (2018) isolaram e selecionaram 12 cepas selvagens, dentre as quais três delas apresentaram destaque em análise qualitativa de produção de lipases microrganismos através de fermentação submersa.
